CZ103896A3 - Oxidized carotenoids, retinoids, related conjugated polyenes and derived compounds usable as compounds causing cell differentiation, cytostatics and anticarcinogenic substances - Google Patents

Description

Oxidované karotenoidy, retinoidy, příbuzné konjugované”pSTyeny a odvozené sloučeniny užitečné jako látky vyvolávající diferenciaci buněk, cytostatika a protirakovinné látky

Oblast techniky

Vynález se týká oxidované karotenoidů, retinoidů, příbuzných konjugovaných polyenů a některých jejich derivátů majících vlastnosti cytostatik a protirakovinových látek a schopných vyvolávat diferenciaci buněk, užitečných jako chemoterapeutioká a chemopreventivní činidla, a zejména taxc.ycn derivace. .-eráre se zisxávaji značnou oxidaci xsrocenoidů, retinoidů a příbuzných konjugovaných polyenů a následujícím zpracováním.

Dosavadní stav techniky

Karotenoidy a retinoidy jsou přírodní látky, které obsahují silně konjugované polyenové řetězce. Karotenoidy mají nejvíce konjugovanou soustavu dvojných vazeb uhlík- uhlík, která vyvolává jejich rozmanité a zářivé barvy. Mnoho

Z¹?//' karotenoidů a retinoidů, které jsou přírodní^/látky, jsou bie.zílogicky aktivní. Například jisté uhlíkovodíkové členy karotenoidové rodiny {nejvýznačněji beta-karoten nebo pro- vitamin A, jeden z nejhojnějších karotenoidů v potravě) jsou zdroje retinolu (jedné formy vitaminu A), karotenoidy chrání rostliny před oxidačním poškozením vyvolávaným světlem, pravděpodobně deaktivací singletového. kyslíku. Epidemiologické důkazy naznačují, že příjem karotenoidů záporně koreluje s výskytem některých typů rakoviny (Peto a j., Nátuře, •X

1981, 290, 201-208) . Ukázalo se, že karotenoidy a retinoidy zpomalují vývoj některých experimentálně vyvolaných zvířecích tumorů (N. I. Krinsky, Účinek karotenoidů v biologieΪ kých systémech, Annu. Rev. Nutr., 13, 561-587 (1993), Matthews- Roth, Curr. Top; Nutr. Dis. (Nové ochranné role vybraných živin) 1989, 22, 17-38, Pure Appl. Chem., 1985, 57, 717-722). Provádí se řada dietních intervenčních studií, aby se stanovila účinnost dodatečného beta-karotenu jako .nejedovaté dietní přoťirákovinové látky, která může účinně snižovat mortalitu na rakovinu. Nejnověji se zkoumá možnost, že beta-karoten může být spojen se sníženým výskytem koronári nich chorob srdce, nové¹ klinické údaje o použití příbuzných ·» sloučenin (retinoidů - retinovš' kyseliny, retinolu a retina- . midů) ukázaly úlohu v prot i rakovinové terapii,' ač. jako terapeut ikum,· nebo jako preventivní látka (rakovina kůže, hlavy a-šíje,· plic a močového..měchýře., akutní: promyelocytické leukémie; leukoplakíe a myelodysplastických syndromů, .D„. L. Hill. & a C. J. Grubs, Retinoidy a prevence rakoviny, Annu. Rev. Nutr., 12, 161-181 (1992)). Konečně má beta- karoten antioxidační účinky při nízkých tlacích kyslíku nalézaných v' tkáních (Burton a Ingold, Beta- karotény, neobyčejný týp antio- . 'xidantu I-ipidů, ’ Science’, ’ 19'8'4','''2'2’4', '56'9-57'3j';

Karotenoidy, retinoidy a příbuzné konjugované polyeny jsou reaktivní vůči molekulárnímu kyslíku (O ) a mohou se tedy oxidačně degradovat v potravinách během skladování, i za snížených teplot. Karotenoidy jsou reaktivnější vůči kyslíku než retinoidy, protože mají větší, více konjugované ' soustavy dvojných vazeb. Produktům takové oxidační degradace karotenoidových retinoidů a příbuzných konjugovaných polyenů a (jejich.možné, fyziologické aktivitě.·se však dostalo pozoru3 /phodně málo pozornosti, s výjimkou vitaminu A, který se chystané jako produkt oxidace beta-karotenu.

Mordi aj., Předběžná studie autooxidace beta-karotenu, publikovaná v Tetrahedron Letters, 1991, 32, 4203-4206, prozkoumali produkty samoiniciované autooxidace beta- karotenu. Publikace uzavírá tím, že hlavní produkty, identifikované v počátečních stadiích autooxidace beta- karotenu, jsou epoxidy, beta-ionon, beta-apo-13-karotenon, retinal a příbuzné karbonylové sloučeniny. V konečné směsi převládají karbonylové sloučeniny s krátkým řetězcem.

Jiná publikace, Mordi aj., Oxidační degradace beta- karotenu a beta-a:

49. číslo 4, 3i;

ováná autooxid;

epoxidy, d i hy d r ;

- 3 ' - karet enalu, cublikovaná v Tetrahedron,. -52?, 22. ledna 1993, ukazuje, š = samoiniciy ce beta-karotenu molekulárním kyslíkem dává

Λ čuraný, karbonylové sloučeniny, oxid uhličihůít tý, stopy alkoholu a některé jiné sloučeniny. Publikace, jejímž spoluautorem je jeden ze spoluvynálezců, se také zmiňuj je nějaký polymerní/oligomerní materiál, který často vypadával z roztoku, zejména v pozdních fázích oxidace beta- karotenu, Vlastnosti polymeru/oligomeru nejsou v publikaci popsány .

Tato patentová přihláška vznikla z rozvoje naší myšlenky, že biologická aktivita karotenoidů nepochází ze samotných karotenoidů, ale místo toho z jednoho či více jejich oxidačních produktů generovaných in vivo. Rovněž jsou zahrnuty pro. svou schopnost se oxidovat retinoidy, ačkoliv to není tak snadné jako u karotenoidů. Biologická aktivita oxidovaných retinoidů se liší od známé aktivity samotných retinoidů.

Podstata vynálezu

V prvé fázi výzkumu vedoucího k vynálezu směsí získaných, oxidací beta.-karotenu, canthaxantinu nebo. reti.nové.kyseliny, kyslíkem 0_,, za podmínek, kdy alespoň část substrátu reaguje na molekulární bázi, s mnohonásobným přebytkem kyslíku (způsob se dále nazývá extensivní oxidace), bylo zjištěno, že tyto směsi jsou schopné v buněčné kultuře způsobit, aby savčí buňky, odvozené od rakoviny a virově změněné, se množily méně rychle způsobem, který je netoxický pro normální buňky. Dále bylo stanoveno v mnoha ošetřených buněčných liniích, že dochází k diferenciaci buněk, například rakovinové buňky případně získávají mnohé charakteristiky normálních, huně k. .. Také. bylo z j išťěno./.. že: směs materiálu.získaného. extensivní oxidací beta-karotenu. je schopná zpozdit nebo. zastavit netoxickým způsobem růst tumoru umyší;

Navrhuje se' oxidovat karotenoidy, retinoidy. nebo.· příbuzné. konjugované.: polyeny kyslíkem.;· za. podmínek „ vhodných-pro.. získání oligomerní nebo polyrnerní složky.

Oxidaci lze provádět s kyslíkem a karotenoidy, retinoidy nebo příbuzné konjugované polyeny, jak v pevném stavu, tak rozpuštěné v organickém rozpouštědle.

‘Podle laboratorních tesťů popsaných dále'~se věří,, že’ jak oxidované směsi (a oligomerní/ polyrnerní složka), získané oxidací beta-karotenu, canthaxantinu, lykopenu, retinové kyseliny, a jejich částečně oxidované směsi jsou účinná činidla prcci množení buněk a proti rakovině a vyvolávají·diferenciaci buněk.

V prvé fázi výzkumu nebyly stanoveny strukturní vzorce polymerních složek. Je tu svědectví, že.polymery vzniklé oxidací beta-karotenu, canthaxantinu nebo retinoidové kyše5 oxidaci.

polymerní složky podle tove srovnání s molekulovou

Z tohoto důvodu lze matelíny mají strukturu polyperoxidu a obsahují kyselé skupiny.

Aby se objasnila otázka, zda sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou přírodní látky, je třeba vyhodnotit, že tvorba polymerních složek je pravděpodobně v přírodě zpomalena, neboť neizolované karotenoidy a retinoidy jsou proti oxidací chráněny antioxidanty, jako je vitamin E. Avšak polární materiál (který polymeruje po izolaci), získaný oxidací beta-karotenu v přítomnosti vitaminu E v roztoku, byl stejně aktivní při testech v buněčné kultuře in vitro jako polymerní materiál získaný neinhibovanou

Molekulová hmotnost většiny hoto wnálezu ⁴e relativně nízká

-4 -I hmotností kar.otenoidů a retinoidů riái označovat jako oligomerní stejně dobře jako polymerní. Pro účely tohoto popisu se bude užívat pro definici materiálu výraz polymer nebo polymerní.

V druhé fázi výzkumu vedoucího k vynálezu bylo stanoveno, že směs podle tohoto vynálezu, získanou extensivní oxidací, jak je definováno shora, lze frakcionovat podle molekulové hmotnosti. Frakcionaci lze provádět například srážením rozpouštědlem nebo gelovou permeační chromatografií. Jisté frakce takto získané lze dále frakcionovat (subfrakcionovat) podle jejich polarity. Bylo zjištěno, že mnohé frakce a subfrakce takto získané a jisté sloučeniny v nich obsažené vykazují aktivitu proti .množení- buněk a proti rakovině a při vyvolání diferenciace ‘buněk srovnatelnou nebo vyšší než odpovídající aktivity směsi definované v prvé fázi výz'k'umu'.

Izolovala se specifická sloučenina, 2-methyl-6-oxo2,4-heptadienal. Bylo zjištěno, že vykazuje cytostatické «

a protirakovinové vlastnosti. Sloučeninu lze získat frakcionací extensivne oxidované směsi podle tohoto vynálezu (oxidovaný beta-karoten), nebo konvenčním syntetickým způsobem. Tato sloučenina byla uvedena dříve jako produkt oxidace' kyseliny trans-retinoidové, Cyler aj ., Charakterizace áutooxidačních produktů kyseliny retinoidové,.publikováno v Tetrahedron, 45, číslo 25, 7679-7694, 1989.

Krátkv popis obrázků..... '

Ňa obrázcích: * - —

Obrázek 1 ukazuje vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) extensivne oxidovaného b.eta-karotenu pro separaci /analýzu.

Obrázek chromatcgřaři

Obrázek světlu je výsledky analýzy gelovou pe*rmeacní.· j?C) 'extensiyně· oxidovaného..beta-karotenu . žedstavujs Fcurreróvo.transformované infračervené spektrum-oxidované .směsi, z extensivne-oxidovaného beta-karotenu.

Obrázek 4 představuje spek-rum protonové jaderné magne\ . .. . i. J. , l .

tické resonánce (NMR) oxidované směsi z extensivne oxidová* . ' ' ' . . * · ’ něho beta-karotenu. - ' :

'Obrázek 5a představuje UV spektrum polymerní složky_r oxidované' 'směsi ž”^ éxténsivně' 'oxidovaného^-' beta-^-karotenu (frakce 1).

Obrázek 5b představuje UV spektrum beta-karotenu. Obrázky 6a-od osvětlují výsledky GPC analýzy specifických frakcí polymerní směsi, následovně:

6a - frakce l .'

6b - frakce 2 c - frakce’ 3 a , .

— 6d - f-rakce- 4. ---......------ ...

Obrázek 7 představuje FTIR spektrum frakce 1 polymerní směsi.

Obrázek 8 osvětluje FTIR spektrum materiálu získaného oxidací pevného beta-karotenu.

Obrázek 9 osvětluje výsledky GPC analýzy polymerního materiálu získaného oxidací pevného beta-karotenu.

Obrázky lOa-lOf (fotografie) osvětlují účinek kyseliny retinové a extensivně oxidovaného beta-karotenu na diferenciaci ES buněk, následovně:

Obrázek 10a - ES buňky, bez indukování,

Obrázek 10 b - kyselina retinová,

Obrázek 10c - extensivně oxidován·/ beta-karoten, 3 mikZOiTtO ί V, ubra^ex lve mikromolů,

Obrázek lOe mikromolů, xtensivně oxidovaný beta-karoten, 7., 5 extensivně oxidovaný beta-karoten, 1.5 > jdfl

Obrázek iCt - extensivně oxidovaný beta-karoten, 30 mikromolů. .

Obrázek	11	osvětluje	účinek	extensivně oxidovaného
beta-karotenu	na	růst tumoru	v dávce	10 mg/kg, injikované ve
dnech 0, 2, 4,	7,	9, 11, 14,	16 a 18	•
Obrázek	12	osvětluje	účinek	extensivně oxidovaného
beta-karotenu	na	růst tumoru v dávc	e 150 mg/kg, injikované
ve dnech 0, 2,	1	7, 5, 11,	14, 16 a	18.
Obrázek	13a	osvětluje	účinek	extensivně oxidovaného
beta-karotenu	na	velikost tumoru u	» utracených zvířat, která

, · .. -v-. .

byla ošetřena různými dávkami extensivně. oxidovaného beta-karotenu a kontroly (neošetřené zvíře).

Obrázek 13b osvětluje účinek extensivně oxidovaného beta-karotenu na velikost tumoru u utracených zvířat, která byla ošetřena různými dávkami extensivně oxidovaného beta-karotenu a okolo tumorů vzniklo krvácení kontroly (neošetřené zvíře).

Obrázek 14 představuje pro srovnání strukturní vzorce * hlavních výchozích sloučenin pro účely tohoto vynálezu.

Obrázek 15 osvětluje rozdělení molekulové hmotnosti hlavních frakcí podle tohoto vynálezu.

Obrázek 16 osvětluje schematicky trojstupňovou frakcionaci směsi zprostředkovanou rozpouštědlem.

Obrázek 17 osvětluje GPC chromatogram preparativní GPC

separace frakce SGl do frakcí LSG	a MSG.
Obrázky ISa a ISb osvětlují	HPLC chromatogramy frakce
LSG siecovar.e tri 21- a 265 nm a	ukazuje jak se frakce LSG
dělila na frakci F1 a frakcí F2.
Obrázky 19a. a 19.b osvětlují	HPLC chromatogramy. frakce
F1 sledované při 219 a 265 nm.
Obrázky 2Ca a 20b osvětlují	HPLC chromatogramy frakce
F2 sledované při 219 a 265 nm.
Obrázek 21 představuje vzorce specifických sloučenin

identifikovaných ve frakcích podle tohoto vynálezu.

Obrázek 22a úkázujě' cýtostátícký účinek' jistýčh frakcí podle tohoto vynálezu na buněčnou linii rakoviny tlustého střeva.

Obrázek 22a ukazuje cytostatický účinek jistých frakcí ’ * · · ’ podle tohoto vynálezu na buněčnou’ linii leukemie.

Obrázek 23'a osvětluje účinek beta-kar^O3C in vitro na

I hladinu glutathionu v buněčné linii DA-3.

Obrázek 23a osvětluje účinek beta-kar^ox na IC_so Melphalanu in vitro v buněčné linii-DA-3. .....

.λ

Obrázek 24 ukazuje protirakovinové vlastnosti beta- karotenu a oxidovaného beta- karotenu na rakovinu vaječniků.

Obrázky 25a a 25b ukazují inhibiční účinek různých frakcí podle tohoto vynálezu na růst tumoru v modelu myši DA3.

Beta- karoten, retinová kyselina a příbuzné sloučeniny byly identifikované jako potencionální protirakovinové látky, nebo se dokonce používaly jako preventivní látky či terapeutika při léčení různých forem rakoviny, například rakoviny plic a jistých forem leukemie. Chemopreventivní účinek beta- karotenu také vzbudil nějakou pozornost ve spojení se způsobem účinku vitaminu A (retinová kyselina), který je sám oxidační produkt beta- karotenu. Ukázalo se, že vitamin A. je schopný způsobit.. aby rakovinové buňky se alespoň Částečné zvrátily ze svého množivého, embryu podobného stavu do stavu podobného normálním buňkám. Avšak silná toxicita vitaminu A přísně omezuje jeho terapeutické aplikace.

Mechanismus účinku karotenoidů ještě není pochopen. Účinek samotného vitaminu A a příbuzných retinoidů, který ovlivňuje růst buněk a diferenciaci, se zdá být zprostředkován receptory retinoidů nacházejících se v jádře buněk.

Co se týče beta-karotenu a možná jiných karotenoidů, obecně se věřilo, že jeho protirakovinové účinky nějak plynou z ' jeho antioxidačních vlastností nedotčené molekuly a nikoliv z jeho schopnosti tvořit vitamin A.

Izolovaný beta- karoten a jiné karotenoídy snadno podléhají spontánní oxidaci při reakci se vzdušným kyslíkem. Rétinoidy jsou též schopné spontánní oxidaci. Avšak od počátku se vědělo, že přítomnost menšího počtu konjugovaných olefinických vazeb zmenšuje rychlost a rozsah jejich spontán10 ní oxidace·.

ť

Spontánní oxidace může působit, že karotenoidy a retinoidy se chovají in vivo jako mezibuněčné prooxidanty. Účinkují jako zdroje u biologicky aktivních radikálů a nebo produktů odvozených od radikálů. Volné radikály a produkty oxidace volných radikálů se považovaly za sekundární posly hrající významnou úlohu v signálních cestách živých buněk. I když se dlouhou dobu uznávalo, že tvorba volných radikálů je nevyhnutelným důsledkem' života v aerobních podmínkách, a to se obecně považovalo za škodlivé pro buňky, sé objevilo rostoucí poznání, že volné radikály, oxy-radikály, hrají důležitou úlohu při údržbě, nej nověj i zejména kontrole

Naším obj:

je to, že produkty extensivně oxidovaných karotenoidů, retinoidů a 'příbuzných konjugovaných polyenů a.jejich strukturní analogy mají bioaktivitu ne-vitaminu A. Dokázali jsme to extensivní předoxidací. beta-karotenu, canthaxantinu a retinové kyseliny in vitro a testováním směsi oxidovaných produktů na biologickou aktivitu. Je důležité uznat rozdíl mezi produkty extensivní oxidace, které jsou základem tohoto vynálezu, a vitamínem A, který je dobře známým produktem in vivo^-oxidační-konverze--bet-a- ka-rotenu a j iných karotenoidů dávajících vitamin A.

V druhé fázi výzkumu se vyvinulo pro extensivně oxidovanou směs beta- karotenu', označenou zde beta- kar^OJ<, frakcionační schéma. Směs se štěpila na tři frakce podle distribuce molekulové hmotnosti (MW) pomocí kombinace srážením rozpouštědlem a gelové permeační.chromatografie (vylučování dle velikostí, GPC)'. Biologické testy ukazují, že většina akti-vi-ty je obsažena ve frakcích s nízkou .a.střední MW. Tedy

Ji se pozornost zaměřila na tyto dvě frakce, zejména na frakci s nízkou MW. Více času je potřeba k výzkumu složitější frakci se střední MW.

Frakce s nízkou MW se dále frakcionovala pomocí srážení rozpouštědlem, avšak později pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie s reversní fází (RP-HPLC)..Dosáhlo se stavu, kdy některé frakce obsahují pouze jednu nebo jen několik hlavních sloučenin. Některé z těchto sloučenin byly identifikovány. Jedna sloučenina, nenasycený ketoaldehyd, se získala nezávislou cestou (synteticky). Bylo zjištěno, že vykazuje cytostatícké a protirakovinové vlastností. Tato sloučenina nebyly dříve identifikována jako vznikající z .beta- kare fenu, ale 'byla uvedena jako produkt autooxidace RA. Zda se, že cytostatícké a protirakovinové vlastnosti třídy sloučenin nenasycených konjugovaných ketoaldehydů nebyly dříve rozpoznány.

Mnohé beta-kar^o;< frakce se zkoušely na cytostatickou aktivitu a aktivitu vyvolávající diferenciaci, více frakcí

'· Ή

4.

má' silnější cytostatickou aktivitu než beta-kar°^x. Indukce diferenciace se zkoušela v mnoha liniích lidských buněk. Nej silnější účinek se pozoroval u linie IMR32 neuroblastomu. Nejpozoruhodnějším.výsledkem bylo pozorování, že prekursorové buňky v jednotné buněčně linii mohou vést ke dvěma různým fenotypům (neurony a gliální buňky), pokud jsou ošetřeny různými frakcemi. (Látky s takovými vlastnostmi mohou nalézt použití při regenerativních neuronových terapiích u poranění mozku a míchy.)

Proti rakovinová aktivita beta-kar^OÍC se prokázala u linie lidské rakoviny vaječníků, pěstované jako xenograft u nahé myši. Xenografty nahých myší odvozené od linií lids12 kých buněk se považují za bližší odraz lidských tumorů než zvířecí tumory odvozené od linií zvířecích buněk. Testování beta-kar^O3C frakcí pomocí modelu in vivo, popsaného v prvém patentu, ukázalo, že silnou aktivitu má více frakcí. Musí se také poznamenat, že aktivita se dosahuje při koncentracích, které u zvířat nevykazují žádnou viditelnou toxicitu.

V současnosti po druhé fázi výzkumu jsme zjistili, že je aktivní více než jedna sloučenina {odvozená z.oxidované směsi' definované shora) jako protirakovinová látka, a že frakce, které obsahují více než jednu sloučeninu''jsou aktivnější než “jednotlivé' sloučeniny.

Rovněž jsme zjistili, že lykopen. (vis obrázek.14), karotenoid nalézající ' se v rajčatech, má po extensivní oxidaci cycostatickou aktivitu. Lykopen. nemá dvě cýklohexýlové skupiny přítomné v beta- karotenu.

.Aby se pot.vrdi'1’tento., vynález, prováděly sebiologické: testy¹ in vivo a in vitro a... způsoby ..syntézy oxidovaných'. směsí beta-karotenu, canthaxahtinu a retinové kyseliny jsou uvedeny níže.

Příklady

Beta-kařoten, canthaxantin a retinová kyselina se. oxidovaly, jak je popsáno .níže.

Příklad 1

Oxidace beta-karotenu.

mmol roztok beta-karotenu (Fluka) v benzenu, nasyceným kyslíkem, se -inkuboval v třepací lázni ve tmě při 30 °C pod čistým kyslíkem za atmosférického tlaku. Po 72 hodinách, když se spotřebovalo 6 až 8 molárních ekvivalentů kyslíku se rozpouštědlo odpařilo. To.dalo pryskyřicovitý žlutý zbytek.

Vliv rozpouštědla:

Oxidace beta-karotenu v chloridu uhličitém dala výsledky podstatně identické s dosazenými v benzenu.

Množství vzniklého vitaminu A:

Ani retinol ani retinová kyselina, oba produkty enzymatické oxidace beta-karotenu in vivo, nebyly zjištěny v oxidované směsi. Ačkoliv retinal, který se může na retinovou kyselinu oxidovat, byl zjištěn jako produkt, je .přítomen v příliš malém množství, aby působil biologickou aktivitu oxidované směsi beta-karotenu. Biologická aktivita oxidované směsi se mimo to podstatně liší od aktivity vitaminu A, jak je popsáno níže.

‘ , .. — -ý .

Velmi podstatné množství polyměrních látek se tvoří během oxidace (vrz níže; . Je pravděpodobné pcdle analogie s oxidačními reakcemi jiných olefinických sloučenin, že lát₇ íř ky s vyšší molekulovou hmotností odpovídají polymerům vznik“'«i i lým z fragmentů oxidovaného beta-karotenu. Zkoušely se různé koncentrace beta-karotenu, aby se stanovila závislost polymerace na koncentraci beta-karotenu v roztoku. Roztoky 20 mmol, 2 mmol a 0,2 mmol beta-karotenu v benzenu, nasyceným kyslíkem, se inkubovaly ve tmě při 30 °C pod čistým kyslíkem za atmosférického tlaku. Ve všech případech byla polymerní složka hlavním produktem. Mimo to se polymerní složka tvoří z počátku oxidace beta-karotenu.

Obrázek 1 ukazuje charakterizaci oxidované směsi pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie (HPLC)

Obrázek 2 osvětluje charakterizaci oxidované směsi pomocí GPC. Ukazuje v poměrných jednotkách složení oxidované směsi podle molekulové hmotnosti složek. Rozpětí molekulové .μ i

hmotnosti je široce rozděleno od asi 600 do asi 8000 Daltonů {ostrý vrchol při 4,9 min. je artefakt působený GPC kolonou, * všechny složky směsi s molekulovou hmotností- asi 1400 eluují současně).

Obrázek 3 je Fourierovo transformované infračervené « < · spektrum oxidované směsi,

Obrázek 4 je spektrum protonové jaderné magnetické resonance (NMR) oxidované směsi..

Částečná frakcionace směsi produktů z beta^-kar⁰^?^-

Extensivně” oxidovaná směs bez žádného zbylého betá- ká* ¹ rotenu, získaná v roztoku,'se frakcionovala pomocí postupného srážení · rozpouštědlem.. Frakce se charakterizoval¹/ gélovou perméační. chromatograf.ií.. (GPC). a elementárnÝ.uanalýzcu,,·· výs+ ledkv elementární analýzy a analýzy obsahu,kyseliny a' peroxidu jsou uvedeny v Tabulce l: '· ' • 1

Tabulka·..!.

Charakterůst.ika.,.různých..f rakcí .z.ískaných-pos.tupnýmús.rážením rozpouštědlem .beta-kar^OJ<.

4*

Frakce	1:	2	3	4
Hmotnost %	37	17	14	3 2
Titrovate.lné	4,3+0,3'	4,3+0,2	*6,l±0,3	6,2±0,1
ky š.el iny
10’4 mol/g
Peroxidy	9/5±l,0	9,9+0,8	8,2+03	5,9+0,4
(jodometričky)
10'4 mol/g
Peroxidy	8,'3±0,2	8,9+0,2	8,8+0,9	5,5φ0,1

(oxidace Fe²*) 10⁴ mol/g

Elementární analýza:

Frakce l 2 34

c	58,5	58,7	61,2	65,3
H	7,2	7,0	7,6	8,7
0	34,3	34,3	31,2	26,0
Frakce se získaly následujícím	způsobem:	Surová směs
(1,2 g)	se rozpustila	v tetrahydrofuranu {THF,	5 ml) a poma-
lu se	přidal hexan	(15 ml) , zatím co se,	roztok vířivě
míchal.	Vzorek se odstředil (3000	otáček/min., 3 min.)

a olejovitý zbytek se oddělil, jednou promyl směsí THF a hexanu (5:15) a sušil ve vakuu na frakci 1. Zbylý roztok se spojil s promývací kapalinou, odpařil a zbytek se rozpustil v tetrahydrofuranu '3 ml). Srážení hexanem (15 ml), následo* vane odstředěním a promytím směsí TH? a hexanu (5:15) dalo

1.

frakci 2. Zbylý roztok se jako dříve spojil s promývací kapalinou, odpařil a rozpustil se v benzenu (3 ml). Srážení hexanem (15 ml), následované promytím'směsí benzenu a hexanu (3:15) dalo frakci 3. Zbývající materiál se označil jako frakce 4.

Z hmotnosti jednotlivých frakcí a stop GPC se odhadlo, že polymerní materiál tvořil téměř 90 % směsi produktů betakar°'^x. Procenta kyslíku v prvých třech získaných frakcích (to je většina produktu) odpovídají dobře 6-8 molárním ekvivalentům kyslíku zachyceného beta-karotenem a 30-35 % čistému zvýšení hmotnosti, které doprovázelo vznik produktu. Přidání 6-3 molekul kyslíku k beta-karotenu, původně obsahujícího ll konjugovaných dvojných vazeb, implikuje ztrátu většiny konjugované 'soustavy dvojných vazeb, neboř’ většina dvojných vazeb byla přerušena tvorbou nových vazeb uhlíkkyslík. Tedy ultrafialové-viditelné spektrum polymemích lá16 tek ukazuje maximum absorpce u mnohem kratší vlnové délky {asi 240 nm s hrbem u 280 nm), ve srovnání s původním betakarotenem (Obrázky 5a a 5b).

Polymerní materiál, který je rozpustný v tetrahydrofuranu, methanolu, acetonu a acetonitrilu, je neomezeně stalý při nižších teplotách než místnosti, avšak částečně se rozkládá při zahřívání za tvorby těkavých produktů, jak se zjistilo plynovou chromatografií.

GPC^;analýza specifických frakcí 1-4 oxidované směsi (Obrázky 6a-6d) ve srovnání s Obrázkem 2, dokazuje, že frakce 1 a 2 obsahují relativně velká množství sloučenin s vyšší MW, zatím co frakce 3a 4, zejména frakce 4, obsahují podstatné.· množství materiálu s nižší MW.

Oxidace'.beta-karotenu v přítomnosti antioxidantů.' Oxidace beta-karotenu (20 mmol) se též prováděla za podmínek, jak je popsáno shora; avšak v přítomnosti. 0,01 až 0,10 molárních ekvivalentů (vztaženo na. beta-karoten) buď alfa-tokoferolu nebo 2,6-di-t-butyl-4-methoxyfenolu. Reakce se značně zpomalila (1 molární ekvivalent kyslíku se spotřeboval asi za 6 dní). Křivka pohlcení kyslíku byla lineární. Sklon této čáry nezávisel na typu inhibitoru a jeho koncentraci. Spotřeba beta-karotenu nepřesáhlá'10' % během 6 dní. se rozpouštědlo odpařilo.

Oxidace beta-karotenu v přítomnosti iniciátoru volných radikálů.

2,2'-azo-bisl2-methylpropionitril) urychloval tvorbu

Ir reakčních produktů.

í

Oxidace beta-karotenu v pevném stavu.

Podobný polymerní materiál se získal jako téměř jediný ...produkt, jak ukázaly FTIR·.a· GPG analýzy,· když se čistý krys17 talický karoten oxidoval v pevném stavu. Reakce se prováděla tak, že se krystalický beta-karoten nechal stát na vzduchu běhen 8 týdnů v otevřené, čisté skleněné nádobě bez žádného pokusu vyloučit denní světlo během dne. Reakce byla značně pomalejší než reakce prováděná v roztoku (40 dní proti 3 dnům). FTIR spektrum polymeru získaného oxidací beta- karotenu v pevném stavu (Obrázek 8) a FTIR spektrum frakce l- polymeru získaného oxidací v roztoku (Obrázek 7) byly jasné podobné podle umístění a relativních intenzit absorpčníéh píku. Totéž platilo pro výsledky GPC analýz (Obrázek 9 proti Obrázku 6a). Dále látky získané oxidací pevného beta- karotenu a z částečné a extensivní oxidace měly podobné biologické aktivity proti množení rakovitov/ch a transformovaných buněk pěstovaných v kultuře.

Příklad 2: Oxidace canthaxantinu

Canthaxantin se oxidoval za podmínek identických s podmínkami použitými pro oxidaci beta-karotenu. Tedy 20 mmol roztok canthaxantinu (Fluka) v benzenu, nasyceném kyslíkem·, se inkuboval v třepatí lázni ve tmě při 30 °C pod čistým kyslíkem za atmosférického tlaku. Po 190 hodinách, když se spotřebovalo asi 7 molárních ekvivalentů kyslíku, se rozpouštědlo odpařilo. To dalo pryskyřicovitý žlutý zbytek. Ačkoliv reakce byla pomalejší, opět došlo k extensivní reakci s kyslíkem. GPC analýzy oxidované směsi (údaje'nejsou ukázány) ukázaly značné podobností s exterisivne oxidovaným beta-karotenem, například reakční produkty byly hlavně polymerní látky.

Příklad 3: Oxidace retinové kyseliny

Reakce retinové kyseliny s kyslíkem za podmínek použitých pro oxidaci beta-karotenu a canthaxantinu probíhala

Celková retinoanalýza s wšší velmi pomalu. Reakce·se urychlila, když se prováděla za zvýšeného tlaku.

Retinová kyselina (Sigma) (0,5 ml, 20 mmol) rozpuštěná v benzenu ve skleněné zkumavce se dala do vysokotlakého zařízení konstruovaného z INCONEL 600. Zařízení se tlakovalo na 2,067 MPa kyslíku a dala se na 3 dny do lázně s teplotou nastavenou na 42 °C. HPLC analýza reakční směsi ukázala, že reakce nebyla úplná. Reakce pokračovala další 2 dny za stejných podmínek, pouze teplota se zvýšila na 50~~°C. doba reakce byla 5 dnů. Zbylo velmi málo neoxidované vé kyseliny (méně než 1 % celkového produktu). GPC (údaje nejsou ukázány) ukázala přítomnost produktů

MW. které vsak představovaly mnohem menší podíl celkové reakční směsi než se našlo u beta-karotenu a canthaxantinu, a nepřítomnost detegovatelného materiálu s vyšší MW než je řez.kolony {asi 1400 Dáltonů) /

Biologie

Biologické testy in vitro' se prováděly k zjištění cytostatické aktivity, vyvolání diferenciace a aktivity proti virům působícím tumory v různých liniích pěstovaných buněk. Většina výsledků se získala s beta-kar°*, avšak také jsou výsledky s ěxténšivně' oxidovaným canthaxantinem 'a reťinovou kyselinou.

Testy in vivo se prováděly s beta-kar⁰* a extensivně oxidovaným canthaxantinem na:

- toxicitu umyší,

- inhibici růstu tumorů u myší včetně histopatologického vyšetření změn tumoru (tumor odvozený od transplantované, chemicky vyvolané rakovinové linie krysích mléčných buněk.

Testy in vitro

Aby se zjistily biologické vlastnosti směsi podle tohoto vynálezu, beta-kar^OM se testoval in vitro na cytostatickou aktivitu a vyvolání diferenciace. Retinová kyselina a nebo beta-karoten se používaly u některých liniích testovaných buněk jako kontrola, aby se odlišily jejich účinky od účinků oxidovaného beta-karotenu. Rovněž se studoval vliv oxidovaného beta-karotenu na buněčný cyklus. Všechny koncentrace týkající se aktivity beta-kar^ox jsou vyjádřeny v mikromolárních ekvivalentech beta-karotenu.

Buněčné modely: Buněčné linie a charakteristiky.

K testování účinků beta-kar‘ nezení a nebo diferenciaci se používaly různé buněčné linie. Linie jsou buď zavedené transformované buněčné linie nebo jsou isolované <· z tumoru pacientů trpících rakovinou. Mimo to se použily dvě myší buněčné linie, ve kterých je program diferenciace dobře definován vhodnými proteinovými značkovači, U těchto dvou linií byly charakterizovány shodne klony transfektované s virem lidského papilomu typu IS (HPV16) - viru spojeného s rakovinou šíje - a ukázalo se, že vykazují transformaci. Transformované fenotypy L6-HPV16 (odvozený od L6 buněk) a BALB/c/MK-HPVIS (odvozený od BALB/c/MK buněk) byly charakterizovány svou hormonovou nezávislostí a schopností tvořit kolonie na měkkém agaru.

Vzor exprese proteinů viru v biopsiích získaných z pacientů se silnou neoplasií se určil v naší laboratoři pomocí řetězové reakce reversní transkriptázové polymerázy. v biopsním materiálu je vzor exprese'podobný transformovanému L6 klonu, což ukazuje vhodnost a platnost L6 modelu pro účely testování.

BALB/c/MK buněčná linie je zajímavá, protože se diferencuje po vystavení vysokým koncentracím Ca²“ iontů. Když jsou buňky vystaveny nízkému vápníku, zvrátí svůj předdiferenční stav během méně než 72 hodin.

Vlastnosti beta-kar^O3C při vyvolání diferenciace se dále zkoumaly ve dvou dalších modelech, které používaly buňky myšího embryonického kmene (například kvazinormální buněčnou linii) a řadu buněčných linií lidského neuroblastomu (to je rakovinových buněk) . ~ - *— - — * - Buňky embryonického kmene (ES) jsou_k totipotentní ,· mohou například dát vzniknout jakékoliv buněčné linii organismu. Za jistých podmínek se spontánně diferencují na různé smíšené' typy in vitrc. Ošetření látkami,.o nichž je známo, že vyvolají diferenciaci, zaměřuje ES buňky na jediný fsnotyp. Například retinová kyselina žene SS buňky za podmínek stanovených -National Research Council k diferenciaci. na neurony (nepublikované· údaje) ,

Modely myších buněk la. L6 krysí myoblastom (L6) .

lb. L6 buňky transfektované s virem lidského papilomu typu 16 (HPV16).

2a'. Myší BALB/c/MK keratinocyty- (·ΒΑΒΒ·/-θ/-Μ·Κ)-.- - .... .. ...

2b. Myší BALB/c/MK transfektované s virem lidského papilomu typu 16 (SALB/C/MX-HPV16).

3a. Mat B-WT: krysí adenokarcinom mléčných žláz.

3b. Mat 3-MLNr krysí adenokarcinom mléčných žláz resistentní vůči melphalanu.

3c. Mat B-DOXr krysí adenokarcinom mléčných žláz resistentní vůči adriamycinu.

4. B16 myší melanom.·. ' ' ,

5. DA-3 myší karcinom mléčných žláz vyvolaný DMBA.

6. FDCP-1 myší myeloidní leukemie.

Dvě buněčné linie, Mat B-MLNr a Mat B-DOXr vykazují resistenci na řadu léku, Mat B-WT je divoký typ. Jsou to spatně diferencované buňky, které nevyjadřují estrogen nebo progesteronové receptory.

Modely lidských buněk

7a. MCF7-WT lidský karcinom mléčných žláz.

7b. MCF7-ADRr lidský karcinom mléčných žláz resistentní vůči adriamycinu.

Buňky jsou mírně diferencované a positivní na estrogen a zrcussterorcve receotorv.

3a. Uro 9 lidský karcinom urothelia, špatně diferencovaný.

3b. iiro 10 lidský karcinom urothelia, špatné diferencovaný.

9. L14 lidský karcinom plic, mírně diferencovaný (isolovaný v Lady Davis institutu Židovské nemocnice v Montrealu z tumoru pacienta).

10. N314 lidská akutní promyelotická leukemie.

·.} i

Cytostatické účinky

Tabulka 2 shrnuje výsledky získané s testem MTT životnosti /toxicity z Promega (metabolický test založený na aktivitě mitochondriální dehyčrogenázy). Životnost se zjistila při zvyšujících se koncentracích (násobky 2,5) beta-kar^OJÍ. Dávky, které půlí růst populace buněk ve srovnání s neosetřenými kontrolami, jsou uvedeny jako hodnoty IC_5O.

Tabulka 2

Cytostatické účinky extensivního beta-kar^o;íC

Buněčná linie Původ
Mat B-WT	krysí adenokarcinom mléčných žláz	25,5
Mat B-MLNr		21,0
BIS	myší melanom	12,4
DA-3	myší karcinom mléčných žláz	15, 6
FDCP-1	myší myeloidní leukemie	7,5
LS	- 'křyšVmýoblástom' >··—-	5Γ,9
L-6HPV16		28, 2
MCF7-WT	lidský karcinom mléčných žláz	1.1,3
MCF7 - AD?.r		11,3
Uro 2	lidský karcinom urothelia.	17,7
Uro-IQ		19', 8
L14	lidský karcinom plic	18,5
NB14	lidská ..akutní promyelotická .leukemie ;	4,8

Poznámka'.: Exponenciálně.· rostoucí buňky, pěstované při nízké· hustotě (lO^-4 až ló⁵ buněk / 1-5 ml) se vystavily jediné dávce různých koncentrací beta-kar ^o>c na 72 hodin či déle. Růst buněk se určil testem MTT. Hodnoty IC_so (vyjádřené v ekvivalentech beta-karotenu) se stanovily graficky z křivek přežívání' ' ' (graf' růstu -buněk' - proti--koncentraci bet-a-k-a-rotenu)·. Každá hodnota v Tabulce 2 je průměr alespoň dvou nezávislých pokusů. Různé várky extensivně oxidovaného beta-karotenu se testovaly a daly konsistentní výsledky. Pozorujte citlivost NB14 leukemické buněčné linie a nedostatek aktivity na kontrolní buňky LS.

Pro některé buněčné linie . se. použily jako kontrola retinová·· kyselina- a- beta-karoten (každý, při 3 mikromolech) .

Neměly žádný účinek na křivky růstu buněk, s výjimkou NB14 buněk, které reagovaly na retinovou kyselinu.

Jako křížová zkouška použití testu MTT se výsledky IC_5O potvrdily u L6 a L-6HPV16 buněčných linií počítáním buněk Couterovým čítačem, jak osvětluje Tabulka 3

Tabulka 3

Srovnání cytostatických účinků (IC_so (mikromoly)) beta- kar^OJC měřených testem MTT a počítáním buněk Couterovým čítačem

Buněčná linie	MTT	Couterův čítač
L6	51,9	39,0
L-6HPV16	2 3,2	24,6

Fraxoe zisnane z ceta-xa:

;os tučném srážení organickými rozpouštědlem se testovaly na buněčné linii MCF7-WT. Zjistilo se, že dvě frakce, 1 a3, jsou podstatně aktivnější než surová směs, jak osvětluje Tabulka 4

Tabulka 4

Cytostatické účinky frakcí proti romoly) .

2

11,8 17,3 ošetřily, jak buněčné linii

Frakce

MCF7-WT IC

O

Buňky se

Tabulce 2.

4

13,1 26,2 j e popsáno v

MCF7-WT (mikbeta-kar^o:

22,8 poznámkách k

Ačkoliv normální buňky se zdají být mírně inhíbované, během delší doby v kultuře ' tento účinek postupně-mizel, co ukazovalo, že beta-kar^ox neovlivňuje drasticky normální buňky. To by mohlo dovolit, aby pacienti s rakovinou byli opaN<

kovaně ošetřováni s omezenými postranními účinky.

Účinek na diferenciací buněk

Morfologická pozorování modelů L6 myoblastomu:

Kultivovaný krysí myoblastom L6 je schopný diferenciace in vitro. V National Research Council se stanovilo pět kroků v diferenciačním programu těchto buněk pomocí morfometrie, in šitu imunofluorescence a analýzy průtokovou cytometrií.

. Použité známé značkovače (charakteristické proteiny) diferenciace myocytů bylý: fibronečtiný a-aktin, N-CAM; vimentin a exprese receptorů acetylcholinu. Mimo to se ukázalo, že receptory acetylcholinu specifické stadiu před fúzí se v L£ buňkách nevyjadřují. Určilo se pět kroků s fenotvpy v pořadí rostoucí diferenciace popsanými níže:

1. Buňky mají vzhled podobný embryonickému fibropblastu.

2. Buňky získají, bipolarní. morfologii .

3. Buňky se orientují.

4. Buňky vstupují do stadia před fúzí.

5. Buňky ukazují tvorbu synthicia a myotub.

Zjistilo se, že HPV16 transfektované buňky se přemění a blokují v stadiu před fúzí 4. Po ošetření beta-kar^M se však pozorovala ' lepší orientace a započala - tvorba- nějakého, synthicia, odpovídající částečnému vstupu do stadia 5 diferenciace.

Pěstovaní v médiu s odlišným obsahem vápníku ukázalo, že beta-kar°^ byl silnější jak u kontrol, tak u transfektovaných buněk, pokud médium obsahovalo málo vápníku (0,05 mmol). Mimo to se pozoroval antagonismus mezi vápníkem a beta- kar^OIC při expresi značkovačů diferenciace uvedené shora. To podnítilo nějaké předběžné pokusy . s účinkem vápníku na buňky ošetřené beta-kar^olc. Použily se myoblastomové a keratinocytové modely.

V krátkosti, v L6 myocytech přívod exogenního vápníku do buněk probíhá nespecifickými kationickými kanály {jak se stanovilo dříve v souhlasu s existující literaturou). Uvnitř buněk se úroveň vápníku kontroluje uvolňováním vápníku z vnitřních zásob. Mimo to receptor acetylcholinu vyjádřený v stadiu před fúzí L6 diferenciačního programu moduluje sarcoplasmické kanály vápníku.

Povaha kanálů regulujících vstup a uvolňování vápníku ze zásob v keratinocytech se ještě nevyjasnila..

Pokusy se provedly dvěma technikami: elektrofysiologií a zobrazením pomocí Fůra-2. Předběžné výsledky naznačují, že beta-kar^ox působí na blokovač kanálu vápníku nebo na činelaΛ tor vápníku. To se potvrdilo jeho schopností částečně překonat resistenci proti mnoha lékům v popsaných resistentních buněčných liniích. Zdá se však být méně účinným než konvenční biokovače kanálu, jako je verapamyl.

Vzor značkovačů diferenciace v BAL3/c/MK modelu.

V BALB/c/MK keratinocytech cytokeratiny 1, 5 a 10,. jak jsou definovány v Foliově katalogu, se nejprve identifikovaly Westernovým skvrnovým imunotestem. Je známo, že cytokeratíny 1 a 10 se spojují s vyššími úrovněmi diferenciace, zatím co cytokeratin 5 se spojuje s méně diferencovanými, ještě se množícími buňkami.

Průtoková cytometrícká analýza ukázala, že cytokeratiny jsou obecně méně vyjádřena v neošetřených HPV16 transfektovaných buňkách než v odpovídajících neošetřených kontrolních buňkách.

Cytokeratin 5

Vystavení 1,8 mmol vápníku, což indukuje nezvratnou diferenciaci během 3 dnů, vedlo ke zvýšení exprese cytokeratinu 5 v kontrolních a transformovaných buňkách. Vystavení beta- kar^ox vedlo k podobnému účinku, jenom stačilo 6 denní vystavení k vyvolání exprese u kontrol, zatím co bylo třeba 9 dní u transformovaných buněk. Vystavení oběma Činidlům současně rušilo zvýšení exprese. To ukazuje, že obě sloučeniny '^ jšoů antagonistickém — - ' -·- . · *Cytokeratiny 1 a 10

Výrazné zvýšení exprese obou těchto cytokeratinů po vystavení 1,8 mmol vápníku (od 0,05 mmol do 1,8 mmol) se pozorovalo· v kontrolních buňkách, zatím co transformované buňky neukázaly žádnou odpověď.

Na rozdíl tomu, beta-kar®^ indukoval expresi obou značkovačů v obou liniích. Stejně jako.u L6 linie bylo nutné delší vystavení pro odpověď.od BALB-HPV16 ve srovnání s kontrolami.

Opět se pozoroval antagonismus s ošetřením vápníkem. Tyto výsledky se zdají být opravdu důležité, protože dávají Svědectví, že alespoň v cytokeratinovém modelu beta- kar^O3< zvyšuje diferenciaci v -HPV16 transformovaných buňkách,. zatím co klasická diferenciace buněk vápníkem je neúčinná.

Indukce diferenciace beta- kar^O3< (oceněná podle morfologických kritérií) se též pozorovala u buněk NB14 leukemie,

ES a neuroblastornové buňky ’ Za podmínek podobných podmínkám vyvinutých v National Research Council pro 'indukci diferenciace retinovou kyselinou ES buněk na neurony beta- kar^OJC ta.ké indukuje diferenciaci ES. buněk, na neurony, jak ukazuje Obrázek 10, a jak pot27 vrzují specifické značkovače pomocí imunohistochemických technik. Avšak existují dva významné rozdíly mezi účinkem kyseliny retinové a beta- kar°^ u ES buněk.

l) Kyselina retinová působí diferenciaci ES buněk na 80 % bipolárního fenotypu způsobem nezávislým na dávce v rozpětí 0,1 do 1 mikromolu (Obrázek 10 b), zatím co betakar°^x při optimální koncentraci (7,5 mikromolárních ekvivalentů beta-karotenu) vyvolává terminální diferenciaci do asi 90 % vysoce rozvětvéného fenotypu podobného Purkyňovým buň₇ kám (Obrázek lOd), mechanismus vysokého rozvětvování se ještě nevyjasnil.

Indukovaní kineticky odliš nová kyselina podmínek).

terminální diferenciace je pro obě činidla é. 3et5'kar“^;< je mnohem účinnější než reti.15 nodin oroti 3 dnům, za tasíc;

U neurobíastomových buněčných linií Neuro2A, IMR32, SK-N-SH a SK-N-MC beta-kar^O3< působil podobně významný vysoký stupeň diferenciace, zatím co kyselina retinová budila pouze částečnou diferenciaci,.

výsledky ES a neurobíastomového modelu ukazují, že beta-kar^Oí!C je mocný promotér diferenciace, a zdá se, še mechanismus jeho účinku je odlišný od retinové kyseliny.

Aktivita proti expresi virových genů působících tumory.

Pozorování, že beta-kar^OÍC může mít aktivitu proti expresi virových genů působících tumory, je založeno na třech nezávislých pokusech.

Cytopathie: Symptomy virové infekce, jasně viditelné jako intenzivní vakuolizace okolo jader tránšf ek to váných--buněk L6-HPV16 a BALB/c/MK-HPV16, se drasticky snížily nebo zmizely po vystavení beta-kar^ol<.

Mesenger RNA se extrahovala z transfektovaných buněk, které byly a nebyly vystaveny beta-kar^O3C. Kinetika'vzoru exprese produktů virových genů se analyzovala RT-PVR. Počáteční výsledky ukázaly, že vzor exprese vírových proteinů a myc onkogenu (onkogen spojený s množením) byl odlišný u buněk ošetřených beta-kar“ ve srovnání s buňkami ošetřenými retinovou kyselinou nebo beta-karotenem.

K stanovení exprese obou proteinů se použila.monoklonální arTtičástice^poštávéná^přóti E6~a E7 'onkogenním proteinům pomocí elektroforézy na polyakrylátovém gelu, Westernová skvrnového imunotestu a průtokové cytometrické analýzy. Snížení exprese Ξ6 a E7 proteinu se pozorovalo po 9 až 12 denním '/-/stavení transfekt.ovaných buněk viru.beta-kar^OJÍ.

Cytostatické účinky neúplně oxidovaného beta-karotenu. oxidované směsi beta-karotenu inhibovaného antioxidant.em a extensivně-oxidovaných . canthaxantinu a retínové kyseliny..

Tabulka. 5 ukazuje relativní účinky neúplně oxidovaného beta-karotenu, obsahujícího jak polymerní oxidovaný produkt, i

tak nezreagovaný beta-karoten, oxidovaných produktů získaných oxidací beta-karotenu inhibovanou a-tokoferolem {5 % molárních), zcela oxidovaných canthaxantinu a retínové kyseliny '{syntéza popsaná·· shora) na- -MG7—WT---buněčnou ..linii... Všechny vzorky obsahovaly alespoň nějaké oxidované materiály s vyšší MW a všechny vykazovaly značnou cytostatickou aktivitu .

Tabulka 5

Cytostatická aktivita na MC7-WT buněčnou linii neúplně oxidovaného beta-karotenu, produktu získaných inhibovanou oxidací beta- karotenu a extensivně oxidovaných.canthaxantinu a retinové kyseliny

Vzorek IC_so (mikromoly)

Asi na 25 % oxidovaný beta-karoten 22

Asi na 50 % oxidovaný beta-karoten 21

100 % oxidovaný beta-karoten 17

A-tokoferolem retardovaná oxidace beta-karotenu 11

Oxidovaný car.tb.axantín . 9

Oxidovaná retinová kyselina 7

Poznámka: Buňky se ošetřily, jak bylo popsáno v poznámkách k Tabulce 2.

Studie toxicity a aktivity proti torům beta-kar⁰⁴* in vivo

Stanovení toxicity: beta-kar^ox ' a extensivně oxidovaný canthaxantin

Toxicita se určila sledováním tělesné hmotnosti BALB/c samic a obecnou prohlídkou zvířete. Injikovaly se dávky 5 mg/kg a 10 mg/kg intraperitoneálne ve dnech 1, 3 a 5 (Tabulka 6). .Kontrolní skupina dostala pouze rozpouštědlo (20 £ vodný ethanol). Podobná studie se provedla s použitím injekcí 50 a 100 mg/kg ve dnech l, 3 a 5, 3 a ll. Nepozorovaly se žádné zřejmé toxické účinky (údaje neuvedeny).

Beta-kar^OÍ< j'e pro zdravé myši netoxický, i když se aplikuje v šesti 100 mg/kg dávkách. Mělo by se zdůraznit, že i s opakovanými dávkami až 150 mg/kg (myš s tumorem), se ne30 pozorovaly žádné nepříznivé účinky.

Podobně extensivně oxidovaný canthaxantin neukazoval žádné zřejmé známky toxicity při identickém režimu dávka / injekce (údaje neuvedeny).

Tabulka. 6

Účinek extensivně oxidovaného beta-karotenu na tělesnou· t

hmotnost myší

Den	Průměrná tělesná hmotnost	•(g)
• - *	Kontrola“	5-mg/kg“ —	10 mg/kg-
1	14,0	‘14,4	14,0
2	14,0	14,5	14,0
-	14,4	14,5	14,5
7	14,3	15,3	14,6
9	- — Ί, -p z	15,8	'15,2 ’
li	15,7	16,3	15,7'
13	16,1	16,.7	16,2
15	15,6	17,3	16,9
17	17,1	17,7 ·	17,4
19	17,6	18,3	17,19
21	18,1	18,7	18,4 .
23	18,7	19,4	19,1
25 :	......19,2· -	- -20-, 0 -	19,-8-- . -

Aktivita proti tumorům: soustava modelu tumorů

Použil se model Dl-DMBA-3 myšího adenokarcinomu mléčných žláz. Buněčná linie se odvodila cd BALB/c myši nesoucí imunogenní nemetastazovaný myší adenokárcinom mléčných žláz způsobený 7,12-dimethylbenzantracenem (DMBA). Každé BALB/c myší samičce se injíkovalo podkožně, jeden milion DA-3 buněk. Když-se tumor stal hmatným. ..(průměr „0,5 cm, 1-2 týdny) , zví31 řata se zařadila náhodně do skupin a injikoval se intraperitoneálně beta-kar^o>= v dávkách v rozsahu od 5 mg/kg do 150 mg/kg, Růst tumorů se měřil každé 2-3 dny. Vyhodnocení se provedlo stanovením inhibice růstu tumoru měřením objemu tumoru jako funkce času, jak popsali Alaoui-Jamali aj . v J. Pharmacol. Exp. Ther., 1993, 264 (3), 1299. Kontrolní skupina dostala opět pouze rozpouštědlo (20 % vodný ethanol).

Obrázky 11 a 12 osvětlují účinek beta-kar^M na růst tumoru. Obrázek 11 odpovídá dávce 10 mg/kg, injikované ve dnech 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 a 18. Obrázek 12 odpovídá dávce 150 mg/kg, injikované stejným způsobem.

, Pro hrstolcgické vyšetření se utratilo několik náhodně vybraných zvířaz. Tumory se rozřezaly a fixovaly ·ν,10 % formalinu v normálním solném roztoku. Histolcgicke řezy se připravily z každého tumoru fixovaného formalinem a uloženého v parafinu a barvily se hematoxylinem-eosinem.

Obrázky 13a a 13b ukazují srovnání tumorů u utracených t

zvířat, která byla ošetřena různými dávkami beta-kar^ox a kontrol (neošetřené zvíře). U některých zvířat okolo tumoř rů vzniklo krvácení (Obrázek 13b). V těchto případech je skutečná velikost tumoru je menší, než naměřená měrkami (rozdíl se přisuzuje hemoragickému otoku zvyšujícímu zdánlivou velikost tumoru).

Histopathologické vyšetření tumorů vyjmutých z utracených zvířat prozradilo, že:

- beta-kar~^:< indukuje zřejmé histologické změny odrážející uhynutí tkáně v DA-3 tumorech,

- tkáně tumorů vykázaly mnoho rysů diferenciace buněk/ tkání, oblasti krvácení se vyskytují u všech ošetřených tumorů a jsou spojeny s extensivní pigmentací a nekrozou,

- pigmenty nejsou železo (ba*rvení pruskou modří bylo negativní), ale může to být hemosiderin, asi vznikající. Zdá se nepravděpodobné, že by z krvácení pigment byl melamin. Přesná povaha pigmentace nebyla potvrzena.

U normálních netumorových tkání nebyly žádné stopy podobných histopathologických změn.

Protože se mnohonásobné intraperitoneální injekce betakar^ox dobře snášely, *i při koncentracích 'až do-150 mg/ g·, -terapeutický index beta- kar“* se zdá být velmi vysoký', což potenciálně dává velkou výhodu nad tradičními léky proti rakovině .

Aby se shrnula prvá fáze našeho výzkumu, beta-karoten a canthaxantin, jako representanty karotenoidů, a v menší míře retinová kyselina, jako representant retinoidů, se mohou podrobit extensivní oxidaci, aby daly-látky, jako je model beta- kar^o;<, které ukazují vlastností činící tyto látky netoxické činidla aktivní proti nekontrolovanému množení buněk, tumorům a virů vyvolávajících tumory, užitečné jako promotory diferenciace buněk. Z chemické analýzy beta- ,kar°^x 'je zřejmé, že není přítomná žádná z různých forem vitaminu Á) ňěbo jsou'přítomné jen v ma-lých množstvích. Dále biologická aktivita oxidovaného canthaxantinu a retinové kyselíny, které nemohou tvořit vitamin A, ukazuje přítomnost aktivních látek odlišných od vitaminu A, Ačkoliv se cytostaticke vlastnosti beta-kar^OJC podobají vlastnostem samotného vitaminu A, obecně jsou účinky u beta-kar^OJ< silnější v rozmanitých okolnostech. Důležitým rozdílem je též to, že betakar^o>c je netoxický.

- 33 Druhá fáze výzkumu

Chemie

Oxidace lykopenu

Lykopen {viz Obrázek 14) rozpuštěný v benzenu se extensivně oxidoval v atmosféře kyslíku podstatně stejným způsobem jako beta-karoten. Cytostatická aktivita surové směsi produktu se testovala způsobem analogickým s beta- kar⁰³*.

Frakcionace beta- kar^OK

Frakcionace se vyvíjela třemi fázemi. Tři.schémata separace, hluboká 3-4 úrovní, jsou zobrazena níže

Fáze 1 Fáze 2 . Fáze 3

Hladina beta- kar^o;<

ŠGí IG1 beta- kar³'*

SG1 IG1 beta- kar^;

SG1 IG1

SG2 IG2

LSG MSG

LSG MSG

SG3

SLSG ILSG

F1 F2

Fl.l F1.2 F1.3

Beta- kar⁰³* se syntetizoval způsobem velmi podobným popsanému v prvé fázi. V krátkosti, beta-karoten (30 g) rozpuštěný v benzenu (3,0 1, 0,02 M) se míchal 4 dny při pokojové teplotě v atmosféře plynného kyslíku GPC chromatografie potvrdila přítomnost tří hlavních složek, to je nízké (pod 300 Daltonú), střední (300-1000 Daltonů) a vysoké (přes 1000 Daltonů) MW frakce (Obrázek 15).

Separace 1, úrovně ífáze 1-3): Roztok se koncentroval asi na 200 ml a zředil se asi 2 1 hexanu. Sraženina IG1, asi 65 % celé směsi, obsahoval většinu materiálu s vysokou molekulo34 vou hmotností {přes 1000 Daltonů). Kalová kapalina obsahující rozpustnou frakci, to je nízké (pod 300 Daltonů) a střední (300-1000 Daltonů) MW frakce a prakticky žádnou frakci s vysokou MW (viz Obrázek 16) se odpařil do sucha a dal zbytek SG1.

Separace 2. úrovně (fáze 1): Frakce SG1 (1,2 g) se míchala v hexanu (120 ml) při pokojové teplotě 30 minut. Nerozpustná frakce IG2 se odfiltrovala. Obsahovala většinou materiál se střední MW a něj aký~matě'riár s ní zkou MW ' {obrázek 15)-. Kalová kapalina obsahující rozpustnou frakci se odpařila a dala SG2, obsahující materiál s nízkou MW a střední MW (Obrázek

16! .

Separace.3. úrovně (fáze 2a 3): Frakce SGl (10 g) rozpuštěná v tetrahydrofuranu (10 ml) se dělila do frakcí s nízkou MW'(LSG,'40 %) a střední MW MSG, 55 £) postupnými injekcemi vzorků (250 mikrolitrů) do kolony preparativního. GPC chromatografu (19*300 mm, Waters styragel, velikost částic 15 mikrometrů, velikost pórů 10 nm) s eluci tetrahydrofuranem (4 ml/min). Dosáhla se čistá separace do dvou MW frakcí, jak osvětluje Obrázek 17.

Separace 3, úrovně (fáze 1): .Frakce SG2 (688 mg) se naložila na silikagelovoukolonu a el-uovala se- hexanem/ethyl acetátem (95:5).'Eluované frakce se spojily a rozpouštědlo se odstranilo. To dalo frakci SG3,

Separace 3, úrovně (fáze 2) / Frakce LSG (600 mg) se míchala s ledové chladným pentanem (1 ml) 1 minutu a pak se většina kalové kapaliny dekantovala. Tento postup se čtyřikrát opakoval. Nerozpustná frakce ILSG se odfiltrovala a rozpouštědlo se odpařilo ze spojených frakcí kalové kapaliny, které obsahovaly rozpustnou složku.. To dalo frakci SLSG.

Separace 3. úrovně (fáze 3): Frakce LSG (4,4 g) rozpuštěná v acetonitrilu (10 ml) se dělila do dvou frakcí postupnými injekcemi vzorků (450 mikrolitrů, celkem 9,0 ml) do kolony preparátivního HPLC chromatografu vybaveného třemi waters NovaPak HR C18 (reversní fáze, 6 mikrometrů velikost částic, velikost pórů 6 nm) PrepPak náplněmi (40*300 mm) , spojenými do série a eluovanými acetonitrilem (40 ml/min). Získaly se frakce Fl (80 %) a F2 (20 %) odebíráním eluentu od 4,8 do

6,4 minuty a od 6,4 do 12 minut. Svislá čárkovaná čára up' rostřed chromatogramu analytické vysokovýkonné kapalinové chromatografie na Obrázku 18 ukazuje jak se frakce LSG dělila na dvě nové frakce Fl a F2. (Doba eluce sloučenin na Obrázku 18 a odpovídající dělicí . čas jsou odlišná od preparativní HPLC, vzhledem k rozdílům v podmínkách potřebných pro optimální separaci za analytických a preparátivních podmínek .

Separace 4. úrovně (fáze 3): Frakce Fl (700 mg) rozpuštěná v acetonitrilu (1,5 ml) se dělila do tří frakcí Fl.l (11 %), F1.2 (13 %) a F1.3 (5 %) postupnými injekcemi vzorků (250 mikrolitrů, celkem 1,25 ml) do kolony preparátivního HPLC chromatografu vybaveného stejnou kolonou, jak byla právě popsaná a eluovanou směsí 50:45:5 voda, acetonitríl a methanol s průtokem 40 ml/min. Frakce se získaly odebíráním eluentu od 2 do 6,6 minuty,· od 6,6 do 12,0 minut a od 12.0 do 23 minut. Svislé čárkované čáry na Obrázku 19 ukazuje jak se dělaly řezy, aby se získaly tři frakce.

Stanovení chemického složení některých frakcí na 3. a 4. úrovni separace. (Vzorce číslovaných- sloučenin j.s.ou dány na Obrázku 21). .

Každá frakce Fl.l, F1.2 a F1.3 obsahuje pouze několik

sloučenin, jak naznačuje Obrázek 19. Hlavní složkou v F1.2 je 2-methyl-6-oxo-2,4-heptadienal {sloučenina 1, označovaná v textu jako ketoaldehyd). Dihydroactininidiolid (sloučenina 2) je hlavní složkou v F1.3. Sloučeniny 3-14 se identifikovaly ve frakci F2. Jsou to beta-cyklocítral (3), beta-ionon (4), beta-ionon-5,6-epoxid (5), 4-oxo-beta-ionon (6), betaionylidenacetaldehyd (7), beta-ionylidenacetaldehyd-5,6epoxid (8), 4-oxo-beta-ionylidenacetaldehyd (9) , beta-apo13-kárótehon {'i0)7^_'beťa-apo-~“l-3—karotenon-5, 6-epoxid .(11)., 4-oxo-beta-apo-13-karotenon (12), retinal (13) a retihal -5,6-epoxid (14).

Biologie *

Biologické testy in vitro se prováděly k zjištění-cytostatické aktivity, vyvolání diferenciace a účinku na buněčný cyklus. Testy in vivo se prováděly inhibici růstu tumorů u myší.

Testy in vitro +

Frakce se testovaly na cytostatičkou aktivitu a vyvolání diferenciace. Výsledky se porovnávaly s výsledky získanými s beta-kar°*, který sloužil jako reference ukazující, zda frakcionace vedla k zvýšení aktivity či nikoliv. (U některých- buněčných lin-ií- se-pou-žily jako... kontrol a. retinová kyselina a nebo beta-karoten, aby se odlišily jejich účinky od testovaných účinků beta-kar°*. Vzhledem k současnému neurčitému složení mnoha frakcí, všechny vzorky se testovaly ve stejných hmotnostních koncentracích. Porovnání se dělalo na pseudomolární stupnici dělením hmotnosti použitého vzorku molekulovou hmotností beta-karotenu (537 Dáltonů).

Použité buněčné linie:

HCT116 lidský karcinom tlustého střeva IMR32 lidský neuroblastom

NB4 lidská akutní promyelotická leukemie K562 lidská chronická myelogenní leukemie BALB/c/MK myší keratinocyty

Cytostatické účinky frakcí beta-kar

Buňky se ošetřily šesti koncentracemi každého vzorku (2,5, 7,5, 15, 22,5, 30, 45 mikromolu pro HCT116 a IMR32, a 2,5, 5, 7,5,10, 15, 22,5 mikromolu pro NB4 a K562 buněčné linie. Po 3 dnech se buňky lysovaly, inkubovaly s barvivém Hcechst 33251 a měřila se fluorescence roztoku, aby dala míru množství buněčné DNA, Údaje o fluorescencí každé testované látky se zaznamenaly a podělily se odpovídajícími hodnotami pro neušetřené. buňky (po opravě na fluorescenci pozadí) , aby stanovil cytostatický účinek u všech koncentrací každého vzorku. Obrázky 22a a 22b osvětlují výsledky získané u buněčných linii KCT116 lidského karcinomu tlustého střeva a K562 lidské leukemie.

~^^r'^,,Je*zřejmé·, -žc-relativní «^aktivita^může^velmi ^záviset .na vybrané buněčně linii. To osvětluje velmi dobře frakce MSG, která je aktivní u buněčné linie HCT116, ale je neaktivní u buněčné linie K562, zatím co frakce ILG je velmi aktivní u obou linií (více než beta-kar^ox). Tato pozorování naznačují, že cytostatický účinek se může dosáhnout působením více než jedné sloučeniny.

Tabulka 7 shrnuje -výsledky,, které se dosáhly u čtyř buněčných linií.· Frakce se uspořádaly relativně s beta-kar^OJ< dělením každé hodnoty inhibice růstu při každé koncentraci vzorku odpovídající hodnotou beta-kar“* a stanovením kvali38 tativně prozkoumáním trendů u šesti koncentrací vzorků.

Aktivity frakcí jsou vyjádřeny jako + 'o a což, označuje aktivitu vyšší, podobnou a menší než aktivita betakar^M.

Jeden z nej nápadnějších výsledků je silná inhibice růstu buněk dosažená ketoaldehydem (sloučenina l na Obrázku 21), Ten byl identifikován jako hlavní složka ve frakci F1.2. Možná překvapující je zdánlivé snížení aktivity jednodusšÍbK~frakcí“při-“pokročilej-ších-úrovních , frakcionace (3 a 4) následující po zvýšení aktivity v jejích složitějších původních hladinách (1 a2), například frakcí Fl, a ?í .3 . -Pozdější ’jednodušší frakce by mělybýt obohaceny aktivními složkami, · což vede· k očekávání tivity. Je možné,, že vyšší aktivita, pozorovaná u dřívějších složitějších frakcí se odvozuje ód přítomnosti více než jedné aktivní sloučeniny a'nebo ze syňergi.čkých ’ vztahů, mezi dvěma- či více-sloučeninami..

F2,- F1.2 ze zásady vyšší i

Tabulka 7

Cytostatické účinky u více buněčných linií frakcí a vybra ných sloučenin vyjádřené relativně k beta-kar^O3C

Stupeň	Frakce	Buněčná linie
HCT116	IMR32	K562 NB4
0	beta-kar	A O f	A O	5	ó
1	SG1	o	+	+	+
	IC-l	+	0	o	+
2	SG2	+	+	+	+
	IG2	+	+	+	+
		Λ	o	ř	o
		O
3	SG3	'' +	+	+	0
3	p-η	-	o	0	o
	F2	o	0	0	-
> ·' *- alr· ·_...4ιιγ ‘“β. v	» -*h. +	'*/ * fJ i— L ' - !)*»*· ·<»,	•ΊΗ. · ,,
4	F1.1	-	o	+	+
	F1.2	-	O	-	O
	F1.3	-	0	0	O
	ketoaldehyd	+	+	+	+
	beta -kar	-	o	-	-
	Ra		+	o .	0
Poznámka:	Údaje zde ukázané se vypočítaly s	použitím	hodno
pro beta	-kar°*, které	se průměrovaly přes	všechny	testy
Hodnoty pro beta-kar“^	jsou podle	definice nastaveny	na o

RA = zcela trans retinová kyselina.

Cytostatické účinky extensivne oxidovaného lykopenu.

Aktivita extensivne oxidovaného lykopenu se porovnávala s beta-kar^O5e, s použitím buněčné linie HCT116. Výsledky v Tabulce 8 ukazují, že dvě látky mají podobnou aktivitu proti této buněčné linii. Ukázali jsme, že beta-kar™, canthaxantin a nyní lykopen mají silné cytostatické vlastnosti. Protože lykopen nemá dvě cyklohexylové skupiny přítomné v jiných dvou karotenoidech (viz Obrázek 14), zdá se, že

- -přítomnost této složky molekuly-není pro cytostaticko.u .aktik... _ vitu oxidovaných produktů nutná. Tabulka 8

Provnání cvtostatického účinku extensivne oxidovaného lykooenu a beta-kar^Oí< u buněčné linie HCT116

Dávka 3eta-kar'^< . (mikromolů)

OxidOvanýo lykopen

0	100	' 100
2,5	86	100
7,5	80	85
15	51 T	55
22,5	18	41
30 - -	8 .	.18
45	1	11
Diferenciace	buněk

Účinek frakcí na vyvolání diferenciace buněk se stanovil kvalitativně pozorováním morfologických změn buněčných linií a kvantitativně měřením exprese značkovačů - charakteristických proteinů pomocí monoklonálních antiČástic a průtokové cytometrie: V Tabulce 9 jsou aktivní frakce označeny symbolem + a vysoce aktivní frakce jsou označeny

U buněčné linie IMR32 lidského neuroblastomu je široké rozprostření aktivity mezi frakce. Tři páry frakcí (SGl, IG1, SG2, IG2 a LSG, MSG) vykazují nepředvídanou schopnost (pokud je nám známo) vyvolávat diferenciaci na dva různé fenotypy ze stejné prekursorové buněčné linie. To znamená, že je možné zaměřit buněčnou linii IMR32 na gliální nebo neurální buňky v závislosti na výběru frakce. Schopnost vyvolávat tvorbu neuronů .mizí v pozdějších jednodušších frakcích (stupeň 4, Tabulka 9). Tato pozorování jsou dalším svědectvím, Že beta-kar^o>= obsahuje násobné aktivní sloučeniny mají-‘*7

Vyvolávání áifu bvnéčné linio N34 lidské l£íikemie se potvrdilo u dřívějších chemicky složitějších frakcí IG1 a MSG, které jsou silně aktivní. Pouze jedna frakce SG3 umožňuje diferenciaci u kvazinormální buněčné linie L6 krysího myoblastu.

Větší aktivita transformovaných buněčných linií, zejmébem.

na IMR32 ve srovnání s kvazinormální linií L6 podporuje

-strategii^-použitíselektivní^'diferenciace-transformovaných buněk ke kontrole růstu rakovinových buněk netolickým způso42

Tabulka 9

Stadium Frakce Buněčná linie

- . .	IMR32	NB4	L6
1	SG1	+ (n)	ne	ne
	IG1	+ (g)	ne	ne
2	SG2	+ (n)	ne	ne
	1G2	++ (g)	++	ne
2	— - - LSG - - · -	-++(n)	ne _.	... ne....... .. . _
	M3G	++ (g)	+ +	ne
3	SG3	+ (n)	ne	++
3	- -	j. -ι* Ύ ΐ	Γ;^	ne
-i	F1, i	_L J. / ' • J /	Γ.β	ΩΘ
	?1, 2	ne	ne	Πθ
	? Ί Ϊ	ne	ne	ne
	ketoaldehyd	ne	ne	ne
Poznámky:	ne - bez účinku,	písmena	v závorce znamenají dife-

renciaci na gliální (g) nebo neurální (n) fenotypy.

$

Kvalitativní údaje se získaly v prvé fázi výzkumu pro účinek beta- kar^OJ<: na. indukci diferenciace BALB/c/MK keratinocytové buněčné linie. Tabulky 10 a 11 nyní ukazují podpůrné kvantitativní údaje.

Tabulka 10

Exprese cytokeratinů 1 a 10 v BALB/c/MK keratinocytech

Vzorek A	I A
Kontrola 90,3	4,4
Ca** {1,8 mmol) 96,5	13,8
RA (3 mikromoly) 94,5	15,4
Beta-karost {30 mikromolů) 96,5	7,9
Poznámka: Sloupec A jsou procenta imunopositivních buněk,
například vyjadřujících ukázané cytokeratiny, Sloupec
představuje intensitu exprese na buňku	(arbitární jednotky)
RA = zcela trans retinová kyselina.
Tabulka 11
Express panelu cytokeratinů v BALB/c/?'	!K keratinocytech
Vzorek. .A	I A
Kontrola 93,7	60, 7
Ca** (1,8 mmol) 97,6	80,2
RA (3 mikromoly) 94,3	129,8
Beta-karOXL (30 mikromolů) 96,2	82,1
Poznámka: Viz poznámku k Tabulce 10.
Cytokeratiny 1 a 10- jsou proteiny	s vysokou molekulovou

hmotností, které zvyšují svou expresi během diferenciačního programu. V buněčných kulturách in vitro je diferenciance klasicky vyvolána vystavením vysokým koncentracím vápníku v kulturním médiu. Buňky pěstované při nízkém vápníku zůstávají množivé. Jak osvětluje Tabulka 10, retinová kyselina může nahradit Ca** při zvýšení exprese cytokeratinů 1 a 10. Beta-kar“* také nahrazuje vápník při indukci diferenciance

BALB/c/MK keratinocytů. Zdánlivě menší účinek beta-kar⁰³* v porovnání, s retinovou kyselinou není působen nižší· potencí, ale opožděnou reakcí. Tabulka li ukazuje, že podobné výsledky se dostaly s použitím panelu jiných cytokeratinů.

Kombinovaný účinek beta-karθ³* nebo jeho frakcí s zcela trans retinovou kyselinou vůči a) identifikaci buněčného cíle beta-kar^O3C a b) kombinované terapie.

Při daných vlastnostech beta-kar^O3C a některých jeho “frákcí^há^vyvolání-diferenciace-buněk, je instruktivní, nejenj. porovnat získané účinky s lépe' známými účinky zcela trans retinové kyseliny, která se považuje za schopnou regulovat schopnost diferenciace u mnoha savčích buněčných typů, ale také stanovit účinek na buňky, když se beta-kar°~ a retinová kyselina použijí společné. Tabulka 12 dává-kvalitativní údaje osvětlující výsledky získané s různými kombinacemi betakar^OJC a retinové kyseliny u obou buněčných linií . NB4 a IMR32.

Když se stejně mocná koncentrace beta-kar^O3C kombinuje s retinovou kyselinou, jejich účinek na indukci diferenciace se ruší. Avšak když se koncentrace jedné z nich zvýší relativně vůči druhé, indukce diferenciace se obnoví. Překvapivé -je,- ze- když se-z-výší . spole.čňě....kon.c.entrace obou látek, pozoruje se výrazné zesílení diferenciace.

' Během diferenciačního programu se přechodně vyjadřuje mnoho značkovačů diferenciace, V buněčné linii NB4 je protein CD33 spojen s počátečními fázemi diferenciace. Následuje protein CDllb, střední značkovač a případně protein CD15, značkovač pokročilé diferenciace. Zesílená diferenciace tedy bude charakterizovaná snížením exprese a intenzity značkovače..CD33 a zvýšením exprese a intenzi-ty značkovače CD15.

Tabulka 12

Diferenciační vlastnosti směsí oxidovaného beta-kar^O3c a retinové kyseliny

Retinová kyselina Beta-kar“ Diferenciace

N

N

V

N

V

N

N

N

V

V ano ano ne ano ano ano (zesílení)

Poznámka: Pišme

Čárka znamená n

N označují nízkou a K vysokou koncentraci.

řítemnost dané látky.

Tabulka 13 ukazuje kvantitativní údaje o účincích zcela trans retinové kyseliny, beta-kar“ ' a některých jeho frakcí na úroveň těchto, specifických značkovačů diferenciace u buněk NB4, dosazených buď s individuálními frakcemi nebo růženými kombinacemi s zcela trans retinovou kyselinou. Výsledky ;**ukazuj í ,*»že,.beta-kar“ není»tak_rtúčinný,.. jakoretinová-^vseli-_7η. _r na (beta-kar“ více času pro expresi svého účinku). Kombinované ošetření retinovou kyselinou a beta-kar“, nebo některými jeho frakcemi, vede k inhibici diferenciace (antagonistický účinek), jak už se ostatně pozorovalo shora pro betakar“ (Tabulka 12), avšak s frakcí IG2 diferenciace postupuje dále než jak se samotným IG2 nebo retinovou kyselinou (synergický účinek).

Toto zjištění, že beta-kar“ a některé jeho frakce může_ jak překážet, tak zvyšovat účinek retinové kyseliny, naznačuje, že když retinová kyselina působí a reaguje s rodinou jaderných receptorů {včetně retinoidů, thyroidového hormonu, v

vitaminu D a sirotčích receptorů), beta-kar^ox a některé jeho frakce jsou specificky zaměřeny na tuto rodinu receptorů a působí na buňku na úrovni transkripce jaderné DNA.

Zvýšení diferenciace dosažené za jistých podmínek ukázaných shora nabízí možnost, že vhodná kombinace retinové kyseliny a beta-kar^O3e a nebo frakce IG2 bude účinnější terapií než samotná retinová kyselina. To má zvláštní význam, pro't'ože~ret'inové~kysel-iny~je- -nedostatek-,--aby - se^stala-běžně.

dostupnou pro léčení akutní promyeloticke leu.kemiě (APL) , přes skutečnost, že’dává jen 5-6 měsíční remisi,' než se stane neúčinnou tři léčení obnovené rakoviny. Naše výsledky podporují možnost', že kombinace dvou látek, zejména⁷ ukázaných shora, bude tlačit leukemické- buňky dále na konečné ···£' cestě diferenciace a. zvýší pravděpodobnost, že j.ejich zvratk množivému stavu je blokován.

Tabulka 13

Účinek beta-kar⁰* (G) nebo jeho frakcí, odděleně a kombinovaně s zcela trans retinovou kyselinou na expresi vybraných u značkovačů v buněčné linii NB4 (po 5 dnech)

CD33 CDllb CD15

	A B	I I	A B	I I	A	Β I I
		A S		A	&	A S
RA	87,1	1,6	71,9	2,6	73,1	9,7
G	95,8	4,8	73,8	1,0	32,1	0,9
SG1	96,9	5,2	77,3	0,8	30,0	0,3
IG1	94,6	5,0	71, 5	i,o	28,7	0,6
SG2	95,3	1 G “ f	72,1	1 ?	? Q d ---- / “	1, o
70	3 ? { J	2	54,6 10,9	1,3 4,	5' 15, 0 3	0,0 1,3 4,1,
SG3	Ο*ΐ , i	1,7	29,1	2, 0	19,9	0,3 i
G+RA		1,6	11,6	2, 0	23,6	1,5
SG1	35,1 15,	5 0,7	3,1 31,7	1,6	64,7	2,1
+RA
SG2	45,4 21,	4 1,0	7,1 59,8	1,0	75,1	5,5
+RA
IG2 “	‘71*6“	i; i -	-h“80v2· - *	....	*“· - 8 3 ý '7**	-11,0.
+RA

Poznámka: Kombinovaná ošetření byla: 1. mikromol RA a 7,5 míkromolů G ( nebo jeho frakcí), Sloupce A a B jsou procenta imunopositivních buněk v populaci, například vyjadřujících ukázaný proteinový značkovač diferenciace). Hodnoty sloupce B odpovídají výskytu odlišné populace buněk v termínech diferenciace, jak se stanovila podle intenzity exprese značkovače. Sloupce I a I_B představují průměrnou intensitu exprese značkovače diferenciace na bázi buňky (arbitární jednotky) .

Hypotéza, že beta-kar^OJ< působí na buňku na úrovni transkripce jaderné DNA interakcemi se shora uvedenou rodinou receptorů, je dále podporována výsledky kombinovaného ošetření jiné buněčné linie IMR32 retinovou kyselinou a betakar^OIC. Jako v případě NB4 lze pozorovat antagonistický nebo synergický účinek (v závislosti koncentraci obou látek), viz Tabulku 7a). Například exprese neurovlákna NF (značkovač ukazující, že buňky se diferenciovaly do neuronů) se maximalizuje při'. 1 mikromolu'RA a 5~mi-kromolech beta-~kar®~, - když jsou oba použity samotné. Když jsou použity společně při těchto koncentracích, ruší se navzájem a exprese NF je podobná kontrole (antagonismus). Avšak když se koncentrace RA zvýší na 2,5 mikromolu a koncentrace beta- kar^O3< sníží na 3 mikrcmoly, exprese NF je vyšší obou z nich samotných (synergie). Exprese gliálníhc fíbrilárního kyselého proteinu GFAP (značkovač ukazující diferenciaci na gliální. buňky), který je zvýrazněn oběma činidly, je asi předmětem komplexní interakce; Například zatím co sama retinová kyselina je nejúčinnější při nízké koncentraci 1 mikromolu, přítomnost beta- kar^O5C zvýší optimální koncentraci až na 10 mikromolu, v závislosti na koncentraci beta-kar“ (viz Tabulku 13a).

Tabulka 13a

Účinek beta-kar^OiC (G), odděleně a kombinovaně s zcela trans retinovou kyselinou na expresi vybraných u značkovačů v bu-

něčné linii RA (mikromoly)	IMR32 (po 48 beta-kar°~ (mikromolv)	hodinách). NF %intenzita	%	GFAP intenzita
0	0	96,0	4,3	65,0	1,7
1	0	96,4	14,2	94,4	18,4
2,5	0	97,2	11,9	90,5	6,1.
5	0	95,5	3,4	87,5	5,2
10	0	92,0	7,9	83,1	4,0
0	2	90, 6	7,7	9 ± . i?	5,2
0	-	93,7	53,0	87,0	5,2'
0	/ {	96,1	3, 6	94, 2	3,7
0	10	95, S	8,5	38,1	4,5
1	5	94,1	6,4 ‘	98,2	22,4
1	7,5	94,7	7,5	87,4	5,6
1	10	98,2	17, 6	89,7	6,2.
2,5	3	98,3	70,0	. 87,7	5,6'
275** ' ' -	* -51 ‘	94ý<7*	·* - -47,2 «κι,. ™	-ψ9 7-, 9.	. . ,,21,.7.
2,5	7,5	98,7	22,2	92,7	10,4
2,5	10	93,0	6,1	97,6	20,4
5	3	97,5	17,0	79,1	3,4
5	5	94,7	7,1	90,3	4,8
5	7,5	95,3	9,1	96,8	. 13,4
5	10	96,7	15,0	97,4	13,5
10	3	96,4	6,6	89,6	5,3
10	5	94,5	7,7	89,5	.7,0.
10	7,5	90,6	7,7	' 93,3	7,9

Účinek beta-kar^ox na buněčný cyklus

Rozdělení buněčné populace ošetřené beta-kar“* na tři fáze buněčného cyklu: G1 fáze (odpočívající buňky) , S fáze (DNA syntézní stupeň) a G2 fáze (zdvojení chromozomů) vykazuje nahromadění buněk v S fázi. Neexistuje blok G1. Tento účinek je působen prodloužením trvání buněčného cyklu. Bylo zjištěno, že buňky ošetřené beta-kar^ox ukončily buněčný cyklus během 3S hodin, zatím co kontroly a odpovídající vzorky“ošetřené* retinovou-kyse-l-inou- za--22 a .18 hodin.. Údaje se dostaly s použitím analýzy průtokovou cytometrií obsahu individuální mezíbuněčné DNA za synchronizovaných populací. Vzorkovalo se každých 5 hodin v období 48 hodin. Použily se dva typy buněk: rostoucí v suspenzi (NB4 leukemickě buňky) a rostoucí jako přilnuté buňky (LS myoblastom).

Jiné biologické vlastnosti >

Účinek beta-kar^Oi< na snížení hladiny buněčného glutathionu a na zvýšení citlivosti rakovinové buněčné linie vůči konvenčnímu chemoterapeutiku. Klasické protirakovinové látky jsou často neúčinné, protože rakovinové buňky získají 'resistenci vůči léčení. V mnoha případech je tento jev spojen se zvýšenou hladinou glutathionu (GSH), který chrání rakovinové buňky, reakcí s aktivní. složkou léku a tím asistuje jeho odstranění z buňky. Údaje v Tabulce 14 ukazují, Že beta-kar°^x je schopný podstatně snížit hladinu glutathionu v linii DA-3 myší rakoviny mléčných žláz, která je stejnou buněčnou linií, jaká se používala ve zvířecím modelu k stanovení protirakovinové aktivity. Výsledky v Tabulce 14 se srovnávají velmi příznivě s odpovídajícím účinkem buthionin sulfoximinu (BSO), toxičtějšího inhibitoru syntézy GSH, který se nyní .testuje, jako protirakovinové látka.

Tabulka 14

Účinek beta-kar^o>c na buněčnou linii DA-3 myší rakoviny mléčných žláz beta-kar^OJC (mikromoly) GSH (nmol/mg proteinu)

30

38

6

3 tím, oset

Prospěch ze co se stane sných j ak b snížení s život _ _ 1,- o buněčného glutathionu se osvětluje .ostí buněk DA-3 (pomocí testu MTT) , tak meichalanem, klasické protirakovinové látky. Údaje v Tabulce 14 ukazují, že IC__o melphalanu se dramaticky sníží přítomnosti nízké koncentrace beta- kar^ol<. (Tyto výsledky osvětlují graficky Obrázky 23a a 23b.)

Tento účinek společného podávání beta-kar⁰^ a konvenční protirakovinové látky, jako je melphalan, zvýší citlivosti rakovinové buněčné linie*vůčv proti rakovinové -látce. To «může pomáhat dvěma způsoby: a) stejná dávka může vyvolat vyšší koncentraci leku v rakovinové buňce, b) pro terapeutický účinek bude třeba nižší dávky, což sníží nežádoucí postranní účinky vyvolané vysokým, obecně toxickým melphalanem.

*

Tabulka 14

Účinek oxidovaného beta- karotenu na XC_so melphalanu u buněčné linie DA-3 myší rakoviny mléčných žláz stanovený testem MTT beta-kar^O3C (mikromoly) IC_5O melphalanu (mikromoly)

0,0 100

5,0 40

- 44“

10,0 6,6

20,0 6-,8

Toxicita jrotitumorová aktivita beta-kar^c

Prctitumorcvý účinek beta-kar^=2<: v jiných zvířecích modelech. Xenografty nahých myší. ...

Hodnocení protitumorové aktivity beta-kar^Oi<: se prodloužilo, aby zahrnulo studium účinek na růst tumoru odvozeného od transplantace linie A2780 lidských buněk rakoviny vaječníků na nahé myši. Obrázek 24 ukazuje, še intraperitoneální podaní beta-kar^M podstatně inhibuje růst tohoto značně agresivnějšího tumoru (ve srovnání s DA-3 modelem).

' Protitumorový účinek frakcí--beta-k-a-r-“-²*- -a -příbuzných-látek·. Použil se model myšího adenokarcinomu mléčných žláz Dl-BMBA-3 (DA-3). Výsledky osvětlují Obrázky 25a a 25b. Řada frakcí byla alespoň stejně silná (frakce SG, Fl, F2) nebo silnější (frakce Fl.l, F1.2, F1.3, pozoruj nižší použité koncentrace) než beta-kar^OJ<. Síla ketoaldehydu (sloučenina l, Obrázek 8) je zarážející. Tabulka 16 ukazuje odhadnutý objem tumoru relativně ke kontrole (to je skupině, která

... - .. .dostala j.en. vehikulum)’.v. _L28. ' dni. pokusu. Na rozdíl od toho, co se dříve pozorovalo u beta-kar^OJC, může být vidět, že alespoň v případe frakce Fl existuje účinek odpovědi na dávku

Tabulka 16

In vivo protitumorová aktivita beta-kar°^x a jeho frakcí v DA-3 modelu

Vzorek Dávka {mg/kg hmotnosti) Relativní velikost tumoru 2 8. den

beta-karM	25	0,36
SG l	25	0,30
LSG	25	0,49
Fl	5	0,72
	10	0,49
	25	0,37
F2	25	0,33
Fl.l	10	0,30	i. 1
F1.2	10	0,47
			‘ um '
Ketoaldehyd	10	0,44
20 % ethanol	N/A	(1,00)
Testoval	se alternativní způsob	podání na témže	modelu
pro dvě frakce	Fl a F2. Údaje v Tabulce 17 ukazují,	že obě

frakce jsou při orálním podání (p.o.) alespoň stejně účinné jako při intraperitoneální podání (i.p.).

54' Tabulka 17

Srovnání in vivo protitumorové aktivity frakcí Fl ných i.p.. a p.o. v DA-3 modelu

Vzorek Relativní velikost tumoru (25 mg/kg hmotnosti) 21. den

F2 p.o. ’ 0,50

F2 i,p. 0,48 “Fl “ρ 7Ó7 ~~~~—'—— ——— —0 _r-3-4— Fl ' i.p. Q,⁴³ % ethanol (1,00) <

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY 1, Oxidovaná směs karotenoidů, retinoidů nebo příbuzného konjugovaného polyenů, užitečná jako netoxická látka vyvolávající diferenciaci buněk, cytostatikum a protirakovinová látka, která se tvoří reakcí karotenoidových, retinoidových nebo příbuzných konjugovaných polyenóvých sloučenin s kyslíkem, kdy spotřeba kyslíku je několikanásobně vyšší na molekulární bázi, než množství spotřebované karotenoidové, retinoidové nebo příbuzné konjugované polyenové sloučeniny.

   xzar.á směs karotenoidů, retinoidů nebo příbuzného konjugovaného polyenů podle nároku 1, vyznačená tím, že je získaná oxidací v organickém rozpouštědle.
2. 3. Oxidovaná směs karotenoidů, retinoidů nebo příbuzné-, ho konjugovaného polyenů podle nároku 1 vyznačená tím, že je. získaná oxidací v pevném stavu.
3. 4. Směs podle nároku 1 získaná z retinoidů nebo rétinové kyseliny vyznačená tím, že oxidace se provádí za zvýšeného tlaku kyslíku.
4. 5. Oxidovaná směs karotenoidů, retinoidů nebo příbuzného konjugovaného polyenů podle nároku 1, vyznačená tím, že je získaná oxidací bez katalyzátorů, iniciátorů nebo inhibitorů oxidace.
5. 6. Oxidovaná směs karotenoidu, retinoidu nebo příbuzného konjugovaného. polyenu podle nároku 1, vyznačená tím, že je užitečná proti množivým a diferenciaci blokujícím účinkům virových genů vyjádřených v savčích buňkách.
6. 7. Polymerní složka oxidované směsi karotenoidu, retinoidu nebo příbuzného konjugovaného polyenu podle nároku 1.

   _____
7. 8_. _Způsob /výroby oxidované směsi karotenoidu, retinoidu________ nebo příbuzného konjugovaného polyenu podle nároku 1, vyznačený tím, že karotenoidové, retinoidové nebo příbuzné konjugované polyenové sloučeniny reagují s kyslíkem v organickém ' rozpouštědle·, v pevném stavu, přičemž., spotřeba...kyslíku .j.e .né.-?-1*.. I ^v kolikanásobně . vyšší na .molekulární . bázi, než množství spot- :+t řebované karotenoidové, retinoidové nebo příbuzné konjugované polyenové sloučeniny.
8. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že s kysl reaguje beta-karoten, canthaxantin nebo retinová kyše v organickém rozpouštědle.
9. 10. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že s kyslíkem reaguje pevný beta-karoten, canthaxantin nebo retinová kyselina.
10. 11. Poúžití směsi podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčení tumorů u zvířat nebo lidí.
11. 12. Látka užitečná jako netoxická látka vyvolávající diferenciaci buněk, cytostatikum a protirakovinový lék vyznačená tím, že se získává frakcionací směsi podle nároku 1 podle molekulové hmotnosti.
12. 13. Látka podle nároku 12 vyznačená tím, že frakcionace se provádí srážením rozpouštědlem.
13. 14. Látka podle nároku 12 vyznačená tím, že frakcionace se provádí chromatografií vylučováním podle rozměru.
14. 15. Látka podle nároku 12 vyznačená tím, že se dále frakcionuje nebo isoluje podle polarity.
15. 16. Látka podle nároku 12 vyznačená tím, že má molekulovou hmotnost menší než asi 700 Daltonů.
16. 17. Látka podle nároku 12 vyznačená tím, že má molekulovou hmotnost menší než asi 300 Daltonů.

    Ml-'—Hrt* i»* „M- _p_ _ r ip.> -μ , + > . *
17. 18. Použití látky podle nároku 12 pro přípravu léčiva pro léčení tumorů u zvířat nebo lidí.
18. 19. Použití podle nároku 18 vyznačené tím, že účinné množství látky je od 10 do 150 mg na kilogram tělesné hmotnosti řečeného zvířete nebo člověka.
19. 20. Použití podle nároku 11 vyznačené tím, že směs dále obsahuje konvenční lék proti rakovině.
20. 21. Způsob podle nároku 8 vyznačený tím, že reakce s kyslíkem se provádí s lykopenem
21. 22. Použití 2-methyl-6-oxo-2,4-heptadienalu pro přípravu léčiva pro léčení tumorů u zvířat nebo lidí, kteří to potřebuj í.