KR20220137705A

KR20220137705A - 직렬 수지 반응기의 펩티드 합성기

Info

Publication number: KR20220137705A
Application number: KR1020227030476A
Authority: KR
Inventors: 마틴 디. 존슨; 마이클 이. 코파치; 루크 피. 웹스터
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2020-02-05
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-10-12
Also published as: JP7415022B2; WO2021158444A3; IL295109A; AU2021216548A1; US20230158468A1; MX2022009598A; EP4100417A2; WO2021158444A2; BR112022015055A2; JP2024045149A; JP2023512772A; CN115298193A; CA3167047A1; CA3218467A1

Abstract

본원에서는, 고체 상 펩티드 합성 (SPPS) 장치 및 펩티드를 제조하기 위한 그의 사용 방법이 교시된다. 시스템은 각 반응기가 소정량의 SPPS 수지를 포함하는 적어도 2개의 반응기를 포함한다. 반응기들은 직렬로 배치된다. 탈-보호 작용제가 제1 반응기에 첨가된 다음, 직렬로 제2 및 제3 반응기로 전달됨으로써, 보호된 N-기를 탈-보호시키는 작용을 한다. 세척 용매가 제1 반응기에 첨가된 다음 제2로 전달되며, 이와 같은 작업은 수회 반복된다. 마찬가지로, 아미노산 활성화 에스테르 용액이 제1, 제2 및 제3 반응기에 직렬로 첨가됨으로써, 탈-보호된 N-기에 아미노산을 커플링시키는 작용을 한다. 세척 용매가 제1 반응기에 첨가된 다음 제2로 전달되며, 이와 같은 작업은 다음 주기 전에 수회 반복된다. 직렬로의 반응기의 사용은 요구되는 전체적인 용매를 감소시킨다. 고체 상 수지 입자 내에서 이루어지는 반응의 진행 및 정체를 모니터링하기 위하여 온라인 LCMS도 사용된다.

Description

직렬 수지 반응기의 펩티드 합성기

본 개시내용은 합성으로 펩티드를 제조하기 위한 새로운 시스템 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 개시내용은 고체 상 펩티드 합성의 일부로서 펩티드들을 서로 커플링시키기 위한 메커니즘으로 직렬 수지 반응기들을 사용하는 장치에 관한 것이다.

고체 상 펩티드 합성(Solid Phase Peptide Synthesis) ("SPPS")은 폴리펩티드 및 아미노산 서열을 합성하는 데에 가장 흔하게 사용되는 방법 및 시스템이다. SPPS는 고체 지지체에 활성화된 아미노산 (보통 서열의 말단 또는 최종 아미노산임)을 커플링시키는 것을 포함한다. 이와 같은 고체 지지체는 보통 관능화된 (예컨대 NH₂ 기를 사용함) 중합체 수지 비드이다. 상기 말단 아미노산 (일반적으로 그의 NH₂ 말단이 F-moc, BOC 또는 다른 보호 기를 통하여 보호되어 있음)은 수지상의 관능화된 기가 말단 아미노산의 활성화된 COOH 기와 반응하여 그에 결합하도록 수지와 반응한다. 이와 같은 방식으로, 말단 아미노산은 수지에 공유 부착된다.

이후, 다음 단계에서, 말단 아미노산의 NH₂ 말단은 탈-보호됨으로써, 그의 NH₂ 기를 다음 반응에 노출시킨다. 이에 따라, 새로운 아미노산이 도입된다. 이와 같은 새로운 아미노산은 그의 NH₂ 말단이 보호 기 (예컨대 Fmoc, BOC 또는 또 다른 보호 기)를 통하여 보호되어 있다. 따라서, 이와 같은 새로운 아미노산이 첨가되는 경우, 새로운 아미노산으로부터의 활성화 에스테르는 말단 아미노산의 새롭게 탈-보호된 NH₂ 기와 반응함으로써 이들 2개 아미노산을 서로 커플링시킨다. 일단 이와 같은 새로운 아미노산이 커플링되고 나면, 그것 역시 차후에 탈-보호된 후 다음 아미노산과 반응될 수 있는 보호된 NH₂ 기를 가지게 된다. 이와 같이 반복적으로 되풀이되는 과정을 여러 번 실행하는 것에 의해, 전체 아미노산 서열이 구성될 수 있다. 일단 전체 서열이 구성되고 나면, 서열은 수지로부터 탈커플링 (절단)되고 탈보호됨으로써 아미노산 구조를 산출할 수 있다 (아미노산 합성 과정 동안 해당 측쇄가 반응하는 것을 방지하기 위하여 이와 같은 과정을 통하여 첨가되는 다양한 아미노산들의 측쇄 (R₁, R₂ 등)가 BOC, t-부틸 또는 트리틸 등과 같은 기를 통하여 직교 보호될 수 있다는 것을 알아야 함. 또한, 아미노산들 중 1종 이상은 그의 구조의 일부로서 역시 보호되어야 할 수 있는 "측쇄" 또는 다른 기를 가질 수 있음. 그러나, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 그와 같은 측쇄 또는 다른 기가 합성 과정 동안 구성되고, 보호되고, 차후에 탈-보호될 수 있는 방법을 알고 있을 것임).

이와 같은 SPPS 과정이 상업적으로 사용되고 있으며 여전히 펩티드 합성의 표준이기는 하지만, 그것은 고가이며 시간을 소비한다는 결점을 가지고 있다. 첨가되는 각 아미노산은 탈-보호되고 커플링될 수 있어야 하는데, 이는 어렵고, 보통 많은 양의 용매가 사용되는 것으로 이어진다. 문제를 어렵게 만드는 것은 이들 용매 중 많은 것이 환경 친화성이 아니라는 것이다.

따라서, 특히 상업적인 펩티드 제조에서 해당 결점들 중 하나 이상을 해소하게 되는 새로운 SPPS 사용 방법을 찾는다면, 그것은 개선이 될 것이다. 그와 같은 시스템이 더 환경 친화성이며 제조 비용을 감소시킬 수 있다면, 그것 또한 진전이 될 것이다. 사실상, 본 발명의 실시양태는 구체적으로 폐기물의 양, 그리고 사용되는 용매 및 시약들의 양을 감소시키게 된다. 본원에서는, 그와 같은 방법 및 시스템이 개시된다.

[발명의 개요]

본 발명은 SPPS 수지에 부착된 아미노산의 보호된 N-기 (예컨대 NH₂ 말단)에 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 커플링시키기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 일반적으로, 상기 시스템은 직렬로 배열되어 있는 일련의 반응기들을 포함하게 된다. 일부 실시양태에서는, 2개 이상의 반응기가 직렬로 배열된다. 바람직한 실시양태에서는, 3개 이상의 반응기가 직렬로 배열된다.

각 반응기는 소정량의 펩티드 합성 수지에 고정된 보호된 N-기를 함유한다. 이와 같은 보호된 N-기는 아미노산의 NH₂ 기일 수 있거나, 또는 비제한적으로 시에버(Sieber) 아미드 또는 링크(Rink) 아미드 수지와 같은 수지 자체상에서 발견되거나 거기에 공유 부착된 NH₂ 기일 수 있다. 왕(Wang) 수지 또는 CTC (클로로트리틸 클로라이드) 수지와 같은 다른 유형의 수지가 사용될 수도 있다.

방법의 첫 번째 단계는 제1 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하고 이와 같은 시약이 보호된 N-기와 접촉하도록 하는 것을 포함한다. 다음에, 이와 같은 제1 양의 탈-보호 시약은 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달되고, 제2 양의 탈-보호 시약이 제1 반응기로 전달된다. 제1 양의 탈-보호 시약은 제2 반응기로부터 제거되며, 제2 양의 탈-보호 시약은 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달된다. 다음에, 이와 같은 제2 양의 탈-보호 시약은 제2 반응기로부터 제거된다.

제1 및 제2 반응기 둘 다를 제1 및 제2 양의 탈-보호 시약과 접촉시키는 목적은 그렇게 함으로써 이와 같은 탈-보호 시약이 보호된 N-기와 반응하게 되고, 별도 또는 집합적인 것 중 어느 하나로 제1 및 제2 반응기 둘 다 내의 펩티드 합성 수지에 고정된 보호된 N-기를 탈-보호시키는 작용을 하게 된다는 것이다. 이에 따라, 제1 및 제2 양의 탈-보호 시약을 첨가하는 것에 의해, 제1 및 제2 반응기 둘 다 내의 N-기는 탈보호된 후, 또 다른 아미노산에 커플링될 수 있다. 제1 양의 세척액이 제1 반응기에 첨가된 다음, 제2 반응기로 전달되며, 이후 폐기된다. 세척 주기는 수회 반복된다. 용매를 사용한 세척은 환경친화 용매(green solvent) 또는 통상적으로 SPPS에서 사용되는 더 환경 친화적인 용매와 함께 사용될 수 있다. 그와 같은 환경친화 세척 용매에는 본원에서 예시되는 아세토니트릴 (ACN), 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 2-MetHF (2-메틸테트라히드로퓨란, 및 CPME (시클로펜틸 메틸 에테르), 또는 NBP/THF 2/1 v/v와 같은 용매 혼합물이 포함된다. 화학 반응은 역시 환경친화 용매인 ACN, ACN/DMSO 또는 n-부틸피롤리딘온 중에서 이루어질 수도 있다.

따라서, 제1 양의 아미노산 "X" 및 제1 양의 용매가 제1 반응기에 첨가되며, 다음에 특정 시간량 후 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달된다. 반응기에 첨가되는 아미노산 "X"의 양은 실제로는 아미노산 X의 "활성화 에스테르"이며 그에 의해 커플링 반응을 촉진하는 것임을 알아야 한다. 그러나, 단축 표기로서, 그것은 본원에서 단순하게 "소정량의 아미노산 X"를 반응기에 첨가하는 것으로 지칭될 수 있지만, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 그것이 활성화 에스테르라는 것을 알고 있을 것이다. 대안적으로는, 비활성화 아미노산이 반응기에 첨가된 다음, 활성화 용액이 반응에 첨가되어, 아미노산을 활성화 에스테르로 전환시킬 수 있다. 본원에서 사용될 때, 이 역시 아미노산 활성화 에스테르를 수지에 첨가하는 것의 의미에 속한다.

제2 양의 아미노산 "X" 및 제2 양의 용매는 제1 반응기에 첨가된다. 제1 및 제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르는 별도 또는 집합적인 것 중 어느 하나로 아미노산 "X"를 제1 반응기 내의 탈-보호된 N 기에 커플링시킨다 (아미노산 "X" 활성화 에스테르는 사슬에 첨가되기를 원하는 관능화되거나, 유도체화되거나 합성인 아미노산을 포함한 임의의 아미노산일 수 있음) (본원에서 사용될 때, 때로는 아미노산 "X"가 커플링되는 것으로 지칭되기는 하지만, 관련 기술분야 통상의 기술자라면 반응의 용이성을 위하여 가장 자주 사용되는 것은 활성화 에스테르라는 것을 알고 있을 것임).

제1 양의 아미노산 "X" 및 제1 양의 용매는 제2 반응기로부터 제거되며, 제2 양의 아미노산 "X" 및 제2 양의 용매는 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달된다. 다음에, 제2 양의 아미노산 "X" 및 제2 양의 용매는 제2 반응기로부터 제거된다. 제1 및 제2 양의 아미노산 "X"는 별도 또는 집합적인 것 중 어느 하나로 아미노산 "X"를 제2 반응기 내의 탈-보호된 N 기에 커플링시킨다. 제1 양의 용매 세척액이 제1 반응기에 첨가된 다음, 제2 반응기로 전달되며, 이후 폐기된다. 용매 세척 주기는 수회 반복된다. 제2 양의 용매 세척액이 제2 반응기 내의 제1 양의 용매 세척액과 동시에 제1 반응기 내에 존재할 수 있는 등이다. 이에 따라, 이러한 단계들을 수행한 후에는, 아미노산 "X"가 탈-보호된 N-기에 커플링됨으로써 - 아미노산 "X"를 사슬에 첨가하게 된다. 물론, 다른 SPPS 시스템에서와 마찬가지로, 아미노산 "X"는 보호된 NH₂ 기를 함유하고 있으며, 그에 따라 상기 방법은 반복될 수 있다 (예컨대 상기에 개괄된 방식으로 NH₂ 기를 탈-보호시키고 새로운 아미노산을 거기에 커플링시키는 것). 이에 따라, 이와 같은 과정을 반복하는 것에 의해, 원하는 아미노산 서열 및/또는 펩티드가 구성될 수 있다. 일단 합성이 종료되고 나면, 구성된 아미노산은 제1 반응기 및 제2 반응기 둘 다에서 수지로 방출 (탈-커플링)될 수 있다.

상기-언급된 방법이 각각 수지가 공급되어 있는 2개의 직렬인 반응기를 사용하고 있기는 하지만, 역시 소정량의 수지를 함유하는 제3 반응기가 처음 2개의 반응기와 직렬로 배치되는 다른 실시양태가 설계될 수 있다. 이와 같은 실시양태에서, 탈-보호 단계는 제3 반응기에서도 이루어져야 한다. 따라서, 일단 제1 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후, 그것은 제3 반응기에 첨가된다. 이와 같은 제1 양의 탈-보호 시약이 제3 반응기로부터 제거된 다음에는, 제2 양의 탈-보호 작용제가 일단 그것이 제2 반응기로부터 제거된 후, 제3 반응기에 첨가된다. 마찬가지로, 제3 양의 탈-보호 시약이 제1 반응기에 첨가되고, 제2 반응기로 이동된 다음, 제3 반응기로 이동된다. 제1, 제2 및 제3 양의 탈-보호 시약의 목적은 별도 또는 집합적인 것 중 어느 하나로 제3 반응기 내의 펩티드 합성 수지에 고정된 보호된 N-기를 탈-보호시키는 것이다. 동일한 방식으로, 제3 반응기로 가는 제1 양의 아미노산 "X" 및 제1 양의 용매는 제2 반응기로부터 그것이 제거된 후 제3 반응기로 첨가된다. 유사하게, 제3 반응기로 가는 제2 양의 아미노산 "X" 및 제2 양의 용매는 제2 반응기로부터 그것이 제거된 후 제3 반응기로 첨가된다. 제3 양의 아미노산 "X" 및 제3 양의 용매는 제1, 제2 및 제3 반응기를 통하여 순차적으로 순환된다. 제1, 제2 및 제3 양의 아미노산 "X"는 별도 또는 집합적인 것 중 어느 하나로 아미노산 "X"를 제3 반응기 내의 탈-보호된 N 기에 커플링시킨다. 다음에는, 상기한 바와 같은 세척 단계가 수행된다. 이에 따라, 이와 같은 방식으로, 전체 3개 반응기 내에서 반복적으로 아미노산 서열이 구축된 다음 (각 아미노산에 대하여 이들 또는 유사한 단계들을 반복하는 것에 의함), 3개 반응기 각각에서 수지로부터 방출될 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 실시양태는 직렬로 배치되며, 시약이 제1 반응기에 첨가된 다음, 이어서 순차적으로 제2 반응기 및 다음의 제3 반응기 등으로 이동하게 되는 다양한 반응기들을 제공한다. 그와 같은 반응기들을 직렬로 배치하는 것에 의해, 각 반응기는 펩티드 서열을 구성하는 데에 사용되게 되는 SPPS에 사용되게 되는 소정량의 수지를 함유할 수 있다. 또한, 이와 같은 방식으로 반응기들을 배치하는 것에 의해, 더 적은 양의 용매 (세척 재료)를 필요로 하게 된다. 마찬가지로, 더 적은 양의 커플링 시약을 필요로 하게 됨으로써, 더 적은 폐기물, 및 더 큰 효율 및 환경-친화적인 공정으로 이어질 수 있다.

첨부 도면과 함께 취합하여 하기 상세한 설명을 고려하면, 본 개시내용의 특징 및 장점들이 관련 기술분야 통상의 기술자에게 더 분명해지게 될 것이다.
도 1은 본원에서 사용되는 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기에 아미노산 "X"를 커플링시키기 위한 시스템 및 방법의 개략도이고;
도 2는 본원에서 사용되는 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기에 아미노산 "X"를 커플링시키기 위한 시스템 및 방법의 개략도이고;
도 3은 본원에서 사용되는 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기에 아미노산 "X"를 커플링시키기 위한 시스템 및 방법의 개략도이고;
도 4는 도 3의 시스템과 함께 사용되는 온라인 LCMS를 위한 시스템 및 방법의 개략도이고;
도 5는 본 발명 실시양태에서 사용되는 바와 같은 3개 직렬 반응기의 사시도이고;
도 6은 본 발명의 실시양태를 사용하여 제조될 수 있는 펩티드를 나타내고;
도 7은 본 발명의 실시양태를 사용하여 제조될 수 있는 펩티드를 나타낸다.

본 개시내용의 원리에 대한 이해를 촉진할 목적으로, 지금부터 도면에 예시되어 있는 실시양태들을 참조할 것이며, 동일한 것을 기술하는 데에는 특정 언어가 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 의해 의도되는 그의 영역에는 제한이 없다는 것이 이해될 것이다.

지금부터, 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기에 아미노산 "X"를 커플링시키기 위한 시스템 (100)의 개략도인 도 1을 참조한다. 시스템 (100)은 본원에서 개괄되는 방법을 실행하는 것으로써, 펩티드 및/또는 아미노산 서열을 산출하도록 설계된 변형 SPPS 시스템이다. 시스템 (100)은 제1 반응기 (106) 및 제2 반응기 (108)로 도시되는 적어도 2개의 반응기를 포함한다. 이들 반응기 (106) (108)는 직렬로 배열된다. 2개를 초과하는 반응기가 사용될 수도 있다. 실제로, 도 1에 나타낸 시스템 (100)에는, 제3 반응기 (112)도 직렬로 배열되어 있다. 3개를 초과하는 반응기가 사용될 수도 있다.

각 반응기는 소정량의 수지 (116)를 포함한다. 상기 수지는 보호된 N-기 (120) (예컨대 보호된 NH₂) 기를 포함하고 있다. 일부 실시양태에서, 보호된 N-기에 사용되는 이와 같은 보호 기는 Fmoc 기이다. SPPS 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 세이버(Seiber) 및 링크 아미드 수지를 포함하여 수지 (116)로 사용될 수 있는 유형의 수지들에 대해 알고 있을 것이다. SPPS 공정의 일부로서, 보호된 N-기는 "탈-보호"됨으로써 그것이 아미노산과 반응할 수 (그리고 그에 따라 펩티드/아미노산 서열을 구성하는 작용을 할 수) 있어야 한다. 이에 따라, 탈-보호 과정이 이루어진다. 이와 같은 탈-보호는 제1 양의 탈-보호 시약 (126)을 첨가하는 것에 의해 이루어진다 (이와 같은 제1 양의 탈-보호 시약 (126)은 화살표로 그려 표시하였음). 일부 실시양태에서, 상기 탈-보호 시약은 피페리딘일 수 있으나, 다른 재료/시약이 사용될 수도 있다.

제1 양의 탈-보호 시약 (126)은 일정 시간 기간 동안 교반되면서 제1 반응기 (106) 내의 수지 (116)상 보호된 N-기 (120)와 반응되도록 할 수 있다 (관련 기술분야 통상의 기술자라면, 여기에 필요한 정확한 시간 할당분을 결정하는 방법을 알고 있을 것임). 다음에, 제1 양의 탈-보호 시약 (126)은 제1 반응기 (106)로부터 제거되어, 제2 반응기 (108)로 전달된다 (화살표 (128)로 나타낸 바와 같음). 이와 같은 제1 양의 탈-보호 시약 (126)은 일정 시간 기간 동안 교반되면서 제2 반응기 (108) 내의 수지 (116)상 보호된 N-기 (120)와 반응되도록 할 수 있다. 동시에, 제2 양의 탈-보호 시약 (130)이 제1 반응기 (106)에 첨가됨으로써, 유사한 방식으로 반응되도록 한다.

일단 이들 반응이 완료되고 나면 (또는 다른 말로 하면, 할당된 시간이 만료되고 나면), 제1 양의 탈-보호 시약 (126)은 제2 반응기 (108)로부터 제거되어, 제3 반응기 (112)로 전달된다 (화살표 (136)으로 나타낸 바와 같음). 마찬가지로, 제2 양의 탈-보호 시약 (130)은 제1 반응기 (106)로부터 제거되어, 제2 반응기 (108)로 전달된다 (화살표 (140)으로 나타낸 바와 같음). 다음에, 제3 양의 탈-보호 시약 (134)이 제1 반응기 (106)에 첨가된다. 이와 같은 시점에, 제1 반응기 (106), 제2 반응기 (108) 및 제3 반응기 (112)에서의 반응은 계속되도록 허용된다.

제1 반응기 (106), 제2 반응기 (108) 및 제3 반응기 (112)에서의 이들 반응이 종료되고 나면 (또는 다른 말로 하면, 할당된 시간이 만료되고 나면), 제1 양의 탈-보호 시약 (126)은 제3 반응기 (112)로부터 제거된다. 제2 양의 탈-보호 시약 (130)은 제2 반응기 (108)로부터 제거되어, 제3 반응기 (112)로 전달된다 (화살표 (144)로 나타낸 바와 같음). 제3 양의 탈-보호 시약 (134)은 제1 반응기 (106)로부터 제거되어, 제2 반응기 (108)에 첨가될 수 있다 (화살표 (146)으로 나타낸 바와 같음).

일부 실시양태에서, 제3 반응기 (112)로부터 제거된 이와 같은 제1 양의 탈-보호 시약 (126)은 추가적인 반응기로 송부될 수 있다 (실시양태가 추가적인 반응기를 포함하는 경우). 다른 실시양태에서, 이와 같은 제1 양의 탈-보호 시약 (126)은 수집된 후 송부되어 폐기된다. 이는 일단 그것이 제3 반응기 (112)를 통하여 순환되고 나면 제2 및 제3 양의 탈-보호 시약 (130) (134)에 대해서도 이루어지게 된다. 도 1에 나타낸 실시양태를 포함한 다른 실시양태에서, 이와 같은 제1 양의 탈-보호 시약 (126) (및 이어지는 제2 및 제3 탈-보호 시약 (130) (134))은 제1 반응기 (106)로 복귀될 수 있으며 (화살표 (148)로 나타낸 바와 같음), 그에 따라 원하는 대로 추가적인 탈-보호의 반복이 전개될 수 있다 (탈-보호 시약이 제1 반응기로 복귀되는 경우, 이와 같은 과정은 배치 반응과 더 유사해질 것이며, 덜 효율적이 될 가능성이 있게 됨에 유의).

제3 양의 시약 (134)은 제1 반응기 (106)로부터 제거되어, 제2 반응기 (108)로 전달되게 된다. 다음에, 이와 같은 양의 시약 (134)은 본원에서 개괄되는 방식으로 제2 반응기 (108) 및 제3 반응기 (112)를 통하여 순환하게 된다 (하지만, 제3 양의 시약 (134)에 대한 화살표가 제2 반응기 (108)로부터 제3 반응기 (112)로 송부되는 것은 나타내지 않음).

관련 기술분야 통상의 기술자라면, 필요에 따라 각 양의 (그리고 각 반응기 내의) 시약 부피를 일정하거나 거의 일정하게 유지하기 위하여 탈-보호 시약 (126) (130) (134)의 제1, 제2 또는 제3 양 중 어느 하나에 대한 펌핑 보정이 이루어질 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.

관련 기술분야 통상의 기술자에게 쉽게 드러나게 되는 바와 같이, 제1, 제2 및 제3 반응기 (106) (108) (112)에 첨가되는 탈-보호 시약 (126) (130) (134)의 목적은 별도 또는 집합적인 것 중 어느 하나로 펩티드 합성 수지 (116)에 고정된 보호된 N-기 (120)를 탈-보호시키는 작용을 하는 것이다. 본원에서 개괄되는 방식으로 직렬로 순환 통과되는 소정량의 시약을 사용하여 그렇게 직렬로 N-기를 탈-보호시키는 것에 의해, N-기는 또 다른 아미노산에 N-기를 커플링시키는 작용을 하게 되는 커플링 반응의 준비가 될 수 있다 (하기에서 매우 상세하게 기술될 바와 같음).

원할 경우, 수지 (116)에 커플링되어 있는 탈보호된 N-기는 DMF와 같은 용매를 사용하여 "세척"될 수 있다. NBP (N-부틸피롤리딘온), NMP (N-메틸-2-피롤리돈), DMSO, 아세테이트 및 에테르 예컨대 MeTHF (메틸테트라히드로퓨란), 또는 본원에서 예시되는 NBP/THF 2/1 v/v와 같은 용매 혼합물을 포함한 다른 용매가 사용될 수도 있다. 이와 같은 세척은 탈-보호 시약 (126) (130) (134)과 관련하여 상기에서 개괄된 것과 동일한 방식으로 이루어질 수 있다. 다른 말로 하면, 제1 양의 세척 용매가 제1 반응기 (106)에 첨가된 다음, 이어서 제2 및 제3 반응기 (108) (112)를 통하여 순환될 수 있다. 마찬가지로, 제2 및 제3 양의 세척 용매가 반응기 (106) (108) (112)를 통하여 동일하게 순환될 수 있다. 이와 같은 세척 단계는 5, 8 또는 10회의 서로 다른 세척 주기 (매회 동일한 양의 용매 또는 새로운 양의 용매 중 어느 하나가 제1 반응기에 첨가되는 것에 의함)가 존재할 수 있도록 반복될 수 있다 (본원에서 상세하게 기술되지는 않지만, 세척 단계는 중요할 수 있으며, 각 탈보호 및 커플링 단계 후에 수행될 수 있음). 마찬가지로, 반응기에 첨가되는 세척 용매의 각 양이 거의 균일한 것을 보장하기 위하여, 펌프 보정이 사용될 수도 있다.

도 2를 참조하여, 지금부터는 시스템 (100)을 사용한 아미노산의 커플링을 기술할 것이다. 각 수지 (116)는 상기에서 개괄된 바와 같이 탈-보호되어 있다 (그리고 임의적으로 세척되어 있음). 이에 따라, 수지 (116)는 (도 1에 나타내었던 보호된 N-기 (120)가 아닌 다른) 탈보호된 N-기 (120a)를 포함하는 것으로 표시된다.

제1 양의 아미노산 "X" (150)가 제1 반응기 (106)에 첨가된다. 이는 도 2에 화살표로 그려 표시하였다. 도 2에 나타낸 실시양태에서, 제1 양의 아미노산 "X" (150)는 제1 양의 용매 (152)는 물론 제1 양의 다른 시약 (154)과 사전-혼합되어 있다. 더 구체적으로, 제1 양의 아미노산 "X" (150)는 제1 반응기 (106)에의 그의 첨가 전에 다른 시약 (154) 및 용매 (152)와 혼합되어 있다. 다른 실시양태에서는, 제1 양의 아미노산 "X" (150)에 더하여 제1 용매 (152) 및/또는 다른 시약 (154)이 순차적으로 및/또는 동시에 제1 반응기 (106)에 첨가될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 양의 용매 (152)는 DMF일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 다른 시약 (154)은 아미노산 "X" (150) 및/또는 탈보호된 N-기 (120a)를 "활성화"하고/거나 커플링 반응을 촉진하는 작용을 하는 작용제이다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 상기 다른 시약 (154)은 DIC 및 옥시마(oxyma)일 수 있다.

일단 아미노산 "X" (150) (및 제1 양의 용매 (152) 및 다른 시약 (154))가 제1 반응기 (106)에 첨가되고 나면, 커플링 반응이 진행되도록 허용된다. 이와 같은 반응은 탈보호된 N-기 (120a)와 아미노산 "X" 사이에서 이루어진다. 일정 시간 기간 (예를 들면 30분, 또는 관련 기술분야 통상의 기술자라면 계산/결정하는 방법을 이해하고 있을 소정의 다른 설정 시간량) 후, 제1 양의 아미노산 "X" (150)는 제1 반응기 (106)로부터 제거될 수 있다 (화살표 (160)으로 나타낸 바와 같음). 일부 실시양태에서, 이와 같은 제1 양의 아미노산 "X" (150)는 제2 반응기 (108)로 전달될 수 있다. 제1 양의 용매 (152) 및/또는 다른 시약 (154) 역시 제1 반응기 (106)로부터 제거되어 제2 반응기 (108)로 전달될 수 있다.

제2 반응기 (108)에 도달하고 나면, 제1 양의 아미노산 "X" (는 물론, 제1 용매 (152) 및/또는 다른 시약 (154))는 제2 반응기 (108) 내에서 탈보호된 N-기 (120a)와 반응하는 작용을 할 수 있다. 마찬가지로, 제2 양의 아미노산 "X" (170)가 제1 반응기 (106)에 첨가될 수 있다 (역시, 이와 같은 제2 양의 아미노산 "X" (170)는 다른 시약 (154) 및/또는 용매 (152)와 사전-혼합될 수 있음). 일정 시간 기간 (예를 들면 30분) 후, 제1 양의 아미노산 "X" (150)는 제2 반응기 (108)로부터 제거될 수 있다 (화살표 (164)로 나타낸 바와 같음). 이와 같은 제1 양의 아미노산 "X" (150)는 제2 반응기 (108)로부터 제3 반응기 (112)로 전달될 수 있다. 제1 양의 용매 (152) 및/또는 다른 시약 (154)이 사용되는 경우라면, 이들 역시 제2 반응기 (108)로부터 제거되어 제3 반응기 (112)로 전달된다. 제2 양의 아미노산 "X" (170)는 제1 반응기 (106)로부터 제거될 수 있다 (화살표 (174)로 나타낸 바와 같음). 이와 같은 제2 양의 아미노산 "X" (170)는 제1 반응기 (106)로부터 제2 반응기 (108)로 전달될 수 있다.

제3 양의 아미노산 "X" (180)가 제1 반응기 (106)에 첨가될 수 있다 (역시, 제3 양의 아미노산 "X" (180)는 다른 시약 (154) 및/또는 용매 (152)와 사전-혼합될 수 있으며, 제1 양 (150) 및/또는 제2 양 (170)과 동일한 배치의 것일 수 있음). 제1, 제2 및 제3 반응기 (106) (108) (112) 내의 탈보호된 N-기 (120a)가 아미노산 "X"와 반응하여 거기에 커플링하도록 진행되는 반응이 허용된다. 이와 같은 반응이 완료되고 나면, 또는 일정 시간 기간 후, 제1 양의 아미노산 "X"는 제3 반응기 (112)로부터 제거된 후 송부되어 폐기되거나 다시 제1 반응기 (106)로 재순환될 수 있다 (화살표 (188)로 표시되어 있는 바와 같음) (역시, 이와 같은 재순환은 이와 같은 반응을 배치와 더 유사하게 하며, 그에 따라 덜 바람직할 수 있음. 실제로, 배치 양식을 원하는 경우, 반응기들을 병렬로 연계시키는 것이 더 좋을 수 있음). 동일한 방식으로, 제2 양의 아미노산 "X" (170)는 제3 반응기 (112)로 전달될 수 있으며 (그리고 화살표 (166)로 나타낸 바와 같이 반응하도록 허용될 수 있으며), 제1 양의 아미노산 "X" (180)는 제2 반응기 (108)로, 이어서 제3 반응기 (112)로 전달될 수 있다 (그리고 각 반응기 내에서 반응하도록 허용될 수 있음). 이와 같은 반복되는 방식으로, "직렬로" 반응이 이루어지며, 제1, 제2 및 제3 양의 아미노산 "X" (150) (170) (180)는 반응기 (106) (108) (112)를 통하여 순환된다. 이와 같은 방식으로, 소정량의 아미노산 (150) (170) (180)은 별도 또는 집합적인 것 중 어느 하나로 탈보호된 N-기 (120a)와 반응하여 제1, 제2 및 제3 반응기 (106) (108) (112) 내에서 탈-보호된 N 기 (120a)에 아미노산 "X"를 커플링시키는 작용을 한다.

일부 실시양태에서는, 일 반응기로부터 다음 반응기로 그것이 전달되기 (예를 들면, 제1 반응기 (106)로부터 제2 반응기 (108)로, 또는 제2 반응기 (108)로부터 제3 반응기 (112)로 전달되기) 전에 용액을 여과하는 것이 유리할 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 그와 같은 여과가 이루어질 수 있는 방법을 알고 있을 것이다.

본원에서 개괄되는 바와 같이 반응기들을 직렬로 사용하는 것이 탈-보호 및/또는 세척 단계에 사용되는 용매 양의 감소를 제공할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 통상적인 배치 처리가 사용되는 경우, DMF 중 피페리딘의 20 % 용액이 탈-보호 반응에 요구된다. 그와 같은 용액은 10 부피로 분할되고, 각 배치 반응기는 이와 같은 용액과 3회 반응한다. 이는 약 30 L/kg이 각 반응기에 사용되는 것으로 이어지게 된다. 그러나, 본원에서 교시되는 바와 같이 3개 반응기가 직렬로 사용되는 경우, DMF 중 피페리딘의 20 % 용액은 각 반응기 내의 수지 양을 기준으로 여전히 10 부피로 분할되며, 직렬 3개 반응기를 통하여 3회 (반복) 반응한다. 반응기 2 및 3이 배치 이상의 피페리딘 당량 수를 경험하기 위해서는, 10 L/kg의 제4 충전물이 사용될 수 있다. 여기에서, 피페리딘 용액의 전체적인 양은 40/3 = 13.3 L/kg이 되게 되는데, 이는 2.25배 감소가 된다.

과량 아미노산의 수가 더 많고 아미노산 비용이 더 높을수록, 커플링시키는 데에 직렬 반응기를 사용하는 것이 더욱 유리하다. 예를 들면, Lys20 IV 탈커플링 시약은 가격이 약 $20/그램일 수 있으며; 그에 따라 과량 시약의 양 감소는 상당한 비용 절약으로 이어질 수 있다. 그러나, 과량 당량 수가 더 낮을수록, 병렬로 커플링 반응을 진행하는 것이 더 유리한데, 과량 당량의 백분율이 희석 없이 다음 반응기로 수송되는 것을 방지하는 수지 내에서의 반응 용액의 유지 때문이다. 과량 아미노산 당량이 약 2 이하인 경우, 및 그것이 표준의 저렴한 아미노산인 경우라면, 커플링 반응은 병렬로, 그러나 탈보호 및 세척은 직렬로 전개하는 것을 선택하였다.

일부 실시양태에서는, 직렬 반응기 수가 더 많을수록 생성물 킬로그램 당 더 적은 전체 용매 및 시약이 필요하다는 것이 이해되어야 한다. 이는 더 많은 수의 직렬 CSTR (연속 교반-탱크 반응기)가 이상적인 평류(plug flow)에 더 가깝게 된다는 유동 화학 원리와 유사하다. 일부 실시양태에서는, 폐기물 감소와 장비 비용 사이의 절충으로 인하여 직렬 3개의 반응기가 최적일 수 있는 것으로 여겨진다. 다른 말로 하면, 점감하는 반송량(return)이 직렬 3개 초과 내지 5개의 반응기와 조합되는 실시양태가 설계될 수 있다. 세척 종료시의 동일한 최대 잔류 시약 농도를 달성하기 위하여, 3개의 직렬 반응기는 단일 배치 처리 대비 절반으로 용매 요구량을 차감하는 작용을 할 수 있다. 물론, 3개 초과 또는 5개 초과의 반응기가 사용되는 다른 실시양태가 설계될 수도 있다. 2개의 반응기가 직렬로 사용되는 추가적인 실시양태가 설계될 수도 있다.

일부 실시양태에서는, 질량을 기준으로 모든 시약 충전량을 측정하고, (윈도우즈(Windows) 기준 사용자 인터페이스가 아닌) 델타(Delta)V 분배 조절 시스템 (미국 미주리 세인트 루이스 소재 에머슨 컴패니(Emerson company) 사에 의해 제공됨)을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 델타V에서는 문서화 역시 자동으로 수행되고 시스템이 실행 마스터 배치 기록를 생성시킬 수 있기 때문이다. 또한, 델타V 시스템에서는, 대부분의 작동이 원격 접근에 의해 수행되는데, 이는 인터넷을 보유하는 세계 어느 곳에서도 수행될 수 있다. 델타V 시스템은 공정에서 중요한 단계가 이루어질 때, 또는 무언가 주목이 필요할 때 운용자, 화학자, 엔지니어 및 분석자의 휴대 전화로 설명하는 문자 메시지를 송부하도록 설정될 수 있으며, 대부분의 상황에서 그것은 이후 원격으로 조작된다. 가장 많이 시중에서 가용한 실험실 연구 규모 SPPS 기술에서의 일반적인 문제점들 중 하나는 펩티드 구축 동안 소정 시점에 조절 시스템이 붕괴되거나, 충전을 생략하거나 또는 오류-출력하는 것이다. 시약 충전은 그것이 높이 센서를 통하여 수행되기 때문에 생략된다. 반면, 시스템은 모든 시약 충전을 칭량 저울눈으로부터의 질량을 기준으로 수행하도록 설계될 수 있다. 개별 실험은 종종 예를 들어 펩티드가 30개를 초과하는 아미노산을 가지는 경우 1개월을 초과하는 동안 전개할 필요가 있다. 1-개월 실험 종료 부근에서의 아미노산 오충전은 실험이 재개시되어야 하며, 폐기되는 재료들과 함께 1개월 (또는 합성에 요구되었던 다른 시간)이 낭비되었음을 의미한다. 델타V 자동화를 사용하면 그것이 발생할 가능성이 훨씬 덜한데, GMP 제조의 산업 표준이기 때문에, 그것이 더 신뢰성 있고 강력하게 설계되기 때문이다.

다른 실시양태에서는, 그의 온라인 분석으로 인하여, 다른 시중에서 가용한 합성기에 비해 훨씬 더 많은 공정 정보 및 이해를 제공하도록 시스템이 설계될 수 있다. 수지상 펩티드의 온라인 LCMS (액체 크로마토그래피/질량 분광법)는 동시에 모든 병렬 반응기에서 모든 탈보호 및 커플링의 반응 전환율 및 동역학을 정량한다. 공정을 전개하는 동일한 델타V 시스템이 온라인 분석도 전개하기 때문에, 시기조정은 화학적 과정과 통합된다. 이에 따라, 작업자는 향후 처리 결정을 위하여 샘플을 채취하고 분석하기 위해 실험실에 머무를 필요가 없을 수 있다.

온라인 LCMS 시스템을 수득하기 위해서는, 하기의 단계들이 실행될 수 있다:

1. 수지 반응기로부터 1.0 mL의 슬러리를 취출한다.

2. 소형 반응기에서 TFA를 사용하여 즉시 절단한다 (샘플 취출로부터 TFA를 사용한 절단을 개시하기까지의 시간은 약 2분임).

3. 절단된 펩티드 용액을 LC (액체 크로마토그래피) 희석제 중에 희석하고, 혼합한다.

4. 실험실 간에 용액을 수송하고, LC 주입 루프상에 탑재한다 (무-기포).

5. 루프를 스위칭하여 LC상에 샘플을 주입한다.

6. 절단 반응기로부터 폐 수지 비드를 플러싱하여 폐기한다.

7. 용매를 사용하여 샘플 밸브 및 배관을 세척한다.

그러나, 이와 같은 온라인 LCMS를 실행하기 위해서는, 그것이 충전되는 기체를 완전히 무기포가 되도록 하기 위해 유동이 샘플 밸브를 통하여 수직으로 상향 진행해야 한다는 것에 유의해야 한다. 슬러리 샘플을 샘플 루프로부터 배출하고 절단 및 탈보호 구역으로 그것을 송부하도록 전환시키는 데에는 2개의 3-방 밸브가 사용된다. 단일 솔레노이드 송기관이 그들이 정확하게 동시에 전환되도록 두 밸브의 액추에이터에 대하여 티잉(tee)하는데, 이는 모든 샘플에서 정확하게 1 mL의 슬러리를 수득하는 데에 중요할 수 있다. 다음에, 슬러리는 줄곧 샘플 구역을 통과한 후, 샘플 밸브를 지나 오르막 방향으로 계속 진행한다. 이는 반응기의 점도 및 슬러리 밀도가 일 단계에서 다음 단계로 변화하고 밸브 후의 유동 거리가 변화하는 경우에도 샘플 밸브가 대표적인 슬러리 밀도로 충전되도록 하는 중요한 것일 수 있다. 반응기로부터의 슬러리 샘플 튜브는 샘플 밸브까지 줄곧 오르막이다. 이는 역방향으로 반응기로 다시 펌핑될 때 후자의 튜브가 깨끗하도록 하는 중요한 것이다. 그것은 이월을 최소화하고 고체 막힘을 방지한다. 매번 희석 카트가 샘플을 마감한 후 샘플 밸브를 플러싱 아웃(flush out)하는 데에는 용매가 사용된다. 그렇지 않을 경우, 그것은 결국 고체에 의해 막힌다. 용매는 밸브로부터 멀어지는 역방향으로 샘플 밸브와 연동 펌프 사이에 진입한 다음, 밸브를 통하여 순 방향을 가압된다. 용매 슬러그는 매번 수지 고체를 세척하기 위하여 줄곧 절단 구역으로 플러싱된다. 밸브 이후에서는, 슬러리는 오르막 방향으로 계속 유동한다. 이와 같은 오르막 방향의 유동은 샘플 루프에서의 대표적인 샘플 수득을 보장하나 슬러리가 정점을 지나 이동하지 않고 다시 내리막으로 유동하기 시작하기에 충분한 여유가 존재하도록, 충분히 길다. 그러한 경우라면, 이월 문제를 야기하며 또한 수지를 마쇄하여 반응기에서 여과성 문제를 야기할 수 있는 연동 펌프에 그것이 도달하게 된다. 연동 펌프는 샘플 루프로부터 상류 대신 샘플 루프의 내리막 부분 이후에 배치된다. 그것이 샘플 루프로부터 상류인 경우, 그것은 이월 문제를 야기하고 반응기 여과성 문제를 야기하는 수지를 마쇄한다. 몸체에 여분 포트가 용접되어 있는 밸브 (맞춤형일 수 있음)가 사용될 수 있으며, 그에 따라 희석 용매는 바로 볼(ball)의 상부로 진입하여 상향 방향으로 가압되는데, 이는 희석 용매를 절단 용액과 완전히 혼합시키며, 또한 볼의 상부에 고정된 수지 상을 붕괴시킨다.

도 1 및 2를 집합적으로 참조하여, 지금부터 펩티드 서열의 다음 아미노산 첨가가 기술될 것이다. 서열의 이와 같은 다음 아미노산은 "Z"로 지칭될 수 있는데, 그것이 원하는 임의의 아미노산일 수 있다는 것을 의미한다 (사실, 상기에서 주지된 바와 같이, 아미노산 "X" 역시 원하는 임의의 아미노산일 수 있음). 상기에서 개괄된 단계 및 과정들은 아미노산 "X"를 수지에 커플링시키는 작용을 하게 된다 (이에 따라, 아미노산 "X"는 펩티드 서열의 첫 번째 아미노산이 됨). 일단 이와 같은 아미노산 "X"가 수지에 커플링되어 커플링되고 나면, 제1, 제2 및/또는 제3 반응기 (106) (108) (112) 내의 수지는 용매를 사용하여 세척될 수 있다. 이와 같은 용매는 일반적으로 상기에서 개괄된 동일 용매가 된다. 그와 같은 세척은 본원에서 개괄되는 순차적인 (예컨대 직렬) 방식으로 이루어질 수 있다. 이에 따라, 예를 들면 제1 추가량의 용매가 제1 반응기 (106)에 첨가되고, 제1 반응기 (106) 내에서 교반된 다음, 제2 반응기 (108)로 전달될 수 있다 (그리고 제2 반응기 (108)에서 수지를 세척하는 데에 사용된 다음, 제3 반응기 (112)로 전달될 수 있음). 마찬가지로, 일단 제1 추가량의 용매가 제1 반응기 (106)로부터 제거되고 나면, 제2 추가량의 용매가 제1 반응기 (106)에 첨가될 수 있다 (그리고 다른 반응기들을 통하여 순환될 수 있음) (제3 양의 추가적인 용매가 역시 시스템을 통하여 순환될 수도 있음). 다른 말로 하면, 세척 단계는 상기에서 개괄된 시퀀스(sequence) 및 방식으로 진행될 수 있다.

일단 반응기 (106) (108) (112)가 용매를 사용하여 세척되고 나면, 제1 추가량의 탈-보호 시약이 제1 반응기 (106)에 첨가된 다음, (특정 시간 기간 후) 제1 반응기 (106)로부터 전달되어 제2 반응기 (108)에 첨가될 수 있다. 이와 같은 제1 추가량의 탈-보호 시약은 이후 (특정 시간 기간 후) 역시 제2 반응기 (108)로부터 제거된다. 제2 추가량의 탈-보호 시약이 제1 반응기 (106)에 첨가되고, 일정 시간 기간 동안 반응한 다음, 제1 반응기 (106)로부터 제거되어, 제2 반응기 (108)로 전달되고, 거기에서 반응한 다음, 제2 반응기 (108)로부터 제거된다 (그리고 다음에 본원에서 개괄되는 방식으로 제3 반응기 (112)에 첨가됨). 이와 같은 제1 및 제2 추가량의 탈-보호 시약 (및 제3 추가량의 탈-보호 시약)은 별도 또는 집합적인 것 중 어느 하나로 제1 및 제2 반응기 둘 다 내 아미노산 "X"의 보호된 N-기를 탈-보호시키는 작용을 한다.

탈-보호 시약을 사용한 이와 같은 반응 후, 아미노산 "X" (수지에 고정되어 있음)는 원하는 서열 중 다음 아미노산 "Z"에 커플링될 준비가 된다. 이에 따라, 본원에서 개괄되는 방식으로, 하기의 단계들이 이루어지게 된다:

제1 양의 아미노산 "Z"를 제1 반응기 (106)에 첨가하는 단계;

제1 양의 아미노산 "Z"를 제2 반응기 (108)로 전달하는 단계;

제2 양의 아미노산 "Z"를 제1 반응기 (106)에 첨가하며, 여기서 제1 및 제2 양의 아미노산 "Z"는 별도 또는 집합적인 것 중 어느 하나로 제1 반응기 (106) 내 아미노산 "X"의 탈-보호된 N 기에 아미노산 "Z"를 커플링시키는 단계;

제1 양의 아미노산 "Z"를 제2 반응기 (108)로부터 제거하는 단계; 및

제2 양의 아미노산 "Z"를 제1 반응기 (106)로부터 제2 반응기 (108)로 전달하는 단계; 및

제2 양의 아미노산 "Z"를 제2 반응기 (108)로부터 제거하는 단계

(제1 및 제2 양의 아미노산 "Z"가 별도 또는 집합적인 것 중 어느 하나로 제2 반응기 (108) 내 아미노산 "X"의 탈-보호된 N 기에 아미노산 "Z"를 커플링시킴).

관련 기술분야 통상의 기술자라면, 아미노산 "Z"가 이러한 일련의 반응기들 및 시약, 각 아미노산을 순차적으로 첨가하는 것을 사용하여 동일한 방식으로 제3 반응기 (112) 내의 아미노산 "X"와 반응될 수도 있다는 것을 알고 있을 것이다. 이에 따라, 이와 같은 방식으로, 아미노산 서열이 구축된다. 상기 과정은 이후 반복적으로 되풀이되어 SPPS 합성에 알려져 있는 바와 같이 다음 아미노산 및 그 다음 등을 부가한다.

도 3을 참조하면, 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기에 아미노산 "X"를 커플링시키기 위한 시스템 (300)의 또 다른 실시양태의 개략도를 나타내었다. 구체적으로, 시스템 (300)은 소정량의 아미노산을 수용하도록 설계되는 다수의 저장 탱크 (301)를 포함한다. 구체적으로, 펩티드 사슬에 첨가될 각 특정 아미노산은 그의 자체 별도 저장 탱크 (301)를 보유할 수 있다. 또한, 각 탱크 (301)는 저장 탱크 (301)로부터 활성화 반응기 (307)로 아미노산 (용액 중에 용해되어 있을 수 있음)을 펌핑하도록 설계되는 그의 자체 펌프 (303)를 보유할 수 있다. 구체적으로, 펌프 (303)는 라인 (309)를 통하여 라인 (311)로, 그리고 반응기 (307)로 탱크 (301)로부터 아미노산의 용액을 펌핑하게 된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 개별 탱크 (301)로부터 반응기 (307)로의 아미노산 용액의 이와 같은 전달을 수행하기 위하여 이와 같은 배관/관조직 및 펌프 (303)를 연결하는 방법에 대해 알고 있을 것이다. 도 3에는 3개의 서로 다른 아미노산 탱크 (301)만을 나타내었다. 원하는 대로 더 많이 사용될 수 있다.

임의적으로, 라인을 통한 (그리고 반응기 (307)로 가는) 아미노산의 유동을 감지함으로써 양, 유량, 유동 시점 등이 원하는 대로 조정될 수 있도록 하기 위한 하나 이상의 유동 센서 (313)가 라인 (309) 및/또는 펌프 (303)에 커플링될 수 있다. 또한, 펌프를 프라이밍(priming)하기 위하여 공급 용기 (301)로 다시 아미노산의 유동을 분지시키기 위한 밸브 (317)가 사용될 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 밸브 및/또는 불활성화 벤트 시스템 (327)을 사용하는 방법에 대해 알고 있을 것인 바, 원하는 대로 안전을 위한 벤트 (329)는 물론 월류 용기가 포함될 수도 있다.

유사하게, 시스템 (300)은 소정량의 다른 시약, 예컨대 DIC, 옥시마 등 및 기타 세척 용매를 수용하도록 설계되는 다수의 저장 탱크 (353)를 포함한다. 또한, 각 탱크 (353)는 저장 탱크 (353)로부터 활성화 반응기 (307) 또는 필터 반응기 (306) (308) (312) 중 어느 것으로 액체를 펌핑하도록 설계되는 그의 자체 펌프 (355)를 보유할 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 이와 같은 전달을 수행하기 위하여 이와 같은 배관/관조직 및 펌프 (355)를 연결하는 방법에 대해 알고 있을 것이다. 도 3에는 3개의 서로 다른 공급 탱크 (353)만을 나타내었다. 원하는 대로 더 많이 사용될 수 있다.

임의적으로, 라인을 통한 유동을 감지함으로써 양, 유량, 유동 시점 등이 원하는 대로 조정될 수 있도록 하기 위한 하나 이상의 유동 센서 (359)가 펌프 (355)로부터의 라인에 부착될 수 있다. 또한, 펌프를 프라이밍하기 위하여 공급 용기 (353)로 다시 유동을 분지시키기 위한 밸브 (357)가 사용될 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 밸브 및/또는 불활성화 시스템 (363)을 사용하는 방법에 알고 있을 것인 바, 원하는 대로 안전을 위한 벤트 버블러(bubbler) (361)는 물론 월류 용기가 포함될 수도 있다.

상기에서 주지된 바와 같이, 시스템 (300)은 활성화 반응기 (307)를 포함한다. 활성화 반응기 (307)는 일반적으로 제1 반응기 (306), 제2 반응기 (308) 및 제3 반응기 (312)의 상류에 배치된다. 활성화 반응기 (307)는 임의적으로 활성화 반응기 (307) 내의 내용물 (용액)을 혼합하도록 설계되는 교반기 (333)를 포함할 수 있다. 또한, 온도 프로브 (335)가 활성화 반응기 (307)에 부가될 수도 있다. 자켓 (345)과 연관된 순환기 (341)가 (임의적으로) 포함될 수도 있다.

활성화 반응기 (307)는 아미노산 용액을 DIC 및 옥시마와 사전-혼합하는 것에 의해 그것이 아미노산 용액을 "활성화"라도록 설계될 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, DIC 및 옥시마 (및/또는 용매 및 소정의 다른 활성화 작용제 및 염기)의 첨가물이 반응기 (307)에 첨가될 수 있는 방법에 대해 알고 있을 것이다.

시스템 (300)은 또한 탈-보호 시약을 수용하는 탈-보호 용액 용기 (371)를 포함한다 (도 3에 나타낸 실시양태에서, 탈-보호 시약은 피페리딘이지만, 다른 재료가 사용될 수도 있음). 제1 반응기 (306) (진입 라인 (379)를 통함)로 탈-보호 시약 (라인 (367)을 통하여)를 펌핑하기 위해서는, 하나 이상의 밸브 (369) 및 펌프 (365)가 설계될 수 있다. 라인 (367)에는, 임의적으로 완화 밸브 (381)가 부가될 수 있다. 또한, 압력 센서 (385)가 임의적으로 용기 (371) 내에 사용될 수 있다. 임의적으로, 용기 (371)용 벤팅 시스템의 일부로서 추가적인 밸브 (383)가 원하는 대로 사용될 수 있다.

용매 (본 사례에서는 DMF 또는 소정의 다른 용매일 수 있음)용으로 사용되는 저장 용기 (371a)가 시스템 (300)의 일부로서 사용될 수도 있다. 저장 용기 (371a)는 (임의적으로) 용매의 압력을 측정하기 위한 압력 센서 (373)를 포함할 수 있다. 용매 용기 (371a)를 전달하는 데에는 하나 이상의 밸브 (375) 및 펌프 (377)가 사용될 수 있다. 용매는 라인 (381)을 통하여 활성화 반응기 (307), 제1 반응기 (306), 제2 반응기 (308) 또는 제3 반응기 (312)로 전달된다. 라인 (381)을 통한 이와 같은 유동을 측정하기 위해서는 (임의적으로) 유동 센서 (383)가 사용될 수 있다. 임의적으로, 추가적인 벤팅 밸브 (386)가 원하는 대로 사용될 수 있다.

상기한 실시양태들에서와 같이, 제1, 제2 및 제3 반응기 (306) (308) (312)는 거기에 수용되는 소정량의 수지 (예컨대 시에버 수지)를 포함하며, 활성화 반응기 (307) 하류에 직렬로 배열된다. 이들 반응기는 안전성을 목적으로 불활성 헤드공간 계량 질소 공급 (403) 및 하나 이상의 벤팅 월류 용기 (401)를 포함할 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면 알고 있을 바와 같이, 다른 벤트 및/또는 안전성 수단이 설계될 수도 있다.

상기에서 주지된 바와 같이, 제1, 제2 및 제3 반응기 (306) (308) (312)는 물론 활성화 반응기 (307) 각각에 하나 이상의 라인 (381)을 통하여 용매 용액이 연결된다. 하나 이상의 밸브 (405)가 이들 용기 각각으로의 용매의 유동을 조절할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이들 반응기 각각으로의 용매 진입 지점은 용기로의 용매의 효율적인 도입을 가능하게 함은 물론 용매가 용기의 측부 (및 그 위에 배치될 수 있는 임의의 고체)를 "하향 세척"함으로써 적정한 혼합, 및 시약 및 세척 용매에 대한 모든 수지의 노출을 보장하는 것을 가능하게 하는 "분무 볼" 또는 기타 분무 형상부일 수 있다 (실제로, 각 특정 아미노산의 첨가 사이 반응기 (306) (308) (312) 내의 수지가 "세척"될 때에, 일반적으로 이와 같은 방식으로 용매를 사용하여 반응기 (306) (308) (312)를 하향 분무하는 것이 권장될 수 있음).

상기에서 주지된 바와 같이, 활성화 반응기 (307)로부터 유출되는 용액은 유출 저부 포트 및 연결 배관을 통하여 유출된다. 이와 같은 유출 라인의 유동에는 임의적으로 유동 센서 (409), 유동을 조절하는 하나 이상의 밸브 (411)은 물론 펌프 (413)가 존재할 수 있다. 또한, 유출 라인은 용액이 폐기 (419) 또는 제1, 제2 및/또는 제3 반응기 (306) (308) (312)로 향할 수 있도록 라인을 통한 용액의 유동을 선택적으로 조절하는 자동화를 가능하게 하는 하나 이상의 밸브 (415)를 포함할 수 있다 (일반적으로, 시스템 (300)은 제2 및 제3 반응기 (308) (312)가 제1 반응기 (306)와 직렬로 존재함으로써, 유동이 먼저 제1 반응기 (306)로 가나 밸브 (415) (3-방 밸브 (또는 2방 밸브 또는 4-방 밸브 등)일 수 있음)가 사용자가 이와 같은 유동을 조절하고 그렇게 하기를 원하는 경우 그것을 조절하는 것을 가능하게 하도록 전개되게 됨).

이와 같은 시스템 (300)에서 사용되는 제1, 제2 및 제3 반응기 (306) (308) (312)는 상기하였던 것과 유사하고/거나 동일하다. 이들 반응기 (306) (308) (312)는 임의적으로 각각 교반기 (421) 및 온도 센서 (423)를 포함할 수 있다. 반응기인 제1, 제2 및 제3 반응기 (306) (308) (312)는 펩티드를 구축하기 위한 기판으로 작용하게 되는 수지를 포함한다. 이와 같은 수지는 용기 (371)로부터의 탈-보호 시약을 통하여 탈보호된 다음 활성화된 아미노산 용액 (반응기 (307) 내에서 활성화됨)과 반응됨으로써 이와 같은 아미노산을 서열/수지에 커플링시킬 수 있는 (SPPS 기술을 사용함) 보호된 N-기를 포함하게 된다. 그와 같은 단계들을 순차적으로 수행하는 것에 의해, 원하는 대로 탱크 (301)로부터의 서로 다른 아미노산들이 첨가될 수 있다.

상기한 바와 같이, 제1 반응기 (306), 제2 반응기 (308) 및 제3 반응기 (312)는 직렬로 배치될 수 있다. 이에 따라, 제1 양의 활성화된 아미노산은 제1 반응기 (306)에서 반응한 다음, 그 양이 상기에서 개괄된 방식으로 순차적으로 제2 및 제3 반응기 (308) (312)로 송부된다 (그리고 새로운 양의 활성화된 용액이 제1 반응기 (306)로 첨가됨). 이와 같은 유동을 촉진하기 위하여, 각 반응기 (306) (308) (312)는 고체 펩티드 수지 비드 및/또는 고체 형성 펩티드가 반응기 (306) (308) (312) 내에 잔존하는 것을 확실히 하기 위한 필터 (427)를 포함할 수 있다. 임의적으로 및/또는 필요에 따라, 제1, 제2 및 제3 반응기 (306) (308) (312) 사이의 이와 같은 "직렬" 유동을 안내하기 위하여 유동 센서 (433), 밸브 (437) 및 펌프 (435)가 사용될 수 있다. 마찬가지로, 시스템 (300)을 통하여 유동되는 것을 샘플링함으로써 그것이 올바르게 작동하고 있는지를 확실히 하거나 폐기물 스트림을 점검하여 세척이 충분한 시간을 결정하기 위하여, 시스템 전체에 걸쳐 어느 곳에나 샘플링 장치 (441) (또는 원하는 대로 다수의 샘플링 장치 (441))가 배치될 수 있다.

도 3의 실시양태에서, 밸브 (437)는 제1, 제2 및 제3 반응기 (306) (308) (312)의 출력물이 순차적으로 직렬로 유동할 수 있고/거나 폐기 (419)로 진행할 수 있도록 설계될 수 있다는 것을 알아야 한다. 이는 자동화기구가 원하는 유동을 조절할 수 있도록 수행된다. 또한, 도 3에서, 제3 반응기 (312)로부터의 출력물 라인은 폐기 (419)로 진행하는 것으로 나타내었다. 상기에서 주지된 바와 같이, 실시양태는 반응기 (306) (308) (312) 및/또는 활성화 반응기 (307)가 용매를 사용하여 세척될 때 용매가 재-사용 (및 다시 반응기로 송부)됨으로써 시스템을 더 환경-친화적으로 만들도록 설계될 수 있다. 마찬가지로, 활성화된 아미노산 용액은 제1, 제2 및 제3 반응기 (306) (308) (312)를 통하여 유동된 다음, 다시 반응을 수행하는 수단으로서 동일한 반응기들 (및/또는 활성화 반응기 (307))을 통하여 다시 뒤로 (원하는 대로 여러번) 재순환될 수 있다 (그러나, 이를 원할 경우, 반응은 병렬로 전개하는 것이 더 우수함). 예를 들어, 각 특정 아미노산의 첨가 사이에 수지가 "세척"되는 경우, 보통 이와 같은 세척은 10개의 서로 다른 세척 단계로 이루어진다. 그것이 이루어지는 경우, 처음 2 내지 8회에서, 세척은 전-사용 용매를 사용하여 이루어질 수 있는데, 이와 같은 용매가 불순물을 보유할 수 있기는 하지만, 순수한 용매를 사용한 나중의 세척 (2 내지 8회 세척)이 후속하는 첫 번째 세척 배치로는 그것이 충분히 "깨끗"하기 때문이다. 나중 2 내지 8회 세척으로부터의 세척 용매는 다음 주기의 처음 2 내지 8회 세척에 사용될 재순환 용기에 수집된다. 이와 같은 방식으로, 전체적인 세척 과정 동안 사용되는 용매의 양은 감소된다.

도 4를 참조하면, 도 1-3의 실시양태와 연계하여 사용될 수 있는 온라인 LCMS 시스템인 시스템 (500)이 나타나 있다. 구체적으로, 시스템 (500)은 상기에서 개괄된 반응기에서 용액 및 고체 상 수지 결합 펩티드 샘플의 측정을 수행함으로써 시스템에서 무엇이 이루어지고 있는지에 관한 운용자 실-시간 정보를 제공하도록 설계된다.

시스템 (500)은 절단 용액 탱크 (503)를 포함한다. 많은 실시양태에서, 이와 같은 절단 용액은 수지로부터의 형성된 펩티드를 절단하도록 (그리고 그에 따라 수지로부터의 형성된 펩티드를 회수하도록) 설계되는 TFA이다. TFA는 커플링 반응을 급랭하는 작용을 할 수도 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 밸브 (518p) (518q) (518s)는 시스템으로의 TFA 용액 (또는 절단 용액)의 유동을 조절하는 작용을 한다. 월류 용기 (509)와 함께 라인 (508)을 포함하는 절단 월류 구역 (507) 및 (질소 공급 (522)에 연결된 밸브 (518r)과 함께) 측정 구역 (511)이 존재할 수도 있다. 이와 같은 시스템 (507)은 원하는 양의 TFA를 측정하고 모든 과량은 다시 저장 용기 (503)로 복귀시키도록 설계된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, TFA 용액의 유동을 조절하기 위하여 이러한 안전성 형상부 및/또는 유동 형상부를 실행하는 방법에 대해 알고 있을 것이다. 이는 하나 이상의 밸브 (518)를 사용하는 것을 포함할 수 있다.

시스템 (500)은 또한 혼합 포트 (510) (500 mL 용기일 수 있음)를 포함한다. 혼합 포트 (510)는 밸브 (518a)에 의해 조절되는 용매 라인 (512)로부터 반응기 용매 (DMF일 수 있음)로부터의 슬러리 샘플을 수용할 수 있다. 이러한 라인 (512)은 (밸브 (518b) 및 (518a)와 함께) 슬러리가 반응기로부터 회수되는 것을 가능하게 한다 (그것이 상기에서 기술된 활성화 반응기인지, 또는 제1, 제2 또는 제3 반응기인지에 관계없음). 라인 (512)는 1/8^th 인치의 내부 직경 및 ¼ 인치의 외부 직경을 가질 수 있다. 라인 (512) 및 밸브 (518a) (518b)는 또한 기체 (질소 공급 (522)로부터의 것)가 시스템은 물론 "펌프 주변" 루프로 첨가되는 것을 가능하게 한다. 밸브 (518a)는 또한 재료가 반응기 복귀 (524)로, 그리고 반응기 (525)로부터 유동하는 것을 가능하게 한다. 밸브 (518b)는 DMF (용매)가 원하는 대로 헤더(header) (526)로부터 수득되는 것을 가능하게 한다. 라인 (512)의 목적은 반응 슬러리의 샘플 (예를 들면 1 mL)을 수득함으로써 그것이 포트 (510)에 첨가될 수 있도록 하는 것이다. 밸브들은 재료가 반응기 (525)로부터 유출 됨으로써 (그리고 필요할 경우 상향 유동함으로써) 슬러리가 펌프에 도달하지 않아 수지 비드의 마쇄를 방지하는 것을 보장하는 데에 사용될 수 있다. 이에 따라, 밸브를 전환시키고 질소를 사용하는 것에 의해, 펌프에서의 수지 마쇄 없이, 슬러리가 추출될 수 있으며, 나머지는 역으로 펌핑하는 것에 의해 반응기 (525)로 복귀될 수 있다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 그렇게 하는 방법에 대해 알고 있을 것이다.

슬러리 샘플 이외에, 혼합 포트 (510)으로 가는 또 다른 공급물은 필요에 따라 1 mL 샘플을 희석하는 용매 또는 다른 재료를 첨가하게 되는 희석제 공급 (520)으로부터의 것이다. 이와 같은 희석제 공급 (520)은 라인 (528)을 통하여 혼합 포트에 연결된다. 희석제 월류 시스템 (527)이 사용될 수도 있다. 이와 같은 시스템 (527)은 또한 월류 용기 (529)와 함께 라인 (528)을 포함하는 희석제 월류 구역 (529) 및 (질소에 연결되는 밸브 (518e) 및 (518l)과 함께인) 측정 구역 (521)을 포함할 수 있다. 밸브 (518h)는 월류 용기 (529)로의 유동을 조절한다. 이와 같은 희석제 월류 시스템 (527)은 원하는 양의 희석제를 측정하여 모든 과량을 다시 저장 용기 (520)로 복귀시키도록 설계된다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 이러한 안전성 형상부를 실행함은 물론 희석제 용액의 유동을 조절하는 방법에 대해 알고 있을 것이다.

일단 혼합 포트 (510)에 도달하고 나면, 절단되고 희석된 샘플은 라인 (540)을 통하여 밸브 (518m)으로 유동하게 된다. 이와 같은 라인 (540)은 분석을 위하여 재료 (일반적으로 수지로부터 절단된 펩티드 또는 성장하는 아미노산 서열임)를 HPLC (544)로 전달한다. 저장 포트 (541) (300 mL 용기일 수 있음)는 중력에 의해 액체로부터 기포를 분리하고 필요에 따라 샘플을 저장하기 위하여 HPLC의 상류에서 사용될 수 있다.

혼합 포트 (510)는 원하는 대로 혼합 포트 (510)를 벤팅하기 위한 라인 (550) (및 밸브 (518j))에 커플링될 수 있다. 압력 또는 온도 센서 (또는 다른 센서)와 같은 센서 (551)는 이와 같은 라인의 (또는 시스템 (500)의 다른 위치에 배치되는 경우 일반적으로 시스템의) 상태를 측정할 수 있다. 압력 센서 (551)는 언제 다음 단계로 진행할지에 대한 표시로서 자동화된 시퀀스로 사용된다.

일반적으로, 펩티드의 탈보호를 위한 시간을 허용하는 혼합 포트 (510)에서의 혼합 30분 후 (및 희석 후), 재료는 라인 (555)를 통하여 혼합 포트 (510)로부터 추출되어 밸브 (518k) 또는 그 부근에서 고정되도록 허용될 수 있다. 일단 이와 같은 밸브 (518k)가 개방되고 나면, 액체 및/또는 폐 수지 비드는 라인 (555)를 통하여 폐기 (546)로 유동할 수 있다. 라인 (555)에 있을 수 있는 임의의 TFA를 세척하는 안전성 메커니즘으로는 가성 발포기 (557)가 사용될 수 있다. 필요에 따라, 이와 같은 세척을 촉진하기 위하여, 질소 또는 다른 기체가 라인 (561) 및 밸브 (562)을 통해 폐기 (546)에 첨가될 수 있다. 녹아웃(knockout) 포트 (569)와 같은 다른 안전성 형상부가 부가될 수도 있다. 녹아웃 포트 (569)는 발포기 액체가 다시 시스템으로 흡인될 수 없도록 설계된다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 이와 같은 녹아웃 포트 (569)는 라인 (580)을 통하여 (569), (546) 및 (557)을 불활성으로 유지하기 위해 질소 또는 다른 기체를 공급하는 질소 공급 (581)에 연결될 수도 있다.

관련 기술분야 통상의 기술자라면, 도 4에 개괄된 시스템 (500)을 사용하여 얼마나 자주 반응기로부터의 샘플링이 샘플링되어야 하는지에 대해 알고 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 커플링 반응이 계속되는 동안, 샘플링은 규칙적인 간격으로, 예컨대 45분마다 이루어질 수 있다. 다른 상황에서, 샘플링은 다른 간격으로, 예컨대 60분마다 또는 세척 단계 동안 이루어질 수 있다. 물론, 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 다른 샘플링 빈도가 설계될 수도 있다.

다른 실시양태에서, 활성화 반응기로부터의 샘플링은 활성화 반응기의 내용물이 제1 반응기에 첨가되기 전에 자동으로 이루어질 수 있다. 그 이유는 활성화 반응기에 첨가된 (그리고 이어서 제1, 제2 및 제3 반응기에 첨가될) 아미노산이 원하는 아미노산 - 예컨대 서열의 다음 아미노산인지를 확인하기 위한 것이다. 그 이유는 예를 들어 25개의 아미노산이 이미 서로 반응하였고 "잘못된" 아미노산이 첨가된 경우라면, 전체 펩티드 서열이 잘못되게 되고 펩티드의 합성이 무에서부터 (시작부터) 다시 시작해야 되기 때문이다. 이에 따라, 이와 같은 오류를 방지하기 위하여, 아미노산은 그것이 커플링 반응에 투입되기 전에 자동으로 샘플링됨으로써, "잘못된" 아미노산이 첨가되게 될 가능성을 최소화하게 된다.

이제 도 5를 참조하면, 도 1에 나타낸 반응기 (106) (108) (112)의 사시도가 예시되어 있다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 수지 (120)은 다공성이며, 그에 따라 (본원에서 개괄되는 바와 같은) 활성화 에스테르 용액 중 일부가 세공 내에 흡수되어 본원에서 개괄되는 바와 같이 반응을 계속할 수 있다.

본 발명 실시양태의 다른 측면은 온라인 LCMS 시스템이 제1 반응기와 함께 사용될 수 있다는 것이다. 이는 본원에서 개괄되는 유형 직렬-반응기 시스템의 제1 반응기와 함께 사용되는, 본원에서 기술되는 온라인 LCMS 시스템일 수 있다. 일부 실시양태에서는 배치 반응기일 수 있는 단일 반응기와 함께 온라인 LCMS 시스템이 사용되는 다른 실시양태가 설계될 수도 있다. LCMS 시스템의 장점은 반응 동안의 다양한 시점에 (예컨대 반응의 개시, 중간 및/또는 종료시에) 정확한 샘플 (예컨대 1 mL)이 자동으로 추출될 수 있다는 것이다. 사용자는 언제 샘플이 자동으로 추출될지를 프로그래밍할 수도 있다. 추출되는 샘플은 반응이 어떻게 진행되고 있는지 및 반응이 완료되었는지를 시험하는 데에 사용될 수 있다. 이와 같은 샘플링은 활성화, 반응 단계 동안 및/또는 세척 단계(들) 동안 이루어질 수 있다. 이와 같은 LCMS를 사용하는 것에 의해, (펩티드 커플링의 진행을 모니터링하는 데에 통상적으로 사용되는) 카이저(Kaiser) 시험이 필요없을 수 (그에 따라 비용 및 시간을 절약할 수) 있다. 샘플링은 또한 생산 규모에서 특히 가치있을 수 있는 반응의 실-시간 모니터링을 제공할 수 있다. 현재 샘플러들 (예컨대 메틀러 톨레도(Mettler Toledo) 샘플러)이 존재하기는 하지만, 이와 같은 장비는 SPPS 반응기에서는 사용되지 않으며, 절단 및 탈보호, 희석, 혼합, 폐 수지 비드로부터의 분리, LCMS로의 수송, 및 LCMS 전환 루프에의 탑재를 위한 장치 및 방법은 포함하고 있지 않다. 도 4에 나타낸 온라인 LCMS 시스템의 자동화된 시퀀스의 상세한 절차는 하기와 같다:

펩티드 합성의 연동 샘플링을 위한 카트(Cart) 491 시퀀스

업데이트: 2020년 12월 15일

벤팅 다운(venting down)에 의해 개시 밸브 개방:

(618A), (518k) 개방 [618A, 518k]

사용자 입력 시간 "Vent PSI Read Dly" 대기

PT < "Vent Low"까지 대기

(618A), (518k) 폐쇄 [ ]

샘플링

밸브 (518j) 개방 [518j]

샘플 연동 펌프를 "forward"로 개시할 것을 명령

사용자 입력 시간 "Pump1 Time1" 대기

샘플 연동 펌프를 정지할 것을 명령

밸브 (518a) (샘플로 가는 3-방 밸브) 작동 [518a, 518j]

"AB open time" 대기

밸브 A 작동-중지 (반응기/레이스트랙으로 가는 복귀 3-방) [518j]

샘플 연동 펌프를 "backward"로 방향 전환할 것을 명령

사용자 입력 시간 "Pump1 CCW time" 대기

샘플 연동 펌프를 정지할 것을 명령

절단 용액 첨가

(518r), (518s) 개방 [518j, 518r, 518s]

절단 용액 병의 압력을 상승시키기 위하여 5초 대기

(518r), (518s) 폐쇄 [518j]

(518q) 개방 [518j, 518q]

절단 용액 측정 구역을 벤팅하기 위하여 5초 대기

(518q) 폐쇄 [518j]

(518p) 개방 [518j, 518p]

사용자 입력 시간 "P Open Time" 대기

(518p) 폐쇄 [518j]

(518r), (518s) 개방 [518j, 518r, 518s]

사용자 입력 시간 "S Open time" 대기

(518s) 폐쇄 [518j, 518r]

(518q) 개방 [518j, 518q, 518r]

사용자 입력 시간 "Q Open time" 대기

(518r), (518q) 폐쇄 [518j]

탈보호

"Deprotect Time" 대기

대기중

모든 "Mix Delay Time" (사용자 입력 파라미터)

밸브 L, (618A) 개방 [518j, L, 618A]

"Mixing Time" (사용자 입력 파라미터) 대기

밸브 L, (618A) 폐쇄 [518j]

밸브 (518j) 폐쇄 [ ]

희석제 측정

G 개방 [G]

사용자 입력 시간 "G Open Time" 대기

G 폐쇄 [ ]

(518e), (518h) 개방 [518e, 518h]

사용자 입력 시간 "DEH Open Time" 대기

(518h) 폐쇄 [518e]

혼합 포트의 압력을 상승시키기 위하여 (518r), (518q) 개방 [518e, 518q, 518r]

PT > Mix Pot Close까지 대기

(518r), (518q) 폐쇄 [518e]

(M1), (M2) 개방 [518e, M1, M2]

PT < LVS Empty / M2 Cls까지 대기

(M1) (M2) 폐쇄 [518e]

절단된 샘플과 희석제를 혼합

밸브 (618a) 개방 [518e, 618a]

PT > 사용자 입력 설정점 "Mix Pot Close"까지 대기

밸브 (618a) 폐쇄 [518e]

고정

사용자 입력 "settling time" 대기

HPLC로 전달

밸브 (M1) 개방 [518e, M1]

PT < "M1 Close PSI"까지 대기

밸브 (M1) 폐쇄 [518e]

혼합 포트로부터 나머지 슬러리 비움

(618a) 개방 [518e, 618a]

PT > 사용자 입력 설정점 "Mix Pot Close"까지 대기

(618a) 폐쇄 [518e]

(518k) 개방 [518e, 518k]

PT 판독치 < "Vent Low"까지 대기

(518k) 폐쇄 [518e]

아길렌트(Agilent)의 경우:

HPLC상에 샘플 탑재

(618a) 개방 [518e, 618a]

PT > 사용자 입력 설정점 "mix pressure" (상기와 동일한 설정점)까지 대기

(M1) 개방 [518e, 618A, M1]

"M3 Open Delay" 대기

(M3) 개방 [518e, 618A, M1,M3]

"M3 Open Time" 대기

(M3), (618a), (518e), (M1) 폐쇄 [ ]

샘플을 채취하도록 HPLC에 신호

벤팅

(618a), (518q), (518k) 개방 [618a, 518k, 518q]

사용자 입력 "Vent PSI Read Dly" 대기

PT 판독치 < "Vent Low"까지 대기

(518q), (618a), (518k) [ ]

다음 샘플링 명령까지 대기

펌프 세척

샘플의 최종 커플링 또는 탈보호 후 수행

밸브 (518a) (혼합 포트로 향하는 3-방 밸브) 작동 [518a]

밸브 (518b) 개방 (DMF) [518a, 518b]

샘플 연동 펌프를 사용자 입력 시간 동안 "forward"로 전개할 것을 명령

샘플 연동 펌프를 정지할 것을 명령

밸브 (518b) 폐쇄 [518a]

밸브 (518a) 작동-중지 (반응기/레이스트랙으로 가는 복귀 3-방) [ ]

밸브 세척:

샘플 연동 펌프를 1초 동안 "reverse"로 전개할 것을 명령

샘플 연동 펌프를 정지할 것을 명령

밸브 (518a) (혼합 포트로 향하는 3-방 밸브) 작동 [518a]

(518k) 밸브 개방 [518a, 518k]

5초 대기

(518k) 밸브 폐쇄 [518a]

밸브 세척 3회 반복

샘플 연동 펌프를 사용자 입력 시간 동안 "reverse"로 전개할 것을 명령

샘플 연동 펌프를 정지할 것을 명령

[ 실시예 ]

실시예 1

고체 상 펩티드 합성 (SPPS)에 의한 티르제파티드의 구성

티르제파티드 (도 6)는 선형 고체 상 펩티드 합성 (SPPS)에 의해 그의 합성이 수행되는 39개 아미노산의 백본(backbone)을 함유한다. 티르제파티드 합성은 먼저 하기에서 기술되는 바와 같은 직렬-반응기 방법을 사용하여 도 7에 나타낸 바와 같은 39-량체 백본 중간물을 구성하는 것에 의해 진행된다. 티르제파티드 합성 과정 동안, 39-량체 백본 중간물 (도 7)은 세린-39에 커플링된 -NH₂ 기를 통하여 고체 지지체 (본원에서 기술되는 바와 같은 시에버 수지)에 커플링된다는 것을 주지하라.

표 1은 39개 아미노산 각각이 티르제파티드 백본의 구성에 사용되는 순서를 열거한다. 예를 들면, 세린은 백본 합성에 사용되는 첫 번째 아미노산으로써, 티르제파티드의 위치 39에 존재하는 아미노산이다. Ser39로부터 Aib2까지 선형 SSPS에 사용되는 각 아미노산의 질소는 α-질소상에서 t-부틸옥시카르보닐 (Boc)에 의해 보호되는 Tyr1 이외에는 α-질소상에서 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 기에 의해 보호된다. 표 1에 표시되어 있는 바와 같은 측쇄 보호 기의 경우, 산소는 tert-부틸 (tBu)에 의해 보호되며, 질소는 트리틸 (Trt), 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥스-1-일리덴)-3-메틸부틸 (ivDde) 또는 Boc에 의해 보호된다.

직렬-반응기 방법

하기와 같이 DMF 중 피페리딘의 20 vol% 용액을 제조한다: DMF의 첨가에 의해 피페리딘 (800 mL)을 4.0 L의 부피까지 희석함으로써, 부피 기준 20 % 용액을 수득한다.

하기와 같이 DMF 중 옥시마의 0.68 M 용액을 제조한다: 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트 (옥시마, 386.85 g, 2.722 mol)를 4.0 L의 부피까지 DMF 중에 용해시킴으로서 0.68 M 용액을 수득한 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 DMF 중 DIC의 0.60 M 용액을 제조한다: N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (340.8 g, 2.700 mol)를 4.5 L의 부피까지 DMF 중에 용해시킴으로써 0.60 M 용액을 수득한 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 DMF 중 세린의 0.375 M 용액을 제조한다: FMOC-Ser(tBu)-OH (431.3 g, 1.318 mol)를 3.0 L의 부피까지 DMF를 사용하여 DMF 중에 용해시키고, 진탕하여 용해시킨 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다. 유사한 방식으로, 표 1에 나타낸 아미노산 각각의 0.375 M 용액을 제조한다.

하기와 같이 반응 시스템을 준비한다: 용액이 펌핑 유출될 때 고체 수지를 유지하기 위한 필터 스크린이 구비된 3개의 동일-크기 반응기들을 설비한다. 반응기들을 "RB1", "RB2" 및 "RB3"로 표지하고, 반응기들 사이에 동일하게 분할된 시에버 수지 (500 g, 0.70 mmol/g, 350 mmol)를 첨가한다. 1500 mL의 DMF를 각 반응기에 첨가하고, 실온에서 24시간 동안 교반함으로써 수지를 팽창시킨다.

일반적인 절차 A - F- moc 탈보호 및 DMF 세척 과정: RB1에 피페리딘의 용액 (DMF 중 20 vol%, 1365 mL)을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반한다. RB1으로부터 RB2로 피페리딘 용액을 펌핑한 다음, RB1에 피페리딘 용액의 또 다른 부분 (DMF 중 20 vol%, 1386 mL)을 충전하고, 반응기 RB1 및 RB2를 30분 동안 교반한다. 교반 시간 종료시, RB2로부터 RB3로 피페리딘 용액을 펌핑하고, RB1으로부터 RB2로 피페리딘 용액을 펌핑한 다음, RB1에 피페리딘 용액의 또 다른 부분 (DMF 중 20 vol%, 1407 mL)을 충전한다. 전체 3개 반응기를 실온에서 30분 동안 교반한다. RB3로부터 폐기로 피페리딘 용액을 펌핑한 다음, RB2로부터 RB3로 피페리딘 용액을 펌핑하고, 이어서 RB1으로부터 RB2로 피페리딘 용액을 펌핑한다. 실온에서 30분 동안 RB2 및 RB3를 교반한다. RB3로부터 폐기로 피페리딘 용액을 펌핑한 다음, RB2로부터 RB3로 피페리딘 용액을 펌핑한다. RB3를 실온에서 30분 동안 교반한 다음, RB3로부터 폐기로 피페리딘 용액을 펌핑한다. 이와 같은 방식으로, 피페리딘 용액은 직렬 3개 반응기를 통하여 3회 펌핑되었으며, 매번 각 회에 30분 교반하였다.

전체 3개 반응기 및 폐기물 수집을 통하여 전체 3개 피페리딘 용액 분취물을 교반한 후, DMF (1218 mL)를 RB1에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 교반한다. 다음에, RB1으로부터 RB2로 용매를 펌핑하고, DMF (1208 mL)를 RB1에 첨가한다. 실온에서 5분 동안 두 용기를 교반한다. RB2로부터 RB3로, 그리고 RB1으로부터 RB2로 용매를 펌핑한다. DMF (1758 mL)를 RB1에 첨가하고, 전체 3개 용기를 실온에서 5분 동안 교반한다. 반응기 당 총 8회 세척 동안 총 12.66 L (11.95 kg)의 DMF를 사용하여, DMF 용매의 할당량이 직렬 3개 반응기를 통하여 펌핑될 때까지 이와 같은 동일 절차를 반복한다 (매번 RB3로부터 폐기로 DMF 용매를 펌핑). 평균 DMF 세척 부피는 1580 mL이다. 목표 세척 부피는 세척 당 1400 mL이며, 그에 따라 이어지는 펩티드 합성 중 아미노산에서는, 차후의 충전이 1400 mL에 더 가깝게 되도록 펌프 및 공급 탱크 압력을 조정한다.

일반적인 절차 B - 아미노산 활성화 및 커플링 과정: "RA"로 표지된 자켓이 구비된 반응기에, 세린 용액 (DMF 중 0.375 M, 774 g), 옥시마 용액 (DMF 중 0.68 M, 422 g), 및 이후 DIC 용액 (DMF 중 0.60 M, 506 g)을 첨가한다. 15 ℃에서 30분 동안 용액을 교반함으로써 활성화된 세린 용액을 수득한 다음, 이와 같은 용액을 RB1에 첨가한다. 이와 같은 과정을 반복하여 반응기 RA 내에서 활성화된 세린 용액을 제조하고, 그것을 RB2에 첨가한 다음, 다시 과정을 반복하고, 활성화된 세린 용액을 RB3에 첨가한다. 3개 반응기 각각은 커플링 반응 동안 약 2200-2300 mL의 총 슬러리 부피를 가지는데, 이는 활성화 에스테르 용액 더하기 팽창된 수지의 부피와 같다. 반응기 RB1, RB2 및 RB3를 실온에서 8시간 동안 교반한 다음, 전체 3개 반응기로부터 용매를 배수한다.

일반적인 절차 A의 각 반응기 당 총 7회 세척에 대한 것과 유사한 방식으로 직렬로 DMF 용매를 사용하여 반응기 RA, RB1, RB2 및 RB3를 세척한다. 처음 3회 세척은 그것이 RB1으로 펌핑되기 전에 RA의 분무 볼로 펌핑한다. 이에 따라, 처음 3회 세척은 직렬로 RA, RB1, RB2 및 RB3를 통과한다. 그러나, RA로부터의 각 세척액을 펌핑할 때에는, 용매 린스의 소량 부분이 RA로부터 RB3 (~30 mL)로 펌핑된 다음, 용매 린스의 소량 부분이 RA로부터 RB2 (~30 mL)로 펌핑되고, 이후 대부분의 용매가 RB1 (~1340 mL)로 펌핑된 후, 이어서 RA와 RB3 사이의 튜브를 펌핑하여 세척하고, RA와 R2 사이의 튜브를 펌핑하여 세척한다. 이는 RA와 각 수지 반응기 사이의 전달 배관 및 밸브들을 플러싱하여 씻어낸다. 다음에, 제4 내지 제7 세척의 경우, DMF 용매의 소량 부분이 RB3의 분무 볼 내로 통과하여 펌핑된 다음 (100 mL), DMF 용매의 소량 부분이 RB2의 분무 볼 내로 통과하여 펌핑되고 (100 mL), 이후 1400 mL의 DMF 용매가 RB1의 분무 볼 내로 통과하여 펌핑되었다. 목적은 각 반응기의 벽으로부터 고체 수지 입자를 하향 세정하는 것이다. 커플링 후 세척에 사용되는 용매의 총량은 10.69 L (10.09 kg)이다. 39량체 펩티드 백본 합성의 후기 아미노산들의 경우, 분무 볼을 통하여 RB2 및 RB3로 분무되는 DMF의 양은 ~50 mL까지 감소된다.

표 1에 열거된 각 아미노산의 경우, 프롤린 38로부터 Boc-티로신 1까지는 일반적인 절차 A를 사용하여 이전에 커플링된 아미노산의 Fmoc 탈보호를 수행한 후, 이어서 일반적인 절차 B를 사용한 커플링을 수행한다. 세린 39는 물론 다음 38 아미노산의 커플링에는, 표 2에 열거된 화학량론에 의한 일반적인 절차 B를 사용한다. 표 2에 표시되어 있는 바와 같이, 추가적인 활성화 에스테르를 제조하고, 일반적인 절차 B에 따라 표 2에서 제시된 화학량론으로 리커플링시킨다. >99 %의 전환율이 달성될 때까지 커플링 반응물을 교반한다.

평균 10회의 DMF 세척이 커플링 후에 사용된다 (표 8 참조). 제조 전개에서는, 시간 및 용매를 절약하기 위하여 7회의 세척이 수행되는 것이 권장된다.

37 위치에서의 프롤린 커플링으로 시작하여, 온-라인 LCMS를 위한 자동화된 샘플을 채취한다. 고체 수지를 함유하는 자동화된 샘플은 커플링 단계로 가는 15, 75, 180, 324, 503 및 684분에 RB3로부터 채취된다. 자동화된 샘플은 또한 탈보호 단계 동안 RB3로부터 다양한 시점에 채취된다. 각 샘플에 있어서, 자동화된 펌프 및 밸브에 의해 반응기로부터 1.0 mL의 슬러리 샘플이 채취된다. 샘플은 25 mL의 TFA에 의해 희석되며, 30분의 반응 시간 동안 간헐적으로 혼합됨으로써, 수지 비드로부터의 펩티드가 절단되고, 펩티드로부터 보호 기가 제거된다. 다음에, 샘플은 75 mL의 4:1 DMSO:아세토니트릴과 혼합된다. 희석된 용액은 2 μL의 LC 스위칭 루프에 탑재되어 컬럼상에 파킹된다.

LCMS에 의해 결정되었을 때 ≥99 %의 전환율이 달성되도록 DMF 중 20 % 피페리딘 세척의 회수 및 교반 시간을 조정한다. Ser39 내지 Leu26의 경우, DMF 중 20 % 피페리딘을 위한 교반 시간은 30분이며; Trp25 및 Gln24의 경우, 그것이 40분이고; Val23 내지 Leu14의 경우, 그것이 50분이다. Aib13 5회 세척은 50분 동안 교반되며, 3회의 추가 세척은 90분 동안 교반된다. 나머지 아미노산 (Ile12 내지 Boc-Tyr1)의 경우, DMF 중 20 % 피페리딘의 처음 3회 세척이 20-30분, 다음에 제4 피페리딘 세척액이 직렬 제1 반응기에 진입할 때에는 더 긴 연장된 시간 동안 교반된다. Pro36 및 Gly34에 대해서는, 일반적인 절차 A에서 개괄된 바와 같은 추가적인 탈보호 및 세척 단계를 수행한다. 일반적으로, DMF 중 20 % 피페리딘을 사용한 3회의 30-분 교반이면 ≥99 %의 전환율을 달성하는 데에 충분하므로, 이는 이와 같은 절차의 제조 전개시에 시간, 용매 및 시약을 절약하게 된다는 것을 알아야 한다.

세척 스트림이 다음 아미노산을 사용한 커플링 절차를 수행하기 전에 기체 크로마토그래피 (GC) 분석에 의해 <600 ppm의 피페리딘을 함유하는 것을 보장하기 위하여, 피페리딘 탈보호 단계 후 DMF 세척의 회수를 조정한다. 피페리딘 탈보호 단계 후 사용되는 평균 세척 회수는 11회 세척이다 (표 7 참조). 일반적으로, 이는 10회 세척에 의해 달성되며, 그에 따라 제조 전개에서는 피페리딘 탈보호 단계 후 10회의 DMF 세척이 사용되어야 하는 것으로 권장된다.

표 3은 39-량체 펩티드 백본 합성 전체에 걸친 온-라인 LCMS 샘플링 시간 및 계산된 % 전환율을 나타낸다. 도 4는 온-라인 LCMS를 위한 자동화된 샘플링, 절단, 탈보호, 희석 및 탑재 카트의 절차 및 기기사용 도식을 나타낸다.

고체 막힘 및 월류를 동반하는 고장수리 문제로 인하여, 39량체 펩티드 합성 동안 온-라인 LCMS 자동화 샘플링 시스템에 대하여 몇 가지 개선이 이루어졌다. Pro37로부터 Ser33까지, 샘플링은 반응기와 3-방 샘플링 밸브 사이에 위치하는 연동 펌프를 사용하여 수행된다. 그러나, 펌프는 수지를 마쇄함으로써, RB3로부터 액체를 비울 때 느린 여과 속도의 원인이 되는 미세 고체를 생성시킨다. 수지 샘플 펌핑 시간은 감소되고, 펌프는 3-방 밸브 뒤로 이동됨으로써, 수지는 사실상 펌프에 진입하지 않는다. Ala21 커플링 및 모든 차후의 커플링 동안, 시스템은 각 샘플링 후 DMF 용매를 사용하여 2개의 자동화된 3-방 슬러리 샘플 밸브를 플러싱하는 능력을 갖추도록 변형된다. 각 시퀀스 종료시에 다시 반응기로 플러싱 제거되지 않는 고체에 의해 3-방 샘플 밸브가 막히게 되는 것을 방지하기 위하여, 샘플 밸브를 통하여 탈보호 혼합 포트로, 그리고 이후 밸브 (518k)로부터 폐기로 DMF가 플러싱된다 (도 4).

합성 동안 가끔씩, 수지의 샘플이 상기한 바와 같이 분석용으로 제거되며, 추가 연구 오프-라인용으로도 샘플이 채취된다. 물질 수지를 기준으로 하여 mmol로 나타낸 각 반응기 중 수지의 나머지 양을 표 4에 열거하였다. 이에 따라, 탈보호, 탈보호-후 DMF 세척, 아미노산 커플링 및 커플링-후 DMF 세척을 위하여 시스템에 충전되는 재료의 양은 각 단계에서 잔존하는 수지의 양에 맞추어 조정된다. 제조 전개시, 많은 샘플이 오프-라인 분석용으로 채취될 가능성은 없으며, 수지 mmol 기준이 급격하게 변화하게 되지는 않게 된다는 것을 알아야 한다.

아미노산 커플링 단계에 사용되는 아미노산 및 커플링 시약 용액의 질량을 표 5에 나타내었다.

피페리딘 탈보호 후 DMF 세척의 선택에서 GC에 의해 측정되는 피페리딘의 농도를 표 6에 나타내었다.

39-량체 백본 중간물 (도 7)의 합성 전체에 걸쳐 탈보호에 사용된 피페리딘 용액 세척 및 DMF 세척의 회수 및 질량을 표 7에 나타내었다. 또한, 표 7에는, mmol 수지 당 사용된 상기 용액들의 질량 계산치 (g)도 나타내었다 (질량을 표 4에 열거된 바와 같은 각 단계에 존재하는 수지의 mmol로 나누는 것에 의해 결정).

39-량체 백본 중간물 (도 7)의 합성 전체에 걸친 mmol 수지 당 사용된 커플링 시약의 질량 (g), 아미노산 커플링 후의 DMF 세척 회수 및 mmol 수지 당 상기 세척에 사용된 DMF의 질량 (g)을 표 8에 나타내었다. 표 7에서와 같이, 표 8에서의 mmol 수지 당 사용된 재료의 질량 (g)은 질량을 표 4에 열거된 바와 같은 각 단계에 존재하는 수지의 mmol로 나누는 것에 의해 결정된다.

표 9는 39-아미노산 백본 중간물 (도 7)의 합성 동안 반응 용기에 충전되는 재료 양의 총 합계를 나타낸다. 표 9는 피페리딘/DMF 탈보호 및 그 이후의 DMF 세척, 그 이후의 아미노산 커플링 단계 및 DMF 세척, 및 시에버 수지의 합계를 포함한다.

Boc-Tyr1의 커플링 후, 수지 결합 펩티드는 전체 3개 반응기로부터 제거되어, 메틸렌 클로라이드를 사용한 세척에 의해 탈-팽창된 후, 건조된다. 나머지 단계들은 자동화된 직렬-반응기가 아니라 배치 용기에서 수동으로 수행된다. 제조 전개시, 수지가 이와 같은 시점에 반응기로부터 제거되어서는 아니 되므로, 직렬-반응기에서 다음 단계가 수행된다. 이는 요구되는 시약 및 용매의 양을 감소시키게 된다.

Lys20으로부터 -ivDde 보호 기를 제거하기 위하여, 2 L 자켓구비 필터 반응기에서 질소하에 히드라진 수화물 (5.34 g, 68.3 mmol)과 DMF (165 g)를 조합한 다음, 건조된 수지 (50.0 g, 7.24 mmol)를 첨가한다. 20 ℃에서 6시간 동안 교반한 다음, 각 세척 당 5분 교반으로 DMF (5 × 500 mL; ~100 mL의 세척 부피이면 충분할 수 있을 것으로 권장됨)를 사용하여 수지를 세척한다.

지방산/링커 커플링의 경우, 250 mL 원형-저 플라스크에 화학식 I의 산 (3,6,12,15-테트라옥사-9,18-디아자트리코산디산, 22-{[20-(1,1-디메틸에톡시)-1,20-디옥소에이코실]아미노}-10,19-디옥소-2,3-(1,1-디메틸에틸) 에스테르, (22S)); 9.5 g, 11 mmol), 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PYBOP; 5.7 g, 11 mmol) 및 DMF (50 g)를 충전하는 것에 의해 활성화 에스테르를 제조한다.

혼합물을 20분 동안 교반하여 용해시킨 다음, 2,4,6-트리메틸피리딘 (1.29 g, 10.6 mmol)을 첨가한다. 활성화 에스테르 혼합물을 13.5 내지 15.8 ℃로 20분 동안 교반한 다음, 그것을 25 ℃에서 반응기 자켓이 구비된 필터 반응기 내 수지에 첨가하고, 추가 5 mL의 DMF를 사용하여 세정한 후, 플라스크로부터 유출 전달한다. 슬러리를 29시간 동안 교반한 다음, 배수하고, 각 세척 당 5분 교반을 동반하여 DMF (4 × 300 mL; ~100 mL의 세척 부피이면 충분할 수 있을 것임)로 수지를 세척한다. 이전과 같이 제조된 활성화 에스테르의 또 다른 배치를 반응 혼합물에 첨가하고, 25 ℃로 19시간 동안 교반한다. 수지를 배수하고, 각 세척 당 4분 교반을 동반하여 DMF (4 × 300 mL; ~100 mL의 세척 부피이면 충분할 수 있을 것임) 및 메틸렌 클로라이드 (4 × 300 mL; ~100 mL의 세척 부피이면 충분할 수 있을 것임)로 세척한다. 사용되는 PYBOP의 로트(lot)는 최적-이하 품질의 것으로 결정되며, 그에 따라 활성화 에스테르의 또 다른 배치 (새로운 PYBOP 병을 사용하여 50 g의 DMF 중에서 3분의 1 시약 규모로 이전과 같이 제조됨)를 반응 혼합물에 첨가하고, 25 ℃로 18시간 동안 교반한다. 수지를 배수하고, 각 세척 당 5분 교반을 동반하여 DMF (4 × 300 mL; ~100 mL의 세척 부피이면 충분할 수 있을 것임) 및 이소프로판올 (4 × 300 mL; ~100 mL의 세척 부피이면 충분할 수 있을 것임)로 세척한다. 제조 전개시, PYBOP는 고품질의 것이어야 하며, 화학식 I 중간물의 커플링에는 활성화 에스테르의 단일 충전만이 사용되어야 한다. 진공에서 40 ℃로 밤새 수지를 건조한다.

하기와 같이 절단 칵테일을 제조한다: 5 L 원형-저 플라스크 내에서 디티오트레이톨 (DTT; 12.33 g, 79.93 mmol)과 물 (17.63 g)을 조합한다. 유리 압력 병에, TFA (538 g, 4720 mmol)를 충전하고, 5-10 psig 질소를 사용하는 4회의 압력 퍼지 주기로 불활성화한다. 불활성화된 TFA 60 g을 2분 간격으로 20 g 분취량씩 5 L 원형-저 플라스크에 첨가한 다음, 나머지 TFA를 2분에 걸쳐 상기 5 L 원형-저 플라스크에 첨가한다. 트리이소프로필실란 (9.37 g, 59.2 mmol) 및 메틸렌 클로라이드 (51 g)를 5 L 원형-저 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 15 ℃로 냉각한다.

수지로부터 펩티드를 절단하여 탈보호시키기 위하여, 건조된 수지를 필터 반응기에 충전하고, 메틸렌 클로라이드를 사용하여 세정한다. 절단 칵테일을 필터 반응기 내 수지에 첨가하고, 4.5시간 동안 교반한다. 반응 용액을 수지로부터 배수하고, 그것을 절단 칵테일이 제조되었던 5 L 원형-저 플라스크에 첨가한다. 메틸렌 클로라이드 (206 g)를 수지에 첨가하고, 5분 동안 교반한 후, 용액을 배수하고, 그것을 5 L 원형-저 플라스크에 첨가한다. 생성되는 혼합물을 -15 ℃ 자켓 설정점에서 교반하여 냉각시킨다. 1.5시간에 걸쳐, 15분 동안 질소를 폭기한 후 이어서 느린 질소 퍼지하에서 유지하는 것에 의해 불활성화된 MTBE (754 g)를 첨가한다. 슬러리를 -8 ℃로 가온하고, 1시간 동안 교반한 다음, 0 ℃로 가온하고 1시간 동안 교반한다. 완전히 건조되도록 하지 않으면서 질소하에 슬러리를 여과한 다음, MTBE (2 × 155 g)를 사용하여 고체를 세척하고, 진공에서 건조함으로써, HPLC에 의해 결정하였을 때 40.9 %의 효능을 가지는 조 티르제파티드 (38.7 g)를 산출한다. -ivDde 탈보호, 화학식 I 산과의 커플링 및 수지의 절단 제거의 과정 동안, 총 0.34 mmol의 개시 수지를 고려하여 혼합물로부터 샘플이 채취된다. 이것 및 HPLC 효능을 고려할 때, 이와 같은 공정에서의 티르제피티드의 조 수율은 48 %이다.

배치 공정 방법

비교를 위하여, 티르제파티드의 배치 제조 공정이 기술된다. Fmoc 시에버 수지 (17 kg, 0.76 mmol/g)를 반응기에 충전한다. DMF를 사용하여 수지를 팽창시키고, 2시간 동안 교반한 다음, 수지로부터 DMF를 여과 제거한다. 이후 DMF를 사용하여 총 2회 수지를 세척한다. 다음에, Fmoc-보호된 수지를 20 % PIP/NMP 처리를 사용하여 탈-보호시킨다. 최종 PIP/NMP 처리 후, >99 %의 Fmoc 제거를 확인하기 위해 UV 분석을 통하여 Fmoc 제거 확인 샘플링을 수행한다. 최종 20 % w/w PIP/NMP 처리 후, 수지 상을 DMF를 사용하여 여러번 세척한다. 다음에, 각 아미노산 커플링 및 탈보호를 위한 하기의 일반적인 조건들을 사용하여 펩티드 백본을 구축한다:

Fmoc 탈보호 :

펩티드 반응기 중 수지를 20 % v/v PIP/NMP 용액의 3회 또는 4회 중 어느 하나의 충전에 의해 처리한다. 각 처리물을 수지상에서 30분 동안 교반한 후, 이어서 Fmoc 보호 기 제거를 완료하기 위하여 여과한다. 최종 20 % v/v PIP/NMP 처리 후, 수지 상을 사전-명기된 DMF 부피 충전으로 DMF를 사용하여 최소 6회 세척한다.

아미노산 활성화:

12 % w/w 순수 옥시마/NMP의 사전-제조 용액을 반응기에 충전한다. 다음에, 선택된 Fmoc 아미노산을 첨가한다. 혼합물을 20 ± 5 ℃에서 Fmoc 아미노산이 완전히 용해될 때까지 교반한다. 다음에, 부차적인 발열 활성화 반응이 조절되고 생성되는 용액 온도가 20 ± 5 ℃의 명기된 범위로 유지되는 것을 보장하기 위하여, 활성화 전에 Fmoc-AA/순수 옥시마/NMP 용액을 15 ± 3 ℃로 냉각한다. 다음에, DIC 첨가에 의해 아미노산 용액을 활성화한다. 다음에, 수지상 펩티드 중간물을 함유하는 반응기로의 용액의 전달 전에, 활성화 에스테르 용액을 20-30분 동안 교반한다.

커플링:

사전-활성화 단계의 완료시, 활성화 에스테르 용액을 탈보호된 수지상 펩티드를 함유하는 반응기로 전달함으로써, 커플링 반응을 개시한다. 20 ± 5 ℃에서 적어도 4시간 동안 펩티드 커플링 반응물을 교반한다. 필요한 교반 시간 후, 커플링 완료에 대하여 수지 슬러리를 샘플링한다 (IPC). 샘플링은 통과 IPC 결과가 수득될 때까지 필요에 따라 특정 간격으로 반복한다. 필요에 따라서는, 리커플링 작업을 수행한다. 커플링이 완료되면, 펩티드 반응기 용액 내용물을 여과한 다음, DMF를 사용하여 수지상 펩티드 중간물을 수회 세척함으로써, 다음 커플링의 준비를 한다.

Aib ( 13)에 대한 Ile ( 12)의 커플링:

6 당량의 Fmoc-AA, 3 당량의 DIC를 이용한 대칭형 무수물 접근법(symmetric anhydride approach)을 사용하여, Aib (13)에 대한 Fmoc-Ile (12) 커플링을 수행한다. 이와 같은 시퀀스의 경우, 활성화된 대칭형 무수물 종의 형성을 보장하기 위하여, 활성화 시간을 40-60분으로 연장한다. HPLC 분석에 의해 결정하였을 때 반응 완료 (<1 % 비커플링)를 달성하기 위해서는, 연장된 커플링 교반 시간 (18시간)이 필요하다.

39-아미노산 백본 중간물 (도 7)의 합성에 사용되는 재료 요약:

평균 26.4 g/g 수지를 위해서는, 0.93 g/mL의 밀도를 동반하는 9 mL/g 수지에서의 주기 당 평균 3.15 피페리딘 충전물이 사용된다. 주기 당 평균 61.2 g/g 수지를 위해서는, 0.945 g/mL의 밀도를 동반하는 9 mL/g 수지에서의 탈보호 후, 평균 7.2회의 DMF 세척이 수행된다. 아미노산 커플링의 경우, 주기 당 평균 7.25 g/g 수지를 위하여, 대략 1 g/mL의 밀도를 동반하는 평균 7.25 mL/g 수지의 커플링 용액이 주기 당 사용된다. 커플링 후에는, 주기 당 평균 42.5 g/g 수지를 위하여, 0.945 g/mL의 밀도를 동반하는 9 mL/g 수지에서 평균 5회의 DMF 세척이 수행된다.

각 주기를 합계하면, 수지 그램 당 평균 137 g의 재료가 사용된다. 39-아미노산 백본 중간물 (도 7)을 제조하기 위해 수행되는 39 주기로 수지 그램 당 5356 g의 재료가 사용된다. 시에버 수지의 몰 용량이 0.7 mmol/g이므로, 수지 mmol 당 사용되는 재료의 총 합계 질량 (수지 자체의 질량 포함)은 대략 7650 g/mmol이다.

Lys - ivDde (20) 탈보호 , 화학식 I에의 커플링, 수지의 절단 제거, 조 생성물 단리:

Lys-ivDde를 탈-보호시키고, 화학식 I의 산을 커플링시키고, 수지를 절단 제거하고, 조 티르제파티드를 단리하기 위한 나머지 단계들은 본질적으로 직렬-반응기 제조에 대하여 기술된 바와 같이 수행된다. 전체적으로, 45 중량% 및 64 % HPLC 면적 % 순도를 동반하여 45.39 kg의 조 티르제파티드가 생성된다. 함유 수율은 시에버 수지 = 47 % 기준이다.

방법 비교

티르제파티드의 배치 및 직렬-반응기 제조에 의해 유사한 조 수율이 수득된다 (각각 47 % 및 48 %). 직렬-반응기 방법의 경우, 39-량체 백본 중간물 (도 7)을 생성시키는 데에 개시 수지 mmol 당 5.42 kg의 총 재료 (용매 더하기 시약 더하기 수지)가 사용된다. 배치 공정 방법에서는, 개시 수지 mmol 당 7.65 kg의 총 재료가 사용된다.

실시예 : DMF 재순환을 사용한 단편 제조 및 시약 당량 감소

3개 직렬 반응기 구성을 개선하여, GPSSGAPPPS-NH-수지이나 각 S 아미노산이 t-부틸 기에 의해 보호되어 있는 티르제파티드 백본의 처음 10개 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드를 합성하는 데에 사용하였다.

장비 구성은 도 3의 연동 펌프 (435)가 압력 전달 시스템으로 대체된다는 사소한 조정 이외에는 도 3에 나타낸 것과 동일하였다. 용매를 펌핑 유출하기보다는, 이와 같은 시스템은 전달 캔상에서 진공을 견인하며, 이후 원하는 반응기 (RB1, RB2 또는 RB3)로부터의 유입구 밸브를 개방한다. 언제 반응기가 완전히 배수될지를 결정하는 데에 압력 센서가 사용되는데, 일단 그것이 용매보다는 캔으로 질소를 견인하기 시작하면, 압력이 빠르게 증가하게 되기 때문이다. 전달 캔은 이후 가압되며, 원하는 반응기 (RB2, RB3 또는 폐기/재순환)로 밸브가 개방된다. 이와 같은 기술은 더 빠르고 더 완전한 반응기의 배수를 제공하며, 이는 배수 후 더 적은 반응기 내 잔류 용매로 이어지고, 이는 수지 세척을 향상시킨다. 다른 차이는 피페리딘을 측정하여 충분한 세척을 보장하기 위한 온라인 GC (기체 크로마토그래피) 및 DMF 재순환 병을 부가하는 것이다.

도 3의 시스템에 대한 유사성과 관련하여, 제1 반응기로부터의 유출물이 제2 반응기로, 제2는 제3으로, 그리고 제3은 폐기로 송부되도록, 3개의 반응기를 직렬로 구성하였다. 그러나, 세척 작업만을 직렬로 수행하였다. 이와 같은 실험 역시 Fmoc 탈보호 및 아미노산 커플링 반응 둘 다를 위한 개선된 조건들을 사용하였다. 새로운 반응 조건은 거의 대부분의 과량 시약을 배제하였으며, 최소한의 이익으로 직렬로 탈보호 및 커플링 반응을 수행한다는 개념을 제공하였다. Fmoc 탈보호의 경우, 1회의 DMF 중 20 % 피페리딘 충전만을 사용하였다. 이와 같은 충전의 부피는 4 부피 (건조 수지 충전물 기준으로 개시) 가량으로 감소되었다. 이와 같은 점에서, 피페리딘 폐기물은 단일 반응기에 대하여 독립적인 9 부피 충전을 3회가 넘게 사용하였던 원래의 공정으로부터 80 % 가량 감소된다. 직렬로 이와 같은 작업을 수행하는 것의 잠재적인 피페리딘 절약은 제3 반응기에서 탈보호 부산물 (피페리딘 - 디벤조풀벤 부가물)의 축적으로부터 발생할 수 있는 잠재적인 문제점만큼 가치가 있지 않은 것으로 여겨졌었다. 그에 따라, 각 반응기는 독립적으로 Fmoc 탈보호 반응용으로 운용되었었다.

PMI를 더 최소화하기 위해, DMF 재순환 용기를 부가하여 시스템을 변형하였다 (PMI는 공정 물질 강도(Process Mass Intensity)이며, 특정량의 생성물을 제조하는 데에 사용되는 재료의 총 질량으로 정의되며, 그에 따라 생성물 1 g을 제조하기 위한 재료 2000 g은 2000의 PMI임). 상기 재순환 용기는 Fmoc 탈보호 후 세척액의 제2 절반을 수집하는 데에 사용되며, 제3 반응기의 하류에 존재하는데, 모든 세척이 직렬로 수행되기 때문이다. 예를 들면, 재순환 용기는 10회 세척중 나중 5회를 수집하였다. 수집된 DMF는 1 % 수준의 피페리딘 농도를 가진다. 이는 탈보호 반응 후 반응기에서의 피페리딘 농도에 비해 상당히 더 낮은 것으로써, 수집된 DMF는 이어지는 세척 주기의 제1 절반에 사용된다. 이는 더 우수한 DMF 이용률로 이어져, 폐기 스트림에서의 평균 피페리딘 농도를 증가시킨다. (이전에 기술된) 온라인-LCMS 장비를 세척하여 샘플 이월을 방지할 필요성으로 인하여, 세척에 있어서의 추가적인 변화가 부가되었다. LCMS 장비 세척은 3개 반응기 각각에서 약 80 mL의 DMF를 초래한다. 이후에는, 벽상 임의의 수지가 수지 상으로 하향 세척되는 것을 보장하기 위해 각 반응기에 대하여 대략 50 mL의 새로운 DMF의 빠른 분무볼 세척이 수행된다. 온라인-LCMS 및 분무볼 세척은 직렬 세척 프로그램으로 반응기에 통합되는데, 사용되는 모든 DMF가 직렬로 반응기들을 통하여 전달되며, 최종 PMI 계산에서 기록된다.

이전에 도 3에서, 하나의 반응기로부터 다음 것으로 재료를 전달하는 데에는 연동 펌프가 사용되었었다. 때때로, 연동 펌프는 자유 용매의 반응기를 완전히 배수시키지 못하였었다. 이는 세척 효율을 감소시키고, PMI를 증가시킨다. 이에 따라, 반응기로부터 더 우수하게 모든 액체를 비우는 압력 전달을 사용하도록 변화가 이루어졌다. 모든 반응기, 폐기 및 DMF 재순환 용기에 연결되는 하나의 전달 용기가 부가된다. 반응기로부터 전달 용기로 전달하는 데에는, 자동화된 시퀀스가 사용된다. 전달 용기상에서는 진공이 견인되며, 전달 캔의 용기 저부 사이의 밸브는 개방된다. 전달 용기 내의 압력이 예정된 설정점에 도달하는 경우, 밸브는 폐쇄된다. 전달 용기는 가압되며, 표적 용기 상부로 이어지는 밸브는 개방되고, 전달 용기 내 압력이 설정값 미만으로 강하할 때까지 전달이 이루어진다.

세척 용액의 온라인 분석도 부가되었다. 온라인 GC는 세척물 중 잔류 피페리딘의 모니터링을 가능하게 하도록 폐기 라인에 설치되었다. 프로그램은 제3 반응기로부터의 최종 3회 세척이 분석되게 되도록 설정되었다. 또한, 온라인-LCMS는 커플링 후 세척할 때의 잔류 아미노산용으로 세척액을 샘플링하는 데에 이용되었다. 수율 감소를 방지하기 위하여, 수지는 세척 샘플링을 촉발하기 전에 고정되도록 허용되었다. 이는 수지가 샘플링되는 것을 막았는데, 침지 튜브가 수지 위 액체 층에 존재하게 되기 때문이다.

각 주기에 대하여, PMI의 정확한 계산을 수득하였다. 이와 같은 특정 실험에 있어서, 모든 반응 모니터링 샘플은 제3 반응기로부터 채취하였는데, 더 낮은 세척 효율로 인한 최고의 잔류 재료 농도로 인하여 그것이 최저속 반응을 나타낼 것으로 예상되었기 때문이다. 일단 반응기 3에서의 반응이 완료되고 나면, 전체 3개 반응기가 완료되게 되는 것으로 가정하였다. 이는 온라인-LCMS에서의 이월 문제에도 도움이 되는데, 각 샘플이 약간만 이월에 의해 영향을 받게 되기 때문이다. 5 % 이월을 가정하면, 100 % 완전한 커플링 반응은 이전 탈보호 반응 샘플의 5 %로 인하여 95 % 완료로만 측정될 수 있다. 3개 반응기 각각이 순차적으로 샘플링되는 경우, 이와 같은 5 % 오차는 샘플 각각에서 보편적인 것일 수 있어서, 3시간 후에도 여전히 반응은 아직 완료된 것으로 보이지 않는다. 하나의 반응기만이 샘플링되는 경우, 완전한 전환을 가정하면, 제1 샘플 전환율은 95 %이게 되나, 제2 샘플은 99.75 % 전환율로 측정되게 되고, 겨우 2시간 후에 반응이 중지될 수 있다. 실험의 역사는 특히 Fmoc 탈보호 반응과 관련하여 필요한 것에 비해 더 긴 반응과 관련된 품질 저하가 존재한다는 것을 시사하고 있다. 하나의 반응기만을 샘플링하는 것의 위험성은 과도한 추가적인 교반 시간 없이 그것이 완료되었을 때 반응을 중지시키는 것으로부터 초래될 수 있는 잠재적인 품질 개선 대비 무시할만한 것으로 느껴진다.

이와 같은 실험에 있어서, 목표는 10회 세척 주기를 이용하여 피페리딘 농도를 2000 ppm으로 감소시키는 것이었다. 피페리딘 탈보호 후 세척의 결과를 표 10에 나타내었다. 10회 세척 및 샘플 카트 세척 주기 후 약 2000 ppm 피페리딘을 초래하는 데에 필요한 세척액 충전량을 예측하기 위한 모델을 사용하였다. 시뮬레이션은 이전의 수지 팽창 및 피페리딘 흡착 실험 데이터를 이용하였다. 일부 샘플은 장비 고장으로 인하여 생략되었으나, 2000 ppm 목표는 정상적으로 충족하였으며, 유일한 예외는 최종 주기였다.

커플링 반응 후, 3회의 세척 충전을 사용하여 시스템을 직렬로 세척하였다. 그 후, 동일한 샘플 카트 세척 절차를 사용하였다. 잔류 AA의 우수한 정량 방법론을 개발되어 있지 않으므로, 펩티드가 성장하고 용매 정체가 증가하면서, 세척 충전 당 점진적으로 더 많은 DMF를 사용하였다.

제3 반응기에서 직렬로 반응 모니터링을 수행하였다. 온라인 LC-MS 시스템을 이전의 실험에서와 같이 사용하였다. 탈보호 결과를 표 11에 제공하였다. 정량 방법론이 하향 기록으로 편향되어 있다는 이해 및 샘플 분석이 실제 반응 1시간 후라는 사실로 인하여, 반응 및 진행을 중지하기 전에는 98 %의 전환율을 희망하였었다. 모든 탈보호가 2시간 샘플이 진행된 시점까지 진행 임계값을 충족하였다. 처리 시간은 1시간을 조금 넘는다.

커플링 반응에 대하여 유사한 모니터링을 수행하였다. 결과를 표 12에 제공하였다. Gly30을 제외한 모든 커플링이 늦어도 2시간 샘플의 결과가 알려진 시점까지 중지되었다. Gly30 커플링의 낮은 전환율에 대한 보편적인 이론은 세척 후 존재하는 높은 잔류 피페리딘 농도였다. Gly30 반응에 대해서는 리커플링을 수행한 바, 리커플링은 커플링 전환율을 빠르게 99.2 %가 되도록 하였으므로, 반응을 중지하였다.

이와 같은 실험의 주요 초점은 최소량의 원료를 사용하여 고품질의 재료를 제조하는 것이었다. 각 주기를 위한 탈보호에 사용된 재료의 양을 표 13에 열거하였다. 재료 양은 각 주기에 대하여 g/mmol로 제공하였다. 매 주기 펩티드의 mmol이 감소되기 때문에, 10주기에 걸친 총 재료 사용을 합쳐 최종 mmol로 나누지 않음은 물론, 개시 mmol이 정확한 수를 산출하게 되지도 않는다.

탈보호 후 세척을 위한 DMF 사용은 표 14에 나타내었다. 표 15는 3개 반응기 각각에서 각 주기에 사용된 커플링 시약의 몰 당량을 열거한다. 각 커플링 주기에 사용된 총 재료는 표 16에 제공하였다. 표 17은 커플링 후 세척을 위한 DMF 사용을 제공한다.

각 단계로부터의 데이터에 대해 말하자면, 화합물별 및 전체적으로 원료 사용이 현행 배치 제조 공정과 비교된 요약본을 생성시켰다. 표 18은 커플링 시약 사용이 37 %까지 감소된 반면, 피페리딘 사용은 84 %까지 감소되었음을 보여준다. 세척에 사용되는 DMF는 공정 중 재료 사용의 대부분으로써, 총 물질 소비의 90 %를 충분히 넘게 차지하므로, DMF 소비를 감소시키는 것이 본 실험의 일차적인 목표였다. DMF 사용은 티르제파티드 배치 제조 공정의 처음 10 주기에 비해 79 %까지 감소되었다. 전체적으로, 새로운 공정 기술의 실험적 증명은 357 g/mmol의 펩티드를 사용하였다. 비교하자면, 현행 배치 제조 공정은 1690 g/mmol을 사용한다. 이는 총 79 %의 감소를 나타낸다.

재료 소비에 있어서의 거의 80 % 감소를 확립하였으므로, 실험의 최종 부분은 생성되는 재료가 고품질의 것임을 입증하는 것이었다. 모든 보호 기를 AA R 기상에 유지하면서, 전체 3개 반응기로부터의 재료를 수지로부터의 펩티드의 약한 절단에 적용하였다. 표 19에 나타낸 HPLC 분석은 전체 3개 반응기에 걸친 높은 품질을 나타내었다. 다소 놀랍게도, 품질과 반응기 사이의 상관관계는 절대적으로는 존재하지 않았다. 직렬 제3 반응기가 제1만큼 많이 세척되지 않기 때문에 3개 반응기들 사이에 부차적인 순도 감소가 존재하게 될 것이라는 가설이 있었다. 이와 같은 발견은 이용된 세척 전략이 적정 이상이라는 것을 입증하고 있다. 이론상, 잔류 피페리딘 및 AA에 대한 세척 목표는 증가될 수 있는데, 이는 재료 소비를 더욱 더 감소시키는 것을 가능하게 할 것이다.

실시예 : DMF 용매 중에서의 SPPS에 의한 테르제파티드 사량체의 구성

하기 티르제파티드 사량체는 4개의 아미노산을 함유한다:

이와 같은 사량체는 하기 문장에서 기술되는 적재 방법 및 직렬-반응기 방법을 통하여 달성되는 선형 고체 상 펩티드 합성 (SPPS)을 사용하여 합성된다. 표 20은 티르제파티드 사량체 백본의 합성에 사용된 4개 아미노산의 서열을 열거한다. 사량체 중간물의 첫 번째 아미노산인 글리신이 먼저 하기에 적재 방법을 사용하여 하기에 나타낸 바와 같이 2-클로로트리티 클로라이드 (CTC) 수지 고체 지지체상에 적재된다 (하기에서 CTC 수지 고체는 하기 원으로 나타냄)는 것에 유의해야 한다.

나머지 3개 아미노산은 직렬-반응기 방법을 사용하여 구성된다. 글리신, 글루탐산 및 2-아미노이소부티르산의 α-질소는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 기에 의해 보호되며, 티로신 α-질소는 t-부틸옥시카르보닐 (Boc)에 의해 보호된다. 글루탐산 및 티로신의 산소는 tert-부틸 (tBu)을 통하여 보호된다.

적재 방법

하기와 같이 Fmoc-Gly-OH 커플링 용액을 제조한다: 5000 mL 시편 병에, 1.8 L 용액의 부피까지 DMF를 사용하여 Fmoc-Gly-OH (142.7 g, 480.0 mmol)를 용해시킨다. 다음에, N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민 (309 g, 2390.9 mmol)을 첨가하고, 5분 동안 내용물을 교반한다.

수지 커플링

10 L 유리 대규모 펩티드 합성기에, CTC 수지 (380 g, 610 mmol, 1.6 mmol/g)를 첨가한다. DMF (2400 mL)를 첨가하고, 15분 교반한다. 배수하고, 나머지 용액을 폐기한다. DMF (2400 ML)를 사용하여 교반하면서 15분 2회 수지를 세척한다. 추가적인 N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민 (62 g, 479.73 mmol)을 첨가하고, 주변 온도에서 총 18시간 동안 교반한다. 18시간 완료시, 용액을 배수하고, DMF (1800 mL)를 사용하여 5분 동안 혼합하면서 5회 수지를 세척한다.

수지 캡핑

DMF (900 mL), N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민 (145.8 g, 1128 mmol) 및 메탄올 (191 g, 5960.9 mmol)을 병에 첨가하고, 실온에서 2분 동안 교반한다. 용액을 수지에 첨가하고, 60분 동안 교반한 이후, 용액을 배수한다. DMF (1800 mL)를 사용하고 각각 5분의 교반을 동반하여 5회 수지를 세척한다. 또한, DCM (1800 mL)을 사용하여 5분 동안 각각 교반하면서 5회 수지를 세척한다. 수지를 건조 디스크로 전달하고, 진공하에서 35 ℃로 일정 중량까지 건조한다.

건조한 수지는 NMR을 통하여 측정된 0.85 mmol/g의 Fmoc-Gly-OH 적재량을 가지는 473.37 g으로 칭량된다.

직렬-반응기 방법

원료 제조

하기와 같이 DMF 중 피페리딘의 20 vol% 용액을 제조한다: DMF의 첨가에 의해 피페리딘 (2.0 L)을 10.0 L의 부피까지 희석함으로써, 부피 기준 20 % 용액을 수득한다.

하기와 같이 DMF 중 옥시마의 1.25 mol/kg 용액을 제조한다: 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트 (옥시마, 195.69 g)를 1.25 mol/kg 용액을 수득할 때까지 DMF (905.91 g) 중에 용해시킨 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 DMF 중 DIC의 1.25 mol/kg 용액을 제조한다: N,N'-5 디이소프로필카르보디이미드 (191.16 g)를 1.25 mol/kg 용액을 수득할 때까지 DMF (1020.60 g) 중에 용해시킨 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 DMF 중 글루탐산의 0.40 mol/kg 용액을 제조한다: Fmoc-Glu(tBu)-OH (162.85 g)를 DMF (755.15 g) 중에 용해시키고, 진탕하여 용해시킨 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 DMF 중 Fmoc-Aib-OH의 0.40 mol/kg 용액을 제조한다: Fmoc-Aib-OH (119.50 g)를 DMF (798.51 g) 중에 용해시키고, 진탕하여 용해시킨 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 DMF 중 Boc-Tyr(tBu)-OH의 0.40 mol/kg 용액을 제조한다: Boc-Tyr(tBu)-OH (123.89 g)를 DMF (794.11 g) 중에 용해시키고, 진탕하여 용해시킨 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 반응 시스템을 준비한다: 반응기 "RB1", "RB2" 및 "RB3" 사이에 동일하게 분할하여 CTC 수지 (108 g, 0.85 mmol/g, 91.8 mmol)를 첨가한다. 350 mL의 DMF를 각 반응기에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반함으로써 수지를 팽창시킨다.

일반적인 절차 A - F moc 탈보호 및 DMF 세척 과정: 전체 3개 반응기 RB1, RB2 및 RB3에 대하여 병렬로 Fmoc 탈보호를 진행한다. 더 구체적으로, RB1에 피페리딘 (DMF 중 20 vol %, 202.4 g)의 용액을 첨가하고, 5 ml의 DMF를 사용하여 피페리딘 전달 라인을 세정한 후, 교반을 개시한다. 유사한 방식으로, 205.4 g 및 205.2 g의 20 vol % 피페리딘 용액을 RB2 및 RB3에 첨가하고, 각각 피페리딘 라인을 세정한다. 다음에, 동시의 병렬 탈보호를 위하여, 3개 반응기를 20 ℃에서 120분 동안 교반한다. 전체 TZP 사량체 구축을 위한 피페리딘 용액 충전에 대해서는 표 21에 요약하였다. 샘플링 카트에 의해 지지되는 온라인 LC-MS를 사용하여 탈보호 반응을 모니터링한다. 탈보호 전환율은 정량적으로 결정될 수 없는데, 탈보호되는 사량체 중간물의 질량 스펙트럼이 그의 낮은 분자량으로 인하여 표로 작성될 수 없기 때문이다. 그러나, Fmoc 보호 사량체의 추출되는 이온 피크가 0이라는 것을 확인함으로써, 탈보호 완료는 정성 검증된다.

탈보호 후, 압력 전달 시스템을 사용하여 전체 3개 반응기로부터 폐기물 탱크로 용액을 배수한다. 탈보호 후 DMF 세척이 직렬-반응기 수단을 사용하여 수행된다는 것, 즉 DMF 세척 용매가 먼저 RB1으로 충전된 다음 RB2 및 RB3로 전달된다는 것을 알아야 한다. 수지 중 잔류 피페리딘을 제거하기 위하여, 하기의 상세한 절차에 따라 10회의 DMF 세척 주기가 적용된다. 처음 5회 DMF 세척의 경우, 동일하게 분할된 용매 질량으로 DMF 재순환 용기로부터 RB1으로 재순환 DMF가 첨가된 후, 교반된다 (즉 재순환 용기 중 DMF 질량이 5회 세척 주기로 동일하게 분할된 후 RB1으로 충전됨). DMF 재순환 용기가 비워지고 처음 5회의 DMF 재순환 세척이 완료된 후에는, DMF 용매 용기로부터의 새로운 DMF가 나머지 5회 세척 주기를 위해 충전된다. 처음 5회 세척 주기로부터의 사용된 DMF는 폐기물 탱크로 폐기되지만, 나머지 5회 세척 주기로부터의 사용된 DMF 용매는 그 대신 다음 아미노산 구성에서 재사용되게 되는 DMF 재순환 탱크로 수집된다. 세척 주기 전체에 걸쳐 5분 교반 시간이 적용된다. 10회 세척 주기가 완료된 후에는, 100 ml의 새로운 DMF가 3개 반응기에 각각 충전되는 추가적인 샘플 카트 세척 주기가 적용된다. 다음에, RB1 및 RB2로부터의 DMF가 RB3로 전달되며, 그것은 최종적으로 DMF 용매 재순환 용기에 수집된다. 탈보호 후 DMF 세척을 위한 재료 사용에 대해서는 표 22에 요약하였다. 온라인 GC를 사용하여 최종 3회 세척 주기로부터 방출되는 DMF 용액의 피페리딘 농도를 측정하고, 그것을 표 23에 요약하였다. 최종 잔류 피페리딘 농도는 합성 전체에 걸쳐 500 ppm 미만으로 억제된다.

일반적인 절차 B - 아미노산 활성화 및 커플링 과정: 자켓이 구비된 반응기 RA에, 글루탐산 용액 (0.4 mol/kg, 401.2 g), 옥시마 용액 (1.25 mol/kg, 128.5 g), DIC 용액 (1.25 mol/kg, 141.2 g)을 첨가한다. 용액을 20 ℃에서 30분 동안 교반함으로써 활성화된 글루탐산 용액을 형성시키고, RB1 (225.4g), RB2 (225.4g) 및 RB3 (227.4g)에 첨가한다. 18시간 커플링 시간이 적용되는 티로신 커플링을 제외하고, 반응기 RB1, RB2 및 RB3를 20 ℃에서 8시간 동안 교반한다. 커플링 시간에 도달한 후, 압력 전달을 사용하여 전체 3개 반응기로부터 폐기물 탱크로 용액을 배수한다. 반응 종료시, 카이저 시험을 통하여 커플링 완료를 확인한다. 구축 전체에 걸친 당량 비 사용을 상술하는 커플링을 위한 재료 사용에 대해서는 표 24에 요약하였다.

일반적인 절차 A에서의 유사한 직렬-반응기 방식으로 커플링 후 새로운 DMF를 사용하여 3주기 동안 반응기 RA, RB1, RB2 및 RB3를 세척한다. 더 구체적으로, 분무 밸브를 통하여 RA로, 그리고 다음에 직렬로 RB1, RB2 및 RB3로 새로운 DMF 용매를 첨가한다. 샘플 카트 세척 절차는 일반적인 절차 A와 유사한 방식으로 수행된다는 것을 알아야 한다. 이후, 3회 DMF 세척 주기 및 추가적인 샘플 카트 세척 주기로부터의 모든 사용된 DMF는 폐기물 탱크로 방출된다. 커플링 후의 DMF 세척을 위한 재료 사용에 대해서는 표 25에 요약하였다.

TZP 사량체 순도 분석 방법

Boc-Tyr 1의 커플링 후, 전체 3개 반응기로부터 건조 디스크로 수지를 전달하고, 메틸렌 클로라이드를 사용하여 세척하는 것에 의해 탈-팽창시킨 후, 건조한다. 사량체 샘플을 약하게 절단하고, 펩티드상에 남아있는 tBu 및 Boc 보호 기 및 그의 순도를 하기 방법에 따라 분석한다. 수지상 펩티드 500 mg마다, 10 mL의 30 % 헥사플루오로-2-프로판올/메틸렌 클로라이드 (v/v)를 섬광 바이알에 첨가한다. 회전 믹서에서 2시간 동안 혼합한다. 여과하고, 10 ml의 메틸렌 클로라이드를 사용하여 수지 케이크를 세척한다. 로타베이퍼(rotavapor)에 의해 오일로 농축한다. UPLC-MS 분석용으로 50 % 아세토니트릴/물 (v/v)을 사용하여 사량체 오일을 추가 희석한다. RB1, RB2 및 RB3에서의 생성되는 TZP 사량체 순도는 각각 99.23 %, 99.58 % 및 99.39 %이다.

TZP 사량체 합성을 위한 배치 공정 방법

직렬-반응기 기술과의 비교를 위하여, 600 mmol에서의 TZP 사량체 배치 공정을 하기와 같이 기술한다. 새로운 기술에 의해 사용되는 직렬 3개 배치 반응기 대신 배치 공정에는 단일 배치 반응기가 사용된다는 것을 알아야 한다. 재료 사용을 표 26에 요약하였다.

Fmoc - Gly -OH 적재

CTC 수지 (500 g)를 반응기에 충전한다. DMF를 사용하여 수지를 팽창시키고, 교반한다. DMF/DCM과 함께인 Fmoc-Gly-OH를 반응기에 첨가하고, 2시간 동안 적재한다. 용액을 배수하고, DMF로 세척한다. DMF/DIPEA/MeOH를 2회 반응기에 첨가하고, 캡핑을 위하여 배수한 후, 각각 20분 동안 교반한다. Gly 적재 수지는 DMF를 사용하여 추가로 세척한다. 적재량은 1.2 mmol/g으로 결정되었다.

Fmoc 탈보호

Fmoc 탈보호는 DMF 중 20 % 피페리딘의 2회 교반을 사용한다. 각 교반에 대하여, 80분의 반응 시간을 적용한 후, 탈보호 시약을 배수 및 여과한다. 탈보호 반응의 완료시, 6.5 부피의 DMF를 사용하고 5분 교반을 동반하여 8회 세척한다. 클로라닐 시험을 사용하여 탈보호 완료를 확인한다.

아미노산 활성화

옥시마 용액 (2 당량, 1.25 mol/kg)을 사전-활성화 반응기에 첨가한 다음, 아미노산 (2 당량)을 추가적인 DMF 용매와 함께 첨가함으로써, 아미노산 농도를 0.4 mol/kg로 희석한다. 다음에, DIC 용액 (2.2 eq., 1.25 mol/kg)을 반응기에 첨가함으로써, 활성화를 개시한다. Glu에는 2시간 활성화 시간이 적용되는 반면, Aib 및 Tyr에는 15분 교반이 사용된다. 활성화 과정은 20 ℃로 유지된다.

커플링

활성화 에스테르 용액을 탈보호된 수지상 펩티드를 함유하는 반응기로 전달한다. Glu 및 Aib에는 8시간의 교반 시간이 적용되는 반면, Tyr 커플링은 18시간을 요하게 된다. 카이저 시험을 사용하여 반응 완료를 확인한다. 일단 커플링이 완료되고 나면, 3 x 6.5 부피로 커플링 용액을 배수한다. DMF 세척을 사용하여 잔류 활성화 에스테르를 제거한다.

순도 분석

배치 공정에서의 TZP 사량체 샘플을 측정하는 데에는 UPLC-MS와 함께인 유사한 약한 절단 분석 방법을 사용한다. 순도는 99.6 %로 결정되었다.

방법 비교

직렬-반응기 기술과 배치 방법에서 유사한 TZP 사량체 순도가 수득된다 (각각 99.3 % 및 99.6 %). 직렬-반응기 방법의 경우, 개시 수지 mmol 당 118.9 g의 총 재료 (용매, 수지를 배제한 시약)를 이용하여 TZP 사량체를 제조한다. 배치 방법에서는, 개시 수지 mmol 당 218.8 g의 총 재료 (용매, 수지를 배제한 시약)가 적용된다. 전체적으로, 새로운 직렬-반응기가 통상적인 배치 방법에 비해 45.7 %의 PMI 감소를 가능하게 한다.

N - 부틸피롤리돈 / 퓨란 환경친화 대안 용매 중에서의 고체 상 펩티드 합성 ( SPPS )에 의한 티르제파티드 사량체의 예시적인 구성

통상적인 고체 상 펩티드 합성에서는 디메틸포름아미드, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸아세트아미드 및 디클로로메탄과 같은 상당량의 독성 용매가 이용되는데, 이는 산업 위생 및 환경 보호에 대하여 과제를 부과하고 있다. 이와 같은 이유로, 차세대 SPPS 기술용으로 직렬-반응기 방법의 PMI 감소 이익을 가지는 더 환경친화적인 대안 용매를 개발하는 것이 많은 관심을 끌고 있다. NBP/퓨란 (특히 바람직하게는 테트라히드로퓨란 및 2-메틸테트라히드로퓨란) 이중 시스템이 집중적인 사전스크리닝 연구에서의 그의 폴리스티렌-기재 수지의 뛰어난 팽창, 커플링 시약 용해도, 그리고 높은 커플링 및 탈보호 반응 성능으로 인하여 대안적인 환경친화 용매로 선택되고 있다. 이전 실시예에서의 DMF 용매를 사용한 TZP (테르제파티드) 사량체 합성과의 연속 비교를 목적으로, NBP/THF 환경친화 대안 용매 시스템을 하기 티르제파티드 사량체를 합성하는 데에 적용한다.

직렬-반응기 방법을 사용한 이와 같은 사량체의 구성은 하기 문장에서 기술된다. 아미노산 서열을 표 27에 제시하였는데, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 기가 글리신, 글루탐산 및 2-아미노이소부티르산의 α-질소를 보호하는 반면, 티로신 α-질소 및 글루탐산의 산소를 보호하는 데에는 각각 t-부틸옥시카르보닐 (Boc) 및 tert-부틸 (tBu)이 사용된다. DMF 용매 예의 TZP 사량체 합성에서 제조되는 Fmoc-Gly-OH 적재 CTC 수지 (적재량 0.85 mmol/g)가 NBP/THF 환경친화 용매 예로 사용된다는 것을 알아야 한다. 상세한 적재 방법은 이전의 실시예를 참조할 수 있다. 유사한 직렬-반응기 방법이 NBP/THF 용매 시스템의 CTC 수지상에서 나머지 3개 아미노산을 구성하는 데에 사용되는데, 하기에 나타낸다.

NBP / 퓨란 대안 용매 방법을 사용하는 직렬-반응기

원료 제조

하기와 같이 NBP/THF 중 피페리딘의 20 vol% 용액을 제조한다: NBP/THF (1.5:1 v:v)의 첨가에 의해 피페리딘 (2.0 L)을 10.0 L의 부피까지 희석함으로써, 부피 기준 20 % 용액을 수득한다.

하기와 같이 NBP/THF (2:1, v:v) 중 옥시마의 0.72 mol/kg 용액을 제조한다: 에틸(히드록시이미노)시아노아세테이트 (옥시마, 176.1 g)를 NBP:THF (2:1, v:v) (1545.1 g)에 용해시켜 0.72 mol/kg 용액을 수득한 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 NBP/THF (2:1, v:v) 중 DIC의 0.72 mol/kg 용액을 제조한다: N,N'-5 디이소프로필카르보디이미드 (172.0 g)를 NBP/THF (2:1, v:v) (1721.3 g)에 용해시켜 0.72 mol/kg 용액을 수득한 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 NBP/THF (2:1, v:v) 중 글루탐산의 0.35 mol/kg 용액을 제조한다: Fmoc-Glu(tBu)-OH (175.8 g)를 NBP/THF (2:1, v:v) (1004.5 g) 중에 용해시키고, 진탕하여 용해시킨 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 NBP/THF (2:1, v:v) 중 Fmoc-Aib-OH의 0.35 mol/kg 용액을 제조한다: Fmoc-Aib-OH (139.4 g)를 NBP/THF (2:1, v:v) (1045.9 g) 중에 용해시키고, 진탕하여 용해시킨 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 NBP/THF (2:1, v:v) 중 Boc-Tyr(tBu)-OH의 0.45 mol/kg 용액을 제조한다: Boc-Tyr(tBu)-OH (139.4 g)를 NBP/THF (2:1, v:v) (1040.9 g) 중에 용해시키고, 진탕하여 용해시킨 다음, 2 SCFH로 용액을 통하여 질소를 폭기한다.

하기와 같이 반응 시스템을 준비한다: 반응기 "RB1", "RB2" 및 "RB3" 사이에 동일하게 분할하여 CTC 수지 (108 g, 0.85 mmol/g, 91.8 mmol)를 첨가한다. 350 mL의 NBP/THF (1.5:1, v:v)를 각 반응기에 첨가하고, 20 ℃에서 1시간 동안 실온 교반함으로써 수지를 팽창시킨다.

일반적인 절차 A - Fmoc 탈보호 및 NBP / THF 세척 과정: 30 ℃하에 특정 시간량 동안 그리고 NBP/THF (1.5:1, v:v) 중 20 % 피페리딘 용액을 사용하여, 전체 3개 반응기 RB1, RB2 및 RB3에 대하여 병렬로 Fmoc 탈보호를 진행한다. 다음에, 용액을 폐기물 탱크로 배수하고, 반응이 완료될 때까지 탈보호 교반을 위하여 추가적인 피페리딘 용액을 충전한다. 더 구체적으로, 예로서 Fmoc-Gly-OH의 제1 탈보호 교반을 위하여, RB1에 피페리딘의 용액 (NBP/THF (1.5:1, v:v) 중 20 vol %, 209 g)을 첨가하고, 5 ml의 NBP/THF (1.5:1, v:v) 용매 혼합물을 사용하여 피페리딘 전달 라인을 세정한 후, 교반을 개시한다. 유사한 방식으로, 208.8 g 및 205 g의 20 vol % 피페리딘 용액을 RB2 및 RB3에 첨가하고, 각각 피페리딘 라인을 세정한다. 다음에, 병렬 탈보호를 위하여 30 ℃에서 45분 동안 3개의 반응기를 교반하고, 이후 용액을 배수한다. 온라인 LC-MS를 샘플링하고, 반응 완료를 확인하기 위하여 Fmoc 보호된 사량체의 추출되는 이온 피크가 0인지를 정성 검증한다. Fmoc-Gly-CTC가 완전히 탈보호되도록 하기 위하여, 또 다른 5회의 병렬 탈보호 교반을 RB 1/2/3에 적용한다. 2회의 탈보호 교반을 사용하여 유사한 탈보호 교반 전략을 Glu 3 및 Aib 4 탈보호에 적용한 바, 전체 TZP 사량체 구축을 위한 피페리딘 용액 충전을 표 28에 요약하였다.

NBP/THF (1.5:1, v:v) 용매 혼합물을 적용된 유사한 직렬-반응기 및 용매 재순환 전력을 사용한 30 ℃하의 반응 후 세척에 이용한다. 더 구체적으로, TZP 사량체 구축 전체에 걸쳐, 10회 NBP/THF 세척 주기를 사용하여 RB 1/2/3를 세척한다. 각각 5분 교반을 동반하는 처음 5회 세척 주기용으로, 재순환 용기 중 사용된 NBP/THF 용매를 5회 충전으로 동일하게 분할하여 직렬로 RB 1/2/3에 첨가한다. 모든 처음 5회 NBP/THF 사용 용매는 사용 후 폐기물 탱크로 폐기한다. 나머지 5회 세척의 경우, 새로운 NBP/THF를 RB 1/2/3 직렬 세척에 사용하고, 다음 아미노산 탈보호 후 세척용으로 준비된 NBP/THF 재순환 용기로 수집한다. 마지막으로, 샘플 카트 세척 주기로서 각각 100 ml로 3개 반응기에 NBP/THF를 충전하고, 다시 재순환 용기로 수집한다. 표 29는 탈보호 후 세척의 물질 수지를 요약하며, 표 30은 모든 주기에서 600 PPM 미만인, 합성 전체에 걸친 잔류 피페리딘 농도를 상술하고 있다.

일반적인 절차 B - NBP / THF 중에서의 아미노산 활성화 및 커플링 과정: 활성화 및 커플링 반응의 경우, 더 우수한 시약 용해도를 가능하게 하기 위하여, NBP/THF 부피 비를 2:1로 조정한다. Fmoc-Glu(tBu)-OH 커플링을 예로 하여, 글루탐산 용액 (0.35 mol/kg, 786.4 g), 옥시마 용액 (0.72 mol/kg, 382.4 g) 및 DIC 용액 (0.72 mol/kg, 420.6 g)을 자켓이 구비된 반응기 RA에 첨가하고 30 ℃에서 70분 교반함으로써 활성화된 글루탐산 용액을 형성시킨 후, 각각 RB1 (531.9 g), RB2 (529.7 g) 및 RB3 (533.9 g)으로 전달한다. 30 ℃에서 8시간 동안 반응기 RB1, RB2 및 RB3를 교반하고, 이후 전체 3개 반응기로부터 폐기물 탱크로 용액을 배수한다. 반응 종료시, 카이저 시험을 통하여 커플링 완료를 점검한다. 제1 커플링 단계 후에는 Glu 커플링이 완료되지 않기 때문에, 1.5 당량 비의 Fmoc-Glu(tBu)-OH 활성화 용액을 추가로 첨가하여, 카이저 시험을 통과할 때까지 또 다른 19시간 커플링을 허용한다. 그러나, 나머지 Aib2 및 Tyr1 커플링은 각각 8시간 및 18시간의 교반 시간을 사용하는 하나의 커플링 단계만을 적용한다. 커플링 동안의 상세한 재료 사용에 대해서는 표 31에 요약하였다.

NBP/THF (1.5:1, v:v) 용매를 사용한 커플링 후 세척을 위하여, 3회 세척 주기를 적용하여 RA, RB1, RB2 및 RB3를 세정한다. 더 구체적으로, 분무 밸브를 통하여 직렬로 3회 RA로, 그리고 이어서 RB1, RB2 및 RB3로 새로운 NBP/THF 용매를 충전한다. 탈보호 후 세척으로서, 유사한 샘플 카트 세척 절차를 수행한다. 모든 사용된 커플링 후 용매를 폐기물 탱크로 폐기한다. 커플링 후 NBP/THF 세척을 위한 재료 사용에 대해서는 표 32에 요약하였다.

결과 요약

Boc-Tyr 1의 커플링 후, 메틸렌 클로라이드를 사용하여 수지를 세척하고, 건조한다. 다음에, 30 % 헥사플루오로-2-프로판올/메틸렌 클로라이드 (v/v)를 사용하여 샘플을 약하게 절단하고, UPLC-MS 분석용으로 단리한다. RB1, RB2 및 RB3에서의 생성되는 TZP 사량체 순도는 각각 92.19 %, 94.64 % 및 98.04 %이다. 주 불순물은 글루탐산 부가물이다. 이는 주로 실시예에서 적용된 이중 글루탐산 커플링 전략에 기인한다. Fmoc-Gly-CTC 탈보호 전의 더 긴 수지 팽창 시간 (> 8시간)에 의해 Gly4 탈보호 및 Glu3 커플링의 과제가 완화될 수 있다는 것을 알아야 한다. 예를 들면, 1 mmol 규모에서 NBP/2-MeTHF (1.5;1, v:v) 환경친화 용매를 사용한 12시간 수지 팽창에 의해 99.6 % TZP 사량체 순도가 수득된다. 이와 같은 이유로, 더 최적인 공정 조건하에서 NBP/퓨란 환경친화 용매 및 직렬-반응기 기술을 사용하면, 상당한 펩티드 순도 개선이 달성될 수 있다. NBP/THF 환경친화 용매를 사용한 직렬-반응기 방법의 경우, TZP 사량체를 제조하는 데에 개시 수지 mmol 당 252.71 g의 총 재료 (용매, 수지를 제외한 시약)가 이용된다. DMF를 사용하는 통상적인 배치 방법은 218.8 g/mmol을 사용하였으며, DMF를 사용하는 직렬 반응기 방법은 118.9 mmol을 사용하였다. NBP/THF를 사용하는 절차는 신규한 것이었으며, 최적화되지는 않았는데, 그것이 DMF를 사용한 절차에 비해 더 많은 총 용매를 사용하였다. 그러나, 어느 한 용매 시스템에서, 직렬 반응기는 여전히 단일 배치 반응기에 비해 더 적은 용매를 사용한다.

Claims

소정량의 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기를 각각 함유하는 제1 반응기 및 제2 반응기를 수득하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기에 첨가하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기에 첨가하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제거하는 것;
용매를 사용하여 제1 및 제2 반응기 둘 다 내의 펩티드 합성 수지를 세척하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기에 첨가하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기에 첨가하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기로부터 제거하는 것; 및
용매를 사용하여 제1 및 제2 반응기 둘 다 내의 펩티드 합성 수지를 세척하는 것
을 포함하는, 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기에 아미노산 "X"를 커플링시키는 방법.
제1항에 있어서, 제1 및 제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르에서 발견되는 아미노산 "X" 자체가 보호된 N-기를 갖는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제1 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지고, 제3 반응기는 소정량의 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기를 함유하는 것; 및
제2 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제2 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것.
제3항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것; 및
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것.
제4항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제3 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 제3 양의 탈-보호 시약은 제2 양의 탈-보호 시약이 제1 반응기로부터 제거된 후에 제1 반응기에 첨가되는 것; 및
제3 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달하며, 여기서 이러한 전달은 제2 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것; 및
제3 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제3 반응기로 전달하는 것; 및
제3 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기로부터 제거하는 것.
제5항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제3 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 제1 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것;
제3 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기로 전달하며, 여기서 이러한 전달은 제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것;
제3 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기로부터 제3 반응기로 전달하는 것; 및
제3 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기로부터 제거하는 것.
제6항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기로부터 제거하는 것; 및
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 다시 제1 반응기에 첨가하는 것.
제7항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기로부터 제거하는 것; 및
제1 양의 탈-보호 시약을 다시 제1 반응기에 첨가하는 것.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 반응기를 팽창시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르 및 제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 용매와 사전-혼합되는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 용매를 사용하여 제1 및 제2 반응기를 세척하는 것이 반응기에 용매를 첨가하는 것에 의해 이루어지는 것인 방법.
제2항에 있어서, 제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 제1 반응기로부터 제거된 후, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 추가량의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 추가량의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달하는 것;
제2 추가량의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 추가량의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제거하는 것;
제2 추가량의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달하는 것;
제2 추가량의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제거하는 것.
제12항에 있어서, 제2 추가량의 탈-보호 시약이 제1 반응기로부터 제거된 후, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 양의 아미노산 "Z" 활성화 에스테르를 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 아미노산 "Z" 활성화 에스테르를 제2 반응기로 전달하는 것;
제2 양의 아미노산 "Z" 활성화 에스테르를 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 아미노산 "Z" 활성화 에스테르를 제2 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 아미노산 "Z" 활성화 에스테르를 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달하는 것; 및
제2 양의 아미노산 "Z" 활성화 에스테르를 제2 반응기로부터 제거하는 것.
제13항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 추가량의 탈-보호 시약을 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제1 추가량의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지고, 제3 반응기는 소정량의 아미노산 "X" 활성화 에스테르의 보호된 N-기를 함유하는 것; 및
제2 추가량의 탈-보호 시약을 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제2 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것.
제14항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 양의 아미노산 "Z" 활성화 에스테르를 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제1 양의 아미노산 "Z"가 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것; 및
제2 양의 아미노산 "Z" 활성화 에스테르를 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제2 양의 아미노산 "Z" 활성화 에스테르가 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 반응기 내 펩티드 합성 수지가 세이버 또는 링크 수지인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 반응기 내 펩티드 합성 수지가 왕 수지 또는 CTC 수지인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 첨가되는 아미노산 X의 양이 1.1 내지 1.6 당량인 방법.
제1 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기에 첨가하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기에 첨가하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제거하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기에 첨가하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기에 첨가하는 것; 및
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기로부터 제거하는 것
을 포함하는, 제1 반응기 및 제2 반응기 내에서 발견되는 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기에 아미노산 "X"를 커플링시키는 방법.
제19항에 있어서, 제1 및 제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르에서 발견되는 아미노산 "X" 자체가 보호된 N-기를 갖는 것인 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제1 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지고, 제3 반응기는 소정량의 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기를 함유하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제2 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것;
제3 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 제3 양의 탈-보호 시약은 제2 양의 탈-보호 시약이 제1 반응기로부터 제거된 후에 제1 반응기에 첨가되는 것; 및
제3 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달하며, 여기서 이러한 전달은 제2 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것;
제3 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제3 반응기로 전달하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 제3 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것; 및
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기로부터 제거하는 것.
제21항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제3 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 제1 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것;
제3 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기로 전달하며, 여기서 이러한 전달은 제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것;
제3 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기로부터 제3 반응기로 전달하는 것;
제3 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기로부터 제거하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 다시 제1 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르의 첨가는 제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르가 제3 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것.
소정량의 펩티드 합성 수지에 부착된 탈-보호된 N-기를 각각 함유하는 제1 반응기 및 제2 반응기를 수득하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기에 첨가하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기에 첨가하는 것; 및
제2 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제2 반응기로부터 제거하는 것
을 포함하는, 펩티드 합성 수지에 부착된 탈-보호된 N-기에 아미노산 "X"를 커플링시키는 방법.
제23항에 있어서, 용매를 사용하여 제1 반응기 및 제2 반응기를 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제1 양의 아미노산 "X"가 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지고, 제3 반응기는 소정량의 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기를 함유하는 것;
제1 양의 아미노산 "X" 활성화 에스테르를 제3 반응기로부터 제거하는 것; 및
제2 양의 아미노산 "X"를 제3 반응기에 첨가하는 것.
제25항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제3 양의 아미노산 "X"를 제1 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 제3 양의 아미노산 "X"가 제2 양의 아미노산 "X"가 제1 반응기로부터 제거된 후에 제1 반응기에 첨가되는 것; 및
제3 양의 아미노산 "X"를 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달하며, 여기서 이러한 전달은 제2 양의 아미노산 "X"가 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것.
제26항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제2 양의 아미노산 "X"를 제3 반응기로부터 제거하는 것;
제3 양의 아미노산 "X"를 제2 반응기로부터 제3 반응기로 전달하는 것;
제3 양의 아미노산 "X"를 제3 반응기로부터 제거하는 것; 및
제1 양의 아미노산 "X"를 다시 제1 반응기에 첨가하며, 여기서 제1 양의 아미노산 "X"는 제1 양의 아미노산 "X" 탈-보호 시약이 제3 반응기로부터 제거된 후에 다시 제1 반응기에 첨가되는 것.
소정량의 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기를 각각 함유하는 제1 반응기 및 제2 반응기를 수득하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기에 첨가하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제거하는 것;
제2 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기에 첨가하는 것; 및
제2 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제거하는 것
을 포함하는, 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기를 탈-보호시키는 방법.
제28항에 있어서, 용매를 사용하여 제1 반응기 및 제2 반응기를 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제28항 또는 제29항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제1 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제1 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지고, 제3 반응기는 소정량의 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기를 함유하는 것;
제1 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기로부터 제거하는 것; 및
제2 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 첨가는 제2 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것.
제30항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제3 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기에 첨가하며, 여기서 이러한 제3 양의 탈-보호 시약은 제2 양의 탈-보호 시약이 제1 반응기로부터 제거된 후에 제1 반응기에 첨가되는 것; 및
제3 양의 탈-보호 시약을 제1 반응기로부터 제2 반응기로 전달하며, 여기서 이러한 전달은 제2 양의 탈-보호 시약이 제2 반응기로부터 제거된 후에 이루어지는 것.
제31항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는 방법:
제2 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기로부터 제거하는 것;
제3 양의 탈-보호 시약을 제2 반응기로부터 제3 반응기로 전달하는 것;
제3 양의 탈-보호 시약을 제3 반응기로부터 제거하는 것; 및
제1 양의 탈-보호 시약을 다시 제1 반응기에 첨가하며, 여기서 제1 양의 탈-보호 시약은 제1 양의 탈-보호 시약이 제3 반응기로부터 제거된 후에 다시 제1 반응기에 첨가되는 것.
소정량의 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기를 각각 함유하는 제1 반응기 및 제2 반응기를 포함하는, 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기의 탈-보호 시스템.
소정량의 펩티드 합성 수지에 부착된 보호된 N-기를 각각 함유하는 제1 반응기 및 제2 반응기를 포함하는, 펩티드 합성 수지에 부착된 탈-보호된 N-기에 아미노산 "X"를 커플링시키는 시스템.
제1 반응기 및 LCMS 장치를 포함하는, 펩티드 합성 수지에 부착된 탈-보호된 N-기에 아미노산 "X"를 커플링시키는 시스템이며, 반응기로부터의 슬러리를 자동으로 샘플링하고 수지로부터 펩티드를 절단하며 관능기를 탈보호시키는 시스템.
제35항에 있어서, 반응의 개시, 중간 또는 종료시에 반응기로부터 샘플이 송부되는 것인 시스템.
제35항에 있어서, 반응의 개시, 중간 및 종료시에 반응기로부터 샘플이 송부되는 것인 시스템.
제35항에 있어서, 반응기가 배치 반응기인 시스템.
제35항에 있어서, 카이저 시험을 사용하지 않는 시스템.
제35항에 있어서, 또한 절단된 펩티드 용액을 액체 크로마토그래피 희석제 중에 희석하고, 액체 크로마토그래피 주입 루프로 용액을 수송하고, 절단 반응기로부터 폐 수지 비드를 플러싱하여 폐기하는 시스템.
제40항에 있어서, 용액 액체 액체 크로마토그래피 주입 루프에 기포가 없는 것인 시스템.