JPH082306B2 - Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原およびその製造法 - Google Patents

Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原およびその製造法

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JPH082306B2
JPH082306B2 JP60153238A JP15323885A JPH082306B2 JP H082306 B2 JPH082306 B2 JP H082306B2 JP 60153238 A JP60153238 A JP 60153238A JP 15323885 A JP15323885 A JP 15323885A JP H082306 B2 JPH082306 B2 JP H082306B2
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幸夫 藤沢
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Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明はワクチンとして有用なＢ型肝炎ウィルス表面
抗原およびその製造法に関する。
（２）従来の技術および発明が解決しようとする問題点 Ｂ型肝炎は、特に熱帯アフリカ、東南アジアおよび極
東において多発するウィルス性疾患であり、慢性肝炎や
肝硬変、さらには原発生肝ガンの原因にもなることが疫
学的に示唆されている。病因は、DNAウィルスの１種で
あるＢ型肝炎ウィルス（Hepatitis B virus;以下、HBV
と略称する）で、それは直径42nmの球状粒子で発見者の
名を冠してデン（Dane）粒子と呼ばれる。その外層に
は、HBV表面抗原（以下、HBsAgと略称する）があり、そ
の抗原性の違いによってadr,adw,ayr,aywなどのサブタ
イプに分けられているが、日本で見いだされるのはadw
型およびadr型である。
Ｂ型肝炎患者の血中には、デン粒子のほかに小型粒子
や管状粒子が検出され、これらの粒子にはデン粒子と同
じ型のHBsAgが認められている。ウィルスの表在性抗原
に対する抗体がそのウィルスの感染を防御することは他
のウィルスでも知られており、HBVの場合にもHBsAgをも
とにＢ型肝炎に対するワクチンの製造が考えられる。と
ころが、HBVはヒトやチンパンジーにしか感染せず、培
養細胞への感染の試みは成功していない。そのためHBsA
gはヒト感染者血中からの入手に限定されており、得ら
れた小型粒子などは診断用試薬の材料としての需要を満
たしても、ワクチンの大量の製造のためには不十分な状
態である。
分子生物学の最近の進歩により非細菌性の蛋白質をコ
ードするDNAを細菌に導入し、形質転換させることが可
能になってきた。この遺伝子組み換えの技術を応用し、
HBsAg構造遺伝子（以下、HBsAg遺伝子と略称する）を細
菌内で発現させることができれば、HBV感染の危険性の
ないHBsAgを大量に調製することが可能になり、Ｂ型肝
炎ワクチンの実用化への道が開かれる。
現在知られている４種のサブタイプすなわちadw,adr,
ayw,ayrのうち、欧米に多いayw型についてはHBsAg遺伝
子の存在部位およびその塩基配列が決定され［Galiber
t,F.ら,Nature,281,646（1979）;Charnay,P.ら,Nucleic
Acids Res.,7,355（1979）］，雑種蛋白質として大腸
菌内での発現が報告されている［Charnay,P.ら,Nature,
286,893（1980）;Edman,J.C.ら,Nature,291,503（198
1）］。
また、日本で多く見出されているadw型およびadr型に
ついては、本発明者らの一部はHBsAg遺伝子を含むDNAの
創製に成功し、当該遺伝子のDNA塩基配列ならびにゲノ
ム上の位置を決定し、さらにこの組み換えDNAを含有す
る形質転換体を培養してHBsAgを大量生産する途を開い
た（特開昭58−194897号公報，特開昭58−201796号公
報，特開昭59−74985号公報）。
最近、Machida,A.ら［Gastroenterology,85,268（198
3）；同誌,86,910（1984）］によって示されたように、
Ｂ型肝炎ウィルスｅ抗原陽性の患者血漿から得られたHB
sAg小型粒子中には、従来同定されていたＰ−Ｉ（分子
量22〜24キロ・ダルトン）,P−II（分子量25〜29.5キロ
・ダルトン）などの主要ペプチドに加えて［Peterson,
D.L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,1530（1977）］,P
31蛋白質（分子量31キロ・ダルトン）とP35蛋白質（P31
に糖が結合した複合蛋白で分子量35キロ・ダルトン）が
存在していることが証明された。P31はＰ−ＩのＮ末端
にpre−Ｓ領域の55個のアミノ酸残基が付加したもの
で、この領域中に重合ヒト血清アルブミン（poly−HS
A）の受容体が存在していることも明らかにされてい
る。さらに上記1984年の報告で、上記Ｐ−31蛋白質が糖
鎖を有することも明らかにされている。一方、肝細胞表
面にもこの受容体があることから、poly−HSAを介して
デン粒子が肝細胞に付着し増殖がおこると考えられてい
る。従って、デン粒子上のpoly−HSA受容体がP31に対す
る抗体でマスクされれば、該粒子は肝細胞と結合できな
くなりHBV感染がより有効に予防できると期待されてい
る。
（３）問題点を解決するための手段および作用 本発明は、 （１）大腸菌でアミノ酸配列（Ｉ）： からなるadr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31またはア
ミノ酸配列（II）： からなるadw型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31を生成さ
せるための組み換えDNAであって、adr型またはadw型Ｂ
型肝炎ウイルス表面抗原P31をコードするDNAを大腸菌で
機能しうるプロモーター領域の３′末端に挿入してなる
組み換えDNA、および （２）アミノ酸配列（Ｉ）からなるadr型Ｂ型肝炎ウ
イルス表面抗原P31またはアミノ酸配列（II）からなるa
dw型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31をコードするDNAを大
腸菌で機能しうるプロモーター領域の３′末端に挿入し
てなる組み換えDNAを含有する大腸菌形質転換体を提供
するものである。
本発明で用いられるＢ型肝炎ウィルス表面抗原P31を
コードするDNAはサブタイプadr、adwであり、たとえば
それらは下記の方法によって調製することができる。特
開昭58−194897号公報あるいはNucleic Acids Res.,11,
1947（1983）に記載されている3.2kbのadwHBVDNAが組み
込まれたプラスミドpBR322−EcoRI/HBV933（pHBV933と
略称）を制限酵素HpalとEcoRIで２重消化すると、pre−
Ｓ領域の一部を含む961bpのDNA断片を得ることができ
る。
この断片に の配列を含む適当なアダプターを結合させることによ
ってP31をコードするDNAを作製することができる。ま
た、特開昭59−74985号公報またはNucleic Acids Res.,
11,1947（1983）に記載されている3.19kbのadr型HBVDNA
が組み込まれたプラスミドpBR322−BamHI/HBr330（pHBr
330と略称）を、制限酵素EcoRIとBamHIで２重消化する
と、pre−Ｓ領域の一部を含む1398bpのDNA断片を得るこ
とができる。この断片に上記のアダプターを結合させる
ことによってP31をコードするDNAを調製することができ
る。
adr型HBsAgP31をコードするDNAとしては第１図に示さ
れるDNA配列のうち、塩基配列順序28〜873で示されるDN
Aが、adw型HBsAgP31をコードするDNAとしては第２図で
示されるDNA配列のうち、塩基配列順序10〜855で示され
るDNAがあげられる。
また、P31をコードするDNAはウィルス由来のもので
も、化学合成したものでもよい。
プロモーター領域は、RNAポリメラーゼが結合するこ
とによってmRNA合成を開始させるのに必要な部位を含む
領域であれば、いかなるものであってもよい。
たとえば大腸菌を宿主として用いる場合、P31をコー
ドするDNAを大腸菌で機能しうるプロモーター領域の
３′末端に挿入すれば、P31をコードするDNAを発現しう
る組み換えDNAが構築できる。たとえば、特開昭58−201
796号公報に記載の発現用ベクターpTRP601,pTRP771など
に、P31をコードするDNAをT4DNAリガーゼの作用により
挿入する。この反応液を用いて，大腸菌（例、C600株,2
94株,W3110株,RR1株,PR13株など）を公知の方法［Co he
n,S.N.ら,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,69,2110（1972）］
もしくはそれに準ずる方法によって形質転換する。
使用するプロモーターは、trpプロモーター（trp−
ｐ）に限定する必要はなく、たとえばrecAプロモーター
［特開昭59−65099号］,lacプロモーター，λPLプロモ
ーターなどを使用してもよい。
上記のようにして得られたP31をコードするDNAを含む
新規な組み換えプラスミドDNAを保持する形質転換体
は、たとえばアンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性
あるいはこれら両薬剤耐性を表現形として選ぶことがで
きる。これらの耐性株の中からP31をコードするDNAを含
有する新規な組み換えプラスミドDNAを保持する菌株を
探し出すには、たとえば次の手法が用いられる。前述し
たアダプターの一方の鎖，５′AATTCCACTGCATTGTAT３′
をT4ポリヌクレオチド・キナーゼによってγ−32P−ATP
を用いて放射性同位元素で標識し、これを探針（プロー
ブ）として、それ自体公知のコロニー・ハイブリダイゼ
ーション法［Grunste in ,M.and Hogness,D.S.,Proc.Na
t1.Acad.Sci.USA,72,3961（1975）］によって、すでに
得た薬剤耐性の形質転換体の中から陽性を示すクローン
を確実に探し出すことができる。
このようにして選択された形質転換体をそれ自体公知
の培地で培養する。培地としては、例えばＬブロス，ペ
ナセイ（Penassay）ブロスおよびグルコース，カザミノ
酸を含むＭ−９培地［Miller,J.,Experiments in Molec
ular Genetics,431−433（Gold Spring Harbor Laborat
ory,New York,1972）］が挙げられる。ここに、必要に
よりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば
３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えること
ができる。
該形質転換体の培養は通常15〜43℃，好ましくは28〜
40℃で２〜24時間，好ましくは４〜16時間行い、必要に
より通気や攪拌を加えることもできる。
生成されるP31はグリコシル化されていても、また、
グリコシル化されていなくてもよい。大腸菌の形質転換
体から得られるP31は実質的にグリコシル化されていな
いが、P31 1分子あたり１分子の糖が結合していてもよ
い。
一般に、HBsAgDNAを含有する形質転換体は表面抗原遺
伝子産物の産生により、形質転換体自体の成育が阻害さ
れることが知られているが、本発明によればP31をコー
ドするDNAを用いると成育阻害が解除され、P31の産生量
が増大する。
生成物のP31活性は、たとえば試料をブロムシアンで
活性化されたセルロース・ペーパーに結合させたのち、
オーストリアII−125（ダイナボット社製）の125I−抗H
BsAg抗体と反応させるdirectimmunoassay法［Fujisawa,
Y.ら,Nucleic Acids Res.,11,3581（1983）］によって
測定することができる。
培養後、公知の方法で菌体を集め、大腸菌の形質転換
体の場合には菌体を尿素，塩酸グアニジンなどの蛋白変
性剤を含む緩衝液に懸濁し、冷所で攪拌したのち、遠心
分離によりP31を含む上澄液を得る方法、あるいは緩衝
液に懸濁し、超音波処理、リゾチームおよび（または）
凍結融解によって菌体を破壊したのち、遠心分離により
P31を含む上澄液を得る方法などが適宜用い得るが、例
えば菌体を集めて緩衝液に懸濁し、リゾチームを加えて
ホモジナイズして溶菌後、尿素（３〜10M）を含む緩衝
液を加え攪拌（０〜10℃で0.5〜８時間）後、遠心分離
して上澄を得る方法が好ましい。
上記抽出液からのP31蛋白質の分離，精製は、アフィ
ニティークロマトグラフィー処理を含む精製工程により
行われる。
アフィニティークロマトグラフィーとして、重合ヒト
血清アルブミン（poly−HSA）をリガンドとするアフィ
ニティークロマトグラフィーやHBsAgに対する抗体、と
りわけモノクローナル抗体を用いる抗体カラム処理が挙
げられる。
poly−HSAをリガンドとするアフィニティークロマト
グラフィーはP31蛋白質の精製に極めて有利に用いられ
る。
アフィニティークロマトグラフィーの担体としてフォ
ルミルセルロファイン（生化学工業），アフィニゲル−
15（バイオラッド社）などが用いられ、とりわけフォル
ミルセルロファインが好ましい。
poly−HSAはヒト血清アルブミンを架橋剤（例えばグ
ルタルアルデヒド）を用いて重合することにより製造で
きる。これを上記担体に、例えば還元剤（NaCNBH3な
ど）を用いて結合させ、所望により洗浄し担体とpoly−
HSAの結合物を得て、これを通常カラムに詰めて使用す
る。
P31蛋白質をpoly−HSAをリガンドとするアフィニティ
ークロマトグラフィーにより精製するには、前記P31含
有溶液（菌体抽出上澄）を、緩衝液［リン酸緩衝液な
ど］で平衡化した上記カラムに吸着させ、緩衝液で溶出
する。該緩衝液には界面活性剤（Tween20など）または
蛋白変性剤（尿素）などを適量加えて使用でき、これら
添加物の種類や濃度を組合せ、適切な溶出液として用い
ることができる。
P31蛋白質を含む溶出画分を集め、所望により限外ろ
過等により濃縮する。
上記濃縮液は、望ましくはジチオスレイトールなどSH
試薬を用いて還元した後、さらに逆相カラムを用いる高
速液体クロマトグラフィーまたはハイドロホービックク
ロマトグラフィー等の疎水性カラムを用いるクロマトグ
ラフィー処理に付すことが好ましい。
上記高速液体クロマトグラフィー用の担体としては、
アルキル（C1-18程度）化ケイ素のもの、例えばAP−202
300Å（C8）,AP−224 300Å（C8）（YMC島久），ウル
トラポアRPSC（ベックマン社），ハイポアRP304（バイ
オラッド社）などが挙げられ、なかでもAP−202 300Å
（C8）およびAP−224 300Å（C8）が好ましく、とりわ
けAP−224 300Å（C8）が好ましい。
またハイドロホービッククロマトグラフィー用の担体
としてはアルキル（C1-18程度）化された担体、例えば
ブチルトヨパール（東洋曹達工業），オクチルセファロ
ース（ファルマシア社）などが挙げられる。とりわけ逆
相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーが有利に
用いられる。
上記逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー
は、例えば溶出溶媒として，水，C1-6の低級アルカノー
ル（エタノール，プロパノールなど），アセトニトリル
などをトリフルオロ酢酸等によりpH1.2〜5.0に調整して
用いるのが好ましく、溶出速度は0.1〜100ml/min、好ま
しくは0.5〜30ml/minであることが好ましい。
得られるP31蛋白質を含有する画分は、所望により凍
結乾燥に付し、白色粉末とすることができる。
かくして生成されるP31蛋白質の純度の測定（比活
性）には、例えば試料をpoly−HSAをコートしたプラス
チックプレートと反応させたのち、poly−HSAに結合し
たP31蛋白質をホースラディッシュ パーオキシダーゼ
（HRP）を結合した抗HBsAgモノクローナル抗体を用いて
検出するエンザイムイムノアッセイ（ELISA）法あるい
はpoly−HSAに結合したP31蛋白質をオーストリアII−12
5（ダイナボット社製，アメリカ）の125I−抗HBsAg抗体
を用いて検出するラジオイムノアッセイ（RIA）法を用
いることができる。
本発明の製造法によれば、医薬等として使用しうる高
度に精製された実質的に純粋なP31蛋白質を得ることが
できる。
例えば、HBsAgP31をコードする塩基配列を有するDNA
を含有する大腸菌で産生したP31を本発明の方法により
精製することにより下記の性状を有する実質的に純粋な
HBsAgP31蛋白質を得ることができる。
（１）SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動で
均一であり、これによる分子量測定値（還元条件下）は
32,000±1,000ダルトンである。
（２）アミノ末端アミノ酸としてメチオニン（もしくは
そのホルミル体）またはグルタミンを有する。
（３）カルボキシ末端アミノ酸としてイソロイシンを有
する。
（４）poly−HSAと結合する。
（５）１×106ユニット/mg以上の比活性を有する。
本発明の方法により製造される実質的に純粋なP31蛋
白質は、公知のHBV感染者の血液を原料に製造されたHBs
Ag小型粒子と同様の生物活性を有し、該HBsAg小型粒子
と同様にしてHBVの診断や予防、治療のためのワクチン
として用いることができる。
本願明細書において蛋白質純度決定のためのP31蛋白
質の活性の（比活性）測定はELISA法で行った。即ち、
参考例４ので得たpoly−HSAをあらかじめ物理吸着さ
えたイムノプレートII（ヌンク社製）に被検液（P31蛋
白質含有溶液（100μｌ）を入れ４℃で１晩反応させ
た。ついでプレートを５％ウシ血清および0.05％Tween2
0を含むPBSで洗ったのち、ホースラディッシュ パーオ
キシダーゼを結合した抗HBsAgモノクローナル抗体溶液1
00μｌをプレートの各穴に加え37℃で２時間反応させ
た。プレートを再度、上記緩衝液で洗ったのち０−フェ
ニレンジアミン（4mg/10ml）および過酸化水素水（４μ
l/10ml）を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）100μ
ｌを加え室温で30分間反応させた。
2N硫酸50μｌを加え酵素反応を停止したのちタイター
テックマルチスキャンMCを用いて492nmにおける吸光度
を測定した。定量は実施例４で得た精製標品を標準品と
して用い、標準品1ngの与える吸光度の値（0.05O.D.）
を１ユニットとしたときのユニット数として算出した。
なお、本願明細書および図面において、塩基やアミノ
酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commission
on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次
に挙げる。またアミノ酸に関し光学異性体がありうる場
合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
DNA デオキシリボ核酸 RNA リボ核酸 mRNA メッセンジャーRNA Ａ アデニン Ｔ チミン Ｇ グアニン Ｃ シトシン dATP デオキシアデノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム DTT ジチオスレイトール Gly グリシン Ala アラニン Val バリン Leu ロイシン Ile イソロイシン Ser セリン Thr スレオニン Cys システィン 1/2Cys ハーフシスチン Met メチオニン Glu グルタミン酸 Asp アスパラギン酸 Lys リジン Arg アルギニン His ヒスチジン Phe フェニルアラニン Tyr チロシン Trp トリプトファン Pro プロリン Asn アスパラギン Gln グルタミン Apr アンピシリン耐性遺伝子 Tcr テトラサイクリン耐性遺伝子 PR λPRプロモーター ars1 オートノマス・レプリケーション・シークエ
ンス１ （autonomous replication sequence 1） IR インバーテッド・リピート（inverted repea
t） （４）実施例および発明の効果 以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明す
るが本発明はこれらに限定されるべきものではない。
参考例１ 酵母抑制性酸性ホスファターゼ・プロモータ
ー（PHO5−Ｐ）を含有する発現用ベクターの作製 酵母Sacharomyces cerevisiae S288C株由来の抑制性
酸性ホスファターゼ遺伝子（PHO5）と構成性酸性ホスフ
ァターゼ遺伝子（PHO3）を含む7.9kbDNA断片を含む大腸
菌プラスミド（pJA1）［Kramer,R.A,and Anderson,N,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,77,6541（1980）］,50μｇに20
ユニットの制限酵素BamHI［宝酒造（株）製］と20ユニ
ットの制限酵素SalI［宝酒造（株）製］を100μｌの反
応液［10mM Tris−HCl（pH8.0）,7mM MgCl2,100mM NaC
l,2mM2−メルカプトエタノール］中で37℃,3時間作用さ
せた後、1.0％アガロース（Sigma社製）・スラブゲルを
用いて緩衝液［100mM Tris−HCl,100mM ホウ酸,2mM EDT
A（pH8.3）］中,140V,2時間電気泳動にかけた。泳動
後、0.63kbDNA断片を含むゲル片を透析チューブ内に封
入し、泳動用緩衝液内に沈め、該DNA断片をゲルから電
気的に溶出した［McDonell,M.W.ら,J.Mol.Biol,110,119
（1977）］。透析チューブ内液をフェノール抽出さらに
エーテル抽出した後、NaClを0.2Mになるように加え、つ
づいて２倍量の冷エタノールを加えて−20℃でDNAを沈
澱させた。
１μｇのプラスミドpSH19に２ユニットの制限酵素Bam
HIと２ユニットの制限酵素SalIを20μｌの反応液［10mM
Tris−HCl（pH8.0）,7mM MgCl2,100mM NaCl,2mM 2−メ
ルカプトエタノール］中で37℃,2時間作用させた後、該
反応液を0.8％アガロース・スラブゲルを用いて上述の
条件下で電気泳動にかけた。泳動後、8.0kbDNA断片を上
述の方法によってゲルから分取し、フェノールで除蛋白
し、冷エタノールでDNAを沈澱させた（第３図参照）。
該8.0kbDNA断片400ngと前記0.63kbDNA断片200ngとを
混合し、20μｌの反応液［66mM Tris−HCl（pH7.6）,6.
6mM MgCl2,10mMジチオジュレイトール,1mM ATP,2ユニッ
トのT4DNAリガーゼ（宝酒造（株）製）］中、14℃で一
夜作用させてDNAを結合させた。この反応液を用いて大
腸菌294株を前記Cohenらの方法に従って形質転換した。
アンピシリン耐性を指標として選択された形質転換体の
中から、プラスミドDNAを前記アルカリ抽出法によって
単離し、分子量と制限酵素による分解パターンを調べ、
pSH19のBamHI−SalI部位に、pJA1から単離された0.63kb
DNA断片が挿入されたプラスミドpPHO12を分離した（第
３図参照）。
３μｇのプラスミドpPHO12DNAに２ユニットの制限酵
素SalIを20μｌの反応液［10mM TrisHCl（pH7.5）,7mm
MgCl2,175mM NaCl,0.2MEDTA,7mM 2−メルカプトエタノ
ール］中で37℃,2時間作用させた後、フエノールで除蛋
白し、冷エタノールでDNAを沈澱させた。このDNA,3μｇ
に12ユニットのBAL31ヌクレアーゼ（Bethesda Research
Laboratories社製）を50μｌの反応液［20mM Tris−HC
l（pH8.1）,12mM CaCl2,12mMMgCl2,1mM EDTA］中で30
℃,2分間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタ
ノールでDNAを沈澱させた（第３図参照）。
200ngのXholリンカーｄ（CCTCGAGG）［New England B
ioLabs社製］に３ユニットのT4ポリヌクレオチド・キナ
ーゼ［宝酒造（株）製］を50μｌの反応液［50mM Tris
−HCl（pH7.6）,10mM MgCl2,10mM 2−メルカプトエタノ
ール,100μMATP］中で37℃,1時間作用させて、５′末端
をリン酸化した。
40ngの５′末端がリン酸化されたXhoiリンカー［５′
−Ｐ−ｄ（CCTCGAGG）］と400ngの前述のBAL−31で処理
されたpPHO12DNAとを混合し、前述の条件下でT4DNAリガ
ーゼの作用で結合させた。この反応液を用いて大腸菌29
4株をCohenらの方法に従って形質転換した。アンピシリ
ン耐性を指標として選択された形質転換体の中から、プ
ラスミドDNAを前記アルカリ抽出法によって単離し、Bam
HIとXhoIによる２重消化物の大きさが0.55kbであるプラ
スミドpPHO17を選択した。BAL−31ヌクレアーゼ処理に
よって、PHO5の開始コドンATGの上流20bpが除去された
ことが、Dideoxynucleotide法［Sanger,F.ら,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,74,5463（1977）］によるDNA塩基配列
の分析によって明らかになった（第３図参照）。
次に、該プラスミドpPHO17,2μｇに４ユニットの制限
酵素XhoI［宝酒造（株）製］を20μｌの反応液［6mM Tr
is−HCl（pH7.9）,150mM NaCl,6mM MgCl2,6mM 2−メル
カプトエタノール］中で37℃,2時間作用させた後、フェ
ノールで除蛋白し、冷エタノールでDNAを沈澱させた。
該DNA1μｇに５ユニットのDNAポリメラーゼＩ ラー
ジ・フラグメント（New England BioLabs社製）を30μ
ｌの反応液［40mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）,6.6m
M MgCl2,1mM 2−メルカプトエタノール,33μM dATP,33
μM dGTP,33μM dTTP,33μM dCTP］中で12℃,30分間作
用させて、接着末端を平滑末端にした後、フェノールで
除蛋白し、冷エタノールでDNAを沈澱させた。該DNA断片
500ngと、前述の条件下でリン酸化されたSalIリンカー
［５′−Ｐ−ｄ（GGTCGACC）］（New England BioLabs
社製）,50ngとを混合し、前述の条件下でT4DNAリガーゼ
の作用で結合させた。この反応液を用いて大腸菌294株
をCohenらの方法に従って形質転換させ、アンピシリン
耐性の形質転換体の中から、プラスミドpPHO17のXhoI部
位がSalI部位に変換したプラスミドpPHO17−１を取得し
た（第３図参照）。
参考例２ 酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ・プロモー
ター（PGK−Ｐ）を含有する発現用ベクターの作製 ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（PGK）のクロ
ーニング Cryer,D.R.らの方法［Methods in Cell Biology,Vol.
XII,P.39〜44（1975）］によって調整されたSaccharomy
ces cerevisiae協会３号株（IFOから入手できる）の染
色体DNA,350μｇに200ユニットの制限酵素HindIII［宝
酒造（株）製］を1mlの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.
5）,7mM MgCl2,60mM NaCl］中37℃,3時間作用させた
後、１％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記
載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、アガロースゲ
ルを分割することによりDNA断片を大きさの順に１から1
0の画分に分けた。各画分のアガロースゲル片をそれぞ
れ透析チューブに封入し、参考例１に記載の条件下でゲ
ル片からDNAを電気的に溶出した。溶出液をフェノール
処理した後、冷エタノールを加えてDNAを沈澱させた。
各画分からのDNA 0.5μｇを１％アガロース・スラブゲ
ルを用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動を行った
後、ニトロセルロースフィルター（Schleicher and Sch
ull社製）にSouthernの方法［Southern,E.M.,J.Mol.Bio
l.,98,503（1975）］に従ってDNAを吸着させた。PGK［D
obson.M.J.ら,Nucleic Acids Res,10,2625（1982）］の
Ｎ末端側からの５個のアミノ酸をコードするオリゴヌク
レオチドに相補な５′−TGAAGATAAAGACAT−３′をCrea,
R.ら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,5765（1978）］の方
法によって合成し、該オリゴヌクレオチド１μｇに10μ
Ciのγ−［32P］ATP（Amersham社製）と10ユニットのT4
ポリヌクレオチド・キナーゼとを30μｌの反応液［50mM
Tris−HCl（pH7.6）,10mM MgCl2,10mM 2−メルカプト
エタノール］中で37℃,30分間作用させ、５′末端を32P
で標識した。該反応液に200mM EDTA（pH8.0）を10μｌ
添加し、１容量のフェノールで除蛋白した後、TEN緩衝
液［10mM Tris−HCl（pH8.0）,200mM NaCl,1mM EDTA］
で平衡化したセファロース4B（Pharmacia社製）・カラ
ム（0.25×25cm）にかけてvoid volume付近に溶出され
る標識された該オリゴヌクレオチドを集め、PGK遺伝子
をスクリーニングするためのプローブとして用いた。上
記のニトロセルロースフィルターと該プローブを用いて
前記Southernの方法でブロッティングを行ったところ、
プローブは、2.6kb〜2.9kbDNA断片が含まれる分画番号
３の試料と強くハイブリダイズした。
次に、クローニング・ベクターpTR262［Roberts,T.M.
ら,Gene,12,123（1980）］,10μｇに10ユニットの制限
酵素HindIIIを50μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.
5）,7mM MgCl2,60mM NaCl］中で37℃,2時間作用させた
後，フェノールで除蛋白し、冷エタノールでDNAを沈澱
させた（HindIII消化pTR262）。HindIII消化pTR262 0.1
μｇと分画番号３のDNA0.2μｇとを混合し、参考例１に
記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用によって結合させ
た。該反応液を用いて大腸菌DH1［Maniatis,T.ら,Molec
ular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,254〜25
5（1982）］を形質転換させ、テトラサイクリン耐性を
示す形質転換体約1300個を得た。
この中からPGK遺伝子を含有する形質転換体を、上述
の32P標識合成プローブを用いるコロニー・ハイブリダ
イゼーション［Suggs,S.V.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
78,6613（1981）］によって選択した。オートラジオグ
ラフィーで強いシグナルが認められた形質転換体から、
前述のアルカリ抽出法によってプラスミドpPKT3を単離
し、HindIIIで分解したところ2.95kbDNAのインサートが
検出され、Southernの方法で調べると該インサートは該
プローブとハイブリすることが確認された。
PGKプロモーター断片の単離 プラスミドpPKT3DNA 50μｇに50ユニットの制限酵素H
indIIIを100μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,7
mM MgCl2,60mM NaCl］中で37℃,2時間作用させた後、１
％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条
件下で電気泳動にかけた。泳動後、2.95kbDNA断片を参
考例１に記載の方法によってゲルから分取した（第４図
参照）。
該2.95kbDNA断片５μｇに５ユニットの制限酵素SalI
を20μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,7mM MgCl
2,175mM NaCl,7mM 2−メルカプトエタノール］中で37
℃,3時間作用させた後、1.2％アガロース・スラブゲル
を用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。
泳動後、2.1kbDNA断片を参考例１に記載の方法によって
ゲルから分取した。該2.1kbDNA断片0.5μｇと、プラス
ミドpBR322のHindIII−Sall消化によって得られた3.74k
bDNA0.5μｇとを混合し、参考例１に記載の条件下でT4D
NAリガーゼの作用によって結合させた。該反応液を用い
て大腸菌DH1を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質
転換体から所望するプラスミドpPKT101を取得した（第
４図参照）。
次に、PGK遺伝子の構造遺伝子領域を取り除くため
に、まず該プラスミドpPKT101 DNA10μｇに10ユニット
の制限酵素SalIを30μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH
7.5）,7mM MgCl2,175mM NaCl,0.2M EDTA,7mM 2−メルカ
プトエタノール］中で37℃,3時間作用させ、フェノール
で除蛋白し、冷エタノールでDNAを沈澱させた（SalI消
化pPKT101）。つづいて、SalI消化pPKT101 1μｇに10ユ
ニットのBAL31ヌクレアーゼを20μｌの反応液［20mM Tr
is−HCl（pH8.1）,12mM CaCl2,12mM MgCl2,1mM EDTA］
中で室温,5分間作用させた後、直ちに１容量のフェノー
ルを加えて反応を停止させ、冷エタノールでDNAを沈澱
させた（BAL消化pPKT101）。参考例１に記載されたリン
酸化XhoIリンカー50ngとBAL消化pPKT101 0.2μｇを混合
し、参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用に
よって結合させた。その後、該反応液で大腸菌DH1を形
質転換させ、アンピシリン耐性を示す形質転換体の中か
ら、pPKT101のSalIサイトからプロモーター領域の方向
へ0.69kbが除かれたプラスミドpPKT567を得た。Dideoxy
nucleotide法によってDNA塩基配列を調べたところ、pPK
T567ではBAL31の作用によってPGK構造遺伝子と５′−近
傍領域−24までが除かれたことが証明された（第４図参
照）。
発現用ベクターの構築 大腸菌−酵母シャトル・ベクターpSH19 5μｇに６ユ
ニットの制限酵素SalIを20μｌの反応液〔10mM Tris−H
Cl（pH7.5）,7mM MgCl2,175mM NaCl,0.2mM EDTA,7mM 2
−メルカプトエタノール］中で37℃,2時間作用させた
後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールで沈澱させ
た。該DNA1μｇにDNAポリメラーゼＩ ラージ・フラグ
メントを参考例１に記載の条件下で作用させ、SalIの接
着末端を平滑末端に変えた。該DNA断片500ngと参考例１
に記載されたリン酸化XhoIリンカー50ngとを混合し、参
考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用によって
結合させた。該反応液で大腸菌DH1を形質転換させ、ア
ンピシリン耐性の形質転換体の中から、pSH19のSalI部
位がXhoI部位に転換したプラスミドpSH19−１を保持す
る形質転換体を得た（第４図参照）。
該プラスミドpSH19−1DNA15μｇに24ユニットの制限
酵素HindIIIを100μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.
5）,7mM MgCl2,60mM NaCl］中で37℃,10分間作用させた
後、直ちに0.2M EDTAを10μｌ添加し反応を停止させ
た。反応液を、0.7％アガロース・スラブゲルを用いて
参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけ、HindIIIで
１箇所截断された8.3kbDNA断片を参考例１に記載の方法
でゲルから分取した。該8.3kbDNA断片３μｇに10ユニッ
トの制限酵素XhoI［宝酒造（株）製］を30μｌの反応液
［10mM Tris−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,100mM NaCl,7mM
2−メルカプトエタノール］中で37℃,2時間作用させた
後、0.7％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に
記載の条件下で電気泳動を行った。泳動後、7.7kbDNA断
片を参考例１に記載の方法によってゲルから分取した
（第４図参照）。
参考例２のに記載のプラスミドpPKT567DNA10μｇ
に、各10ユニットの制限酵素HindIIIとXhoIとを50μｌ
の反応液［50mM Tris−HCl（pH7.6）,50mM NaCl,1mMジ
チオスレイトール,10mM MgCl2］中で37℃,2時間作用さ
せた後、1.2％アガロース・スラブゲルを用いて参考例
１に記載の条件下で電気泳動を行い、1.40kbDNA断片を
ゲルから分取した（第４図参照）。
該1.40kbDNA断片0.2μｇと上述の7.7kbDNA断片0.5μ
ｇとを混合し、参考例１に記載の条件下でT4DNAリガー
ゼの作用によって結合させた。該反応液で大腸菌DH1を
形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体の中か
ら、所望するプラスミオpPKT700を保持する形質転換体
を取得した。次に、参考例１に記載した方法に従って、
該プラスミドpPKT700のXhoI部位がSalI部位に変換され
たプラスミドpPKT700−１を作製した（第４図参照）。
参考例３ 酵母グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵
素・プロモーター（GLD−Ｐ）を含有する発現用ベクタ
ーの作製 グルセルアルデヒド 3−リン酸脱水素酵素遺伝子
（GLD）のクローニング GLDのうちのpgap491［Holland,J.P.ら,J.Biol.Chem.2
58,5291（1983）］のＮ末端側からの５個のアミノ酸を
コードするオリゴヌクレオチドに相補な５′−AGCAACTC
TAACCAT−３′を前述のCrea,R.らの方法によって合成
し、参考例２のに記載の方法に従って32Pで標識し、
プローブとして用いた。参考例２のに記載したニトロ
セルロースフィルターと該プローブを用いてSouthernブ
ロッティングを行ったところ、プローブは2.0〜2.3kbDN
A断片が含まれる分画番号７の試料と強くハイブリダイ
ズした。
参考例２のに記載されたHindIII消化pTR262 0.1μ
ｇと分画番号７のDNA0.2μｇとを混合し、参考例１に記
載の条件下でT4DNAリガーゼの作用によって結合させ
た。該反応液を用いて、参考例２のに記載した方法で
大腸菌DH1を形質転換させ、テトラサイクリン耐性形質
転換体約1200個を取得し、コロニー・ハイブリダイゼー
ションによって32P標識プローブと強くハイブリする形
質転換体を分離した。この形質転換体から前述のアルカ
リ抽出法によってプラスミドpGLD9を単離し、HindIIIで
分解したところ、2.2kbインサートDNAが検出され、Sout
hernの方法で調べると、このインサートDNAは該プロー
ブとハイブリすることが確認された（第５図参照）。
GLDプロモーター断片の単離 プラスミドpGLD9DNA 100μｇに50ユニットの制限酵素
HindIIIを200μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,
7mM MgCl2,60mM NaCl］中で37℃,3時間作用させた後、
1.0％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載
の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、2.2kbDNA断片を
参考例１に記載の方法によってゲルから分取した。該2.
2kbDNA断片10μｇに10ユニットの制限酵素HinfI［宝酒
造（株）製］を50μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.
5）,7mM MgCl2,175mM NaCl,7mM 2−メルカプトエタノー
ル］中で37℃,2時間作用させた後、GLD用プローブを用
いてSouthernの方法によってハイブリダイゼーションを
行ったところ、該プローブは0.5kbDNA断片と結合した
（第５図参照）。
該0.5kbDNA断片５μｇに、各10ユニットの制限酵素Hh
aI［宝酒造（株）製］とTaqI（New England BioLabs社
製）とを30μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,50
mM NaCl,10mM MgCl2,1mMジチオスレイトール］中で37
℃,3時間作用させた後、1.5％アガロース・スラブゲル
を用いて参考例１に記載された条件下で電気泳動にかけ
た。泳動後、0.36kbDNA断片を参考例１に記載の方法に
よってゲルから分取した（第５図参照）。
該0.36kbDNA断片１μｇにDNAポリメラーゼＩ ラージ
・フラグメントを参考例１に記載の条件下で作用させ、
TaqIの接着末端を平滑末端に変えた。次に、この断片１
μｇと参考例１に記載されたリン酸化XhoIリンカー50ng
とを混合し、参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼ
を作用させて結合させた。反応後、過剰量のXhoIを加え
37℃,4時間作用させ、次に参考例２のに記載した条件
下でセフアローズ4B・カラムを用いてリンカーの結合し
た0.36kbDNA断片を分離した。
一方、上述の2.2kbDNA10μｇにDNAポリメラーゼI ラ
ージ・フラグメントを参考例１に記載の条件下で作用さ
せ、接着末端を平滑末端に変えた後、参考例１に記載さ
れた条件下でリン酸化されたBamHIリンカー［５′−Ｐ
−ｄ（CGCGGATCCGCG）］（New England BioLabs社製）5
0ngを参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用に
より結合させた。反応後、20ユニットのBamHIを加え
て、37℃,3時間作用させ、次に参考例２のに記載した
条件下でセフアローズ4B・カラムを用いてリンカーの結
合した2.2kbDNA断片を分離した。該DNA断片６μｇに２
ユニットの制限酵素HhaIを50μｌの反応液［10mM Tris
−HCl（pH7.5）,50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM ジチオスレ
イトール］中で37℃,2時間作用させた後、1.0％アガロ
ース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電
気泳動にかけた。泳動後、0.75kbDNA断片を参考例１に
記載の方法によってゲルから分取した（第５図参照）。
発現用ベクターの構築 参考例２のに記載のプラスミドpSH19−I DNA10μｇ
に各ユニットの制限酵素BamHIとXhoIとを50μｌの反応
液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,100mM NaCl,7
mM 2−メルカプトエタノール］中で37℃,2時間作用させ
た後、1.0％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１
に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、8.0kbのD
NA断片を参考例１に記載の方法によってゲルから分取し
た。
該8.0kbDNA断片500ng,参考例３のに記載の0.36kbDN
A断片200ngおよび0.75kbDNA断片200ngとを混合し、参考
例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用により結合
させた。該反応液を用いて大腸菌DH1を形質転換させ、
アンピシリン耐性形質転換体の中から３種のDNA断片が
結合したプラスミドpGLD906を保持する形質転換体を分
離した。次に、参考例１に記載した方法に従って、該プ
ラスミドpGLD906のXhoI部位がSalI部位に変換されたプ
ラスミドpGLD906−１を作製した（第５図参照）。
参考例4 poly−HSA−セルロファインカラムの製造 重合人血清アルブミンの製造 人血清アルブミン（アルブミン−ニチヤク；日本製薬
製，東京）溶液20ml（人血清アルブミン4g含有）にリン
酸緩衝液−食塩水（PBS;8.1mM NaH2PO4,1.5mM KH2PO4,
2.7mM KCl,137mM NaCl,pH7.2）180ml,2％グルタアルデ
ヒド溶液60mlを加え均一に混和したのち室温で１時間静
置した。重合反応は本溶液を蒸留水10lに対して５℃で
透析することにより停止させた。ついで、透析外液を３
回変えることにより反応液中に残存するグルタルアルデ
ヒドを完全に除き重合人血清アルブミン（poly−HSA）
溶液275mlを得た。
poly−HSA−セルロファインカラムの製造 上記のようにして得られたpoly−HSA溶液90mlに10倍
濃度に調製したPBS 10mlを加えたのちホルミルセルロフ
ァイン40mlを加えて混和したのち室温で30分間反応させ
た。ついで本混合液にNaCNBH3 1.6gを加え密栓したのち
室温で18時間振盪した。混合液をガラスフィルター上に
移してゲルをPBSで洗いホルミルセルロファインに結合
しなかったpoly−HSAを除いた。この操作でのpoly−HSA
のセルロファインへの結合率は約73％でセルロファイン
1ml当り約24mgのpoly−HSAの結合したpoly−HSA−セル
ロファイン40mlが得られた。本ゲルを0.1Mエタノールア
ミンを含むPBSに懸濁し、NaCNBH3200mgを加え室温で３
時間振盪したのち、ゲルをガラスフィルター上に移し、
PBS,8M尿素溶液,6M塩酸グアニジンついで25mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.5）で順次洗浄したのち内径5cmの
カラムに詰めpoly−HSA−セルロファインカラムを製造
した。
実施例１ adr型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原P31遺伝子を
発現する組み換えDNA分子の構築および該DNA分子による
大腸菌の形質転換 特開昭59−74985号公報およびNucleic Acids Res.11,
1747（1983）に記載されているプラスミドpBR322−BamH
I/HBr330DNA（pHBr330とも略す）は、特開昭58−201796
号公報に記載されている参考例１の方法によって調製し
た。該プラスミドpHBr330 50μｇに各20ユニットの制限
酵素EcoRI［宝酒造（株）製］とBamHIとを100μｌの反
応液［100mM Tris−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,50mM NaC
l,7mM 2−メルカプトエタノール］中で37℃,3時間反応
させた後、1.0％アガロース・スラブゲルを用いて参考
例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、1.4k
bDNA断片を参考例１に記載の方法によってゲルから分取
した（第６図参照）。
２μｇのプラスミドpBR322DNAに各２ユニットの制限
酵素BamHIとClaI（New England BioLabs社製）とを20μ
ｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH8.0）,7mM MgCl2,100m
M NaCl,2mM 2−メルカプトエタノール］中で37℃,2時間
反応させた後、0.8％アガロース・スラブゲルを用いて
参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、
4.01kbDNA断片を参考例１に記載の方法によってゲルか
ら分取した。
500ngの前記4.01kbDNA断片,500ngの前記1.4kbDNA断片
および参考例１で記載の方法によって５′末端がリン酸
化された合成アダプター とを参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用に
よって結合させた。なお、上記アダプターはトリエステ
ル法［Crea,R.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,5765（19
78）］を用いて化学合成された。この反応液を用いて大
腸菌294株を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転
換体から前記３種のDNAが結合したプラスミドpHBrP31DN
Aが得られた（第６図参照）。
１μｇのプラスミドpHBrP31DNAに２ユニットの制限酵
素BamHIを20μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH8.0）,7
mM MgCl2,100mM NaCl,2mM 2−メルトカプトエタノー
ル］中で37℃,2時間作用させた後、フェノールで除蛋白
し、冷エタノールを加えてDNAを沈澱させた（BamHI消化
pHBrP31）。
500ngのBamHI消化pHBrP31にDNAポリメラーゼI ラージ
・フラグメントを、参考例１に記載の条件下で作用させ
て、接着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白
し、冷エタノールでDNAを沈澱させた。該DNA断片300ng
と、参考例１に記載の方法で５′末端がリン酸化された
PstIリンカー［５′−Ｐ−ｄ（GCTGCAGC）］（New Engl
and BioLabs社製）50ngとを参考例１に記載の条件下でT
4DNAリガーゼの作用により結合させた。該反応液を用い
て大腸菌294部を形質転換させ、形質転換体を参考例１
に記載の方法によって調べ、プラスミドpHBrP31のBamHI
部位がPstI部位に変換したプラスミドpHBrP31−17を分
離した（第６図参照）。
該pHBrP31−17 50μｇに各20ユニットの制限酵素ClaI
とPstI［宝酒造（株）製］とを100μｌの反応液［20mM
Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,50mM(NH4)2SO4］中で3
7℃,3時間作用させた後、案内液を1.0％アガロース・ス
ラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動に
かけた。泳動後、1.42kbDNA断片を参考例１に記載の方
法でゲルから分取した。
特開昭58−201796号公報およびNucleic Acids Res.,1
1,3581（1983）に記載の発現用ベクターpTRP771 50μｇ
に制限酵素ClaIとPstIとを前記100μｌの反応液中で同
一条件下で反応させた後、反応液を1.0％アガロース・
スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動
にかけた。泳動後、3.3kbDNA断片を参考例１に記載の方
法でゲルから分取した。
200ngの該1.42kbDNA（P31をコードするDNA）と500ng
の3.3kbDNAとを参考例１に記載の条件下でT4DNAリガー
ゼの作用によって結合させた。該反応液を用いて大腸菌
294株を形質転換させ、参考例１の方法に従って該P31を
コードするDNAが発現用ベクターに挿入されたプラスミ
ドpTRP P31−Ｒを保持する大腸菌株（294/pTRP P31−
Ｒ）を分離した（第６図参照）。
実施例２ adw型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原P31遺伝子を
発現する組み換えDNA分子の構築および該DNA分子による
大腸菌の形質転換 特開昭58−194897号公報，特開昭58−201796号公報お
よびNucleic Acids Res.,11,1747（1983）に記載されて
いるプラスミドpBR−EcoRI/HBV933DNA（pHBV933と略
す）は、特開昭58−201796号公報に記載されている参考
例１の方法によって調製した。２μｇの該プラスミドに
２ユニットの制限酵素HpaI［宝酒造（株）製］を20μｌ
の反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,100mM
KCl,7mM 2−メルカプトエタノール］中で37℃,2時間作
用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールでDN
Aを沈澱させた。該DNA300ngとリン酸化されたPstIリン
カー［５′−Ｐ−（GCTGCAGC）］50ngとを、実施例１に
記載された条件下で結合させた後、該反応液を用いて大
腸菌294株を形質転換させ、形質転換体を参考例１に記
載の方法によって調べ、プラスミドpHBV933のHpaIサイ
トがPstIサイトに変換したプラスミドpHBV933−５を得
た（第７図参照）。
500μｇの該プラスミドpHBV933−5DNAに500ユニット
の制限酵素PstIを800μｌの反応液［20mM Tris−HCl（p
H7.5）,10mM MgCl2,50mM(NH4)2SO4］中で37℃,20分間作
用させた後、直ちにフェノールで除蛋白した。該反応液
を1.0％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記
載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、PstIによる部
分分解物1.7kbDNA断片を参考例１に記載の方法によって
ゲルから分取した（第７図参照）。
３μｇの該1.7kdDNAを６ユニットの制限酵素EcoRIと2
0μｌの反応液［100mM Tris−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,
50mM NaCl,7mM 2−メルカプトエタノール］中で37℃,1
時間反応させた後、1.0％アガロース・スラブゲルを用
いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動
後、0.97kbDNA断片を参考例１に記載の方法によってゲ
ルから分取した（第７図参照）。
500ngの該0.97kbDNA断片,500ngの実施例１に記載の3.
3kbDNA（pTRP771のClaI−PstI消化物）および50ngの実
施例１に記載のリン酸化アダプター とを参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用に
よって結合させた。該反応液を用いて大腸菌294株を形
質転換させ、テトラサイクリン耐性の形質転換体から参
考例１に記載された方法を用いて前記３種のDNAが結合
したプラスミドpTRP P31−Ｗを分離した。該プラスミド
のClaI部位に、特開昭58−201796号公報に記載のプラス
ミドpTRP 601をClaIとHpaII［宝酒造（株）製］で消化
して得られた約330bpのtrpプロモーターを含む断片を挿
入して、プラスミドpTRP P31−W2（第７図参照）を完成
した。
参考例5 adr型Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原P31遺伝子を
発現する酵母用組み換えDNA分子の構築および該DNA分子
による酵母の形質転換 実施例１に記載されたプラスミドpHBrP31DNA,50μ
ｇに各20ユニットの制限酵素ClaIとBamHIとを100μｌの
反応液［100mM Tris−HCl（pH8.0）,7mM MgCl2,100mM N
aCl,2mM 2−メルカプトエタノール］中で37℃,3時間作
用させた後、反応液を1.0％アガロース・スラブゲルを
用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳
動後、1.42kbDNA断片を参考例１に記載の方法でゲルか
ら分取した。
２μｇの該1.42kbDNA断片にDNAポリメラーゼI ラージ
・フラグメントを参考例１に記載の条件下で作用させて
接着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白し、
冷エタノールでDNAを沈澱させた。該DNA1.5μｇと参考
例１に記載のリン酸化SalIリンカー,50ngとを参考例１
に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用により結合させ
た。該反応液に10ユニットの制限酵素SalIを添加し、37
℃,3時間作用させて接着末端を生成させた。反応後、フ
ェノールで除蛋白し、試料を参考例２のに記載された
条件下でセファローズ4B・カラムにかけ、void volume
付近に溶出されてくる1.43kbDNA断片（adr型P31をコー
ドするDNA）を含む画分を集め、冷エタノールで該DNAを
沈澱させた（第８図参照）。
１μｇの参考例１に記載された発現用ベクターpPHO17
−1DNAに２ユニットの制限酵素SalIを20μｌの反応液
［6mM Tris−HCl（pH7.5）,6mM MgCl2,150mM NaCl,6mM
2−メルカプトエタノール］中で37℃,2時間作用させ、
次に0.1ユニットのアルカリ性ホスファターゼを添加し
て65℃,30分間反応を続けた。反応後、フェノールで除
蛋白し、冷エタノールを加えてDNAを沈澱させた（SalI
消化pPHO17−１）。
次に、200ngの前記1.43kbDNA断片と200ngのSalI消化p
PHO17−１とを、参考例１に記載の条件下でT4DNAリガー
ゼの作用により結合させた。該反応液を用いて大腸菌29
4部を形質転換させ、形質転換体を参考例１に記載され
た方法によって調べ、adr型P31をコードするDNAを含む
1.43kbDNA断片がPHO 5プロモーターと順方向に挿入され
たプラスミドpPHO P31−Ｒを保持する菌株（Escherichi
a coli 294/pPHO P31−Ｒ）を分離した。この形質転換
体よりアルカリ抽出法によって分離された該プラスミド
pPHO P31−Ｒを用いて酵母宿主Saccharomyces cerevisi
ae AH22R-を前述のHinnenらの方法で形質転換させ、該
プラスミドを保持する酵母形質転換体（AH22R-/pPHO P3
1−Ｒ）を分離した（第８図参照）。
参考例２のに記載された発現用ベクターpPKT700
−1DNA,1μｇに２ユニットの制限酵素SalIを37℃で２時
間作用させ、つづいて0.1ユニットのアルカリ性ホスフ
ァターゼを実施例３のに記載された条件下で作用させ
た後、冷エタノールでDNAを沈澱させる（SalI消化pPKT7
00−１）。
次に、実施例３のに記載の1.43kbDNA断片200ngとSa
lI消化pPKT700−1 200ngとを参考例１に記載の条件下で
T4DNAリガーゼの作用により結合させる。該反応液を用
いて、実施例３のに記載した方法によって、adr型P31
をコードするDNAを含む1.43kbDNA断片がPGKプロモータ
ーと順方向に挿入されたプラスミドpPKT P31−Ｒを保持
する菌株（294/pPKT P31−Ｒ）を分離し、該プラスミド
で酵母宿主K33−8Dを形質転換し、酵母形質転換体（K33
−8D/pPKT P31−Ｒ）を取得する（第８図参照）。
参考例３のに記載された発現用ベクターpGLD906
−1DNA,1μｇに２ユニットの制限酵素SalIを37℃で２時
間作用させ、つづいて0.1ユニットのアルカリ性ホスフ
ァターゼを実施例３のに記載の条件下で作用させた
後、冷エタノールでDNAを沈澱させる（SalI消化pGLD906
−１）。
次に、実施例３のに記載の1.43kbDNA断片200ngとSa
lI消化pGLD906−１とを参考例１に記載の条件下でT4DNA
リガーゼの作用により結合させる。該反応液を用いて、
実施例３のに記載した方法によって、adr型P31をコー
ドするDNAを含む1.43kbDNA断片がGLDプロモーターと順
方向に挿入されたプラスミドpGLD P31−Ｒを保持する菌
株（294/pGLD P31−Ｒ）を分離し、該プラスミドで酵母
宿主K33−7Bを形質転換し、酵母形質転換体（K33−7B/p
GLD 31−Ｒ）を取得する（第８図参照）。
これら形質転換体を通常の方法で培養して、目的とす
るP31を得ることができる。
参考例６ adw型Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原P31遺伝子
を発現する酵母用組み換えDNA分子の構築および該DNA分
子による酵母の形質転換 実施例２に記載されたプラスミドpHBV933DNA,2μｇ
に２ユニットの制限酵素HpaIを20μｌの反応液［10mM T
ris−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,100mM KCl,7mM 2−メル
カプトエタノール］中で37℃,2時間作用させた後、フェ
ノールで除蛋白し、冷エタノールでDNAを沈澱させた。
該DNA300ngと、参考例１に記載されたリン酸化Sal1リン
カー50ngとを混合し、参考例１に記載された条件下でT4
Dリガーゼの作用によって結合させた。該反応液を用い
て大腸菌294株を形質転換させ、アンピシリン耐性の形
質転換体の中からプラスミドpHBV933のHpaI部位がSalI
部位に変換したプラスミドpHBV933−８を得た（第９図
参照）。
100μｇの該プラスミドpHBV933−8DNAに、各100ユニ
ットの制限酵素EcoRIとSalIを200μｌの反応液［100mM
Tris−HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,50mM NaCl,7mM 2−メル
カプトエタノール］中で37℃,2時間作用させた後、反応
液を1.2％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に
記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、adw型P31を
コードするDNA断片を含む0.96kbDNA断片を参考例１に記
載の方法によってゲルから分取した（第９図参照）。
20μｇのプラスミドpBR322DNAに、各20ユニットの制
限酵素ClaIとSalIとを100μｌの反応液［6mM Tris−HCl
（pH7.9）,150mM NaCl,6mM MgCl2,6mM 2−メルカプトエ
タノール］中で37℃,2時間反応させた後、1.0％アガロ
ース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電
気泳動にかけた。泳動後、3.74kbDNA断片を参考例１に
記載の方法によってゲルから分取した。
該3.74kbDNA断片500ng、前記0.96kbDNA断片500ngおよ
び実施例１に記載のリン酸化アダプター とを参考例１に記載の条件下でT4DNAリガーゼの作用に
よって結合させた。該反応液を用いて大腸菌294株を形
質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体から前記３
種のDNAが結合したプラスミドpHBV P31DNAが得られた
（第９図参照）。
50μｇの該プラスミドpHBV P31DNAに各20ユニットの
制限酵素SalIとClaIとを100μｌの反応液［10mM Tris−
HCl（pH7.5）,7mM MgCl2,175mM NaCl,0.2mM EDTA,7mM 2
−メルカプトエタノール］中で37℃,3時間作用させた
後、反応液を1.0％アガロース・スラブゲルを用いて参
考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳動後、0.
98kbDNA断片を参考例１に記載の方法でゲルから分取し
た（第９図参照）。
２μｇの該0.98kbDNA断片にDNAポリメラーゼI ラージ
・フラグメントを参考例１に記載の条件下で作用させて
接着末端を平滑末端にした後、フェノールで除蛋白し、
冷エタノールでDNAを沈澱させた。参考例５のに記載
の方法によって、該0.98kbDNA断片にSalIリンカー
［５′−Ｐ−ｄ（CGTCGACG），ベセスダ・リサーチ社］
を結合させ、SalI処理によって接着末端を生成させ、セ
ファローズ4Bカラムを用いて0.99kbDNA断片（adw型P31
をコードするDNA）を含む画分を集め、冷エタノールで
該DNAを沈澱させた（第９図参照）。
参考例５のに記載のSalI消化pPHO 17−1,200ngと上
記0.99kbDNA断片200ngとを参考例１に記載の条件下でT4
DNAリガーゼの作用により結合させた。該反応液を用い
て大腸菌294株を形質転換させ、形質転換体を参考例１
に記載された方法によって調べ、adw型P31をコードする
DNAを含む0.99kbDNA断片がPHO 5プロモーターと順方向
に挿入されたプラスミドpPHO P31−Ｗを保持する菌株
（Escherichia coli 294/pPHO P31−Ｗ）を分離した。
該形質転換体よりアルカリ抽出法によって分離された該
プラスミドpPHO P31−Ｗを用いて酵母宿主AH22R-を前述
のHinnenらの方法で形質転換させ、該プラスミドを保持
する酵母形質転換体（Saccharomyces cerevisiae AH22R
-/pPHO P31−Ｗ）を分離した（第９図参照）。
また、adw型P31をコードするDNAとPGKプロモーターま
たはGLDプロモーターを含有するプラスミドも上記の方
法に従って構築することができる。
参考例7 adw型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原P31遺伝子を発
現する酵母組み換えDNAの構築および該DNAによる酵母の
形質転換 50μｇの前記プラスミドpTRP P31−W2に20ユニットの
制限酵素PstIを100μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH
7.5）,10mM MgCl2,50mM NaCl,1mMジチオスレイトール］
中で37℃,20分間作用させ、部分分解した後、反応液を
0.8％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に記載
の条件下で電気泳動にかける。泳動後、PstIでただ１か
所切断された4.6kbの線状DNA分子を参考例１に記載の方
法でゲルから分取する（第10図参照）。
５μｇの該4.6kbDNA分子に５ユニットの制限酵素ClaI
を、30μｌの反応液［10mM Tris−HCl（pH7.5）,7mM Mg
Cl2,10mM NaCl］中で、37℃,3時間作用させた後、反応
液を1.0％アガロース・スラブゲルを用いて参考例１に
記載の条件下で電気泳動にかける。泳動後、0.98kbDNA
断片を参考例１に記載の方法でゲルから分取する。
該0.98kbDNA断片0.8μｇを2.5ユニットのT4DNAポリメ
ラーゼ［宝酒造（株）製］を用いて、20μｌの反応液
［33mM Tris−acetate（pH7.9）,66mM酢酸カリウム,10m
M酢酸マグネシウム,5mMジチオスレイトール］中、37℃
で15分間処理し、接着末端を平滑末端にした後、フェノ
ールで除蛋白し、冷エタノールでDNAを沈澱させる。参
考例５のに記載の方法によって、該0.98kbDNA断片にS
alIリンカーを結合させ、SalI処理によって接着末端を
生成させ、セファローズ4Bカラムを用いて、0.99kbDNA
断片（adw型P31をコードするDNA）を含む画分を集め、
冷エタノールで該DNAを沈澱させる。
参考例５のに記載のSalI消化pPHO17−1 200ngと上
記0.99kbDNA断片200ngとを参考例１に記載の条件下でT4
DNAリガーゼの作用により結合させる。該反応液を用い
て大腸菌294株を形質転換させ、形質転換体を参考例１
に記載された方法によって調べ、adw型P31をコードする
DNAを含む0.99kbDNA断片がPHO5プロモーターと順方向に
挿入されたプラスミドpPHO P31−Ｗを保持する菌株（29
4/pPHO P31−Ｗ）を分離する。該形質転換体よりアルカ
リ抽出法によって分離された該プラスミドpPHO P31−Ｗ
を用いて酵母宿主AH22R-を前述のHinnenらの方法で形質
転換させ、該プラスミドを保持する酵母形質転換体（AH
22R-/pPHO P31−Ｗ）を分離する（第10図参照）。
この形質転換体を通常の方法で培養して、目的とする
P31を得ることができる。
実施例３ P31遺伝子の大腸菌における発現 実施例１と２で得られたP31遺伝子発現プラスミドを
含む各形質転換体を、1.0％グルコース、1.0％カザミノ
酸を含むＭ−９培地で、37℃,6時間培養した後、菌体を
集め、緩衝液［30mM Tris−HCl（pH8.0）,50mM NaCl,5m
M EDTA］で洗浄した。菌体を10mM Tris−HCl（pH8.0）,
5mM EDTA,1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド,5
mg/mlリゾチームからなる溶菌液に懸濁し、溶菌した。
該溶菌液に最終濃度5Mになるように塩酸グアニジンを添
加し、37℃で２時間インキュベーションした。溶菌液を
室温で15,000rpm,15分間遠心分離にかけて上澄液を得
た。この上澄液のP31活性を、前述のdirect immunoassa
yによって測定した。その結果を第２表に示すが、P31の
生成量はブロス1mlあたりとして計算された。また、こ
の生成量は特開昭58−201796号公報記載の表面抗原の生
産量より高いことがわかった。
オースリアII−125キット添付の125I−抗HBsAg抗体の
カウント数の値である。
参考例８ P31遺伝子の酵母における発現 参考例５と６で得られたP31遺伝子発現プラスミドを
含む各酵母形質転換体を、Burkholderおよびその低リン
酸培地で、30℃,2日間培養した後、菌体を集め、生理食
塩水で洗浄した。
Miyanohara,A.ら［前出］の方法によって菌体をZymol
yase［生化学工業（株）製］によってスフェロプラスト
にした後、スフェロプラストに0.1％トリトンＸ−100を
添加してP31を抽出した。溶菌液を室温で15,000rpm,15
分間遠心分離にかけて上澄液を得た。この上澄液のP31
活性をオースザイムII［アボット（株）製］を用いて測
定した。その結果を第３表に示すが、P31の生成量はブ
ロス１あたりとして計算された。
実施例４ 実質的に純粋なP31蛋白質の製造 菌体からの抽出 実施例３記載の方法で培養し、−20℃で凍結して得た
Escherichia coli 294/pTRP P31−Ｒの凍結保存菌体100
gを10mM EDTA,25mMリン酸ナトリウムを含む緩衝液（pH
7.5）200mlに均一に懸濁した。この懸濁液に696mgのフ
ェニルメチルスルホニルフルオライドおよび100mgのリ
ゾチームを加え37℃で15分間加温したのち、200mlの8M
尿素を含む25mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）を加
えてオムニミキサー（サーバル社製）を用いて4000rpm
で30秒間２回ホモジナイズした。ホモジネートにさらに
8M尿素を含む25mMリン酸ナトリウム緩衝液600mlを加え
４℃で４時間攪拌した。この溶菌液に25mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH7.5）3000mlを加えさらに１時間攪拌し
たのち18,900×ｇで70分間遠心分離して上清3900ml（9.
7×103ユニット/ml）を得た。
poly−HSA−セルロファインカラムによる精製 上記で得た上清を25mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
5）で平衡化した参考例４で得たpoly−HSAセルロファイ
ンカラム（５×2cm）に通してP31蛋白質を吸着させ、カ
ラムを0.05％Tween20を含むPBS 300ml、0.05％Tween20,
0.5M NaClを含むPBS 220ml,0.05％Tween20を含むPBS80m
l,4M尿素を含む25mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）3
00mlで順次洗ったのち、7.5M尿素を含むリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH7.5）300mlを用いてP31を溶出させた。活
性画分250mlをYM−５メンブラン（アミコン社製，アメ
リカ）を用いて7.2ml（2.3×106ユニット/ml）に濃縮し
た。得られた濃縮液7mlに140mgのDTTを加え80℃で15分
間還元したのち、メンブランフィルター（アクロディス
ク；口径0.2μm:ゲルマン社製）を用いてろ過した。
逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーに
よる精製 上記で得られたろ液のうち500μｌをAP202 300Å
（C8）逆相カラム（YMC島久社製）に吸着させ、トリフ
ルオロ酢酸−アセトニトリル−ｎ−プロピルアルコール
系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィーを行っ
た。
カラム,AP202 300Å（C8）（4.6×150mm）；カラム温
度,30℃；溶出溶媒A,0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％
水；溶出溶媒B,0.1％トリフルオロ酢酸−49.95％アセト
ニトリル−49.95％ｎ−プロピルアルコール；溶出プロ
グラム,0分（45％Ａ＋55％Ｂ）−25分（25％Ａ＋75％
Ｂ）−47分（25％Ａ＋75％Ｂ）−49分（５％Ａ＋95％
Ｂ）−50分（45％Ａ＋55％Ｂ）；溶出速度1ml/min;検出
波長280nm。本条件下で保持時間約41分の画分4.8ml（3.
1×104ユニット/mlを集め凍結乾燥に付し、実質的に純
粋なP31蛋白質（adr型）149μｇ（１×106ユニット/m
g）を含む白色粉末を得た。
上記方法で製造した実質的に純粋なP31蛋白質（adr
型）は下記の性状を有していた。
（１）単一性： ラエムリの方法［Nature,227,680（1970）］に準じて
SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動を行った
あと銀染色試薬「第１」（第１化学製，東京）で染色し
た結果、P31蛋白質は単一のバンドを示した（第11図参
照）。
（２）分子量： P31蛋白質の分子量は、SDS−ポリアクリルアミドスラ
ブゲル電気泳動から約32,000ダルトンと算出された（第
11図参照）。
（３）アミノ酸組成： P31蛋白質20μｇをガラス製加水分解用試験管にと
り、４％チオグリコール酸を含む定沸点塩酸を加えて、
減圧下に封管したのち、110℃で24,48,72,96時間加水分
解した。加水分解後、開管し、減圧下に塩酸を除去し、
残渣を0.02N塩酸に溶解して日立製835型アミノ酸分析計
によりアミノ酸分析を実施した。シスチンおよびシステ
ィンはハースの方法［Methods in Enzymol,11,197（196
7）］に従い、P31蛋白質を過ギ酸酸化したのち、減圧
下、定沸点塩酸中で24時間加水分解して、アミノ酸分析
計によりシスティン酸として定量した。アミノ酸分析値
は、24,48および72時間の加水分解で得られた値を平均
して求めた。但し、イソロイシン，ロイシンおよびフェ
ニルアラニンは96時間の加水分解で得られた値を、また
セリンおよびスレオニンの値は加水分解時間を０時間に
外挿して求めた。その結果を第４表に示す。
（４）Ｎ末端アミノ酸配列： P31蛋白質62μｇに気相プロティンシークエネーター
（アプライド・バイオシステムズ社製470A型，アメリ
カ）を用いる自動エドマン分解法を適用して、Ｎ末端ア
ミノ酸配列を分析した。フェニルチオヒダントインアミ
ノ酸（PTH−アミノ酸）はミクロパックSP−ODSカラム
（バリアン社製，アメリカ）を用いる高速液体クロマト
グラフィーにより同定した。各ステップで検出されたPT
H−アミノ酸を第５表に示す。
（５）Ｃ末端アミノ酸： 該31蛋白質620μｇをガラス製ヒドラジン分解用試験
管にとり、無水ヒドラジン0.1mlを加えて減圧下に封管
したのち、100℃で６時間加熱した。得られたヒドラジ
ン分解物を凍結乾燥したのち、蒸留水に溶解した。この
溶液にベンズアルデヒドを添加し、室温１時間攪拌し、
遠心分離を行なったのち、上清を得た。この上清を凍結
乾燥し、日立製835型アミノ酸分析計によりアミノ酸分
析を実施した。その結果、4.7nmoleのイソロイシンが検
出された。
実施例３記載の方法で培養して得たEscherichia coli
294/pTRP P31−W2の菌体についても上記と同様の方法
により実質的に純粋なP31蛋白質（adw型）を製造でき
る。
参考例９ 参考例２のに記載された発現用ベクターpPKT 700−
1DNA,1μｇに２ユニットの制限酵素SalIを37℃で２時間
作用させ、つづいて0.1ユニットのアルカリ性ホスファ
ターゼを参考例５のに記載された条件下で作用させた
後、冷エタノールでDNAを沈澱させた（SalI消化pPKT700
−１）。
次に、参考例５のに記載の1.43kbDNA断片200ngとSa
lI消化pPKT700−1 200ngとを参考例１に記載の条件下で
T4DNAリガーゼの作用により結合させた。該反応液を用
いて、実施例３のに記載した方法によって、adr型P31
をコードするDNAを含む1.43kbDNA断片がPGKプロモータ
ーと順方向に挿入されたプラスミドpPKT 31−Ｒを保持
する菌株（294/pPKT P31−Ｒ）を分離し、該プラスミド
で酵母宿主AH22R-を形質転換し、酵母形質転換体（AH22
R-/pPKT P31−Ｒ）を取得した（第８図参照）。
参考例10 参考例３のに記載された発現用ベクターpGLD906−1
DNA,1μｇに２ユニットの制限酵素SalIを37℃で２時間
作用させ、つづいて0.1ユニットのアルカリ性ホスファ
ターゼを実施例３のに記載の条件下で作用させた後、
冷エタノールでDNAを沈澱させた（XhoI消化pGLD906−
１）。
次に、参考例５のに記載の1.43kbDNA断片200ngとSa
lI消化pGLD906−１とを参考例１に記載の条件下でT4DNA
リガーゼの作用により結合させた。該反応液を用いて、
参考例５のに記載した方法によって、adr型P31をコー
ドするDNAを含む1.43kbDNA断片がGLDプロモーターと順
方向に挿入されたプラスミドpGLD P31−Ｒを保持する菌
株（294/pGLD 31−Ｒ）を分離し、該プラスミドで酵母
宿主AH22R-を形質転換し、酵母形質転換体（AH22R-/pGL
D 31−Ｒ）を取得した（第８図参照）。
参考例11 P31遺伝子の酵母における発現 参考例９および10で得られたP31遺伝子発現プラスミ
ドを含む各酵母形質転換体を、Burkholderおよびその低
リン酸培地で、30℃,2日間培養した後、菌体を集め、生
理食塩水で洗浄した。
Miyanohara,A.ら［前出］の方法に従って菌体をZymol
yase［生化学工業（株）製］によってスフェロプラスト
にした後、スフェロプラストに0.1％トリトンＸ−100を
添加してP31を抽出した。溶菌液を室温で15,000rpm,15
分間遠心分離にかけて上澄液を得た。この上澄液のP31
活性をオースザイムII［アボット（株）製］を用いて測
定した。その結果を第６表に示すが、P31の生成量はブ
ロス１あたりとして計算された。
実施例５ 実施例１および２で得られたP31遺伝子発現プラスミ
ドを含む大腸菌294株よりプラスミドを抽出し、該プラ
スミドを用いて大腸菌C600株を形質転換し、Escherichi
a coli C600/pTRP P31−ＲおよびEscherichia coli C60
0/pTRP P31−W2を得た。
実施例６ 実施例５で得られたP31遺伝子発現プラスミドを含む
大腸菌C600株を、2.0％グルコース,1.0％カザミノ酸を
含むＭ−９培地で、37℃,8時間培養した後、菌体を集
め、緩衝液［30mM Tris−HCl（pH8.0）,50mM NaCl,5mM
EDTA］で洗浄した。菌体を10mM Tris−HCl（pH8.0）,5m
M EDTA,1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド,5mg
/mlリゾチームからなる溶菌液に懸濁し、溶菌した。該
溶菌液に最終濃度7Mになるように塩酸グアニジンを添加
し、37℃で２時間インキュベーションした。溶菌液を室
温で15,000rpm,15分間遠心分離にかけて上澄液を得た。
この上澄液のP31活性を、前述のdirect immunoassayに
よって測定した。その結果を第７表に示すが、P31の生
成量はブロス1mlあたりとして計算された。
オースリアII−125キット添付の125I−抗HBsAg抗体の
カウント数の値である。
実施例7 実質的に純粋なP31蛋白質の製造 実施例５で得たEscherichia coli C600/pTRP P31−Ｒ
を用い、実施例４記載の方法で得たpoly−HSA−セルロ
ファインカラムからの溶出液の濃縮液0.6ml（2.1×106
ユニット/ml）に6mgのDTTを加え37℃で１時間還元した
のち、メンブランフィルターを用いてろ過した。ろ液の
うち500μｌをAP224 300A（C8）逆相カラム（YMC島久社
製）に吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル−
ｎ−プロピルアルコール系を溶出溶媒とする高速液体ク
ロマトグラフィーを行った。
カラム,AP224 300Å（C8）（１×30cm）；カラム温
度,30℃；溶出溶媒A,0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％
水；溶出溶媒B,0.1％トリフルオロ酢酸−49.95％アセト
ニトリル−49.95％ｎ−プロピルアルコール；溶出プロ
グラム,0分（70％Ａ＋30％Ｂ）−10分（28％Ａ＋72％
Ｂ）−30分（24％Ａ＋76％Ｂ）−50分（14％Ａ＋86％
Ｂ）−55分（５％Ａ＋95％Ｂ）−58分（５％Ａ＋95％
Ｂ）−59分（70％Ａ＋30％Ｂ）；溶出速度2.5ml/min;検
出波長280nm。本条件下で保持時間約42分の画分20ml
（1.7×104ユニット/ml）を集め−20℃に保持した。
上記方法で製造した実質的に純粋なP31蛋白質（adr
型）は実施例４で得たP31蛋白質（adr型）と同一の性状
を有していた。
実施例８ （１）実施例７で得たP31蛋白質1mgをガラス製試験管に
とり、減圧下に溶媒を除去したのちフェノール硫酸法
（アナリティカル ケミストリー28巻350頁1956年）に
従って糖の定量を行なった。なお標準品はグルコースを
用いた。その結果、P31蛋白質の分子量を31,000ダルト
ンとして計算すると標準品中に検出された糖はP31蛋白
質１分子当たり0.3分子以下であった。したがって得ら
れたP31蛋白質には糖がないと考えられる。
（２）実施例７で得たP31蛋白質30μｇをガラス製加水
分解用試験管にとり、溶媒を除去したのちトリフルオロ
酢酸／定沸点塩酸（1:2（v/v））200μｌを加えて、減
圧下に封管したのち、170℃で25,50,180分加水分解し
た。加水分解後、開管し、減圧下にトリフルオロ酢酸お
よび塩酸を除去し、残渣を0.02N塩酸に溶解して日立製8
35型アミノ酸分析計によりアミノ酸分析を実施した。シ
スチンおよびシスティンはハースの方法に従い、P31蛋
白質を過ギ酸酸化したのち、減圧下、定沸点塩酸中で24
時間加水分解して、アミノ酸分析計によりシスティン酸
として定量した。スレオニン，セリンおよびトリプトフ
ァンはP31蛋白質を減圧下４％チオグリコール酸を含む
定沸点塩酸中で16,20,24,30時間加水分解して定量し
た。アミノ酸分析値は、25,50および180分間の加水分解
で得られた値を平均して求めた。但し、トリプトファン
は24時間の加水分解で得られた値をまたセリンおよびス
レオニンの値は加水分解時間を０時間に外挿して求め
た。その結果を第８表に示す。
各微生物の寄託機関への寄託およびその受託番号は第
９表に示すとおりである。
表中、IFOは財団法人発酵研究所を、FRIは日本国通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所を、E.coliはEs
cherichia coliを、S.cerevisiaeはSaccharomyces cere
visiaeを表わす。FERM BP番号はブタペスト条約に基づ
く寄託の寄託番号を、括弧内のFERM P番号はブタペスト
条約に基づく寄託への切り換え前の受託番号を表わす。
なお、E.coli294は公知［Backman,K.ら,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,73,4174（1974）］である。
本発明により製造されるHBsAg P31はHBVの診断やHBV
の感染防止に有用なワクチンとして有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図はadr型HBsAgP31をコードするDNA配列（上段）お
よび対応するアミノ酸配列（下段）を示す。 第２図はadw型HBsAgP31をコードするDNA配列（上段）お
よび対応するアミノ酸配列（下段）を示す。 第３図はプラスミドpPHO17−１の構築図を示し、記号E,
S,B,HおよびＸはそれぞれEcoRI,SalI,BamHI,HindIIIお
よびXhoIを表わす。 第４図はプラスミドpPKT700−１の構築図を示し、記号
E,S,B,HおよびＸはそれぞれEcoRI、SalI,BamHI,HindIII
およびXhoIを表わす。 第５図はプラスミドpGLD906−１の構築図を示し、記号
E,S,B,HおよびＸはそれぞれEcoRI,SalI,BamHI,HindIII
およびXhoIを表わす。 第６図は大腸菌用adr型HBsAgP31の発現プラスミドpTRP
P31−Ｒの構築図を示し、記号E,B,CおよびＰはそれぞれ
EcoRI,BamHI,ClaIおよびPstIを表わす。 第７図は大腸菌用adw型HBsAgp31の発現プラスミドpTRP
P31−W2の構築図を示し、記号E,B,CおよびＰはそれぞれ
EcoRI,BamHI,ClaIおよびPstIを表わす。 第８図は酵母用adr型HBsAgP31の発現プラスミドpGLD P3
1−R,pPHO P31−ＲおよびpPKT P31−Ｒの構築図を示
し、記号E,B,S,H,XおよびＣはそれぞれEcoRI,BamHI,Sal
I,HindIII,XhoIおよびClaIを表わす。 第９および10図は酵母用adw型HBsHg P31の発現プラスミ
ドpPHO P31−Ｗの構築図を示し、記号E,P,B,C,Sおよび
ＨはそれぞれEcoRI,PstI,BamHI,ClaI,SalIおよびHindII
Iを表わす。 第11図は実施例７の後に記載した（１），（２）におけ
るSDS−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動の結果
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８００ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０１ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８０８ (72)発明者 西村 紀 大阪府豊中市東豊中町５丁目２番123―502 号 (56)参考文献 特開 昭59−74985（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−104887（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−63995（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−80615（ＪＰ，Ａ) ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ，Ｖ ｏｌ，85，（1983）Ｐ．268−274 Ａｎｎ，Ｖｉｒｏｌ，Ｖｏｌ，134Ｅ, （1983）Ｐ．87−96

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】大腸菌でアミノ酸配列： からなるadr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31またはアミ
    ノ酸配列： からなるadw型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31を生成させ
    るための組み換えDNAであって、adr型またはadw型Ｂ型
    肝炎ウイルス表面抗原P31をコードするDNAを大腸菌で機
    能しうるプロモーター領域の３′末端に挿入してなる組
    み換えDNA。
  2. 【請求項２】大腸菌で機能しうるプロモーター領域が大
    腸菌のtrpプロモーター領域である特許請求の範囲第１
    項記載の組み換えDNA。
  3. 【請求項３】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31がadr型Ｂ型
    肝炎ウイルス表面抗原P31である特許請求の範囲第１項
    記載の組み換えDNA。
  4. 【請求項４】プラスミドpTRP P31−Ｒである特許請求の
    範囲第１項記載の組み換えDNA。
  5. 【請求項５】アミノ酸配列： からなるadr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31またはアミ
    ノ酸配列： からなるadw型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31をコードす
    るDNAを大腸菌で機能しうるプロモーター領域の３′末
    端に挿入してなる組み換えDNAを含有する大腸菌形質転
    換体。
  6. 【請求項６】大腸菌で機能しうるプロモーター領域が大
    腸菌のtrpプロモーター領域である特許請求の範囲第５
    項記載の大腸菌形質転換体。
  7. 【請求項７】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原P31がadr型Ｂ型
    肝炎ウイルス表面抗原P31である特許請求の範囲第５項
    記載の大腸菌形質転換体。
  8. 【請求項８】組み換えDNAがプラスミドpTRP P31−Ｒで
    ある特許請求の範囲第５項記載の大腸菌形質転換体。
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