CN1351663A - 病毒变体 - Google Patents
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Abstract
本发明一般涉及对特定药剂敏感性下降和/或与免疫试剂相互作用性降低的病毒变体。更具体而言,本发明是指乙型肝炎病毒变体,该变体对核苷类似物呈现完全或部分的抗性,和/或对病毒表面成分抗体的相互作用性包括敏感性下降。本发明另外涉及该类病毒变体的检测方法,该方法用于监控抗病毒治疗方案,以及开发新的或改进的抗病毒尤其是乙型肝炎病毒变体的疫苗。
Description
发明领域
本发明一般涉及对特定药剂敏感性下降和/或与免疫试剂相互作用活性降低的病毒变体。更具体而言，本发明是指乙型肝炎病毒变体，该变体对核苷类似物呈现完全或部分的抗性，和/或对病毒表面成分抗体的相互作用性包括敏感性下降。本发明另外涉及该类病毒变体的检测方法，该方法可用于监控抗病毒治疗方案，以及开发新的或改进的抗病毒尤其是乙型肝炎病毒变体的疫苗。
发明背景
本说明书中引用了大量文献，其参考书目细节罗列于篇末。
此处氨基酸序列中的特定突变表示为“Xaa1nXaa2”，其中Xaa1是突变前的原始氨基酸残基，n是残基编号，Xaa2是突变氨基酸。缩写“Xaa”可以是三字母或单字母(如“X”)码。乙型肝炎病毒DNA聚合酶的氨基酸残基按基序Tyr Met Asp Asp(YMDD)中甲硫氨酸残基号码为550进行编号。
乙型肝炎病毒(HBV)可引起衰弱的病态，并导致急性肝衰竭。HBV是一种DNA病毒，经由RNA中间体利用反转录策略进行复制(1)。HBV基因组具有复杂的部分双链DNA结构，编码表面、核心、聚合酶和X基因的开放阅读框架相重叠。HBV基因组的复杂特征如图1所示。
HBV DNA聚合酶的存在使人认为核苷类似物能够用作有效的抗病毒剂。目前试验的核苷类似物的例子有喷昔洛韦(Penciclovir)及其口服形式法昔洛韦(Famciclovir)(2，3，4，5)、拉米夫定(Lamivudine)(6，7)。阿德福韦(Adefovir)已显示有效的体外抗HBV活性。这些核苷酸类似物通常与乙肝病毒免疫球蛋白(HBIG)治疗联用，它们有可能用于治疗慢性HBV感染。
Penciclovir已显示具有高效的体外抑制鸭子HBV DNA合成的活性，以及体外抑制HBV DNA聚合酶-反转录酶活性(8，9)。类似地，已证明口服Famciclovir可体内抑制鸭子HBV病毒的肝内复制(10)。对人而言，Famciclovir使一个同位肝移植(orthotopic livertransplantation，OLT)后的严重乙型肝炎患者的HBV DNA复制减少(11)。
在产生本发明的工作中，使用了核苷类似物抗病毒治疗控制OLT后严重复发的HBV感染(12)。当患者处于免疫抑制以及HBV复制速率很高时，必须进行长程治疗。然而，在类似感染性药剂长程化疗的情况下，有可能引起对所用治疗药剂的抗性，或者敏感性下降。另外，一些患者在OLT前对Famciclovir没有反应，可能由于患者不能代谢Famciclovir或者患者感染了Famciclovir抗性的HBV变体。
根据本发明，发明者鉴定了带有HBV DNA聚合酶基因突变的HBV变体，不同程度地降低了HBV对核苷类似物的敏感性。鉴定这些HBV变体是重要的，可用于开发监控核苷类似物治疗方案的方法，以及筛选可掩饰突变效应的制剂，即开发新疫苗。另外，既然HBV基因组包含一系列重叠的开放阅读框架，一个开放阅读框架中的一个核苷酸突变可以影响到另一个开放阅读框架的翻译产物。又根据本发明，发明者观察到与针对病毒表面成分的免疫试剂(例如抗体和免疫细胞)相互作用性降低的突变。由于这些病毒变体有可能逃逸现有的免疫记忆，此处记为“逃逸突变”。
发明概述
贯穿本说明书，除非上下文另外需要，词语“包含”理解为包括一个所述成分或整数或者成分或整数组，但并不排除任何其他的成分或整数或者成分或整数组。
以序列标识符的形式提交核苷酸和氨基酸序列，即<400>1、<400>2等，序列表列于权力要求书之后。
本发明一方面是指经由RNA中间体复制的分离DNA病毒变体，其中所述变体的DNA聚合酶编码基因包含一个核苷酸突变，导致所述DNA聚合酶至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
本发明另一方面提供了经由RNA中间体复制的分离DNA病毒变体，其中所述变体的病毒表面成分编码基因包含一个核苷酸突变，导致所述病毒表面成分至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
本发明再一方面指经由RNA中间体复制的分离DNA病毒变体，其中所述变体的至少两个开放阅读框架的重叠部分包含一个核苷酸突变，导致所述开放阅读框架翻译产物有氨基酸增加、替换和/或缺失。本发明还有一方面提供了HBV变体，该变体编码DNA聚合酶的核苷酸序列中包含一个突变，导致所述DNA聚合酶列于式I的一个或多个氨基酸中有氨基酸增加、替换和/或缺失：
式IS Z1L S W L S L D V S A A F Y H Z2P L H P A A M P H L L Z3G S S G L Z4R Y V A RL S S Z5S Z6Z7X N Z8Q Z9Z10X X X Z11L H Z12Z13C S R Z14L Y V S L Z15L L Y Z16TZ17G Z18K L H L Z19Z20H P I Z21L G F R K Z22P M G Z23G L S P F L L A Q F T S A I Z24Z25Z26Z27Z28R A F Z29H CZ30Z31F Z32Y M* D D Z33V L G A Z34Z35Z36Z37H Z38E Z39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z46L L Z47Z48G I H L N P Z49K T K R W G Y S L N F M G Y Z50I G
其中：
X 是任意氨基酸
Z1 是N或D；
Z2 是I或P；
Z3 是I或V；
Z4 是S或D；
Z5 是T或N；
Z6 是R或N；
Z7 是N或I；
Z8 是N或Y或H；
Z9 是H或Y；
Z10 是G或R；
Z11 是D或N；
Z12 是D或N；
Z13 是S或Y；
Z14 是N或Q；
Z15 是L或M；
Z16 是K或Q；
Z17 是Y或F；
Z18 是R或W；
Z19 是Y或L；
Z20 是S或A；
Z21 是I或V；
Z22 是I或L；
Z23 是V或G；
Z24 是C或L；
Z25 是A或S；
Z26 是V或M；
Z27 是V或T；
Z28 是R或C；
Z29 是F或P；
Z30 是L或V；
Z31 是A或V；
Z32 是S或A；
Z33 是V或L或M；
Z34 是K或R；
Z35 是S或T；
Z36 是V或G；
Z37 是Q或E；
Z38 是L或S或R；
Z39 是S或F；
Z40 是F或Y；
Z41 是T或A；
Z42 是A或S；
Z43 是V或I；
Z44 是T或C；
Z45 是N或S；
Z46 是F或V；
Z47 是S或D；
Z48 是L或V；
Z49 是N或Q；
Z50 是V或I；并且
M* 是氨基酸550；条件是该突变不单独位于C结构域YMDD基序内，并且其中所述变体对核苷类似物的敏感性降低。
本发明另一方面涉及HBV变体，该变体在编码病毒表面成分的核苷酸序列中包含突变，导致所述病毒表面成分列于式I的氨基酸序列的相应区域中有氨基酸增加、替换和/或缺失，其中该变体与针对所述病毒表面成分的免疫试剂的相互作用性下降。
本发明再一方面还提供了HBV变体，该变体在编码病毒表面成分的核苷酸序列中包含突变，导致所述病毒表面成分位于HBV表面抗原的67-226位氨基酸区域或功能相当区域中有氨基酸增加、替换和/或缺失，其中该变体与针对所述病毒表面成分的免疫试剂的相互作用性下降。
本发明另一方面提供了HBV变体，在该变体基因组的重叠开放阅读框架中包含突变，其中所述突变位于HBV DNA聚合酶的F和A-E结构域中的一个或多个所处区域内，条件是不单独位于C结构域的YMDD基序内；以及在HBV表面抗原67-226位氨基酸对应的重叠区域内；并且其中所述变体对核苷酸类似物的敏感性降低，以及与特异针对HBV表面抗原的免疫试剂的相互作用性下降。
本发明还有另一方面涉及检测HBV对核苷类似物敏感性降低的可能性的方法，所述方法包含从该HBV分离DNA或相应mRNA，并在HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，该突变导致所述DNA聚合酶的F和A-E结构域中的一个或多个区域或其邻近区域中发生至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失，其中存在该突变表明可能对该核苷类似物有抗性。
本发明另有一方面提供检测HBV与针对HBV表面抗原的抗体相互作用性降低的可能性的方法，所述方法包含从该HBV分离DNA或相应mRNA，并在编码HBV表面抗原的核苷酸序列中筛选突变，该突变导致所述HBV表面抗原的67-226位氨基酸内或最接近该表面抗原的区域中的至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失，其中存在该突变表明该抗体可能对所述突变表面抗原的相互作用性降低。
本发明另一方面涉及检测HBV分离物是否编码变异的DNA聚合的方法，所述方法包含直接或由核苷酸序列测定其DNA聚合酶的氨基酸序列，并比较与下列氨基酸序列的一致性：
式IS Z1L S W L S L D V S A A F Y H Z2P L H P A A M P H L L Z3G S S G L Z4R Y V A RL S S Z5S Z6Z7X N Z8Q Z9Z10X X X Z11L H Z12Z13C S R Z14L Y V S L Z15L L Y Z16TZ17G Z18K L H L Z19Z20H P I Z21L G F R K Z22P M G Z23G L S P F L L A Q F T S A I Z24Z25Z26Z27Z28R A F Z29H C Z30Z31F Z32Y M* D D Z33V L G A Z34Z35Z36Z37H Z38E Z39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z46L L Z47Z48G I H L N P Z49K T K R W G Y S L N F M G Y Z50I G
其中：
X 是任意氨基酸
Z1 是N或D；
Z2 是I或P；
Z3 是I或V；
Z4 是S或D；
Z5 是T或N；
Z6 是R或N；
Z7 是N或I；
Z8 是N或Y或H；
Z9 是H或Y；
Z10 是G或R；
Z11 是D或N；
Z12 是D或N；
Z13 是S或Y；
Z14 是N或Q；
Z15 是L或M；
Z16 是K或Q；
Z17 是Y或F；
Z18 是R或W；
Z19 是Y或L；
Z20 是S或A；
Z21 是I或V；
Z22 是I或L；
Z23 是V或G；
Z24 是C或L；
Z25 是A或S；
Z26 是V或M；
Z27 是V或T；
Z28 是R或C；
Z29 是F或P；
Z30 是L或V；
Z31 是A或V；
Z32 是S或A；
Z33 是V或L或M；
Z34 是K或R；
Z35 是S或T；
Z36 是V或G；
Z37 是Q或E；
Z38 是L或S或R；
Z39 是S或F；
Z40 是F或Y；
Z41 是T或A；
Z42 是A或S；
Z43 是V或I；
Z44 是T或C；
Z45 是N或S；
Z46 是F或V；
Z47 是S或D；
Z48 是L或V；
Z49 是N或Q；
Z50 是V或I；并且
M* 是氨基酸550；
本发明另一方面还涉及分离的变异HBV表面抗原、或重组体、或其衍生形式、或其化学等价物，其中所述表面抗原、或重组体、或其衍生形式、或其化学等价物与参照HBV的表面抗原相比，具有不同的免疫学特性。
本发明另一方面还提供了一种HBV疫苗，其中包含一种或多种携带可改变表面抗原的突变(不包括G145R)的HBV变体。
本发明另一方面还提供了一种组合物，其中包含一种变体HBV、或一种来自该变体HBV的HBV表面抗原、或重组体、或其衍生形式、或其化学等价物，以及一种或多种可药用的载体或稀释剂。
本发明另一方面更提供了分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体在制备治疗和/或预防肝炎的药剂中的用途，其中所述变体的DNA聚合酶编码基因包含核苷酸突变，导致所述DNA聚合酶有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
本发明另一方面也提供了分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体在制备治疗和/或预防肝炎的药剂中的用途，其中所述变体的病毒表面成分编码基因包含核苷酸突变，导致所述病毒表面成分有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
本发明另一方面提供了分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体在制备治疗和/或预防肝炎的药剂中的用途，其中所述变体的至少两个开放阅读框架的重叠部分包含核苷酸突变，导致所述开放阅读框架的翻译产物有氨基酸增加、替换和/或缺失。
附图简述
图1图解HBV的部分双链DNA基因组，表明编码表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X基因的重叠开放阅读框架。
图2表示HBV结构域A-E(下划线)的保守区。YMDD中M的氨基酸编号指定为550，*代表在该位置共有序列中有3个以上氨基酸的可能性。
优选实施案详述
如前所述，本发明一方面是指分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体，其中所述变体的DNA聚合酶编码基因包含核苷酸突变，导致所述DNA聚合酶有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
本发明另一方面提供了分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体，其中所述变体的病毒表面成分编码基因包含核苷酸突变，导致所述病毒表面成分有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
本发明再一方面是指分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体，至少其中所述变体的至少两个开放阅读框架的重叠部分包含核苷酸突变，导致所述开放阅读框架的翻译产物有氨基酸增加、替换和/或缺失。
优选地，该DNA病毒是肝炎病毒或相关病毒，最优选是HBV。
根据本发明，“相关病毒”是在遗传学、免疫学、流行病学和/或生物化学水平相关联的病毒。
优选地，DNA聚合酶的突变导致HBV对核苷类似物的敏感性下降。
优选地，病毒表面成分的突变降低了与针对病毒表面成分的免疫试剂(例如抗体和免疫细胞)的相互作用性。最优选地，病毒表面成分是病毒表面抗原。与针对病毒表面成分的免疫试剂的相互作用性降低通常包括丧失识别或基本上识别病毒表面成分的免疫记忆。
根据本发明的优选方面，病毒变体可以仅仅DNA聚合酶或表面抗原有突变，或者两个分子都有。所用术语“突变”具有最广义的内涵，可以包括基本不影响DNA聚合酶或表面抗原正常功能的沉默突变，或者是对核苷类似物抗性具有选择性效应的活性突变，或是逃逸突变表型。根据本发明的多个突变或由单一突变产生的多个表型，至少一个突变必须是活性突变，或该病毒必须至少改变一个表型，例如核苷类似物抗性或对病毒表面抗原的免疫相互作用性降低。
HBV聚合酶一些区域与其它RNA依赖性的DNA聚合酶和RNA依赖性聚合酶具有氨基酸相似性(13)。本发明涵盖HBV DNA聚合酶的所有结构域，特别是结构域F和A-E。本说明书特别引用了Poch等人(13)定义的结构域A-E保守区(又见文献18)。A-E区由以下式I所列氨基酸序列定义：
式IS Z1L S W L S L D V S A A F Y H Z2P L H P A A M P H L L Z3G S S G L Z4R Y V A RL S S Z5S Z6Z7X N Z8Q Z9Z10X X X Z11L H Z12Z13C S R Z14L Y V S L Z15L L Y Z16TZ17G Z18K L H L Z19Z20H P I Z21L G F R K Z22P M G Z23G L S P F L L A Q F T S A I Z24Z25Z26Z27Z28R A F Z29H C Z30Z31F Z32Y M* D D Z33V L G A Z34Z35Z36Z37H Z38E Z39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z46L L Z47Z48G I H L N P Z49K T K R W G Y S L N F M G Y Z50I G
其中：
X 是任意氨基酸
Z1 是N或D；
Z2 是I或P；
Z3 是I或V；
Z4 是S或D；
Z5 是T或N；
Z6 是R或N；
Z7 是N或I；
Z8 是N或Y或H；
Z9 是H或Y；
Z10 是G或R；
Z11 是D或N；
Z12 是D或N；
Z13 是S或Y；
Z14 是N或Q；
Z15 是L或M；
Z16 是K或Q；
Z17 是Y或F；
Z18 是R或W；
Z19 是Y或L；
Z20 是S或A；
Z21 是I或V；
Z22 是I或L；
Z23 是V或G；
Z24 是C或L；
Z25 是A或S；
Z26 是V或M；
Z27 是V或T；
Z28 是R或C；
Z29 是F或P；
Z30 是L或V；
Z31 是A或V；
Z32 是S或A；
Z33 是V或L或M；
Z34 是K或R；
Z35 是S或T；
Z36 是V或G；
Z37 是Q或E；
Z38 是L或S或R；
Z39 是S或F；
Z40 是F或Y；
Z41 是T或A；
Z42 是A或S；
Z43 是V或I；
Z44 是T或C；
Z45 是N或S；
Z46 是F或V；
Z47 是S或D；
Z48 是L或V；
Z49 是N或Q；
Z50 是V或I；并且
M* 是氨基酸550；
优选地，突变导致结构域F和A-E中任何一个或多个或者接近HBVDNA聚合酶的区域的氨基酸序列改变。本发明并未涵盖仅在HBV DNA聚合酶C结构域YMDD基序的突变，而若该突变与其它位置的一个或多个突变联合发生，则也在本发明之内。
病毒表面成分的突变优选地位于该蛋白主要亲水区的一个或多个氨基酸残基，特别是在HBV病毒表面抗原的67-226位氨基酸序列内。
根据本发明的优选方面，提供了一种HBV变体，该变体的DNA聚合酶编码核苷酸序列中包含突变，导致列于式I的所述DNA聚合酶中的一个或多个氨基酸有氨基酸增加、替换和/或缺失：
式IS Z1L S W L S L D V S A A F Y H Z2P L H P A A M P H L L Z3G S S G L Z4R Y V A RL S S Z5S Z6Z7X N Z8Q Z9Z10X X X Z11L H Z12Z13C S R Z14L Y V S L Z15L L Y Z16TZ17G Z18K L H L Z19Z20H P I Z21L G F R K Z22P M G Z23G L S P F L L A Q F T S A I Z24Z25Z26Z27Z28R A F Z29H C Z30Z31F Z32Y M*D D Z33V L G A Z34Z35Z36Z37H Z38E Z39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z46L L Z47Z48G I H L N P Z49K T K R W G Y S L N F M G Y Z50I G
其中：
X 是任意氨基酸
Z1 是N或D；
Z2 是I或P；
Z3 是I或V；
Z4 是S或D；
Z5 是T或N；
Z6 是R或N；
Z7 是N或I；
Z8 是N或Y或H；
Z9 是H或Y；
Z10 是G或R；
Z11 是D或N；
Z12 是D或N；
Z13 是S或Y；
Z14 是N或Q；
Z15 是L或M；
Z16 是K或Q；
Z17 是Y或F；
Z18 是R或W；
Z19 是Y或L；
Z20 是S或A；
Z21 是I或V；
Z22 是I或L；
Z23 是V或G；
Z24 是C或L；
Z25 是A或S；
Z26 是V或M；
Z27 是V或T；
Z28 是R或C；
Z29 是F或P；
Z30 是L或V；
Z31 是A或V；
Z32 是S或A；
Z33 是V或L或M；
Z34 是K或R；
Z35 是S或T；
Z36 是V或G；
Z37 是Q或E；
Z38 是L或S或R；
Z39 是S或F；
Z40 是F或Y；
Z41 是T或A；
Z42 是A或S；
Z43 是V或I；
Z44 是T或C；
Z45 是N或S；
Z46 是F或V；
Z47 是S或D；
Z48 是L或V；
Z49 是N或Q；
Z50 是V或I；并且
M* 是氨基酸550；条件是该突变不单独位于C结构域YMDD基序内，并且其中所述变体对核苷类似物的敏感性降低。
本发明另一优选方面涉及HBV变体，该变体编码病毒表面成分的核苷酸序列包含突变，导致所述病毒表面成分列于式I的氨基酸序列的相应区域中有氨基酸增加、替换和/或缺失，其中该变体与针对所述病毒表面成分的免疫试剂的相互作用性下降。
本发明还有一优选方面提供了HBV变体，该变体编码病毒表面成分的核苷酸序列包含突变，导致所述病毒表面成分位于HBV表面抗原的67-226位氨基酸的区域或功能相当区域中有氨基酸增加、替换和/或缺失，其中该变体与针对所述病毒表面成分的免疫试剂的相互作用性下降。
本发明又有一优选方面是指HBV变体，在该变体基因组的重叠开放阅读框架中包含突变，其中所述突变位于HBV DNA聚合酶F和A-E结构域中的一个或多个所处区域内，条件是不单独位于C结构域的YMDD基序内；以及在HBV表面抗原67-226位氨基酸对应的重叠区域内；并且其中所述变体对核苷酸类似物的敏感性降低，以及与特异针对HBV表面抗原的免疫试剂的相互作用性下降。
一个特别的突变是M550I/V，先前已在lamivudine治疗后述及。因其在只用lamivudine治疗后出现，本发明并未涵盖该突变。M550V突变与L562M突变一起筛出，也不在本发明范围之内。
本发明并未涵盖在lamivudine单独治疗后筛选的下列lamivudine抗性突变，但涵盖famciclovir(FCV)治疗中筛选的这些突变：L428M，T481C，T496A，L497F，V509I，V519L，L526M，T530S，A546V，F548V，M550I，V553I，S559T，Q561H，S565A，A568T，I570S，L575M，L581I，N584S(16，29，30，31，32，33，34，35，36，37，40，41，42，45).
此外，本发明不涵盖下述公开的famciclovir筛选的突变：S424T，Del 462-468，I509V，V519L，P523L，L526M，L526V，A528T，T530S，V553I，S565A，I570V，N594H(38，39，41，43，44，46).
对免疫试剂相互作用性降低的病毒变体是逃逸突变，抗体或预先接触病毒的其它HBV免疫反应或后续的疫苗接种针对病毒表面成分不再有效，因为突变改变了表面抗原的B-和/或T-细胞表位。
术语“抗性”也包含对核苷酸类似物或免疫试剂的敏感性减少或降低。术语“抗性”使用其最普遍的含义，包括对核苷类似物完全或部分的抗性或降低的敏感性。
优选地，变体以分离形式存在，即至少经由一个纯化步骤从天然体液中分离。替代地，变体可以保存在分离的体液中，或以DNA形式存在。本发明也涉及包含源自HBV变体基因组或其部分的感染性分子克隆。
HBV DNA聚合酶和/或表面抗原的优选突变包括，从经famciclovir和HBIG治疗后HBV复发的患者以及依据HBV DNA和/或病毒蛋白减少显示对famciclovir治疗没反应的患者中筛选的变体。
HBV DNA聚合酶的优选突变连同表面抗原相应突变(括号内所示)，包括例如从经famciclovir和HBIG治疗后HBV复发的患者中筛选得到的L423L/M/V(I68I/M)、L423L/F(C69F/L)、H436H/Y、H436Y、DEL471-474(DELl17-120)、S438T、W499E(D144E、G145R)、I508V、V519L(E164D)、L526M、S565A(S210R)、N584S、N/S/H584N/K、R588R/K和N594H；以及例如从对famciclovir没反应的患者中筛选得到的H436N/H、S463S/Y(L109I/L)、V537V/I(C/W182Y/STOP)、V/G560E(Y206N)、S/F565A/S(S210R/S)、S/F565A(S210R)、N/Q584H、K587R和N594H中的一个或多个。表面抗原的优选突变包括在仅乙型肝炎病毒免疫球蛋白(HBIG)治疗后得到的V96A、C138R、P142T/P、K160K/N和A194G/A中的一个或多个。写法“DEL”表示“缺失”，“STOP”表示终止密码子。
位于乙肝表面抗原的突变G145R单独或与D144E突变(23)一起，如果是未经famciclovir治疗而筛选得到，则不受本发明涵盖。
HBV DNA聚合酶的特别优选突变连同表面抗原相应突变(括号内所示)，包括例如从经famciclovir和HBIG治疗后HBV复发的患者中筛选得到的L423L/M/V(I68I/M)、H436H/Y、H436Y、DEL471-474(DEL117-120)、W499E(D144E和G145R)、V519L(E164D)、N/S/H584N/K和R588R/K；以及例如从对famciclovir治疗后没反应的患者中筛选得到的H436H/N、S463S/Y(L109I/L)、V537V/I(C/W182Y/STOP)和K587R中的一个或多个。
为鉴定本发明的变体而产生了一系列检测这些变体的方法。检测这些变体对于鉴定抗性变体，以确定适合的化疗形式和/或监控疫苗接种方案、开发新的或改进的疫苗制剂是重要的。
因而本发明另一方面涉及确定HBV对核苷类似物敏感性下降的可能性的方法，所述方法包含从该HBV分离DNA或相应mRNA，并在编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，该突变导致所述DNA聚合酶的A-E结构域中的一个或多个区域或最接近区域内有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失，其中存在该突变表明对该核苷类似物可能有抗性。
本发明另一方面提供检测HBV与针对HBV表面抗原的抗体相互作用性降低的可能性的方法，所述方法包含从该HBV分离DNA或相应mRNA，并在编码HBV表面抗原的核苷酸序列中筛选突变，该突变导致所述表面抗原的67-226位氨基酸或最接近区域中有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失，其中存在该突变表明该抗体对所述突变表面抗原的相互作用性可能降低。
优选地，该分析方法可检测下述HBV DNA聚合酶突变(连同括号内所示表面抗原相应突变)中的一个或多个：例如从经famciclovir和HBIG治疗后HBV复发的患者中筛选得到的L423L/M/V(I68I/M)、L423L/F(C69F/L)、H436H/Y、H436Y、DEL471-474(DEL117-120)、S438T、W499E(D144E、G145R)、I508V、V519L(E164D)、L526M、S565A(S210R)、N584S、N/S/H584N/K、R588R/K和N594H；以及例如从对famciclovir没反应的患者中筛选得到的H436N/H、S463S/Y(L109I/L)、V537V/I(C/W182Y/STOP)、V/G560E(Y206N)、S/F565A/S(S210R/S)、S/F565A(S210R)、N/Q584H、K587R和N594H。也可以检测下述表面抗原突变中的一个或多个：例如在乙型肝炎病毒免疫球蛋白(HBIG)治疗后得到的V96A、C138R、P142T/P、K160K/N和A194G/A。
更优选地，该分析方法检测下述HBV DNA聚合酶突变(以及括号内所示表面抗原相应突变)中的一个或多个：从经famciclovir和HBIG治疗后HBV复发的患者中筛选得到的L423L/M/V(I68I/M)、H436H/Y、H436Y、DEL471-474(DEL117-120)、W499E(D144E和G145R)、V519L(E164D)、N/S/H584N/K和R588R/K；以及从对famciclovir治疗后没反应的患者中筛选得到的H436H/N、S463S/Y(L109I/L)、V537V/I(C/W182Y/STOP)和K587R。
可以分析DNA或相应RNA，或替代地DNA聚合酶或表面抗原以筛查突变。
根据本发明，该检测可以是任何基于核酸的检测方法，例如核酸杂交技术或聚合酶链式反应(PCR)。本发明另外包含使用所述基于核酸的检测方法的不同分析形式，包括限制性片断长度多态性(RFLP)、扩增片断长度多态性(AFLP)、单链链多态性(SSCP)、扩增和错配检测(AMD)、散布重复序列聚合酶链式反应(IRS-PCR)、反向聚合酶链式反应(iPCR)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，及其它。
本发明涵盖一系列基于免疫学的HBV变体DNA聚合酶或表面抗原的检测方法，这些方法以针对天然HBV DNA聚合酶或表面抗原的抗体为基础，所述抗体不与或基本上不与变体HBV DNA聚合酶或表面抗原相互作用。替代地，使用针对变体HBV DNA聚合酶或表面抗原，而不与或基本上不与天然HBV DNA聚合酶或表面抗原相互作用的抗体。
可以使用单克隆或多克隆抗体，但因其以均一形式大量生产而优选单克隆抗体。大量免疫分析技术可用，如美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653中所述。
可以参照图2所示共有氨基酸序列，方便地检测DNA聚合酶的氨基酸变体，图示多态性代表了各种数据库中HBV活性致病株的变异。若HBV变体包含与图示相异的氨基酸，则推断这是一株DNA聚合酶活性改变的潜在HBV变体。
因此，本发明另一方面涉及确定HBV分离株是否编码变体DNA聚合酶的方法，所述方法包含直接或经由核苷酸序列确定其DNA聚合酶的氨基酸序列，并比较与下列氨基酸序列的一致性：
式IS Z1L S W L S L D V S A A F Y H Z2P L H P A A M P H L LZ3G S S G L Z4R Y V A RL S S Z5S Z6Z7X N Z8Q Z9Z10X X X Z11L H Z12Z13C S RZ14L Y V S L Z15L L Y Z16TZ17G Z18K L H L Z19Z20H P I Z21L G F R K Z22P M G Z23G L S P F L L A Q F T S A I Z24Z25Z26Z27Z28R A F Z29H C Z30Z31F Z32Y M* D D Z33V L G A Z34Z35Z36Z37H Z38E Z39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z46L L Z47Z48G I H L N P Z49K T K R W G Y S L N F M G Y Z50I G
其中：
X 是任意氨基酸
Z1 是N或D；
Z2 是I或P；
Z3 是I或V；
Z4 是S或D；
Z5 是T或N；
Z6 是R或N；
Z7 是N或I；
Z8 是N或Y或H；
Z9 是H或Y；
Z10 是G或R；
Z11 是D或N；
Z12 是D或N；
Z13 是S或Y；
Z14 是N或Q；
Z15 是L或M；
Z16 是K或Q；
Z17 是Y或F；
Z18 是R或W；
Z19 是Y或L；
Z20 是S或A；
Z21 是I或V；
Z22 是I或L；
Z23 是V或G；
Z24 是C或L；
Z25 是A或S；
Z26 是V或M；
Z27 是V或T；
Z28 是R或C；
Z29 是F或P；
Z30 是L或V；
Z31 是A或V；
Z32 是S或A；
Z33 是V或L或M；
Z34 是K或R；
Z35 是S或T；
Z36 是V或G；
Z37 是Q或E；
Z38 是L或S或R；
Z39 是S或F；
Z40 是F或Y；
Z41 是T或A；
Z42 是A或S；
Z43 是V或I；
Z44 是T或C；
Z45 是N或S；
Z46 是F或V；
Z47 是S或D；
Z48 是L或V；
Z49 是N或Q；
Z50 是V或I；并且
M* 是氨基酸550；
本发明另外涉及掩蔽核苷类似物抗性突变的试剂，该试剂在核苷类似物的长程治疗中特别有益。该试剂可以是DNA或RNA或蛋白质类或非蛋白质类化学分子。从植物、珊瑚和微生物中筛选的天然产物也可能是掩蔽试剂的可用来源，该试剂可以是分离形式或药物组合物形式，可以与核苷类似物先后或同时施用。
本发明另外涵盖此处所述HBV变体的分离的表面成分。更具体而言，本发明提供一种分离的表面抗原、或其重组体、或衍生物、或其化学等价物。该分离的表面成分，更具体而言，该分离的表面抗原、或其重组体、或衍生物、或其化学等价物在生物组合物(例如疫苗配方)的开发中有益。
因此，本发明的另一方面涉及一种分离的变体HBV表面抗原、或重组体、或衍生物、或其化学等价物，其中所述表面抗原、或重组体、或衍生物、或其化学等价物与参照HBV的表面抗原相比，具有不同的免疫学性质。更具体而言，本发明提供了一种分离的变体HBV表面抗原、或重组体、或衍生物、或其化学等价物，其中所述HBV表面抗原、或重组体、或衍生物、或其化学等价物包含有单个或多个氨基酸替换、增加和/或缺失的氨基酸序列，或者包含比参照HBV的HBV表面抗原截短的序列，其中针对参照HBV的中和抗体对携带该变体HBV表面抗原的HBV丧失或减弱了其中和活性。
本发明特别涉及一种HBV疫苗，该疫苗含有改变表面抗原的一个或多个突变(不包括G145R)。表面抗原和HBV疫苗中的优选突变包括例如从经famciclovir和HBIG治疗后HBV复发的患者中筛选得到的I68I/M、C69F/L、H436Y、DEL117-120、D144E、E164D、S210R；以及例如从对famciclovir没反应的患者中筛选得到的L109I/L、C/W182Y/STOP、Y206N、S210R/S和S210R中的一个或多个。特别优选的是表面抗原在V96A、C138R、P142T/P、K160K/N和/或A194G/A位点突变的变体。
术语“分离的”与涉及分离的HBV变体同义。
如上所述，本发明涵盖了HBV表面成分的衍生物和化学等价物(即类似物)。衍生物包含HBV表面抗原的单个或多个氨基酸替换、增加和/或缺失。氨基酸序列的“增加”包括与其它肽、多肽或蛋白质的融合，或者与核苷酸序列的融合，包括与其它病毒组分的融合。
本文涵盖的变体HBV表面抗原的类似物包括，但并不限于，侧链修饰、在肽、多肽或蛋白质合成中掺入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及使用交联剂和其它限制蛋白质类分子或其类似物的构象的方法。这些类型的修饰对于稳定用于诊断分析或治疗方案的免疫活性分子有益。
本发明涉及的侧链修饰的例子包括氨基修饰，例如通过与醛反应，随后用NaBH4还原，进行还原型烷基化；用亚氨逐乙酸甲酯脒化；用乙酸酐酰化；用氰酸盐对氨基进行甲氨酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苄基化；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基进行酰基化；以及用吡哆醛-5-磷酸对赖氨酸进行吡哆氧化，随后用NaBH4还原。
精氨酸残基的胍基可以与试剂2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成杂环缩合物进行修饰。
修饰羧基可由碳化二亚胺形成O-酰基异脲而活化，随后发生衍生化，变成例如相应的酰氨化合物。
修饰巯基方法，例如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；过蚁酸氧化成磺基丙氨酸；与其它巯基化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞-4-硝基酚和其它汞制剂形成汞的衍生物；在碱性pH用氰酸盐进行甲氨酰化。
色氨酸残基的修饰可以通过诸如N-溴代琥珀酰亚胺的氧化或2-羟-5-硝基溴化苄或卤化硫苯(sulphenyl halide)的吲哚环烷基化进行。另一方面，酪氨酸残基的改变可以通过四硝基甲烷进行硝基化，形成3-硝基酪氨酸衍生物。
组氨酸残基咪唑环的修饰可通过碘乙酸衍生物的烷基化或通过焦碳酸二乙酯的N-乙酯化进行。
肽合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的例子包括，但不限于，使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基3-羟基-5-苯基戊烷酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、戊氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本文涉及的非天然氨基酸列于下表1，包含这些非天然氨基酸或此处所述其它衍生物可能有助于疫苗组合物中分子的稳定。
表1非常见氨基酸 代码 非常见氨基酸 代码α-氨基丁酸 Abu L-N-甲基丙氨酸 Nmalaα-氨基-α-甲基丁酸酯 Mgabu L-N-甲基精氨酸 Nmarg氨基环丙烷羧酸酯 Cpro L-N-甲基天冬酰胺 Nmasn氨基异丁酸 Aib L-N-甲基天冬氨酸 Nmasp氨基降冰片基羧酸酯 Norb L-N-甲基半胱氨酸 Nmcys环己基丙氨酸 Chexa L-N-甲基谷氨酰胺 Nmgln环戊基丙氨酸 Cpen L-N-甲基谷氨酸 NmgluD-丙氨酸 Dal L-N-甲基组氨酸 NmhisD-精氨酸 Darg L-N-甲基异亮氨酸 NmileD-天冬氨酸 Dasp L-N-甲基亮氨酸 NmleuD-半胱氨酸 Dcys L-N-甲基赖氨酸 NmlysD-谷氨酰胺 Dgln L-N-甲基甲硫氨酸 NmmetD-谷氨酸 Dglu L-N-甲基正亮氨酸 NmnleD-组氨酸 Dhis L-N-甲基戊氨酸 NmnvaD-异亮氨酸 Dile L-N-甲基鸟氨酸 NmornD-亮氨酸 Dleu L-N-甲基苯丙氨酸 NmpheD-赖氨酸 Dlys L-N-甲基脯氨酸 NmproD-甲硫氨酸 Dmet L-N-甲基丝氨酸 NmserD-鸟氨酸 Dorn L-N-甲基苏氨酸 NmthrD-苯丙氨酸 Dphe L-N-甲基色氨酸 NmtrpD-脯氨酸 Dpro L-N-甲基酪氨酸 NmtyrD-丝氨酸 Dser L-N-甲基缬氨酸 NmvalD-苏氨酸 Dthr L-N-甲基乙基甘氨酸 NmetgD-色氨酸 Dtrp L-N-甲基叔丁基甘氨酸 NmtbugD-酪氨酸 Dtyr L-正亮氨酸 NleD-缬氨酸 Dval L-正缬氨酸 NvaD-α-甲基丙氨酸 Dmala α-甲基-氨基异丁酸 MaibD-α-甲基精氨酸 Dmarg α-甲基-γ-氨基丁酸 MgabuD-α-甲基天冬酰胺 Dmasn α-甲基环己基丙氨酸 MchexaD-α-甲基天冬氨酸 Dmasp α-甲基环戊基丙氨酸 McpenD-α-甲基半胱氨酸 Dmcys α-甲基-α-萘基丙氨酸 ManapD-α-甲基谷氨酰胺 Dmgln α-甲基青霉胺 MpenD-α-甲基组氨酸 Dmhis N-(4-氨基丁基)甘氨酸 NgluD-α-甲基异亮氨酸 Dmile N-(2-氨基乙基)甘氨酸 NaegD-α-甲基亮氨酸 Dmleu N-(3-氨基丙基)甘氨酸 NornD-α-甲基赖氨酸 Dmlys N-氨基-α-甲基丁酸 NmaabuD-α-甲基甲硫氨酸 Dmmet α-萘基丙氨酸 AnapD-α-甲基鸟氨酸 Dmorn N-苄基甘氨酸 NpheD-α-甲基苯丙氨酸 dmphe N-(2-氨甲酰基乙基)甘氨酸 NglnD-α-甲基脯氨酸 Dmpro N-(氨甲酰基乙基)甘氨酸 NasnD-α-甲基丝氨酸 Dmser N-(2-羧乙基)甘氨酸 NgluD-α-甲基苏氨酸 Dmthr N-(羧甲基)甘氨酸 NaspD-α-甲基色氨酸 Dmtrp N-环丁基甘氨酸 NcbutD-α-甲基酪氨酸 Dmty N-环庚基甘氨酸 NchepD-α-甲基缬氨酸 Dmval N-环己基甘氨酸 NchexD-N-甲基丙氨酸 Dnmala N-环癸基甘氨酸 NcdecD-N-甲基精氨酸 Dnmarg N-环十二烷基甘氨酸 NcdodD-N-甲基天冬酰胺 Dnmasn N-环辛基甘氨酸 NcoctD-N-甲基天冬氨酸 Dnmasp N-环丙基甘氨酸 NcproD-N-甲基半胱氨酸 Dnmcys N-环十一烷基甘氨酸 NcundD-N-甲基谷氨酰胺 Dnmgln N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸 NbhmD-N-甲基谷氨酸 Dnmglu N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸 NbheD-N-甲基组氨酸 Dnmhis N-(3-胍丙基)甘氨酸 NargD-N-甲基异亮氨酸 Dnmile N-(1-羟乙基)甘氨酸 NthrD-N-甲基亮氨酸 Dnmleu N-(羟乙基)甘氨酸 NserD-N-甲基赖氨酸 Dnmlys N-(咪唑基乙基)甘氨酸 NhisN-甲基环己基丙氨酸 Nmchexa N-(3-吲哚乙基)甘氨酸 NhtrpD-N-甲基鸟氨酸 Dnmorn N-甲基-γ-氨基丁酸 NmgabuN-甲基甘氨酸 Nala D-N-甲基甲硫氨酸 DnmmetN-甲基氨基异丁酸 Nmaib N-甲基环戊基丙氨酸 NmcpenN-(1-甲基丙基)甘氨酸 Nile D-N-甲基苯丙氨酸 DnmpheN-(2-甲基丙基)甘氨酸 Nleu D-N-甲基脯氨酸 DnmproD-N-甲基色氨酸 Dnmtrp D-N-甲基丝氨酸 DnmserD-N-甲基酪氨酸 Dnmtyr D-N-甲基苏氨酸 DnmthrD-N-甲基缬氨酸 Dnmval N-(1-甲基乙基)甘氨酸 Nvalγ-氨基丁酸 Gabu N-甲基-α-萘基丙氨酸 NmanapL叔丁基甘氨酸 Tbug N-甲基青霉胺 NmpenL-乙基甘氨酸 Etg N-(对羟基苯基)甘氨酸 NhtyrL-高苯丙氨酸 Hphe N-(硫代甲基)甘氨酸 NcysL-α-甲基精氨酸 Marg 青霉胺 PenL-α-甲基天冬氨酸 Masp L-α-甲基丙氨酸 MalaL-α-甲基半胱氨酸 Mcys L-α-甲基天冬酰胺 MasnL-α-甲基谷氨酰胺 Mgln L-α-甲基-叔丁基甘氨酸 MtbugL-α-甲基组氨酸 Mhis L-甲基乙基甘氨酸 MetgL-α-甲基异亮氨酸 Mile L-α-甲基谷氨酸 MgluL-α-甲基亮氨酸 Mleu L-α-甲基高苯丙氨酸 MhpheL-α-甲基甲硫氨酸 Mmet N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸 NmetL-α-甲基正缬氨酸 Mnva L-α-甲基赖氨酸 MlysL-α-甲基苯丙氨酸 Mphe L-α-甲基正亮氨酸 MnleL-α-甲基丝氨酸 Mser L-α-甲基鸟氨酸 MornL-α-甲基色氨酸 Mtrp L-α-甲基脯氨酸 MproL-α-甲基缬氨酸 Mval L-α-甲基苏氨酸 MthrN-(N-(2，2-二苯乙基)氨基
Nnbhm L-α-甲基酪氨酸 Mtyr甲酰基甲基)甘氨酸1-羧基-1-(2，2-二苯乙氨
Nmbc L-N-甲基高苯丙氨酸 Nmhphe基)环丙烷
N-(N-(3，3-二苯基丙基)氨基
Nnbhe
甲酰基甲基)甘氨酸
交联剂能够用于，例如稳定三维构象，其中使用同双功能交联剂如具有(CH2)n隔臂基团(n＝1-6)的双功能酰亚胺酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，以及通常含有一个氨基反应部分的异双功能交联剂如N-羟基琥珀酰亚胺以及另一种基团特异性反应部分如马来酰亚胺或二巯基部分(SH)或碳化二亚胺(COOH)。另外，可以限制肽的构象，例如通过掺入Cα和Nα-甲基氨基酸、在氨基酸的Cα和Cβ原子间引入双键以及通过引入共价键形成环肽或类似物，例如在N端和C端之间、两条侧链之间或一条侧链和N端或C端之间形成酰胺键。
如上所述，这些类型的修饰对于稳定施用给患者或用作诊断试剂的变体HBsAg分子可能是重要的。
本发明涉及的其它衍生物包括从完全未糖基化分子到修饰的糖基化分子的一系列糖基化变体。由于在不同的宿主细胞中式重组分子，可以导致不同的糖基化形式。
本发明另一方面涵盖变体HBV的表面抗原分子或其重组体、衍生物或化学形式或以组合物形式存在的包含所述HBV表面抗原的变体HBV。这些组合物特别可用作治疗组合物，作为生物学、疫苗或药物组合物在本文中多次提及。生物学组合物特别可用于诱导对HBV变体感染的免疫记忆，例如由施用变体HBV表面抗原或重组体、衍生物或其化学形式或包含同样能够诱导免疫反应包括免疫记忆的HBV进行HBV逃逸突变控制。
因此，本发明涉及一种组合物，该组合物包含变体HBV、或来自该变体HBV的HBV表面抗原、或重组体、或其衍生物、或其化学等价物，可以认为该组合物是一种生物组合物。
通常，如果使用HBV，即首先将其减毒。根据本发明的生物组合物一般另外包含一种或多种可药用的载体和/或稀释剂。
该生物组合物可以包含来自HBV变体的HBV表面抗原或类似分子，或者该组合物可以是来自一系列HBV变体(包括参照HBV)的HBsAg或类似分子的混合物。当组合物包含HBV时，也具有类似的组成。
适合注射使用的该生物组合物形式包括无菌水溶液(水溶性时)或无菌粉末，以临时制成无菌注射液。它在制备和保存的条件下必须稳定，必须保持没有细菌和真菌等微生物的污染。载体可以是溶剂或稀释剂，例如含有水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其适当的混合物以及植物油。可以利用各种抗细菌和抗真菌制剂防止微生物污染，例如对苯酚、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。许多情况下，优选包括等渗试剂，如糖或氯化钠。在组合物中使用延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射组合物的吸收。
无菌注射液的制备，是通过在合适的溶剂或稀释剂中掺入需要量的HBsAg或类似分子或HBV变体或参照株，然后灭菌，如滤膜过滤。关于制备无菌注射液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，由先前无菌过滤的溶液得到含有免疫活性分子和其它所需成分的粉末。本发明涉及的给药途径包括静脉内、腹膜内、鞘内(intrathelial)、皮下和颅内。
本发明的生物组合物也可提供为口服剂、经颊给药剂、鼻喷剂、吸入剂、贴剂、滴剂或栓剂形式。
药用可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有的溶剂、分散剂、包裹剂、抗细菌和抗真菌试剂、等渗剂和吸收延迟剂，等等。为药用活性物质使用这些介质和试剂为本领域所公知。除了与免疫活性分子不相容的常规介质或试剂以外，其在治疗组合物中的应用均涵盖在本发明内。补充的活性成分也可掺入到组合物中。
以有效浓度加入HBV表面抗原或类似分子或HBV变体或参照株，即对相同分子或携带相同或免疫学相似分子的HBV可诱导相互作用的免疫反应。例如，HBV表面抗原的有效量可以介于约10mg-约2000ng，或50ng-约1000mg，或100ng-约500mg，或其它合适的有效量。有时按体重表示剂量更为方便，因而有效量可以从，例如约0.5ng/kg体重到约500mg/kg体重，或其间的量。
本发明涵盖变体HBV的分析试剂盒，该试剂盒可以包含，例如PCR或其它核酸杂交技术的试剂，或基于免疫学检测技术的试剂。
本发明另外涉及经由RNA中间体复制的分离的DNA病毒变体用于制备治疗和/或预防肝炎的药剂，其中所述变体的DNA聚合酶编码基因包含核苷酸突变，导致所述DNA聚合酶至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
在相关的实施方案中，提供了经由RNA中间体复制的分离的DNA病毒变体用于制备治疗和/或预防肝炎的药剂的用途，其中所述变体的病毒表面成分编码基因包含核苷酸突变，导致所述病毒表面成分至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
在另一个相关的实施方案中，提供了经由RNA中间体复制的分离的DNA病毒变体用于制备治疗和/或预防肝炎的药剂的用途，其中所述变体的至少两个开放阅读框架的重叠部分包含核苷酸突变，导致所述开放阅读框架翻译产物有氨基酸增加、替换和/或缺失。
本发明也提供了HBV变体筛选抗病毒试剂的用途，这些抗病毒试剂可抑制病毒。术语“抑制”包括对抗或防止感染、复制、组装和/或释放或任何中间步骤。优选的抗病毒试剂包括核苷类似物，但本发明也涵盖非核苷类分子。
因而，本发明另一方面涉及经由RNA中间体复制的分离的DNA病毒变体用于筛选能够抑制该病毒的抗病毒试剂的用途，其中所述变体的DNA聚合酶编码基因包含核苷酸突变，导致所述DNA聚合酶至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
本发明另一方面提供了经由RNA中间体复制的分离的DNA病毒变体用于筛选能够抑制该病毒的抗病毒试剂的用途，其中所述变体的病毒表面成分编码基因包含核苷酸突变，导致所述病毒表面成分至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
本发明另一方面还指经由RNA中间体复制的分离的DNA病毒变体用于筛选能够抑制该病毒的抗病毒试剂的用途，其中所述变体的至少两个开放阅读框架的重叠部分包含核苷酸突变，导致所述开放阅读框架的翻译产物有氨基酸增加、替换和/或缺失。
由以下非限制性的实施例进一步描述本发明。
实施例
为鉴定OLT中FCV治疗期间可以筛选出何种的其它突变，发明人对经FCV治疗的26个高水平HBV患者(大于90pg/ml HBV DNA)和10个低水平HBV患者(小于90pg/ml HBV DNA)，测序并分析了其包含催化结构域的HBV DNA聚合酶，分析了多个连续样本，包括治疗前和OLT前、OLT后FCV反应期以及OLT后的HBV复发期。方法和结果如实施例1-7所示。
实施例1
患者和方法治疗方案
先前描述过FCV预防肝移植方案的临床细节(19)。简言之，研究目的是比较口服FCV和静脉注射penciclovir，对于减少肝移植患者OLT后乙型肝炎再次感染的安全性和有效性。针对晚期肝病需要OLT的患者，研究设计了多中心性、随机、部分双盲、部分安慰剂的可控试验。研究起点(根据杂交测定)HBV DNA水平超过90pg/ml的患者(高复制患者)，在OLT后联用FCV和HBIG治疗，在OLT之前用FCV(500mg，每天三次)治疗，以减低HBV DNA水平，在OLT后用famciclovir持续治疗12个月。未治疗的对照组患者，研究起点HBV DNA水平低于90pg/ml(低复制患者)，在OLT后单用HBIG治疗。最初的研究中，36名患者实施了OLT，其中22名患者经FCV治疗最近已取得临床和病毒学的成果(17 Manns)。基本上，FCV治疗的高复制患者(其HBV DNA在OLT之前已检测不到)，与单用HBIG治疗的低复制患者相比，其HBV的复发率相似。
实施例2
患者
26名研究起点HBV水平超过90pg/ml的患者(高HBV复制患者〔HR))，在OLT之前用FCV治疗，有反应的患者然后在OLT后联用HBIG和FCV治疗。19名对FCV有反应的患者随后进行OLT，9名在OLT后0-12个月没有HBV复发，10名在OLT后12个月内复发。最初的26名患者中，6名起初对FCV没有反应，1名由于用lamivudine治疗而退出研究。10名研究起点HBV水平低于90pg/ml的患者(低HBV复制患者〔LR〕)，OLT后仅用HBIG治疗，其中6名OLT后12个月没有复发，4名在OLT后12个月期间复发。
实施例3
从患者血清中提取HBV DNA
从36名患者的总共90个样本中提取HBV DNA。50ml血清的等分试样混合150ml TE(10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，2mmol/L EDTA)、1％w/v SDS和1mg/ml蛋白酶K，55℃温育30分钟。DNA用酚/氯仿抽提去除蛋白质，异丙醇沉淀，溶于40ml无核酸酶的水中。
实施例4
PCR扩增
两条寡核苷酸引物(Bresatec，Adelaide，澳大利亚)用于扩增包含聚合酶蛋白质催化结构域和表面蛋白质“a”决定簇的片段。第一轮扩增使用正向引物(5’-GCC TCA TTT TGT GGG TCA CCA TA-3’<400>1)和反向引物(5’-TCT CTG ACA TAC TTT CCA AT-3’<400>2)。每次反应以5ml提取DNA为模板，1.5U Taq聚合酶(Qiagen，Melbourne，澳大利亚)，1mmol/L正向引物和反向引物，200mmol/L每种dNTPs，50mmol/L KCl，3.5mmol/L MgCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)以及0.01％ w/v明胶。PCR条件为变性(94℃45秒)、退火(55℃ 45秒)和延伸(72℃ 1.5分钟)，40个循环，随后延长7分钟(Perkin-Elmer2400，Cetus，Norwalk，CT)。如果需要，另外进行一轮半巢式扩增，使用第一轮产物2ml为模板，正向引物为5’-TTG GGG TGG AGC CCT CAGGTC-3’<400>3，除只有25个循环外，扩增条件与第一轮相同。
实施例5
HBV DNA的聚合酶/外膜基因测序
扩增产物经Geneclean II(BIO 101 Inc.，La Jolla，CA)凝胶纯化，使用ABI Prism大染料终止循环测序反应试剂盒依照说明书直接测序(Perkin Elmer，Cetus Norwalk，CT)，在澳大利亚基因组研究实验室(Walter和Eliza Hall研究所，墨尔本)完成电泳。测序引物使用PCR引物和PCR产物内部区域测序所需的另外几条引物(5’-AAA TTC GCA GTC CCC AAC-3’<400>4，5’-GAA AAT TGG TAA CAGCGG-3’<400>5以及5’-GTA TCC CTC CTG TTG CTG T-3’<400>6)。采用MacVector和AssemblyLIGN(MacVector 6.0版本和AssemblyLIGN，Oxford Molecular，UK)分析自动测序的所有数据，使用ClustalW子程序对推断的氨基酸序列进行比较。
实施例6
序列分析
通过将推断的聚合酶基因内氨基酸序列与发表的聚合酶共有序列相比较，进行序列分析(图2；式I；参考文献18)。一个独特的氨基酸改变定义为，变成在HBV聚合酶共有序列中并不存在的氨基酸。将HBV分离物中的独特改变与治疗前的分离物比较，适当时，与其它治疗前样本进行序列比较，记录位于聚合酶保守结构域A-E内的任何突变(结构域A包括421-436位氨基酸，结构域B包括505-529位氨基酸，结构域C包括546-555位氨基酸，结构域D包括576-586位氨基酸以及结构域E包括592-601位氨基酸)。由于编码聚合酶和外膜(HBsAg)的基因具有重叠的开放阅读框架，记录聚合酶基因中改变HBsAg的独特改变。
推断的位于重叠开放阅读框架内的表面抗原氨基酸序列，与88个Norder等人发表的基因型A-F序列作比较(20)。一个独特的氨基酸改变定义为，变成在发表序列中并不存在的氨基酸(20)。另外，将独特的改变与发表的HBIG治疗和/或疫苗接种后检测到的氨基酸改变作比较(21，22，23，24，25，26)。由于聚合酶和外膜基因具有重叠的开放阅读框架，记录外膜基因中改变聚合酶基因的独特改变。
实施例7
结果结果分析
本研究中，对晚期肝衰竭患者，由于血清HBV DNA大于90pg/ml的慢性HBV感染(高复制患者〔HR))，在OLT前预防性给药famciclovir(FCV)，患者随后用OLT后HBIG和FCV治疗。于FCV、OLT前、OLT后的FCV反应期顺序治疗前抽取样本，以及HBV复发期间病毒血症上升情况下的样本。检查了36名患者的HBV DNA序列，包括26名高复制患者(研究起点HBV DNA超过90pg/ml〔HR))，他们联用FCV和HBIG治疗，其中19名在OLT前有反应，6名最初无反应，1名由于用lamivudine治疗而退出研究。19名进行OLT有反应的患者中，9名在OLT后12个月没有HBV复发，其中7名在OLT后得到血清，其余10名患者HBV复发，从其中7名OLT后HBV复发患者得到血清样本用于研究。10名仅用HBIG治疗的患者，其OLT前的血清HBV DNA水平低于90pg/ml(低HBV复制患者〔LR))，其中4名在OLT后12个月期间HBV复发，3人在OLT前以及2人在HBV复发后留有血清。6名患者在OLT后12个月没有HBV复发，其中5名在OLT后留有血清。序列分析(A)HBV DNA高于90pg/ml的患者(HR组)
OLT前期
(i)FCV反应型患者
最初26名HR患者中19名对FCV有反应(另一患者有反应，但由于随后用lamivudine治疗而退出进一步分析)。与发表序列比较，在包含聚合酶催化区域范围内有28个独特的氨基酸改变(表2)，包括8名FCV反应型患者功能结构域内的9个独特突变，它们位于L423F(A结构域)、I508V(B结构域)、V/L/M553I/M(C结构域)、N/Q584S(D结构域)、N/Q584H(D结构域)、S592H(E结构域)、N594H(E结构域)、N594H/Y(E结构域)和M596T/M(E结构域)。
与Norder等人(20)发表的序列比较，这些治疗前分离物的HBsAg中还有28个独特突变(表2)，其中8个氨基酸要么以前在相同位置记录过，要么是与报告的疫苗逃逸或OLT后HBIG治疗筛选相关的同一氨基酸，这其中3个位于氨基酸位置120(P/S/A120S/A/T/P、P/S/A120T和P/S/A120T/P)，4个位于氨基酸位置134(F/Y/I134V、F/Y/I134N/Y、F/Y/I134S和F/Y/I134N)，另一个改变在D/A144E/N。
(ii)FCV非反应型患者
6名移植前HBV DNA高水平的患者(HR)对FCV治疗没有反应。与先前发表的聚合酶共有序列比较，从6名患者中分离的HBV有10个独特的氨基酸突变(表4)，其中4个氨基酸H436N/H、S436S/Y、V537V/I和K587R，在19名FCV反应型患者中不存在(表1)。这些在聚合酶基因463、537、560和565位置检测到的改变(两种分离物中)，均导致重叠开放阅读框架中HBsAg的改变(表4)。
与Norder等人的HBsAg序列比较(20)，在5/6患者中有8个独特的氨基酸差异，包括上文记录的也引起聚合酶基因独特突变的5个改变、P/S/A120Y/S和S204R(引起聚合酶共有序列中出现的聚合酶基因改变[即不独特])以及P217L(不引起聚合酶基因的变化)，其中之一位于P/S/A120Y/S，与HBIG筛选的已知突变体(P120Q)的位置相同。
OLT后期
(i)HBV复发
研究起点HBV DNA高水平的19名患者(HR)中，10名于OLT后的最初12个月内复发，其中7名于复发后获取血清，进行序列分析。与先前发表的共有序列或患者治疗前的序列比较，5/7患者中有15个独特突变，10个位于保守结构域内(表5)，这15个中的8个(于4/7患者中检测到)既没有在19名OLT前FCV反应型患者的任何治疗前样本中检测到，也没有在9名FCV治疗后不复发患者的OLT后样本中检测到，它们是L423L/M/V(A结构域)、H436H/Y(A结构域)、H436Y(A结构域)、471-474位的氨基酸缺失、W499E、V519L(B结构域)、N584N/K(D结构域)和R588R/K(表5)。位于V519L的改变与先前报道长程FCV治疗后的改变相同(27)。先前报道长程FCV治疗后的L526M突变(27)，也在本研究一名FCV反应型患者的样本中检测到(表5)，但在该患者的后续样本中未检测到。在两个不同复发患者的分离物中发现H436Y突变，但都是暂时性的改变(即后来样本回到初始序列)。在非反应型患者中也发现位于该位置的氨基酸变为不同的残基(见上文)。
然后检测了HBV聚合酶中的15个独特改变，以确定重叠开放阅读框架中HBsAg是否发生改变(表5)，发现位于471-474残基的缺失，引起外膜基因相应框架的缺失(aa 117-120)，而H436Y、H436H/Y、S483T、I508V和L526M突变未引起外膜基因序列的任何变化。L423L/M/V使HBsAg序列变为I68I/M，L423F/L使其变为C69F/L，V519L使其变为E164D以及S565A使其变为S210R。W499E突变(由两个核苷酸变化引起)导致HBsAg序列中发生2个变化D144E和G145R(一个已知的疫苗逃逸突变)，突变N584N/K、N584S、R588R/K和N594H位于HBsAg基因末端以后，HBsAg的终止密码位于226，与编码聚合酶582位氨基酸的密码子相重叠。
与Norder等人发表的HBsAg序列(20)以及治疗前序列比较，HBsAg中共有11个独特的氨基酸改变，包括上述改变HBV聚合酶的7个突变，以及不改变HBV聚合酶的P67P/Q、P67Q、R73P和M133T。这11个突变中，一名患者的两个突变以前已报道为疫苗或HBIG逃逸(D144E和G145R)。在治疗前的任何样本中没有检测到的HBV复发患者中OLT后的5个HBsAg独特突变，列于表6。
(ii)HBV未复发
用FCV和HBIG治疗的9名HR患者在OLT后12个月没有HBV复发，收集7名患者的血清作序列分析。与先前发表的HBV聚合酶共有序列相比，3名患者中有12个独特突变，在治疗前的样本中并不存在。其中包括5个位于功能结构域的突变，以及L423L/F(A结构域)、A432V(E结构域)、R466K、N477T、N485N/K、G498E、L526M(B结构域)、T530S、N572K、F573Y、L577L/M/V(D结构域)和L593G/V/L/STOP(E结构域)。突变L526M只在移植后马上出现的HBV DNA的高峰期检测到，而在该患者后续分离物中未检测到。聚合酶12个独特突变中的9个引起重叠开放阅读框架中HBsAg的改变(列于括号中)，L423L/F(C69C/F/S/Y)、A432V(R78L)、R466K(G112R)、N477T(T123P)、N485N/K(N131N/I/T/S)、G498E(D144N)、T530S(L176V)、N572K(I218N)和F573Y(F219I)。
与Norder等人发表序列(20)以及治疗前分离物比较，治疗后HBsAg共有11个独特突变，它们是C69C/S/F/Y、R78L、T123P、T131N/I/T/S、D144N、C147S/Y、S167L、L173R、L176V、I218N和F219I。C147S/Y、S167L和L173R的改变不引起重叠的聚合酶阅读框架改变，而其它的HBsAg独特突变均引起聚合酶改变(列于上文)。T131N/I/T/S突变先前已在HBIG治疗后检测到，T123P和D144N与先前其他人报告的HBIG相关突变位于相同位置。即使存在先前记录的HBIG相关变体，这些患者也不复发HBV。该患者组中未记录到与所有非复发患者共有，而复发和FCV非反应型患者HBV分离物中均没有的氨基酸序列。(B)HBV DNA低于90pg/ml的患者(LR组)
OLT前期
只用HBIG而不用FCV治疗的移植患者的多个HBV分离物，经序列分析，确定移植过程中在可比较的时间间隔内的序列变化背景。10名低水平病毒血症的患者中，取得9名患者OLT前的血清样本。分离物测序显示，与发表的HBV聚合酶共有序列相比，在5名患者中分离到12个独特突变，它们是S/D455P、N469D、Y494F、Y/F497L、S/F565A/S、F/V573F/L、P583T(D结构域)、N/Q584S(D结构域)、K585K/G(D结构域)、S592N(E结构域)、L593L/I/V(E结构域)和N594H(E结构域)。
与Norder等人发表序列(20)比较，在这些治疗前分离物的HBsAg中，有4名患者分离到5个氨基酸变体，它们是P/S/A120Q、P/S/A120T、S/N210A/S、S/N210R/S和F219Y/F，前两个与先前OLT后用HBIG筛选的HBsAg突变有关(23)。
OLT后期
(i)HBV复发
仅从两名HBIG治疗期间HBV复发的患者中得到适合测序的血清样本，该两名患者的HBV序列特征表明，与发表的共有序列以及治疗前样本序列比较，存在6个独特突变，它们是N469D、L492S、Y494F、T496T/N、Y497L和S548S/R(C结构域)。L492S、T496T/N和S548S/R也分别在C138R、T142T/P和A194G/A改变了HBsAg，其它突变不改变HBsAg。A结构域是唯一保守的结构域，从OLT后LR患者的HBV分离物中，在该区域没有检测到独特突变，而FCV治疗中的HR HBV分离物在该区域筛选到几个突变(见上述A部分)。
与发表序列(20)及治疗前样本序列比较，两名患者的HBsAg存在6个独特突变，它们是V96A、P120Q、C138R、P142T/P、K160K/N和A194G/A。K160K/N突变引起HBV聚合酶位于I515I/L的突变，上文列有影响两个重叠阅读框架的其它突变，这些突变中的5个未能在任何治疗前样本中检测到(表5)。在治疗前检测到位于P120Q的突变，先前已报道该突变在HBIG治疗后可筛选到(23)。
(ii)HBV未复发
OLT后HBV未复发的6名患者中的5名留取血清，与发表的共有序列及治疗前分离物序列比较，其中两名患者的聚合酶基因存在5个突变，它们是L/S/R563R/C、L581L/F(D结构域)、L581L/STOP(D结构域)和P583P/R(D结构域)以及L593L/I(E结构域)，只有L/S/R563R/C突变在I208I/M处改变HBsAg的重叠阅读框架。
与Norder等人发表序列(20)及治疗前样本序列比较，I208I/M是HBsAg序列中检测到的仅有的独特突变，该突变先前未被记录为与疫苗或HBIG逃逸有关。在一名患者治疗前的分离物中检测到氨基酸变体(P/S/A120T，一个已知的HBIG筛选变体)，但在该患者治疗后的分离物中未检测到，该患者没有复发。
表2 FCV反应型患者治疗前HBV分离物中HBV聚合酶的独特改变
| 与发表的HBV聚合酶共有序列的氨基酸差异 | 相应的HbsAg改变 |
| L423F | C69S |
| S452A | 无变化 |
| S/D455P | 无变化 |
| L461V | 无变化 |
| S462A | C107W |
| Q471L | S117C |
| H/Y 472R | 无变化 |
| H479H/Q | T/M125M/T/K/R |
| S483T | 无变化 |
| V488E | F/Y/I134S |
| V488E/V | F/Y/I/134N/Y |
| V488G | F/Y/I134V，M/K/L133T |
| R/W499G/W | D/A144G |
| I508V | 无变化 |
| I533L | 无变化 |
| V/L/M533I/M | 终止密码子之后 |
| V/G560E | Y/F/H/C206N |
| V/G560P | K/N/S204R |
| Q/E561S | S/G/H/N/D/T207R |
| Q/E561 Q/Stop | 无变化 |
| S/F565A | S/N210R |
| T/A568S | I/L/M213F |
| N/Q584S | HBsAg终止密码子之后 |
| N/Q584H | HBsAg终止密码子之后 |
| S592H | HBsAg终止密码子之后 |
| N594H | HBsAg终止密码子之后 |
| N594H/Y | HBsAg终止密码子之后 |
| M596T/M | HBsAg终止密码子之后 |
表3 FCV反应型患者治疗前HBV分离物中HBV HBsAg的独特突变
| 与发表的HBV HBsAg共有序列的氨基酸差异 | 相应的HBV聚合酶改变 |
| P67Q | 无变化 |
| C69S | L423F |
| R73P | 无变化 |
| R79H | 无变化 |
| L94Stop | 无变化 |
| V96A | 无变化 |
| Q101R | 无变化 |
| C107W | S462A |
| S117C | Q417L |
| P/S/A120S/A/T/P | T/P/N/I474I/T/N/S |
| P/S/A120T | 无变化 |
| P/S/A120T/P | 无变化 |
| T/M125M/T/K/R | H479Q |
| M/K/L133T | V488G |
| F/Y/I134N/Y | V488V/E |
| FN/I134V | V488G |
| F/Y/I134S | V488E |
| F/Y/I134N | V488E |
| S/T143M | 无变化 |
| D/A144E/N | R/W499G/W |
| A/G166V | 无变化 |
| K/N/S204R | 无变化 |
| Y/F/H206N | V/G560E |
| S/G/H/N/D/T207R | Q/E561S |
| S/N210R | S/F565A |
| I/M/L213F | T/A568S |
| P214L | 无变化 |
| P217L | 无变化 |
表4 与发表的共有序列(18)相比，从FCV非反应型患者分离的HBV
变体的氨基酸改变总结
FCV反应型患者中没有检测到黑体表示的氨基酸突变。a＝FCV治疗期间在HBV复发患者中分离的HBVb＝治疗前在FCV治疗反应型患者中分离的HBVc＝治疗前在未用FCV治疗的HBV低复制患者中分离的HBV表5 与发表的共有序列相比，HBV复发期间在FCV治疗的患者中分离
| 与发表的HBV聚合酶共有序列的氨基酸差异 | 相应的HbsAg改变 | 其他患者组的氨基酸改变 |
| H436N/H | 无变化 | H436H/Y(3-6a，27-3a) |
| S463S/Y | L109I/L | 未检测到 |
| V537V/I | C/W182Y/Stop | 未检测到 |
| V/G560E | Y206N | V560E(15-1b) |
| S/F565A/SS/F 565 A | S210R/S | S/F 565A(4-1b，10-1b，18-1b) |
| N/Q584H | HbsAG末端之后 | N/Q584H(15-1b)N/Q584 S(2-3a，3-1b，26-1c)N/S/H 584N/K(3-3a) |
| K587R | HbsAG末端之后 | 未检测到 |
| N594H | HbsAG末端之后 | N594H(2-3a，14-1b，15-1b，17-1b，26-1c，31-1c)N594N/Y(2-1b) |
的HBV变体的氨基酸突变总结
| 与发表的HBV聚合酶共有序列的氨基酸差异 | 相应的HbsAg改变 | 其他患者组的氨基酸改变 |
| L423L/M/V | I68I/M | L423F/L(15-2a)L423F(12-1e) |
| L423L/F | C69F/L | L423F/L(15-2a)L423F(12-1e) |
| H436H/YH436Y | 无变化 | H436N(32-2b) |
| DEL 471-474 | 117-120 | 未检测到 |
| S483T | 无变化 | S483T(2-1e) |
| W499E | D144E/G145R | R499K(1-2c) |
| I508V | 无变化 | I508V(2-1e) |
| V519L | E164D | V519L(1-3c) |
| L526M | 无变化 | L526M(1-3c，6-2a，g) |
| S565A | S210R | S565A(4-1e，10-1e，18-1e) |
| N584S | HBsAg终止密码子之后 | N/Q584S(3-1e，26-1c)N584H(15-1f，32-1b) |
| N/S/H584N/K | HBsAg终止密码子之后 | N/Q584S(3-1e，26-1c)N584H(15-1f，32-1b) |
| R588R/K | HBsAg终止密码子之后 | 未检测到 |
| N594H | HBsAg终止密码子之后 | N594H(14-1e，15-1e，17-1e，24-1b，25-1b，26-1f，31-1e)N594N/Y(2-1e) |
FCV反应型患者以及OLT后没有HBV复发的HR HBV患者，均未检测黑体表示的氨基酸突变。
a OLT前FCV反应型、OLT后来复发HR患者
b 非反应型HR患者
c OLT后复发、复发后用FCV治疗的LR患者
d 未复发HR患者
e OLT前FCV反应型HR患者
f OLT前LR患者
g 暂时性突变表6 与Norder等人发表序列(20)及所有治疗前HBsAg序列相比，
HBV复发患者的HBsAg独特突变
| HBsAg突变 | 分离物 | FCV治疗 | HBV聚合酶相应突变 |
| I68I/M | 5-2 | FCV+HBIG | L423L/M/V |
| DEL 117-120 | 4-3 | FCV+HBIG | DEL 471-474 |
| D144E | 4-3 | FCV+HBIG | W499E |
| G145R | 4-3 | FCV+HBIG | W499E |
| E164D | 27-3，4，5 | FCV+HBIG | V/G519L |
| V96A | 26-3 | HBIG | 无变化 |
| C138R | 26-3 | HBIG | L492S |
| P142T/P | 28-4 | HBIG | T496T/N |
| K160K/N | 26-4 | HBIG | I515I/L |
| A194G/A | 26-3 | HBIG | S/A548S/R |
参考书目1. Summers J，Mason W.Cell(1982)29：403-415.2. Vere Hodge R.A.Antiviral Chem Chemother(1993)4：67-84.3. Boyd MR et al Antiviral Chem Chemother.(1987)32：358-363.4. Kruger Tet al Hepatology(1994)22：219A.5. Main J et al.J.Viral Hepatitis(1996)3：211-215.6. Severini A et al Antimicrobial Agents Chemother(1995)39：1430-1435.7. Dienstag JL et al New England J Med(1995)333：1657-1661.8. Shaw T，et al.Antimicrobiol Agents Chemother(1994)38：719-723.9. Shaw T，et al. Hepatology(1996)24：in press.10. Tsiquaye KN，et al.J.Med Virol(1994)42：306-310.11. Boker KHW，et al.Transplantation(1994)57：1706-1708.12. Angus P，et al.J.Gastroenterol Hepatol(1993)8：353-357.13. Poch O，et al.EMBO J.(1989)8：3867-3874.14. Delarue M，et al.Protein Engineering(1990)3：461-467.15. Chiou HC，et al.Antiviral Chem Chemother(1995)6：281-288.16. Ling R，et al.Hepatology(1996)24：711-713.17. Price PM，et al.Hepatology 1992 16：8-13.18. Bartholomeusz et al.，Intervirology 199719. Manns M，et al，Hepatology 1998 28(4 part2)260A.20. Norder H，et al，J.Gen Virol 1993 74：1341-1348.21. Wallace L A and Carman W F，Viral Hepatitis Reviews 1997 3：5-16.22. Protzer-Knolle U et al， Hepatology 1998 27：254-263.23. Carman W F，Thomas H C.Gastroenterology 1992 102：711-719.24. Moriyama K，et al.Lancet 1991 337：125.25. Ghany M G et al，Hepatology 1998 27：213-222.26. Cariani E，et al，Journal of Medical Virology 1995 47：410-415.27. Aye TT， et al.，Journal of Hepatologyl997 26：1148-1153.28. Xiong，et al.，Hepatology 1998 28 1669-167329 Allen MI，et al.，Hepatology 1998 27：1670-1677.30. Niesters HGM，et al.，Journal of Infectious Diseases 1998 177：1382-5，31. Chayama K，et al.，Hepatology 1998 1711-1716.32. Ladner SK，et al.，Antiviral Chemistry & Chemotherapy 1998 9：65-72.33. Tipples GA，et al.，Hepatology 1996 24：714-717.35. Bartholomew MM，et al.，Lancet 1997 349：20-22.36. Cane PA，et al.，Submitted 1998.37. Wolters LMM，et al.，Journal of Hepatology 1998 28：909-911.38. Naoumov NV，et al.，.Hepatology 1996 24：282A39. Zoulim F，et al.，Hepatology 1997；Abstr.1200.40. Xiong X，et al.，11th International Conference on Antiviral Research，San Diego，April
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Claims (42)
1.分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体，其中所述变体的DNA聚合酶编码基因包含核苷酸突变，导致所述DNA聚合酶至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
2.分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体，其中所述变体的病毒表面成分编码基因包含核苷酸突变，导致所述病毒表面成分至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
3.分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体，其中所述变体的至少两个开放阅读框架的重叠部分包含核苷酸突变，导致所述开放阅读框架翻译产物的氨基酸增加、替换和/或缺失。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的变体，其中该DNA病毒是肝炎病毒或相关病毒。
5.根据权利要求4所述的变体，其中该肝炎病毒是乙型肝炎病毒(HBV)。
6.根据权利要求5所述的变体，其中DNA聚合酶的突变导致HBV对核苷类似物不敏感。
7.根据权利要求5所述的变体，其中病毒表面成分的突变使免疫试剂对该病毒表面成分的相互作用性降低。
8.根据权利要求7所述的变体，其中该病毒表面成分是病毒表面抗原。
9.根据权利要求8所述的变体，其中该病毒表面抗原的突变位于氨基酸67-226之间。
10.HBV变体，该变体编码DNA聚合酶的核苷酸序列包含突变，导致所述DNA聚合酶列于式I的一个或多个氨基酸中有氨基酸增加、替换和/或缺失：
式IS Z1 L S W L S L D V S A A F Y H Z2 P L H P A A M P H L L Z3 G S S G L Z4 R Y V A RL S S Z5 S Z6 Z7 X N Z8 Q Z9 Z10 X X X Z11 L H Z12 Z13 C S R Z14 L Y V S L Z15 L L Y Z16 TZ17 G Z18 K L H L Z19 Z20 H P I Z21 L G F R K Z22 P M G Z23 G L S P F L L A Q F T S A I Z24Z25 Z26 Z27 Z28 R A F Z29 H C Z30 Z31 F Z32 Y M* D D Z33 V L G A Z34 Z35 Z36Z37 H Z38 E Z39 LZ40 Z41 Z42 Z43 Z45 Z46 L L Z47 Z48 G I H L N P Z49 K T K R W G Y S L N F M G Y Z50 I G
其中：
X 是任意氨基酸
Z1 是N或D；
Z2 是I或P；
Z3 是I或V；
Z4 是S或D；
Z5 是T或N；
Z6 是R或N；
Z7 是N或I；
Z8 是N或Y或H；
Z9 是H或Y；
Z10 是G或R；
Z11 是D或N；
Z12 是D或N；
Z13 是S或Y；
Z14 是N或Q；
Z15 是L或M；
Z16 是K或Q；
Z17 是Y或F；
Z18 是R或W；
Z19 是Y或L；
Z20 是S或A；
Z21 是I或V；
Z22 是I或L；
Z23 是V或G；
Z24 是C或L；
Z25 是A或S；
Z26 是V或M；
Z27 是V或T；
Z28 是R或C；
Z29 是F或P；
Z30 是L或V；
Z31 是A或V；
Z32 是S或A；
Z33 是V或L或M；
Z34 是K或R；
Z35 是S或T；
Z36 是V或G；
Z37 是Q或E；
Z38 是L或S或R；
Z39 是S或F；
Z40 是F或Y；
Z41 是T或A；
Z42 是A或S；
Z43 是V或I；
Z44 是T或C；
Z45 是N或S；
Z46 是F或V；
Z47 是S或D；
Z48 是L或V；
Z49 是N或Q；
Z50 是V或I；并且
M* 是氨基酸550；条件是该突变不单独位于C结构域YMDD基序内，其中所述变体对核苷类似物的敏感性降低。
11.HBV变体，该变体编码病毒表面成分的核苷酸序列中包含突变，导致所述病毒表面成分中列于式I的氨基酸序列的相应区域中有氨基酸增加、替换和/或缺失，其中该变体与针对所述病毒表面成分的免疫试剂的相互作用性下降。
12.HBV变体，该变体编码病毒表面成分的核苷酸序列中包含一个突变，导致所述病毒表面成分位于HBV表面抗原的67-226位氨基酸区域或功能相当区域中有氨基酸增加、替换和/或缺失，其中该变体与针对所述病毒表面成分的免疫试剂的相互作用性下降。
13.HBV变体，该变体在其基因组的重叠开放阅读框架中包含突变，其中所述突变位于HBV DNA聚合酶F和A-E结构域中的一个或多个所处区域内，条件是不单独位于C结构域的YMDD基序内；以及在HBV表面抗原67-226位氨基酸对应的重叠区域内；并且其中所述变体对核苷酸类似物的敏感性降低，与特异针对HBV表面抗原的免疫试剂的相互作用性下降。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的HBV变体，其中HBV DNA聚合酶和/或表面抗原的突变包含从经法昔洛韦和HBIG治疗后HBV复发的患者中筛选到的变体。
15.根据权利要求11-13中任一项所述的HBV变体，其中该变体包含HBV DNA聚合酶中的突变以及表面抗原中的相应突变(括号内所示)，所述突变选自
L423L/M/V(I68I/M)，L423L/F(C69F/L)，H436H/Y，H436Y，DEL 471-474(DEL 117-120)，S438T，W499E(D144E，G145R)，I508V，S565A(S210R)，N584S，N/S/H584N/K，R588R/K和N594H；H436N/H，S463S/Y(L109I/L)，V537V/I(C/W182Y/STOP)，V/G560E(Y206N)，S/F 565A/S(S210R/S)，S/F 565A(S210R)，N/Q 584H，K587R和N594H中的一个或多个，其中DEL表示缺失，STOP表示终止密码子。
16.根据权利要求11-13中任一项所述的HBV变体，其中该变体包含HBV表面抗原中的突变，所述突变选自V96A、C138R、P142T/P、K160K/N和A194G/A中的一个或多个。
17.根据权利要求11-13中任一项所述的HBV变体，其中该变体包含HBV DNA聚合酶中的突变连同表面抗原中的相应突变(括号内所示)，突变选自所述L423L/MV[I68I/M]，H436H/Y，H436Y，DEL471-474[DEL117-120]，W499E[D144E和G145R]，N/S/H 584 N/K和R588 R/K；H436H/N，S463 S/Y[L109I/L]，V537 V/I[C/W 182 Y/STOP]，和K587R中的一个或多个。
18.测定HBV对核苷类似物敏感性下降的可能性的方法，该方法包含从该HBV分离DNA或相应mRNA，并在编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，该突变导致所述DNA聚合酶的F结构域和A-E结构域中的一个或多个区域或最接近区域中有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失，其中存在该突变表明对该核苷类似物可能有抗性。
19.测定HBV与针对HBV表面抗原的抗体相互作用性降低的可能性的方法，所述方法包含从该HBV分离DNA或相应mRNA，并在编码HBV表面抗原的核苷酸序列中筛选突变，该突变导致所述HBV表面抗原的67-226位氨基酸或最接近该表面抗原的区域中有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失，其中存在该突变表明该抗体对所述突变表面抗原的相互作用性可能降低。
20.根据权利要求18或19所述的方法，该分析方法检测下述HBVDNA聚合酶突变(以及括号内所示表面抗原中的相应突变)中的一个或多个： L423L/M/V(I68I/M)，LA23L/F(C69F/L)，H436H/Y，H436Y，DEL 471-474(DEL 117-120)，S438T，W499E(D144E，G145R)，I508V，V519L(E164D)，L526M，S565A(S210R)，N584S，N/S/H584N/K，R588R/K；H436N/H，S463S/Y(L109I/L)，V537V/I(C/W182Y/STOP)，V/G560E(Y206N)，S/F 565A/S(S210R/S)，S/F 565A(S210R)，N/Q 584H，K587R和N594H，
其中DEL表示缺失，STOP表示终止密码子。
21.根据权利要求18或19所述的方法，该分析方法检测下述表面抗原突变中的一个或多个：V96A、C138R、P142T/P、K160K/N和A194G/A。
22.根据权利要求20所述的方法，该分析方法检测下述HBV DNA聚合酶突变(以及括号内所示表面抗原中的相应突变)中的一个或多个： L423L/MV[I68I/M]，H436H/Y，H436Y，DEL471-474[DEL117-120]，W499E [D144E和G145R]，V519L[E164D]，N/S/H 584 N/K和R588 R/K；H436H/N，S463 S/Y[L109I/L]，V537 V/I[C/W 182 Y/STOP]，和K587R。
23.确定HBV分离物是否编码变体DNA聚合酶的方法，该方法包含直接或经由核苷酸序列确定其DNA聚合酶的氨基酸序列，并比较与下列氨基酸序列的一致性：
式IS Z1L S W L S L D V S A A F Y H Z2P L H P A A M P H L L Z3G S S G L Z4R Y V A RL S S Z5S Z6Z7X N Z8Q Z9Z10X X X Z11L H Z12Z13C S R Z14L Y V S L Z15L L Y Z16TZ17G Z18K L H L Z19Z20H P I Z21L G F R K Z22P M G Z23G L S P F L L A Q F T S A I Z24Z25Z26Z27Z28R A F Z29H C Z30Z31F Z32Y M*D D Z33V L G A Z34Z35Z36Z37H Z38E Z39LZ40Z41Z42Z43Z44Z45Z46L L Z47Z48G I H L N P Z49K T K R W G Y S L N F M G Y Z50I G
其中：
X 是任意氨基酸
Z1 是N或D；
Z2 是I或P；
Z3 是I或V；
Z4 是S或D；
Z5 是T或N；
Z6 是R或N；
Z7 是N或I；
Z8 是N或Y或H；
Z9 是H或Y；
Z10 是G或R；
Z11 是D或N；
Z12 是D或N；
Z13 是S或Y；
Z14 是N或Q；
Z15 是L或M；
Z16 是K或Q；
Z17 是Y或F；
Z18 是R或W；
Z19 是Y或L；
Z20 是S或A；
Z21 是I或V；
Z22 是I或L；
Z23 是V或G；
Z24 是C或L；
Z25 是A或S；
Z26 是V或M；
Z27 是V或T；
Z28 是R或C；
Z29 是F或P；
Z30 是L或V；
Z31 是A或V；
Z32 是S或A；
Z33 是V或L或M；
Z34 是K或R；
Z35 是S或T；
Z36 是V或G；
Z37 是Q或E；
Z38 是L或S或R；
Z39 是S或F；
Z40 是F或Y；
Z41 是T或A；
Z42 是A或S；
Z43 是V或I；
Z44 是T或C；
Z45 是N或S；
Z46 是F或V；
Z47 是S或D；
Z48 是L或V；
Z49 是N或Q；
Z50 是V或I；并且
M* 是氨基酸550；
24.根据权利要求23所述的方法，其中该变体包含HBV DNA聚合酶中的突变以及表面抗原中的相应突变(括号内所示)，所述突变选自
L423L/M/V(I68I/M)，L423L/F(C69F/L)，H436H/Y，H436Y，DEL 471-474(DEL 117-120)，S438T，W499E(D144E，G145R)，I508V，S565A(S210R)，N584S，N/S/H584N/K，R588R/K和N594H；，H436N/H，S463S/Y(L109I/L)，V537V/I(C/W182Y/STOP)，V/G560E(Y206N)，S/F 565A/S(S210R/S)，S/F 565A(S210R)，N/Q 584H，K587R，N594H中的一个或多个，其中DEL表示缺失，STOP表示终止密码子。
25.根据权利要求23所述的方法，其中该变体包含HBV DNA聚合酶中的突变以及表面抗原中的相应突变(括号内所示)，所述突变选自
L423L/MV[I68I/M]，H436H/Y，H436Y，DEL471-474[DEL 117-120]，W499E[D144E和G145R]，N/S/H 584 N/K和R588 R/K；H436H/N，S463 S/Y[L109I/L]，V537 V/I[C/W 182 Y/STOP]，和K587R中的一个或多个。
26.一种分离的HBV变体表面抗原、或重组体、或其衍生物、或其化学等价物，其中该表面抗原、或重组体、或其衍生物、或其化学等价物与参照HBV的表面抗原相比，具有不同的免疫学性质。
27.根据权利要求26所述的分离的HBV变体表面抗原，其中该变体与参照HBV的HBV表面抗原相比包含带有单个或多个氨基酸替换、增加和/或缺失的氨基酸序列，或者包含有所截短的序列，其中针对参照HBV的中和抗体对携带该变体HBV表面抗原的HBV丧失或减弱了其中和活性。
28.一种HBV疫苗，其中该疫苗包含一个或多个携带改变表面抗原的突变的HBV变体(不包括G145R)。
29.根据权利要求28所述的HBV疫苗，其中该表面抗原中的突变选自I68I/M，C69F/L，H436Y，DEL 117-120，D144E，E164D，S210R；L109I/L，C/W182Y/STOP，Y206N，S210R/S和S210R中的一个或多个，其中DEL表示缺失，STOP表示终止密码子。
30.根据权利要求28所述的HBV疫苗，其中该表面抗原中的突变选自V96A、C138R、P142T/P、K160K/N和/或A194G/A中的一个或多个。
31.一种组合物，其中包含变体HBV、或来自所述变体HBV的HBV表面抗原、或重组体、或其衍生形式、或其化学等价物，以及一种或多种可药用的载体或稀释剂。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中包含多种变体HBV、或多种来自所述变体HBV的HBV表面抗原、或重组体、或其衍生形式、或其化学等价物。
33.根据权利要求31或32所述的组合物，其中该表面抗原携带位于HBV表面抗原的67-226位氨基酸或功能相当区域内的突变。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中该变体包含表面抗原内的突变以及HBV DNA聚合酶中的相应突变(括号内所示)，所述突变选自 168I/M(L423L/M/V)，C69F/L(L423L/F)，DEL117-120(DEL 471-474)，D144E，G145R(W499E)，S210R(S565A)，L109I/L(S463S/Y)，C/W182Y/STOP(V537V/I)，Y206N(V/G560E)，S210R/S(S/F 565A/S)，S210R(S/F 565A)，
中的一个或多个，其中DEL表示缺失，STOP表示终止密码子。
35.根据权利要求33所述的组合物，其中该变体包含HBV表面抗原中的突变，所述突变选自V96A、C138R、P142T/P、K160K/N和A194G/A中的一个或多个。
36.根据权利要求33所述的组合物，其中该变体包含HBV DNA聚合酶中的突变以及表面抗原中的相应突变(括号内所示)，所述突变选目I68I/M[L423L/MV]，DEL 117-120[DEL471-474]，D144E和G145R[W499E]，L109I/L[S463 S/Y]，C/W 182 Y/STOP[V537 V/I] 中的一个或多个。
37.分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体用于制备治疗和/或预防肝炎的药剂的用途，其中所述变体的DNA聚合酶编码基因中包含核苷酸突变，导致所述DNA聚合酶有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
38.分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体用于制备治疗和/或预防肝炎的药剂的用途，其中所述变体的病毒表面成分编码基因中包含核苷酸突变，导致所述病毒表面成分有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
39.分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体用于筛选能够抑制所述病毒的抗病毒试剂的用途，其中所述变体在至少两个开放阅读框架的重叠部分包含核苷酸突变，导致所述开放阅读框架的翻译产物有氨基酸增加、替换和/或缺失。
40.分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体用于筛选能够抑制所述病毒的抗病毒试剂的用途，其中所述变体的DNA聚合酶编码基因中包含核苷酸突变，导致所述DNA聚合酶有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
41.分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体用于筛选能够抑制所述病毒的抗病毒试剂的用途，其中所述变体的病毒表面成分编码基因中包含核苷酸突变，导致所述病毒表面成分有至少一个氨基酸增加、替换和/或缺失。
42.分离的经由RNA中间体复制的DNA病毒变体用于筛选能够抑制所述病毒的抗病毒试剂的用途，其中所述变体在至少两个开放阅读框架的重叠部分包含核苷酸突变，导致所述开放阅读框架的翻译产物有氨基酸增加、替换和/或缺失。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |