PL184296B1 - Utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzące od pokrewnych sprzężonych polienów sposób ich wytwarzania oraz środek farmaceutyczny, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienalu - Google Patents

Abstract

1. Utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzace od pokrew- nych sprzezonych polienów, uzyteczne jako nietoksyczne srodki wywolujace róznicowanie komóricowe, srodki cytostatyczne i srodki przeciwnowotworowe, otrzymywane w reakcji utleniania karotenoidów, retinoidów lub pokrewnych sprzezonych zwiazków polienowych, znamienne tym, ze skladaja sie z mieszaniny polimerów majacej w widmie absorpcyjnym w podczerwieni szerokie bezksztaltne pasmo absorpcyjne przy okolo 3450 cm-1 , dwa silne, wezsze pasma wielopikowych absorpcji przy okolo 2950 i 1700 cm-1 , odpowiednio, i sze- rokie kompleksowe pasmo pomiedzy okolo 1500 i 750 cm-1 z okolo szescioma pikami, przy czym mieszanina zawiera zwiazki polimerowe o ciezarze czasteczkowym od okolo 300 do 8000 Daltonów, srodkowa frakcje zwiazków o ciezarze czasteczkowym okolo 900 Daltonów i niskoczasteczkowe zwiazki zawierajace miedzy innymi: 2-metylo-6-okso- 2,4-neptadienal o wzorze 1, a gdy karotenoidem jest ß-karoten to mieszanina zawiera di- hydroaktynidiolid o wzorze 2, ß-cyklocytral o wzorze 3, ß-jonon o wzorze 4, 5, 6-epoksy- ß-jonon o wzorze 5, 4-okso-ß-jonon o wzorze 6, ß-jonylidenoacetaldehyd o wzorze 7 i 5,6-epoksy-ß-jonylidenoacetaldehyd o wzorze 8. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzące od pokrewnych sprzężonych polienów o własnościach indukowania różnicowania komórkowego, cytostatycznych i, przeciwnowotworowych, przydatne jako środki chemoterapeutyczne i chemoprewencyjne, zaś w szczególności pochodne otrzymane metodą ekstensywnego utleniania karotenoidów, retinoidów i pokrewnych sprzężonych polienów oraz sposób ich otrzymywania · oraz środek farmaceutyczny, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienalu.

Karotenoidy i retinoidy są substancjami występującymi w naturze i mają one ekstensywnie sprzężone łańcuchy polienowe. Karotenoidy mają najbardziej ekstensywnie sprzęgnięty układ podwójnych wiązań węgla z węglem, które powodują ich różnorodne i jaskrawe zabarwienie. Wiele występujących w naturalnym środowisku karotenoidów i retinoidów jest biologicznie aktywna. Przykładowo, pewne węglowodorowe związki grupy karotenoidów (w szczególności β-karoten lub prowitamina A, które najliczniej występują w żywności) są źródłem retinolu (jednej z postaci witaminy A). Karotenoidy zabezpieczają rośliny przed uszkodzeniem w fotochemicznym utlenianiu, prawdopodobnie poprzez dezaktywację pojedynczych atomów tlenu. Badania epidemiologiczne wykazały, że spożywanie karotenoidów ujemnie koreluje z występowaniem pewnych odmian raka (Peto i współpracownicy. Nature, 1981, 290, 201-208). Wykazano również, że karotenoidy i retinoidy opóźniaj ją rozwój eksperymentalnie wywołanych guzów nowotworowych u zwierząt (N. I. Krinsky. Actions of Carotenoids in Biological Systems, Annu. Rev. Nutr, 13, 561-587 (1993); Matthews-Roth, Curr. Top. Nutr. Dis. [New Prot. Roles Select. Nutr.], 1989,22, 17-38; Pure Appl. Chem., 1985, 57, 717-722). Przeprowadzono szereg interwencyjnych badań dietetycznych, w celu określenia wpływu uzupełniającego (β-karotenu jako nietoksycznej, spożywczej substancji przeciwnowotworowej, która może skutecznie zmniejszać śmiertelność spowodowaną nowotworami, zaś ostatnio rozpoczęto badania nad możliwością związku β-karotenu ze zmniejszeniem częstości występowania choroby wieńcowej serca; ostatnie badania kliniczne z zastosowaniem pokrewnych związków (retinoidy - kwas retinowy, retinol i retinoamidy) wykazały ich znaczenie w terapii przeciwnowotworowej, zarówno jako środki terapeutyczne jak i prewencyjne (rak skóry, głowy i szyi, płuc, pęcherza, ostra białaczka promielocytowa, leukoplakia, zespoły mielodysplastyczne); D. L. Hill and C. J. Grubs, Retinoids and Cancer Prevention, Annu. Nutr. 1992, 12, 161-181). W końcu stwierdzono, że β-karoten ma własności antyoksydacyjne przy niskim ciśnieniu tlenu w tkance (Burton and Ingold, β-Carotene: an unusual type of lipid antioxidant, Science, 1984,224, 569-573).

Karotenoidy, retinoidy i pokrewne sprzężone polieny są aktywne w stosunku do tlenu cząsteczkowego (0₂) i dlatego podczas przechowywania żywności mogą ulegać rozkładowi tlenowemu w pożywieniu nawet przy obniżonej temperaturze. Karotenoidy są bardziej aktywne wobec tlenu niż retinoidy, z powodu ich większego, bardziej ekstensywnie sprzężonego układu podwójnych wiązań. Mimo to, produkty rozkładu tlenowego retinoidów i karotenoidowych i pokrewnych sprzężonych polienów i ich potencjalne aktywności fizjologiczne nie cieszyły się większym zainteresowaniem, z wyjątkiem witaminy A, którą otrzymuje się poprzez biologiczne utlenianie β-karotenu.

Mordi i współpracownicy (Exploratory study of β-carotene autooxidation, Tetrahedron Letters, 1991, 32(33), 4203-4206), badali produkty wytworzone podczas samoistnego autoutleniania β-karotenu. W publikacji stwierdzono, że podstawowymi produktami zidentyfikowanymi w początkowych etapach samorzutnego autoutleniania β-karotenu są: epoksydy, β-jonon, β-apo-13-karotenon, retinal i pochodne związki karbonylowe; w końcowej mieszaninie dominowały związki z krótkimi łańcuchami karbonylowymi.

W innej pracy, Mordi i współpracownicy Oxidative Degradation of β-carotene and P-Apo-8'-carotenal opublikowanej w Tetrahedron, tom 49 Nr 4, str. 911-928, 22 stycznia 1993 w^k^iią że samoistnie zapoczątkowane utlenianie β-karotenu cząsteczkowym tlenem powoduje powstanie epoksydów, dwuhydrofaranów, związków karbonylowych, dwutlenku węgla, śladowych ilości alkoholi i trochę innych związków. W publikacji, której współautorem jest jeden z twórców wynalazku, wzmiankuje się również, o pewnych polimerowych/oligomerowych związkach, które często oddzielają się od roztworu, a w szczególności

184 296 w późniejszych etapach utleniania β-karotenu. W publikacji nie ujawniono właściwości polimeru/oligomeru.

Niniejsze zgłoszenie patentowe wynika z opracowania pomysłu, że aktywność biologiczna karotenoidów nie wynika z właściwości samych karotenoidów, ale zależy od właściwości jednego lub więcej produktów powstających in vivo w wyniku ich utleniania. Dotyczy to również retinoidów z powodu ich zdolności do utleniania się, jakkolwiek nie tak łatwo jak u karotenoidów. Biologiczna aktywność utlenionych retinoidów różni się jednak od aktywności samych retinoidów.

Przedmiotem wynalazku są utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzące od pokrewnych sprzężonych polienów, użyteczne jako nietoksyczne środki wywołujące różnicowanie komórkowe, środki cytostatyczne i środki przeciwnowotworowe, otrzymywane w reakcji utleniania karotenoidów, retinoidów lub pokrewnych sprzężonych związków polienowych, charakteryzujące się tym, że składają się z mieszaniny polimerów mającej w widmie absorpcyjnym w podczerwieni szerokie bezkształtne pasmo absorpcyjne przy około 3450 cm¹, dwa silne, węższe pasma wielopikowych absorpcji przy około 2950 i 1700 cm⁴, odpowiednio, i szerokie kompleksowe pasmo pomiędzy około l500 i 750 cm⁴ z około sześcioma pikami, przy czym mieszanina zawiera związki polimerowe o ciężarze cząsteczkowym od około 300 do 8000 Daltonów, środkową frakcję związków o ciężarze cząsteczkowym około 900 Daltonów i niskocząsteczkowe związki zawierające między innymi: 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienal o wzorze 1, a gdy karotenoidem jest β-karoten to mieszanina zawiera dihydroaktynidiolid o wzorze 2, β-cyklocytral o wzorze 3,p-jonon o wzorze 4, 5,6-epoksy-e-jonon o wzorze 5, 4-okso-e-jonon o wzorze 6, β-jonylidenoacetaldehyd o wzorze 7 i 5,6-epoksy-e-jonylidenoacetaldehyd o wzorze 8.

Utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzące od pokrewnych sprzężonych polienów, korzystnie są otrzymane przez utlenianie w organicznym rozpuszczalniku.

Utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzące od pokrewnych sprzężonych polienów, korzystnie są otrzymane przez utlenianie w stanie stałym.

Utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzące od pokrewnych sprzężonych polienów, korzystnie zawierają związki polimerowe o ciężarze cząsteczkowym powyżej 300 Daltonów.

Przedmiotem wynalazku jest również środek farmaceutyczny, charakteryzujący się tym, że jako substancję czynną zawiera 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienal oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalne zarobki, rozcieńczalnik lub nośnik, charakteryzująca się tym, że jako substancję czynną zawiera 2-metylo-6okso-2,4-heptadienal.

Wynalazek dotyczy również zastosowania 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienalu do wytwarzania leku do leczenia nowotworów u ludzi i zwierząt.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania utlenionych karetonoidów, retinoidów i utlenionych mieszanin pochodzących od pokrewnych sprzężonych polienów, polegający na kontaktowaniu karetonoidów, retinoidów lub pokrewnych sprzężonych polienów z tlenem, charakteryzujący się tym, że karotenoid, retinoid, lub pokrewny, sprzężony związek polienowy poddaje się reakcji z tlenem, w organicznym rozpuszczalniku lub w stanie stałym, przy czym tlen dodaje się w kilkakrotnym nadmiarze w stosunku do jego molekularnego zużycia przez karetonoid, retinoid lub pokrewny sprzężony związek polienowy.

W sposobie korzystnie reakcji z tlenem poddaje się β-karoten, likopen lub kantaksantynę.

W pierwszej fazie badań prowadzących do wynalazku stwierdzono, że mieszaniny otrzymane przez utlenienie β-karotenu, kantaksantyny albo kwasu retinowego tlenem Θ₂, w warunkach, w których stechiometrycznie reagują przynajmniej niektóre substraty, z kilkakrotnym nadmiarem tlenu (sposób określany dalej jako ekstensywne utlenianie) są zdolne, w hodowli komórkowej, do powodowania zwolnionej proliferacji komórek ssaczych pochodzenia nowotworowego albo transformowanych wirusem, w sposób nieszkodliwy dla normalnych komórek.

Ponadto stwierdzono w przypadku kilku traktowanych linii komórkowych, że zachodzi różnicowanie komórek, tj . komórki nowotworowe-podobne nabierają cech komórek normalnych. Stwierdzono również, że mieszanina substancji otrzymanych w wyniku ekstensywnego

184 296 utleniania β-karotenu ma własności nietoksycznego opóźniania lub zatrzymywania wzrostu nowotworów u myszy.

Zaproponowano utlenianie tlenem karotenoidów, retinoidów lub pokrewnych sprzężonych polienów w warunkach odpowiednich do otrzymania mieszaniny zawierającej oligomerowe lub polimerowe komponenty.

Utlenianie przeprowadza się przy użyciu tlenu i karotenoidu, retinoidu lub sprzężonego polienu, w postaci stałej lub rozpuszczonej w organicznym rozpuszczalniku.

W oparciu o przedstawione poniżej laboratoryjne testy uważa się, że obydwie utlenione mieszaniny (oraz składnik oligomerowo/polimerowy) otrzymane w wyniku utleniania β-karotenu, kantaksantyny, likopenu, kwasu retinowego oraz ich częściowo utlenione mieszaniny są skuteczne jako środki antyproliferacyjne i przeciwnowotworowe oraz są induktorami różnicowania komórkowego.

W pierwszym etapie badań nie określono strukturalnych wzorów polimerowych składników. Istnieje dowody, że otrzymane polimery w wyniku utleniania (β-karotenu, kantaksantyny lub kwasu retinowego mają polinadtlenkową strukturę i zawierają grupy kwasowe.

W odniesieniu do pytania, czy substancje według wynalazku występują w przyrodzie, należy zauważyć, że powstawanie polimerowych komponentów podczas utleniania jest prawdopodobnie opóźnione w naturze, gdzie niewyizolowane karotenoidy i retinoidy są zabezpieczone przed utlenianiem przez antyoksydanty takie jak witamina E. Jednakże polarna substancja (która polimeryzuje po wyizolowaniu) otrzymana przez utlenianie w roztworze β-karotenu w obecności witaminy E wykazuje taką samą aktywność w testach kultur komórkowych in vitro jak polimerowe materiały otrzymane w nieinhibitowanym utlenianiu.

Ciężar cząsteczkowy większości składników mieszaniny polimerowej według wynalazku jest stosunkowo niski w porównaniu z ciężarami cząsteczkowymi karotenoidów i retinoidów. Z tych powodów otrzymane związki mogą być określone jako oligomery jak również jako polimery. W dalszej części opisu określenie polimer lub polimerowe będzie używane do określenia substancji.

W drugiej fazie badań prowadzących do niniejszego wynalazku stwierdzono, że mieszaninę według wynalazku otrzymaną przez opisane wyżej ekstensywne utlenianie, można frakcjonować według jej ciężaru cząsteczkowego. Frakcjonowanie można przeprowadzić, przykładowo, przez wytrącanie z roztworu lub chromatografię na żelu. Otrzymane w ten sposób frakcje można dalej rozdzielać na podfrakcje według ich polarności. Stwierdzono, że wiele z otrzymanych w ten sposób frakcji i podfrakcji oraz pewne zawarte w nich związki mają działanie przeciwnowotworowe, cytostatyczne i/lub powodują różnicowanie komórkowe w stopniu porównywalnym lub wyższym niż mieszaniny określone w pierwszym etapie badań.

Wyizolowano związek, 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienal i zbadano jego własności cytostatyczne i przeciwnowotworowe. Związek ten można otrzymać przez frakcjonowanie ekstensywnie utlenianej mieszaniny według wynalazku (utleniony β-karoten) lub konwencjonalną metodą syntezy. Związek został opisany uprzednio jako produkt otrzymany metodą utleniania kwasu trans-retinowego przez Oyler i współpracowników w publikacji Characterization of autoxidation products of retionic acid w Tetrahedron, tom 45, Nr 25, str. 7679-7694, 1989.

Na rysunkach:

figura 1 pokazuje wynik separacji/analizy ciekłej chromatografii wysokociśnieniowej o odwróconej fazie (HPLC) ekstensywnie utlenianego β-karotenu;

figura 2 pokazuje wyniki chromatografii na żelu (GPC) zawierające analizę ekstensywnie utlenianego β-karotenu;

figura 3 pokazuje przetworzone podczerwone widmo Fouriera (FTIR) utlenionej mieszaniny z ekstensywnie utlenionego β-karotenu;

figura 4 pokazuje widmo protonowego, magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) utlenionej mieszaniny ekstensywnie utlenionego β-karotenu;

figura 5a pokazuje widmo UV polimerowego składnika utlenionej mieszaniny ekstensywnie utlenionego β-karotenu (frakcja 1;

figura 5b pokazuje widmo UV β-karotenu;

184 296 figura 6a - 6d pokazują wyniki analizy GPC wybranych frakcji polimerowej mieszaniny: 6a - frakcja 1,

6b - frakcja 2,

6c - frakcja 3,

6d - frakcja 4;

figura 7 pokazuje widmo FTIR frakcji 1 mieszaniny polimerowej;

figura 8 pokazuje widmo FTIR materiału otrzymanego przez utlenianie stałego β-karotenu;

figura 9 pokazuje wyniki analizy GPC materiału polimerowego otrzymanego przez utlenianie stałego β-karotenu;

figura 10a - 10f (fotografie) pokazują działanie kwasu retinowego i ekstensywnie utlenionego β-karotenu na różnicowanie komórek ES:

figura 10a - komórki ES - brak induktora;

figura 10b - kwas retinowy;

figura 10c - ekstensywnie utleniony β-karoten 3 μΜ;

figura 10d - ekstensywnie utleniony β-karoten, 7,5 μΜ;

figura 10e - ekstensywnie utleniony β-karoten 15 μΜ;

figura 10f - ekstensywnie utleniony β-karoten 30 μΜ;

figura 11 pokazuje działanie ekstensywnie utlenionego β-karotenu na wzrost nowotworu, podawanego w zastrzykach w dawce 10 mg/kg w dniach 0,2,4,7,9,11,14,16 i 18;

figura 12 pokazuje działanie ekstensywnie utlenionego β-karotenu na wzrost nowotworu przy dawce 150 mg/kg podawanej w zastrzykach w dniach 0,2,4,7, 9,11, 14,16 i 18;

figura 13a pokazuje działanie ekstensywnie utlenionego β-karotenu na wielkość nowotworu u zabitych zwierząt, które leczono stosując różne dawki ekstensywnie utlenionego β-karotenu i porównywano wyniki z kontrolą (nie leczonymi zwierzętami);

figura 13b pokazuje działanie ekstensywnie utlenionego β-karotenu na wielkość nowotworu u zabitych zwierząt, które leczono różnymi dawkami ekstensywnie utlenionego β-karotenu oraz powstawanie wylewów wokół nowotworu i porównanie z kontrolą (nie leczonymi zwierzętami);

figura 14 pokazuje porównanie wzorów strukturalnych podstawowych związków wyjściowych stosowanych w sposobie według wynalazku;

figura 15 pokazuje rozdział ciężaru cząsteczkowego podstawowych frakcji według wynalazku;

figura 16 pokazuje schematycznie trójpoziomowe frakcjonowanie mieszaniny w rozpuszczalniku;

figura 17 pokazuje chromatogram GPC preparatywnej separacji frakcji SG1 na frakcje LSG i MSG;

figura 18a i 18b pokazują chromatogram HPLC frakcji LSG, monitorowany, odpowiednio, przy 219 i 265 nm oraz pokazuje jak rozdzielono frakcję LSG na frakcje FI i F2;

figura 19a i 19b pokazują chromatogram HPLC frakcji F1 monitorowany, odpowiednio, przy 219 i 265 nm oraz pokazuje jak rozdzielono frakcję F1 na frakcje F1.1 i F1.2 oraz F1. 3;

figura 20a i 20b pokazują chromatogram HPLC frakcji F2 monitorowany, odpowiednio, przy 219 i 265 nm;

figura 21 pokazuje wzory związków zidentyfikowanych we frakcjach według wynalazku; figura 22a pokazuje cytostatyczne działanie pewnych frakcji według wynalazku na linię komórkową raka okrężnicy;

figura 22b pokazuje cytostatyczne działanie pewnych frakcji według wynalazku na linię komórkową białaczki;

figura 23a pokazuje działanie in vitro β-car⁰¹ na poziom glutationu w komórkach DA-3; figura 23b pokazuje działanie in vitro β-car” na IC₅₀ melfalanu w linii komórek DA-3; figura 24 pokazuje przeciwnowotworowe właściwości β-karotenu i utlenionego β-karotenu wobec raka jajnika;

figura 25a i 25b pokazują działanie hamujące różnych frakcji według wynalazku na wzrost nowotworu w mysim modelu DA-3 .

184 296 β-karoten, kwas refcinowy i pokrewne związki zostały zidentyfikowane jako potencjalne środki przeciwnowotworowe, lub nawet zapobiegawcze i/lub lecznicze środki stosowane w leczeniu różnych odmian raka, a między innymi raka płuc i pewnych typów białaczki. Chemoprewencyjne działanie β-karotenu zwróciło również uwagę ze względu na sposób działania witaminy A (kwas retinowy), będącej produktem utleniania β-karotenu. Stwierdzono, że witamina A wykazuje wobec pewnych typów komórek raka zdolność do przynajmniej częściowego odwrócenia ich stanu proliferacyjnego, naśladującego embrionalny, do stanu przypominającego normalne komórki. Jednakże, wysoka toksyczność witaminy A ściśle ogranicza jej terapeutyczne stosowanie.

Mechanizm działania karotenoidów jest do tej pory jeszcze nieznany. Działanie witaminy A i pokrewnych retinoidów, które mają wpływ na wzrost komórek i ich różnicowanie, wydaje się zachodzić przez receptory retinoidowe umieszczone w jądrze komórki.

W odniesieniu do β-karotenu i prawdopodobnie innych karotenoidów, wydaje się wielce prawdopodobne, chociaż nie udało się tego udowodnić, że ich przeciwnowotworowe działanie wynika niejako z ich przeciwutleniających własności cząsteczki, a nie z ich zdolności do tworzenia witaminy A.

Wydzielony β-karoten i inne karotenoidy łatwo ulegają utlenieniu pod wpływem tlenu zawartego w powietrzu. Retinoidy również łatwo samorzutnie utleniają się. Jednakże, jak wspomniano na początku, obecność mniejszej ilości sprzężonych wiązań olefinowych w retinoidach zmniejsza tempo i nasilenie samoczynnego utleniania się.

Samorzutne utlenianie się może spowodować, że karotenoidy i retinoidy zachowują się in vivo jak wewnątrzkomórkowe pro-oksydanty działając jako źródło biologicznie aktywnych rodników i/lub pochodzących z nich produktów. Stwierdzono, że wolne rodniki i produkty ich utleniania działają jako wtórne przekaźniki pełniące ważną rolę w szlakach sygnalizacyjnych żywej komórki. Mimo, że dawno temu stwierdzono, że wytwarzanie wolnych rodników jest nieuchronną konsekwencją życia w środowisku tlenowym i ogólnie uważa się je za szkodliwe dla komórek, to ostatnio przeważa pogląd, że wolne rodniki, szczególnie rodniki tlenowe, odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu, kontroli i rozwoju komórek.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że produkty ekstensywnego utleniania karotenoidów, retinoidów, pokrewnych sprzężonych polienów i ich strukturalne analogi mają inne bioaktywne własności niż witamina A. Wykazano to przez wstępne ekstensywne utlenianie β-karotenu, kantaksantyny i kwasu retinowego in vitro, a następnie przetestowano mieszaninę utlenionych produktów pod kątem jej biologicznej aktywności. Jest to bardzo ważne dla poznania różnicy pomiędzy produktami ekstensywnego utleniania, które stanowiąpodstawę wynalazku, a witaminą A będącą znanym produktem utleniającej konwersji in vivo β-karotenu i innych karotenoidów.

W drugim etapie badań opracowano schemat frakcjonowania ekstensywnie utlenionej mieszaniny β-karotenu, określanej tu jako P-car°*. Mieszaninę rozdzielono na trzy frakcje na podstawie ciężaru cząsteczkowego (MW), stosując kombinację wytrącania z rozpuszczalników i chromatografię żelową (GPC). Testy biologiczne wykazały, że większość aktywności zawiera się we frakcjach o niskich i średnich MW. Stąd też skoncentrowano się na tych dwóch frakcjach, a w szczególności na frakcji o niskim MW. Dla zbadania bardziej złożonej frakcji o średnim MW konieczna jest większa ilość czasu.

Frakcję o niskim MW podzielono na dalsze frakcje, stosując na początku wytrącanie w rozpuszczalnikach, a następnie wysokosprawną chromatografię cieczową o odwróconej fazie (RP-HPLC). Uzyskano rozdział, przy którym pewne frakcje zawierały tylko jeden lub bardzo niewiele głównych związków. Niektóre z tych związków zostały zidentyfikowane. Jeden z nich, nienasycony ketoaldehyd otrzymano inną metodą (syntetycznie) i stwierdzono, że ma on silne własności cytostatyczne i przeciwnowotworowe. Nie stwierdzono do tej pory, że związek ten można otrzymać z β-karotenu ale opisywano, że stanowi produkt autoutleniania RA. Okazuje się, że cytostatyczne i antynowotworowe własności grupy związków nienasyconego sprzężonego ketoaldehydu nie byty do tej pory znane.

Badano wiele frakcji β-car⁰* pod względem ich własności cytostatycznych i indukujące różnicowanie komórkowe. Szereg frakcji ma silniejszą aktywność cytostatyczną w porównaniu z P-car°* Indukowanie różnicowania komórkowego zbadano na szeregu ludzkich linii

184 296 komórkowych. Najsilniejsze działanie zaobserwowano wobec linii nerwiaka niedojrzałego EMR32. Najbardziej uderzającym wynikiem była obserwacja, że komórki macierzyste w pojedynczej linii komórkowej traktowane różnymi frakcjami, mogą powodować powstawanie dwóch różnych fenotypów (komórki nerwowe i glejowe). (Substancje mające takie własności mogą znaleźć zastosowane w terapii regeneracji układu nerwowego, po urazach mózgu rdzenia kręgowego).

Przeciwnowotworowe właściwości β-car⁰* wykazano wobec raka ludzkich jajników rosnącego jako przeszczep ksenogeniczny na myszach nagich. Przeszczepy ksenogeniczne pochodzące z ludzkich linii nowotworowych rosnące na myszach nagich uważane są za bliższe ludzkim nowotworom niż nowotwory zwierząt pochodzące ze zwierzęcych komórek. Badając wiele frakcji β-car™ in vivo stwierdzono, że pewne frakcje mają silną aktywność. Warto odnotować, że aktywność frakcji uzyskuje się przy stężeniu, w którym nie występuje zauważalna toksyczność dla zwierząt.

W tym momencie, po drugim etapie badań stwierdzono, że więcej niż jeden związek (pochodzący z utleniania mieszaniny, jak to opisano wyżej) jest aktywny jako czynnik przeciwnowotworowy oraz, że frakcje zawierające więcej niż jeden związek są aktywniejsze w porównaniu z pojedynczymi związkami.

Likopen (fig. 14·), karotenoid odkryty w pomidorach wykazuje również aktywność cytostatyczną po ekstensywnym utlenianiu. Likopen jest pozbawiony dwóch pierścieni cykloheksylowych, które występują w β-karotenie.

W celu oceny wynalazku przeprowadzono testy biologiczne in vivo i in vitro oraz przedstawiono poniżej metody syntezy i dane analityczne utlenionej mieszaniny β-karotenu, kantaksantyny i kwasu retinowego, które opisano niżej.

Doświadczenia

Pierwsza faza badań

Chemia β-karoten, kantaksantynę i kwas retinowy utleniano w opisany niżej sposób:

Przykład 1: Utlenianie β-karotenu mM roztwór β-karotenu (Fluka) w benzenie przedmuchuje się tlenem, a następnie inkubuje w łaźni na wstrząsarce w ciemności w 30°C w obecności czystego tlenu pod ciśnieniem atmosferycznym. Po 72 godzinach, gdy 6 do 8 molowych równoważników tlenu zostało zużytych, odparowuje się roztwór otrzymując żółtą pozostałość podobną do żywicy.

Wpływ rozpuszczalnika:

Utleniając β-karoten w czterochlorku węgla otrzymano zasadniczo takie same wyniki jak przy utlenianiu w benzenie.

ilość wytworzonej witaminy A:

W mieszaninie utleniającej nie wykryto obecności retinolu i kwasu retinowego, produktów enzymatycznego utleniania in vivo β-karotenu. Mimo to, retinol, który może być utleniony do kwasu retinowego, został zidentyfikowany jako produkt występujący w zbyt małej ilości żeby przypisać to aktywności biologicznej utlenianej mieszaniny β-karotenu. Ponadto, aktywność biologiczna utlenionej mieszaniny różni się zasadniczo od witaminy A, co zostanie dalej opisane.

Substancje polimerowe:

Podczas utleniania otrzymano znaczne ilości substancji polimerowych (patrz, niżej). Prawdopodobnie, przez analogię z reakcjami utleniania innych związków olefinowych, substancje o wyższym ciężarze cząsteczkowym odpowiadają polimerom otrzymanym przez utlenianie fragmentów β -karotenu. Przebadano różne stężenia β-karotenu w celu określenia zależności polimeryzacji od stężenia β-karotenu w roztworze. Roztwory o stężeniu 20 mM, mM i 0,2 mM β-karotenu w benzenie przedmuchiwano tlenem, inkubowano w atmosferze czystego tlenu (760 mm Hg) w ciemnym miejscu w temperaturze 30°C. W każdym przypadku jako główny produkt otrzymano składnik polimerowy. Ponadto, składnik polimerowy tworzył się wcześnie podczas utleniania β-karotenu.

Figura 1 pokazuje charakterystykę utlenionej mieszaniny w wysokowydajnej chromatografii cieczowej w odwróconej fazie (HPLC).

184 296

Figura 2 pokazuje charakterystykę utlenionej mieszaniny w GPC, w jednostkach arbitralnych, skład mieszaniny utleniającej według ciężaru cząsteczkowego składników. Zakres ciężaru cząsteczkowego jest szeroki, od około 600 do około 8000 Daltonów z maksimum w okolicy około 900 Daltonów (ostry pik po 4,9 minutach jest artefaktem spowodowanym własnościami fizycznymi GPC - wszystkie komponenty mieszaniny o ciężarze cząsteczkowym powyżej około 1400 eluowały razem).

Figura 3 pokazuje transformację Fouriera widma podczerwieni (FTIR) utlenionej mieszaniny.

Figura 4 pokazuje widmo protonowego jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR) utlenionej mieszaniny.

Częściowy rozdział mieszaniny produktów z β-car⁰*

Otrzymana ekstensywnie utleniona mieszanina nie zawierająca pozostałości β-karotenu, otrzymana w roztworze została rozfrakcjonowana przez wytrącenie w kolejnych rozpuszczalnikach. Frakcje zostały scharakteryzowane przez chromatografię na żelu (GPC) oraz analizę pierwiastkową Wyniki analizy pierwiastkowej i analiz zawartości kwasu i nadtlenku pokazano w tabeli 1.

Tabela 1

Charakterystyki różnych frakcji otrzymane przez wytrącanie w kolejnych rozpuszczalnikach p-car°X

Frakcja	1	2	3	4
Masa w %	37	17	14	32
Zmiareczkowane kwasy (10^* mola/g)	4,3 ± 0,3	4,3 ± 0,2	6,1 ± 0,3	6,2 ± 0,1
Nadtlenki (jodometrycznie, 10-’mola/g)	9,5 ±1,0	9,9 ± 0,8	8,2 ± 0,3	5,9 ± 0,4
Nadtlenki (utlenienie Fe++, D^mola/g)	8,3 ± 0,2	8,9 ± 0,2	8,8 ± 0,9	5,5 ± 01
Mikroanaiiza: C	58,5	58,7	61,2	65,3
H	7	7,0	7,6	8,7
O	34,3	34,3	31,2	26,0

Frakcje otrzymuje się w następujący sposób: surową mieszaninę (1,2 g) rozpuszcza się w 5 ml tetrahydrofuranu (THF) (5 ml) i dodaje powoli heksan (15 ml) intensywnie mieszając roztwór. Próbkę odwirowuje się (3000 obrotów/minutę, 3 minuty) i oddziela oleistą pozostałość, a następnie mieszaninę przemywa się mieszaniną THF i heksanu (5 : 15) i suszy pod próżniąjako frakcję 1. Pozostały roztwór łączy się z roztworem po przemywaniu, odparowuje i pozostałość rozpuszcza w THF (3 ml). Następnie roztwór strąca się heksanem (15 ml), odwirowuje i przemywa (mieszanina THF z heksanem, 3 : 15) otrzymując frakcję 2. Tak jak poprzednio, pozostały roztwór łączy się z popłuczynami, odparowuje i rozpuszcza w benzenie (3 ml). Strącanie heksanem (15 ml), poprzedzające przemywanie (benzenem z heksanem 3 : 5) daje frakcję 3. Pozostały nadsącz oznacza się jako frakcję 4.

Na podstawie ciężaru poszczególnych frakcji i śladów GPL ocenia się, że około 90% mieszaniny β-car⁰' stanowi substancja polimerowa. Procentowa zawartość tlenu w pierwszych trzech frakcjach (stanowiących większość produktu) wykazuje 6-8 cząsteczkowych ekwiwalentów tlenu zabranych przez β-karoten i 30 do 35% wzrost masy towarzyszący powstaniu produktów. Dodanie 6-8 cząsteczek tlenu do β-karotenu, zawierającego początkowo 11 sprzężonych podwójnych wiązań, powoduje utratę większości układu wiązań, przez rozerwanie z wytworzeniem nowych wiązań węgla z tlenem. Tak więc, widmo absorpcyjne w ultrafiolecie-świetle widzialnym substancji polimerowych pokazuje maksymalną absorpcje w znacznie krótszych długościach fal (około 240 nm do maksimum 280 nm) w porównaniu z absorpcją β-karotenu (odpowiednio, fig. 5a i 5b).

Substancja polimerowa, która rozpuszcza się w THF, metanolu, acetonie i acetonitrylu, jest permanentnie stabilna w temperaturze niższej niż pokojowa, ale częściowo rozkłada się przy ogrzaniu tworząc lotne produkty, co stwierdzono metodą chromatografii gazowej.

184 296

Analiza GPC frakcji 1-4 utlenionej mieszaniny (fig. 6a - 6d) w porównaniu z fig. 2 wykazuje, że frakcje 1 i 2 zawierają stosunkowo dużą ilość związków o wyższych MW, podczas gdy frakcje 3 i 4, a w szczególności frakcja 4 zawiera znaczne ilości związków o niższych Mw.

Utlenianie β-karotenu w obecności antyoksydantów

W opisanych powyżej warunkach utlenia się β-karoten (20 mM) w obecności 0,01 - 0,10 równoważników molowych (w odniesieniu do β-karotenu) alfa-tokoferolu lub 2,6-di-t-butylo-4-metoksyfenolu. Reakcja przebiega bardzo powoli (1 molowy ekwiwalent tlenu zostaje zużyty w ciągu około 6 dni). Wykres zużycia tlenu jest liniowy. Nachylenie prostej jest niezależne od typu inhibitora i jego stę^eniia Zużycie β-karotenu nie przekracza 10% w ciągu 6 dni.

Utlenianie β-karotenu w obecności inicjatora wolnych rodników

2,2'-azo-bis(2-metylopropionitryl) przyspieszał powstawanie produktów reakcji.

Utlenianie β-karotenu w postaci stałej

Podobną substancję polimeryczną, stanowiącą niemal jedyny produkt, co potwierdziły analizy FUR i GPC uzyskano utleniając czysty, krystaliczny karoten w postaci stałej. Reakcję przeprowadzono pozostawiając krystaliczny β-karoten w otwartym szklanym naczyniu nie chronionym przed dostępem dziennego światła przez okres 8 tygodni. Reakcja przebiegała znacznie wolniej niż utlenianie w roztworze (40 dni zamiast 3 dni. Widmo FTIR polimeru otrzymanego po utlenianiu stałego β-karotenu (fig. 8) i widmo FTIR polimeru frakcji 1 otrzymanego po utlenianiu roztworu (fig. 7) są podobne po względem rozmieszczenia i względnego natężenia pików absorpcyjnych. Takie same wyniki otrzymano również z analizy GPC (fig. 9 i 6a). Ponadto, substancje otrzymane w wyniku utleniania stałego β-karotenu i częściowego ekstensywnego utleniania w roztworze mają taką samą aktywność biologiczną w hamowaniu proliferacji komórek nowotworowych i komórek transformowanych w hodowli.

Przykład 2

Utlenianie kantaksantyny

Kantaksantynę utleniono stosując takie same warunki jak przy utlenianiu β-karotenu. Tak więc, 20 mM roztwór kantaksantyny (Fluka) w benzenie przedmuchiwanym tlenem inkubowano w łaźni na wstrząsarce, w ciemności, w temperaturze 30°C w obecności czystego tlenu pod ciśnieniem atmosferycznym. Po upływie 190 godzin, gdy około 7 molowych ekwiwalentów tlenu zostało zużytych, roztwór odparowano otrzymując żółtą pozostałość o konsystencji żywicy. Tak więc chociaż reakcja była wolniejsza, to mimo tego nastąpiła ekstensywna reakcja z tlenem. Analiza GPC utlenionej mieszaniny (dane nie pokazane) wykazała duże podobieństwo do produktów ekstensywnego utleniania β-karotenu, a produkty reakcji stanowiły w większości substancje polimeryczne.

Przykład 3

Utlenianie kwasu retinowego

Reakcja utleniania kwasu retinowego tlenem w warunkach stosowanych przy utlenianiu β-karotenu i kantaksantyny przebiegała bardzo powoli. Reakcję można przyśpieszyć przez przeprowadzenie jej przy podwyższonym ciśnieniu.

Kwas retinowy (Sigma) rozpuszczony w benzenie (0,5 ml, 20 mM) w szklanej probówce wkłada się do wysokociśnieniowej aparatury INCONEl 600. W aparaturze stosowano ciśnienie tlenu 2069 kPa (300 psi) i temperaturę 42°C przez 3 dni. Analiza HPLC mieszaniny reakcyjnej wykazała, że reakcja nie przebiegła do końca. Reakcję kontynuowano przez następne 2 dni zachowując te same warunki za wyjątkiem temperatury, którą podniesiono do 50°C, przez całkowity czas reakcji 5 dni. Pozostała jedynie nieznaczna część kwasu retinowego (poniżej 1%o całkowitej ilości produktu). Analiza GPC (nie pokazano danych) wykazała obecność produktów o wyższym MW, które jednak stanowiły dużo mniejszą frakcję całkowitego produktu niż w przypadku utlenienia β-karotenu i kantaksantyny, a ponadto brak było wykrywalnych związków o MW większym niż ciężar odcięcia kolumny (około 1400 Da).

Badania biologiczne

Przeprowadzono badania biologiczne in vitro badając aktywność cytostatyczną, indukcję różnicowania i aktywność wobec wirusów powodujących nowotwory w różnych liniach

184 296 komórkowych w hodowli. Większość wyników uzyskano z użyciem β-car”¹, ale również badano ekstensywnie utlenioną kantaksantynę i kwas retinowy.

Badania in vivo wykonano dla β-car⁰* i ekstensywnie utlenionej kantaksantyny oznaczając:

- toksyczność u myszy;

- zahamowanie wzrostu nowotworów u myszy, w tym badania histopatologiczne zmian nowotworu (nowotwory przeszczepione, linia komórkowa chemiczne indukowanego raka sutka szczura).

Badania in vitro

W celu określenia własności biologicznych mieszaniny według wynalazku przebadano in vitro β-car”¹ pod kątem jej własności cytostatycznych i indukcji różnicowania Kwas retinowy i/lub β-karoten stosowano jako kontrolę na niektórych liniach komórkowych, w celu rozróżnienia ich działań od utlenionego β-karotenu. Badano również wpływ utlenionego β-karotenu na cykl komórkowy. Wszystkie stosowane stężenia przy których oznaczono aktywność β-car”' wyrażono w mikromolowych ekwiwalentach β-karotenu.

Modele komórek: Linie komórkowe i ich charakterystyka

Stosowano różne linie komórkowe w celu zbadania działania β-car” na proliferację i/lub różnicowanie. Linie komórek stanowiły ustalone transformowane linie komórkowe lub wyizolowane z guzów pacjentów cierpiących na nowotwory. Oprócz tego, zastosowano dwie mysie linie komórkowe, których program różnicowania komórkowego jest dobrze określony odpowiednimi markerami białkowymi. Dla tych dwóch linii scharakteryzowano odpowiadające im klony transfekowane ludzkim wirusem brodawczaka typu 16 (HPV16) - wirusa związanego z rakiem szyjki macicy i stwierdzono że wykazują transformację. Transformowane fenotypy L6-HPV16 (pochodne komórek L6) i BA'LB/c/M'K-HPV16 (pochodne komórek BALB/c/MK) scharakteryzowano przez ich niezależność od czynników hormonalnych i zdolność do tworzenia komórek na miękkim agarze.

Wzorce ekspresji białek wirusowych w biopsjach pobranych od pacjentów z ciężkimi nowotworami ustalono we własnym laboratorium stosując reakcję odwrotnej transkryptazy i reakcję łańcuchową polimerazy (RT-PCR). W próbkach biopsji wzorce ekspresji są takie podobne do transformowanego klonu L6, co wskazuje na istotność i wierność modelu L6 dla celów badawczych.

Linia komórkowa BALB/c/MK jest interesująca z uwagi na różnicowanie w wysokim stężeniu jonów Ca⁺⁺. Gdy komórki eksponuje się na niskie stężenie wapnia, powracają one do swego stanu sprzed różnicowania w ciągu poniżej 72 godzin.

Właściwości wywołujące różnicowanie β-car”' badano dalej na dwóch dodatkowych modelach, w których zastosowano embrionalne komórki macierzyste myszy (tj. quasi normalne linie komórek) i szereg zwierzęcych i ludzkich linii komórkowych nerwiaka (tj. komórki nowotworowe).

Embrionalne komórki macierzyste (ES) są totipotencjalne, tj. mogą zapoczątkować dowolną linię rozwojową komórek organizmu. W odpowiednich warunkach in vitro różnicowały się one spontanicznie w różne mieszane typy. Traktowanie substancjami znanymi jako promotory różnicowania ukierunkowuje komórki ES w kierunku pojedynczego fenotypu. Przykładowo, kwas retinowy stosowany w warunkach określonych przez National Research Council powoduje różnicowanie komórek Es w hodowli w neurony (nie publikowana informacja).

Mysie modele komórkowe la. szczurza pierwotna komórka mięśniowa L6 (L6).

lb. komórki L6 transfekowane ludzkim wirusem brodawczaka typu 16 (L6-HPY16).

2ća mysie keratynocyty BALB/c/MK (BALB/c/MK).

2b. mysie komórki BALB/c/MK transfekowane ludzkim wirusem brodawczaka typu 16 (BALB/c/MK-HPV16).

3a. Mat B-WT: szczurzy gruczolakorak sutka.

3b. Mat B-MLNr, szczurzy gruczolakorak sutka oporny na melfalan.

3c. Mat B-DOXr, szczurzy gruczolakorak sutka oporny na adriamycynę.

4. B16, czerniak mysi.

184 296

5. DA-3, rak sutka myszy indukowany DMBA.

6. FDCP-1, mysia białaczka szpikowa.

Dwie linie komórkowe Mat MLNr i Mat B-DOXr wykazują oporność wielolekową, a Mat B-WT jest typem dzikim. Komórki są słabo zróżnicowane i nie wyrażają receptorów estrogenowych lub progesteronowych.

Ludzkie modele komórkowe

7a. MCF7-WT, ludzki rak sutka.

7b. MCF7-ADRr, ludzki rak sutka odporny na adriamycynę.

Komórki były umiarkowanie zróżnicowane i posiadały receptory estrogenowe i progesteronowe.

8a. Uro 9, ludzki rak cewki moczowej; dobrze zróżnicowany.

8b. Uro l0, ludzki rak cewki moczowej; słabo zróżnicowany.

9. L14, ludzki gruczolakorak płuc; umiarkowanie zróżnicowany (wyizolowany w Lady Davis Institute, Montreal Jewish Hospital z nowotworu pacjenta).

10. NB4, ludzka ostra białaczka promielocyto wa.

Działanie cytostatyczne

W tabeli 2 podano wyniki otrzymane w testach z MTT żywotności/toksyczności firmy Promega (metaboliczny test oparty na aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej). Żywotność badano w rosnących stężeniach β-car⁰* (wielokrotność 2,5). Dawki, które zmniejszały wzrost populacj i komórek o połowę w porównaniu z nie traktowaną kontrolą są przedstawione jako wartości IC5.

Tabela 2

Cytostatyczne działania ekstensywnie utlenionego β-car⁰*

Linia komórkowa	Pochodzenie	1C5„(pM)
MatB-WT	Szczurzy gruczolakorak sutka	25,5
Mat-MLNr	Szczurzy gruczolakorak sutka	21,0
B16	Mysi czerniak	12,4
DA-3	Mysi rak sutka	15,6
FDCP-1	Mysia białaczka szpikowa	7,5
L6	Szczurza embrionalna pierwotna komórka mięśniowa	51,9
L6-HPV16	L6 transfekowana ludzkim wirusem brodawczaka	28,2
MCF7-WT	Ludzki rak piersi	11,3
MCF7-ADRr	Ludzki rak piersi odporny na adriamycynę	11,3
Uro-9	Ludzki rak pęcherza	17,7
Uro-10	Ludzki rak pęcherza	19,8
L14	Ludzki gruczolakorak płuc	18,5
NB4	Ludzka białaczka promielocytowa	4,8

Wykładniczy wzrost komórek w kulturach o niskim zagęszczeniu (10⁴ do 10⁵ komórek^zl-5 ml) poddano działaniu pojedynczej dawki β-car⁰* o różnych stężeniach przez 72 godziny lub dłużej. Wzrost komórek oznaczono w teście MTT. Wartości 1C₅₀ (wyrażone w ekwiwalentach β-karotenu) zostały oznaczone graficznie z krzywych przeżycia (pokazującą wzrost komórki w zależności od stężenia β-car⁰*. Każda wartość na tabeli 2 jest średnią wyników przynajmniej dwóch niezależnych badań. Badano różne partie ekstensywnie utlenionego β-karotenu i uzyskiwano zgodne wyniki. Warto zauważyć wrażliwość komórek białaczki NB4 i brak aktywności wobec kontrolnych komórek L6.

184 296

Kwas retinowy i β-karoten (każdy w stężeniu 3 μΜ), które użyto do kontroli pewnych linii komórek nie wywierały działania na krzywą wzrostu komórek, za wyjątkiem komórek NB4, które były podatne na kwas retinowy.

Jako kontrolę dla testu MTT, IC₅₍, dla linii komórkowych L₆ i L₆-HPV16 zostały potwierdzone przez liczenie komórek licznikiem Coulter jak podano w tabeli 3.

Tabela 3

Porównanie działania cytostatycznego (IC50 [pM]) β-car⁰¹ oznaczonego w teście MTT oraz policzenie komórek licznikiem Coulter.

Linia komórkowa	MTT	Licznik Coulter'a
L6	51,9	39,0
L6-HPB16	28,2	24,6

Frakcje otrzymane z P-car°^x poprzez kolejne wytrącanie z roztworów badano na linii komórkowej MCV7-WT; stwierdzono, że dwie frakcje 1 i 3 miały znacznie większą aktywność w porównaniu z rozdzieloną mieszaniną, co przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4

Cytostatyczne działanie frakcji na linię komórek MC7-WT (pM)

Frakcja	1	2	3	4	P-car™
MCF7-WT, IC50	11,8	17,3	23,1	26,2	22,8

Komórki traktowano w sposób opisany w tabeli 2

Jakkolwiek, normalne komórki były hamowane umiarkowanie, efekt ten stopniowo zanikał po dłuższym okresie czasu wykazując, że β-car⁰¹ nie oddziaływał w sposób drastyczny na normalne komórki. Powinno to potencjalnie umożliwić powtarzanie leczenia pacjentów z nowotworami bez ograniczeń spowodowanych powstaniem ubocznych efektów.

Wpływ na różnicowanie komórkowe

Morfologiczne obserwacje modeli L6 pierwotnej komórki mięśniowej

Kultury szczurzych mioblastów L6 są zdolne do różnicowania in vitro. National Research Council scharakteryzował 5 etapów różnicowania komórek, z użyciem morfometrii, imunofluorescencji in situ i cytometrii przepływowej.

Zastosowano znane znaczniki (białka charakterystyczne) różnicowania myocytu: fibronekytynę, a-aktynę, N-CAM, wimentynę i ekspresję receptorów acetylocholinowych. Oprócz tego wykazano, że receptory acetylocholinowe, swoiste dla stanu sprzed fuzji, nie ulegały ekspresji w komórkach L6-HPV16. Zidentyfikowano pięć stadiów, których fenotypy opisano poniżej wraz z rosnącym zróżnicowaniem:

1. Komórki przypominające embrionalny fibroblast.

2. Komórki o morfologii dwubiegunowej.

3. Komórki zorientowane.

4. Komórki w stanie przed fuzją

5. Komórki wykazujące tworzenie syncytium z licznymi jądrami i włókienkami mięśniowymi.

Stwierdzono, że transfekowane komórki HPV16 ulegają transformacji i zatrzymaniu w fazie przed fuzją Oznacza to, że komórki HPV16 są zatrzymane w stadium 4. Jednakże, po traktowaniu komórek β-car™ zaobserwowano lepszą, orientację komórek i zainicjowanie zespólni komórkowych, co odpowiada częściowemu wejściu w 5 stadium różnicowania.

Hodowla w pożywkach różniących się zawartością wapnia wykazała, że 3-car°^x ma większe działanie na komórki kontrolne i transfekowane, gdy pożywka zawiera mało wapnia (0,05 nM). Dodatkowo zaobserwowano pewien antagonizm pomiędzy wapniem i β-car^ox w ekspresji znaczników różnicowania opisanych wyżej. Spowodowało to przeprowadzenie kilku doświadczeń wyjaśniających nad działaniem wapnia na komórki traktowane e-car°^x. Zastosowano model mioblastu i keratynocytu.

Pokrótce, w miocytach L6 badano napływ egzogennego wapnia do komórki przez nieswoisty kanał kationowy (jak opisano wcześniej i zgodnie z literaturą). Wewnątrz komórek

184 296 poziom wapnia kontroluje się przez jego uwalnianie z wewnętrznych zasobów. Oprócz tego, receptor acetylocholinowy wyrażany w stadium poprzedzającym fuzję programu różnicowania L6 moduluje sarkoplazmatyczne kanały wapniowe.

W keratynocytach nie zbadano do tej pory natury kanałów regulujących napływ wapnia i uwalnianie z zasobów.

Badania wykonano dwiema metodami: elektrofzjologiczmą i obrazowania z użyciem Fura2. Wstępne wyniki wykazały że β-car™ działajako bloker kanałów wapnia lub chelator wapnia.

Zostało to potwierdzone przez jego zdolność do przezwyciężania oporności wielolekowej opisanych linii komórkowych. Wydaje się to jednak mniej skuteczne w porównaniu z konwencjonalnymi blokerami kanałów jak na przykład verapamil.

Wzorzec znaczników zmian w modelach BALB/c/MK

W keratynocytach BALB/c/MK, cytokeratyny 1, 5 i 10, opisane w katalogu Poll, zidentyfikowano metodą Western immunoblot. Wiadomo, że cytokeratyny 1 i 10 związane są z wyższym poziomem różnicowania, podczas gdy cytokeratyna 5 jest związana z komórkami słabiej zróżnicowanymi, wciąż dzielącymi się. Analiza metodą cytometrii przepływowej wykazała, że cytokeratyny są ogólnie słabiej wyrażane w nie traktowanych transfekowanych komórkach HPV16 w porównaniu z dobranymi nie traktowanymi komórkami kontrolnymi.

Cytokeratyna 5

Ekspozycja na 1,8 mM wapń, co wywołuje nieodwracalne różnicowanie w ciągu 3 dni, spowodowała wzrost ekspresji cytokeratyny 5 w komórkach kontrolnych i transformowanych. Ekspozycja na β-car⁰* spowodowała podobny wynik, za wyjątkiem tego, że 6 dni działania wystarczyło do indukcji ekspresji w komórkach kontrolnych, podczas gdy 9 dni było konieczne do transformowania komórek.

Ekspozycja na oba induktory równocześnie, znosiła wzrost ekspresji, wykazując antagonistyczne działanie obu związków.

Cytokeratyny 1 i 10

Zaobserwowano uderzający wzrost ekspresji obu cytokeratyn w komórkach kontrolnych po ekspozycji zwiększony poziom wapnia (od 0,05 do 1,8 mM), podczas gdy komórki transformowane nie wykazywały żadnej reakcji.

W przeciwieństwie, β-car⁰* indukował ekspresję obu znaczników w obu liniach. Podobnie jak w linii L6, konieczny był dłuższy czas działania dla spowodowania reakcji BALB-HPV16, w porównaniu z kontrolą

Ponownie, zaobserwowano antagonizm z wapniem. Wyniki te są istotne, ponieważ dowodzą, że przynajmniej na modelu keratynocytów, β-car⁰* zwiększa różnicowanie transformowanych komórek HPV16, podczas gdy klasyczny induktor różnicowania, wapń, jest nieskuteczny.

Zaobserwowano również indukcję różnicowania przez β-caro* (ocenioną kryteriami morfologicznymi) w komórkach białaczki promielocytowej NB4.

Komórki ES i nerwiaka niedojrzałego

Badania wykonano w opracowanych przez National Research Council warunkach dla indukcji różnicowania kwasem retinowym komórek ES w neurony, β-caro* _ró_wmeż ułatwia różnicowanie komórek ES w komórki neuronalne jak pokazano na fig. 10 i potwierdzono specyficznymi znacznikami, stosując techniki immunohistochemiczne. Sąjednakże dwie wyraźne różnice pomiędzy działaniem kwasu retinowego i β-caro* _M komórki Es.

1. Kwas retinowy ułatwia różnicowanie komórek ES w 80% w fenotyp bipolarny przy stosowanych dawkach w granicach 0,1 do 1 μ.M (fig. 10b), podczas gdy β-car™* w optymalnym stężeniu (7,5 μ-M ekwiwalentów β-karotenu) wywołuje końcowe różnicowanie u około 90% w fenotypy silnie rozgałęzionych komórek przypominających komórki Purkinje'go (fig. 10d) ; mechanizm silnego rozgałęzienia komórek nie jest jeszcze wyjaśniony.

2. Indukcja różnicowania końcowego jest kinetycznie różna dla obu induktorów; p-car°* jest znacznie bardziej aktywny niż kwas retinowy (odpowiednio, 15 godzin wobec 3 dni, w stosowanych warunkach doświadczalnych).

W komórkach nerwiaka linii Neuro2A, IMR32, SK-N-SH i SK-N-MC, P-car°* powoduje podobnie uderzający wysoki stopień różnicowania, podczas gdy kwas retinowy wywołuje tylko częściowe różnicowanie.

184 296

Wyniki badań modeli ES i nerwiaka wskazują, że β-car”¹ jest silnym promotorem różnicowania, a jego mechanizm działania różni się od działania kwasu retinowego.

Aktywność wobec ekspresji wirusowych genów onkogennych

Obserwację, że β-car”* może wykazywać aktywność wobec ekspresji onkogennych genów wirusowych oparła się na trzech niezależnych doświadczeniach.

Cytopatia· Objawy infekcji wirusowej, widoczne wyraźnie jako intensywna wakuolizacja wokół jąder L6-HPV16 i BALB/c/MK-HPV16, zmniejszały się lub znikły w wyniku działania β-car”*

Przekaźnikowy RNA izolowano z transfekowanych komórek, które poddano lub nie działaniu β-car⁰*. Kinetykę wzorca ekspresji produktów genów wirusa poddano analizie RTPCR. Początkowe wyniki wykazały, że wzorzec ekspresji białek wirusowych i onkogenu myc (onkogenu związanego z proliferacją) był różny dla komórek poddanych działaniu β-car⁰* w porównaniu z komórkami na które działano kwasem retinowym lub β-karotenem.

Przeciwciała monoklonalne wywołane przeciwko wspólnemu fragmentowi onkogennych białek E6 i E7 HPV16 zastosowano do oznaczenia ekspresji obu białek z użyciem elektroforezy na żelu poliakryloamidowym, analizy Western błot i cytometrii przepływowej. Zaobserwowano spadek ekspresji białek E6 i E7 po 9 i 12 dniach ekspozycji na β-car⁰* komórek transfekowanych wirusem.

Cytostatyczne działanie niecałkowicie utlenionego β-karotenu, mieszaniny utleniającej β-karoten hamowanej przeciwutleniaczem i ekstensywnie utlenionej kantaksantyny i kwasu retinowego

W tabeli 5 pokazano względne działanie na linię komórkową MC7-WT niecałkowicie utlenionego β-karotenu zawierającego zarówno polimerowe produkty utleniania i nie przereagowany β-karoten, produkty utleniania β-karotenu hamowanego aa-tokoferole‘m (5 mol %), całkowicie utlenionej kantaksantyny i kwasu retinowego (syntezy opisano powyżej). Każda z próbek zawierała przynajmniej nieco substancji utlenionych o wyższym MW, zaś wszystkie próbki wykazywały znaczną aktywność cytostatyczną.

Tabela 5

Cytostatyczna aktywność wobec linii komórkowej MC-7WT częściowo utlenionego β-karotenu, produktów otrzymanych w hamowanym utlenianiu β-karotenu oraz ekstensywnie utlenionej kantaksantyny i kwasu retinowego

Próbka	IC50 (uM)
Około 25% utlenionego β-karotenu	22 '
Około 50% utlenionego β-karotenu	21
100% utleniony β-karoten	17
α-tokoferol - przedłużone utlenianie β-karotenu	11
Utleniona kantaksantyna	9
Utleniony kwas retinowy	7

Komórki badano w sposób opisany przy tabeli 2

Badanie in vivo toksyczności i aktywności przeciwnowotworowej β-car”*

Ocena toksyczności: β-car”* i ekstensywnie utleniona kantaksantyna

Toksyczność oceniano monitorując ciężar ciała samic myszy BALB/c oraz wykonując ogólne badania zwierząt. Dawki 5 mg/kg i 10 mg/kg podawano dootrzewnowo w zastrzykach w dniu 1, 3 i 5 (tabela 6). Grupy kontrolne dostawały tylko rozpuszczalnik (20% wodny roztwór etanolu). Podobne badanie wykonano z dawkami 50 i 100 mg/kg podawanymi w zastrzykach w dniach 13, 5, 8 i 11. Nie zaobserwowano widocznych toksycznych objawów (danych nie podano).

β-car⁰* jest nietoksyczny dla zdrowych myszy nawet przy zastosowaniu 6 dawek po 100 mg/kg. Trzeba podkreślić, że przy powtarzających się dawkach (9 krotnie) podawanych w wysokości 150 mg/kg (myszom z nowotworem) nie zauważono szkodliwego działania.

Podobnie nie stwierdzono szkodliwego działania ekstensywnie utlenionej kantaksantyny, którą stosowano w identycznych dawkach i warunkach badań (danych nie podano).

184 296

Tabel a 6

Działanie ekstensywnie utlenionego β-karotenu na wagę myszy Średni ciężar ciała [g]

Dzień	Kontrola	5 mg/kg	10 mg/kg
1	14,0	14,4	14,0
2	14,0	14,5	14,0
5	14,4	14,9	14,5
7	14,8	15,3	14,6
9	15,2	15,8	15,2
11	15,7	16,3	15,7
13	16,1	16,7	16,2
15	16,6	17,3	16,9
17	17,1	17,7	17,4
19	17,6	18,3	17,9
21	18,1	18,7	18,4
23	18,7	19,4	19,1
25	19,2	20,0	19,8

Aktywność przeciwnowotworowa: układ modelu nowotworu

Stosowano model D1-DMBA-3 (DA3) mysiego gruczolakoraka sutka. Lina komórek wywodziła się od BALB/c myszy niosących imunogenny nie-przerzutujący mysi gruczolakorak sutka indukowany 7,12-dwumetylobenzenoantracenem (DMBA). Jeden milion komórek DA-3 wstrzyknięto podskórnie samicy myszy BALB/c. Gdy nowotwór był j'uż wymacywany (0,5 cm średnicy po 1-2 tygodniach), zwierzęta losowo podzielono na grupy i wstrzyknięto im dootrzewnowe β-car°^x w dawkach od 0,5 mg/kg do 150 mg/kg. Co 2-3 dni mierzono wzrost nowotworu. Ocenę badań dokonano mierząc objętość nowotworu w funkcji czasu, jak zostało opisane przez Alaoui-Jamali i współpracowników w J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993, 264 (3), 1299. Grupa kontrolna otrzymywała tylko rozpuszczalnik (20% wodny roztwór etanolu).

Na fig. 11 i 12 pokazano działanie β-caro na wzrost nowotworu. Figura 11 odpowiada dawce 10 mg/kg wstrzykiwanej w dniach 0, 2, 4, 7, 11, 14, 16 i 18. Figura 12 odpowiada dawce 150 mg/kg wstrzykiwanej w tych samych warunkach.

Do badań histologicznych wybrano losowo kilka zwierząt u których wykonano wycięcia nowotworu, który zakonserwowano w 10% roztworze formaliny w soli fizjologicznej. Wykonano skrawki histologiczne z zakonserwowanych w formalinie i zatopionych w parafinie nowotworów i zabarwiono je hematoksyliną-eozyną.

Wyniki pokazały, że β-caro ma działanie opóźniające wzrost nowotworów pochodzących z komórek nowotworowych, które wszczepiono myszom. Na fig. 11 i 12 pokazano, że ekstensywny β-caro zastosowany w powtarzających się niskich dawkach wynoszących 10 mg/kg ma zdolność efektywnego zatrzymania wzrostu nowotworu i stabilizowania go przez długi okres czasu.

Na fig. 13a i 13b pokazano porównanie nowotworów u zabitych zwierząt, którym podano inne dawki β-caro¹ o_raz kontrole (zwierzęta nie leczone). U niektórych zwierząt występowały krwotoki dookoła nowotworu (fig 13b) . W tych przypadkach rzeczywisty rozmiar nowotworu jest mniejszy niż zmierzony cyrklem (rozbieżność jest spowodowana krwawiącym obrzmieniem zwiększającym rzeczywisty rozmiar nowotworu).

Histopatologiczne badania nowotworów wyciętych z badanych zwierząt wykazały że:

- β-car⁰·' indukuje zauważalne histologiczne zmiany polegające na obumieraniu tkanki w nowotworach DA-3;

184 296

- tkanki nowotworowe wykazują wiele cech różnicowania komórek/tkanek;

- miejsca krwawienia występu ją we wszystkich leczonych nowotworach i są połączone z siŁnąpigmenttacjąi martwicą;

- pigmenty są nieżelazne (barwienie na żelazo z użyciem błękitu pruskiego dało negatywne wyniki), ale są prawdopodobnie hemosyderyną spowodowanakrwawieniem.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że pigmentem jest melanina. Właściwości zabarwienia wymagają potwierdzenia.

Nie stwierdzono obecności podobnych histopatologicznych zmian w normalnych tkankach nienowotworowych.

Wielokrotne dootrzewnowe zastrzyki β-cajO* były dobrze tolerowane nawet przy dawce do 150 mg/kg, wskaźnik terapeutyczny β-car⁰* wydaje się być bardzo wysoki, co jest ważną zaletą w porównaniu z tradycyjnymi lekami przeciwnowotworowymi.

Podsumowują: pierwszą fazę badań, β-karoten i kantaksantyna, które reprezentują karotenoidy oraz w mniejszym stopniu kwas retinowy reprezentujący retinoidy, można poddać ekstensywnemu utlenianiu celem otrzymania substancji takich jak β-car⁰* stanowiący model, które wykazują właściwości czyniące je przydatnymi jako nietoksyczne związki aktywne przeciwko nie kontrolowanej proliferacji komórek, nowotworów i wirusów onkogennych oraz użyteczne jako promotory różnicowania komórkowego. Z analizy chemicznej β-cajO* wynika, że nie zawiera on jakiejkolwiek odmiany witaminy A lub zawiera jedynie małe ilości. Ponadto, aktywność biologiczna utlenionej kantaksantyny i kwasu retinowego, które nie tworzą witaminy A wskazuje na obecność aktywnych substancji, które różnią się od witaminy A. Chociaż własności cytostatyczne i ułatwianie różnicowania komórek powodowane przez βcaro* przypomina działanie witaminy A, to β-caro* działa znacznie silniej w szerokim zakresie. β-caro* jest ponadto nietoksyczny co jest bardzo ważną różnicą w stosunku do witaminy A.

Druga faza badań

Chemia

Utlenianie likopenu

Likopen (fig. 14) rozpuszcza się w benzenie i ekstensywnie utlenia w atmosferze tlenu w taki sam sposób jak β -karoten w pierwszym etapie badań. Surową mieszaninę produktów badano pod względem jej aktywności cytostatycznych w sposób analogiczny do β-caro*.

Mieszaninę rozfrakcjonowano na trzy frakcje. Te trzy schematy frakcjonowania, na 3-4 poziomy przedstawiono poniżej:

Poziom	Faza 1	Faza 2	Faza 3
0	β-car”	β-car”	β-car”
	/ \	/ \	/ \
1	SGl IGI	SGl IGI	SGl IGI
	/ \	/ \	/ \
2	SG2 IG2	LSG MSG	LSG MSG
	/	/ \	/ \
3	SG3	SLSG ILSG	FI F2

/ I \

Fl.l FI.2 FI.3

184 296

Zsyntetyzowano β-car” stosując sposób podobny do sposobu zastosowanego w pierwszym etapie badań. Pokrótce, β-karoten (30 g) rozpuszczono w benzenie (3 1; 0,02 Μ), a następnie całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 dni w atmosferze gazowego tlenu. Analiza chromatograficzna GPC potwierdziła obecność trzech głównych związków to jest frakcji o niskich <300 Da, średnich: 300 - 1000 Da i wysokich > 1000 Da MW (fig. 15).

Poziom 1, separacja faz 1-3: Zatęża się roztwór (3 l) do około 200 ml, a następnie rozcieńcza go w około 2 l heksanem. Wytrąca się IGI stanowiąc około 65% całej mieszaniny, zawierającej większość związków o wysokich MW (>100). Supematant zawierający rozpuszczalną frakcję tj. frakcję o niskich (<300) i średnich (300-1000) MW i praktycznie nie zawierający żadnej frakcji o wysokim MW (fig. 16) odparowuje się i suszy celem otrzymania pozostałości SG1.

Poziom 2, separacja fazy 1: Miesza się frakcję SG1 (1,2 g) w heksanie (120 ml) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Nierozpuszczalna frakcja IG2, którą odfiltrowuje się, zawiera w większości frakcje o średnim MW i pewne ilości frakcji o niskim Mw (fig. 15). Supematant zawierający rozpuszczalną frakcję odparowuje się, otrzymując pozostałość SG2, która w większości zawiera frakcje o niskim Mw i pewną ilość frakcji o średnim MW (fig. 16).

Poziom 2, separacja fazy 2 i 3: Frakcję SG1 (10 g) rozpuszcza się w czterohydrofuranie (10 ml) i rozdziela na frakcje o niskim i średnim Mw otrzymując 40% LSG i 55% MSG poprzez sukcesywne wkraplanie otrzymanego roztworu dawkami po 250 μΐ do kolumny chromatograficznej GPC (19x300 mm, Waters, wielkość cząstek 15 μη, rozmiar porów 10nm), a następnie frakcje eluuje się tetrahydrofuranem (4 ml/minutę). Uzyskuje się czysty rozdział dwóch frakcji MW co pokazano na fig. 17.

Poziom, separacja fazy 1: Do kolumny wypełnionej żelem krzemionkowym dodaje się frakcję SG2 (688 mg) i eluuje mieszaniną heksanu z octanem etylu (95:5). Łączy się eluowane frakcje i odparowuje rozpuszczalnik otrzymując pozostałość SG3.

Poziom 3, separacja fazy 2: Frakcję LSG (600 mg) miesza się przez 1 min. z lodowatym pentanem (1 ml), następnie zlewa się większość supematantu. Czynność tę powtarza się czterokrotnie. Nierozpuszczalną frakcję, ILSG, odwirowuje się, a rozpuszczalnik odparowuje z połączonych roztworów zawierających rozpuszczalny składnik, otrzymując frakcję SLSG.

Poziom 3, separacja fazy 3: Frakcję LSG (4,4 g) rozpuszcza się w acetonitrylu (10 ml) i rozdziela na dwie frakcje przez wstrzykiwanie w sukcesywnych dawkach po 450 pl (w sumie 9 ml) do preparatywnej aparatury HPLC zaopatrzonej w trzy połączone w szeregu Waters NovaPak HR C18 (odwrócona faza, rozmiar cząstek 6 pm, rozmiar porów 6 nm) wkładów PrepPak (40x100 mm), które następnie eluuje się acetonitrylem (40 ml/minutę) otrzymując frakcję f1 (80%) i F2 (20%) z eluatu połączonego od 4,8 do 6,4 minut i frakcje F2 (20%) z eluatu połączonego od 6,4 do 12 minut eluowania. Kropkowana linia w środku chromatogramu wysokowydajnej analizy ciekłej chromatografii (HPLC) pokazanego na fig. 18 wskazuje jak LSG została podzielona na dwie nowe frakcje F1 i F2 (czasy elucji związków na fig. 18 i odpowiadający im czas rozdziału różnią się od przygotowanych HPLC z powodu różnych warunków koniecznych do otrzymania optymalnej separacji w warunkach, odpowiednio, analitycznych i preparacyjnych).

Poziom 4, separacja fazy 3: frakcję F1 (700 mg) rozpuszcza się w acetylonitrylu (1,5 ml), a następnie rozdziela na 3 frakcje F1.1 (11%), f1.2 (13%) i F1.3 (5%) dodając roztwór w sukcesywnych dawkach (250 μ, w sumie 1,25 ml) do aparatury HPLC wyposażonej w kolumny opisane powyżej, które następnie eluuje się mieszaniną wody, acetonitrylu i metanolu (50:45:5) z szybkością. 40 ml/minutę. Frakcje otrzymuje się zbierając eluat po 2,0-6,6 minut, 6,6-12 minut i 12-23 minut. Kreskowana pionowa linia na fig. 19 pokazuje jak przeprowadzono rozdział trzech frakcji.

Oznaczenie chemicznego składu niektórych frakcji na 3 i 4 poziomie separacji (wzory strukturalne ponumerowanych związków są podane na fig 21)

Każda z frakcji F1.1, F1.2 i F1.3 zawiera tylko kilka związków jak pokazano na fig. 19. Głównym składnikiem frakcji F1.2 jest 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienai (związek wymieniony w opisie jako ketoaldehyd). Dihydroaktynodiolid (związek 2) jest ważnym związkiem frakcji F1.3. Związki 3-14 zostały zidentyfikowane we frakcji F2. Są to p-cyklocytral (3),

184 296 β-jonon (4), 5,6-epoksy-β-jonon (5), 4-okso-β-jonon (6), acefcaldehydo-β-jonylidyna (7), acetałdehydo-5,6-epoksy-β-jonylidyna (8), acetaldehydo-4-okso-β-jonylidyna (9), β-apo-Ϊ3karotenon (10), 5,6-epoksy-β-apo-13-karotenon (11), 4-okso-β-apo-13-karotenon (12), retinal (13) i 5,6-epoksy-retinal (14).

Badania biologiczne

Przeprowadzono testy biologiczne in vitro przez zbadanie aktywności cytostatycznej, indukcję różnicowania i wpływu na cykl komórkowy. Przeprowadzono również testy in vivo przez zbadanie zahamowania wzrostu nowotworów u myszy.

Testy in vitro

Badano cytostatyczne własności frakcji i ich zdolność do indukowania różnicowania. Wyniki porównano z działaniem β-car⁰’¹, który służył jako odnośnik wskazujący czy frakcjonowanie dało frakcje o zwiększonej aktywności (w pewnych badanych liniach komórek stosowano do celów kontrolnych kwas retinowy i/lub β-karoten w celu odróżnienia ich działania od β-car'”). Mając na uwadze nieokreślone własności wielu z frakcji, wykonano wszystkie badania stosując te same stężenia oznaczone w procentach wagowych. Porównanie wyników przedstawiono w pseudomolamej skali dzieląc odważoną badaną próbkę przez ciężar cząsteczkowy β-karotenu (537 Da).

Zastosowane linie komórkowe

HCT116 ludzki rak okrężnicy

1MR32 ludzki nerwiak niedojrzała

NB4 ludzka ostra białaczka promielocytowa

K562 luUzZkprznwlekiabiałaazZassnikkwa

BALB/c/MK mysie keratynocyty

Działanie cytostatyczne frakcji β-ca?”¹

Komórki HCT116 i MR32 poddano działaniu β-car”, który stosowano w następujących stężeniach: 2,5, 7,5, 15, 22,5, 30, 45 |”M; linie komórkowe NB4 i K562 poddano działaniu β-car⁰* o stężeniu 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 22,5 pM. Po trzech dniach komórki poddano lizie i inkubowano je z barwnikiem Hoechst Nr 33258 oraz oznaczono fluorescencję roztworów celem zmierzenia ilości komórkowego DNA. Zbierano wyniki fluorescencji każdej badanej substancji i podzielono je przez odpowiednie wartości fiyorescencji komórek nie traktowanych (po korekcji na fluorescencje tła) w celu oznaczenia cytostatycznego działania każdego stężenia badanej próbki. Na fig. 22a i 22b pokazano wyniki otrzymane przy badaniu ludzkiego raka okrężnicy HCT116 i linii ludzkich komórek białaczki K562.

Jest oczywiste, że aktywność składnika może w dużym stopniu zależeć od wybranej linii komórek. Pokazano to bardzo dobrze na przykładzie frakcji MSG, która jest aktywna wobec linii komórek HCT116 i nieaktywna wobec linii K562, podczas gdy frakcja 1LSG jest silnie aktywna wobec obydwu linii (bardziej niż β-car⁰*. Oznacza to, że cytostatyczna aktywność może być otrzymana w wyniku działania więcej niż jednego związku.

W tabeli 7 zestawiono wyniki uzyskane dla czterech linii komórkowych. Frakcje zostały sklasyfikowane pod względem β-car”* poprzez podzielenie wartości wzrostu inhibicji każdego stężenia próbki przez odpowiednią wartość uzyskaną przy stosowaniu β-caro* i oznaczone jakościowo przez badanie trendu sześciu różnych stężeń próbki.

Aktywność frakcji oznaczono jako wyższą+, taką samą0 i niższą- w stosunku do aktywności β-car⁰*

Nieoczekiwanie, najlepszy wynik zahamowania wzrostu komórek otrzymano przy zastosowaniu ketoaldehydu (związek 1, fig.21), który zidentyfikowano jako główny składnik frakcji F1.2. Być może zdumiewające jest wyraźne zmniejszenie aktywności prostszych frakcji na bardziej zaawansowanych poziomach rozdzielania (3 i 4), których frakcje wyjściowe wykazywały aktywność na poprzedzających poziomach 1 i 2 to jest frakcje F1,

F2, F1.2 i F1.3. Następne prostsze frakcje z zasadzie powinny być wzbogacone w składniki czynne, co prowadzi do oczekiwania wyższej aktywności. Możliwe, że obserwowana wcześniej wysoka aktywność bardziej złożonych frakcji jest spowodowana obecnością więcej niż jednego aktywnego związku i/lub synergistycznym działaniem dwóch lub więcej związków.

184 296

Tabela 7

Działanie cytostatyczne poszczególnych frakcji i związków na pewne linie komórek w stosunku do działania β-car”*

Linie komórkowe

Poziom	Frakcja	HCT116	EMR32	K562	NB4
0	β-car””	0	0	0	0
1	SG1	0	+	+	+
	IG1	+	0	0	+
2	SG2	+	+	+	+
	IG2	+	+	+	+
2	LSG	-	0	+	0
	MSG	0	0	-	0
3	SG3	+	+	+	0
3	F1	-	0	0	0
	F2	0	0	0	-
4	F1. 1	-	0	+	+
	F1. 2	-	0	-	0
	F1. 3	-	0	0	0
	ketoaldehyd	+	+	+	+
	β-car””	-	0	-	-
	RA	-	+	0	0

Uwaga: Podane powyżej dane zostały obliczone w stosunku do uśrednionej wartości β-car”* w trakcie badań.

Wartość β-car”* przyjęto jako 0. RA = kwas all-trans retinowy.

Cytostatyczne własności ekstensywnie utlenionego likopenu

Aktywność ekstensywnie utlenionego likopenu porównano z β-car”* dla linii komórek HCT-116. Podane w tabeli 8 wyniki wskazują, że obydwie substancje mają podobną aktywność wobec tej linii komórek. Wykazano, że β-carO* kantaksantyna i również produkty likopenu mają silne własności cytostatyczne. Ponieważ likopen nie ma dwóch pierścieni cykloheksylowych, które mają obydwa karotenoidy (fig. 14), wydaje się, że obecność tego składnika cząsteczki nie jest potrzebna do cytostatycznej aktywności utlenianych produktów.

Tabela 8

Porównanie cytostatycznego działania ekstensywnie utlenionego likopenu i β-car”* na linię komórkową HTC-116.

Dawka (gM)	β-car”*	Utleniony likopen
0	100	100
2,5	86	100
7,5	80	85
15	51	55
22,5	18	41
30	8	18
45	1	11

184 296

Różnicowanie komórek

Indukowanie różnicowania komórkowego przez frakcje zostało jakościowo zbadane przez określenie morfologicznych zmian w liniach komórkowych, a ponadto ilościowo zmierzono ekspresję charakterystycznych markerów białkowych stosując przeciwciała monoklonalne i cytometrię przepływową. W tabeli 9 frakcje aktywne oznaczono przez +, a bardzo aktywne frakcje jako ++.

Istnieje szeroki zakres aktywności wśród frakcji wobec ludzkiej linii komórkowej nerwiaka IMR32. Nieoczekiwanie, trzy pary frakcji (SG1, IG1, SG6, IG2 i LSG, MSG) wykazują bezprecedensową zdolność (o ile wiadomo) do indukowania różnicowania w kierunku dwóch różnych fenotypów z tej samej linii komórek macierzystych. Oznacza to, że możliwe jest ukierunkowanie linii komórkowej IMR32 w kierunku komórek glejowych lub nerwowych, w zależności od wyboru frakcji.

Zdolność do indukowania tworzenia się komórek nerwowych zanika w późniejszych, prostszych frakcjach (poziom 4, tabela 9). Badania te dalej wskazują, że β-car⁰* zawiera wiele aktywnych związków mających różne rodzaje aktywności.

Indukcja różnicowania linii komórkowej ludzkiej białaczki NB4 jest ograniczona do wczesnych i chemicznie złożonych frakcji IG2 i MSG, które mają silną aktywność. Tylko frakcja SG3 ma silne działanie różnicujące ąuasi-normalną linię szczurzych pierwotnych komórek mięśniowych L6.

Największa aktywność wobec transformowanych linii komórkowych, w szczególności IMR32, w porównaniu z ąuasi-normalną linią L6 pozwala na opracowanie strategii stosowania selektywnego różnicowania transformowanych komórek w celu kontroli wzrostu komórek nowotworowych w sposób nietoksyczny.

Tabela 9

Wyniki indukowania zmian komórki przez frakcje β-car* Linie komórkowe’

Poziom	Frakcja	IMR32b	NB4	L6
1	SG1	+ (n)	ne	ne
	IG1	+ (g)	ne	ne
2	SG2	+ (n)	ne	ne
	IG2	+ (g)	++	ne
2	LSG	++(n)	ne	ne
	MSG	++<g)	++	ne
3	SG3	+ (n)	ne	++
3	F1	++(n)	ne	ne
	F2	++(n)	ne	ne
4	F1. 1	++ (g)	ne	ne
	F1. 2	ne	ne	ne
	F1. 3	ne	ne	ne
	Ketoaldehyd	ne	ne	ne

a ne = brak efektu b litery w nawiasach oznaczają różnicowanie fenotypów w kierunku komórki glejowej (g) lub nerwowej (n).

Jakościowe dane indukowania zmian przez β-car* w mysiej linii komórkowej keratynocytów Balb/c/MK zostały przedstawione w pierwszym etapie badań. W tabelach 10 i 11 przedstawiono dodatkowe dane ilościowe.

184 296

Tabela 10

Cytokeratyna 1i 10 w keratynocytach Balb/c/MK.

Próbka	A	ia
Kontrola	90,3	4,4
Ca++ 1,8 mM	96,5	13,8
RA (3 nm)	94,5	15,4
β-Caro* (30 ąM)	96,5	7,9

Uwaga· W kolumnie A podano procent komórek immunopozytywnych, to jest wyrażających określoną cytokeratynę. Kolumna I_A przedstawia intensywność ekspresji w komórce (jednostki arbitralne). RA = kwas all-transretinowy.

Tabela 11

Ekspresja panelu cytokeratyn w keratynocytach Balb/c/MK.

Próbka	A	Ia
Kontrola	93,7	60,7
Ca'’(1,8 mM)	97,6	87,2
RA (3 |iM)	94,3	129,8
β-Caro* (30 ąM)	96,2	82,1

Uwaga: patrz, uwagę do tabeli 10.

Cytokeratyny 1 i 10 są białkami o dużym ciężarze cząsteczkowym, których ekspresja wzrasta wraz z postępem programu różnicowania. W hodowlach komórkowych różnicowanie jest klasycznie indukowane przez ekspozycję na pożywkę zawierającą duże stężenie wapnia. Komórki hodowane w pożywkach o niskiej zawartości wapnia dalej proliferują. Jak pokazano w tabeli 10, kwas retinowy może zastąpić Ca^{4 1}· zwiększając ekspresję cytokeratyny 1 i 10. Również β-caro* może zastąpić wapń w indukowaniu różnicowania keratynocytu Balb/c/MK. Widoczne mniejsze działanie β-caro* w porównaniu do kwasu retinowego nie wynika z jego niższej siły, ale z opóźnienia działania. W tabeli 11 pokazano, że uzyskuje się podobne wyniki stosując panel innych cytokeratyn.

Skojarzone działania β-caro* lub jego frakcji z kwasami all-trans-retinowymi wobec

a) identyfikacji celów komórkowych dla β-car⁰* oraz b) terapii skojarzonej

Znając własności β-caro* i pewnych jego frakcji do indukowania zmian komórkowych jest pouczające nie tylko porównanie tego działania z aktywnością, lepiej znanych kwasów alltrans-retinowych, które są zdolne do indukowania zdolności różnicowania szeregu typów komórek ssaków, ale również określenie wpływu wywieranego przez β-car⁰* i kwasu retinowego na komórkę przy stosowaniu równoczesnym. W tabeli 12 przedstawiono jakościowe dane ilustrujące wyniki uzyskane przy użyciu różnych kombinacji β-caO* i kwasu retinowego wobec linii komórkowych NB4 i IMR32.

Jeśli β-caro* i kwas retinowy są stosowane w stężeniach ekwipotencjalnych to ich działanie różnicujące znosi się wzajemnie. Jednakże, jeżeli stężenie jednego z nich zostaje zwiększone w stosunku do drugiego, to indukcja różnicowania zostaje przywrócona. Nieoczekiwanie stwierdzono, że jeżeli podnosi się jednocześnie stężenie obydwu związków, to następuje wyraźne wzmocnienie różnicowania.

Podczas programu różnicowania, przemijającej ekspresji ulega wiele znaczników różnicowani;! W linii komórek NB4, białko CD33 jest związane z wczesnym stadium różnicowania, poprzedzając białko CD11b, znacznik pośredni, a w końcu białko CD 15, stanowiące znacznik zaawansoowanego różnicowania. Zwiększone różnicowanie będzie więc charakteryzowało się zmniejszeniem ekspresji i intensywności znacznika CD33 i wzrostem ekspresji i intensywności znacznika CD 15.

184 296

Tabela 12

Własności różnicowania mieszanin utlenionego β-caro* i kwasu retinowego.

Kwas retinowy	β-car-o’	Różnicowanie
L	-	tak
-	L	tak
L	L	nie
H	L	tak
L	H	tak
H	H	Tak (wzmocnione)

Uwaga: Litery L i H wskazują, odpowiednio, niskie i wysokie stężenie. Kreska - wskazuje brak danego związku.

W tabeli 13 przedstawiono ilościowe dane dotyczące działania kwasu all-transretinowego, β-caro* i pewnych jego frakcji na poziom ekspresji specyficznych znaczników różnicowania w komórkach NB4, z dodatkiem poszczególnych frakcji lub różnych podwójnych kombinacji z kwasem all-trans-retinowym. Wyniki wskazują, że β-car¹’* nie jest tak aktywny jak kwas retinowy β-car°* wymaga więcej czasu do uzyskania efektów). Skojarzone działanie kwasem retinowym i β-caro* l_ub pewnymi jego frakcjami powoduje zahamowanie różnicowania (efekt antagonistyczny) jak to już uprzednio przedstawiono wyżej dla β -car⁰* (tabela 12), ale w połączeniu z frakcją IG2 różnicowanie przebiega dalej niż w przypadku działania samej IG2 lub pojedynczego kwasu retinowego (działanie synergiczne).

Stwierdzenie, że β-caro* i pewne jego frakcje mogą kolidować ze i wzmacniać działanie kwasu retinowego świadczy o tym, że ponieważ kwas retinowy działa przez i współpracuje z nadrodziną receptorów jądrowych (w tym z receptorami retinoidowymi, hormonu tarczycy, witaminy D₃ i sierocymi), β-car¹’* i pewne jego frakcje kierują się swoiście do tej rodziny receptorów i wywierają wpływ na komórkę na poziomie transkrypcji jądrowego DNA.

Przedstawione powyżej wzmocnienie różnicowania uzyskane w pewnych warunkach wskazuje na możliwość, że odpowiednia kombinacja kwasu retinowego i β-caro* lub jego frakcji IG2 może stanowić bardziej skuteczną terapię niż sam kwas retinowy. Jest to o tyle istotne, że kwas retinowy stanie się niedługo powszechnie stosowany w leczeniu ostrej białaczki promielocytowej (APL), mimo iż zapewnia tylko 5-6 miesięczną remisję, po której staje się nieskuteczny w leczeniu nawracającego nowotworu. Niniejsze wyniki potwierdzają możliwość, że skojarzenie dwóch związków, a w szczególności opisanych powyżej może skierować komórki białaczki na szlak końcowego różnicowania, zwiększając prawdopodobieństwo zablokowania powrotu do ich stanu proliferacyjnego.

Tabela 13

Działanie β-caro* lub jego frakcji oddzielnie i w połączeniu z kwasem all-trans-retinowym po ekspresji wybranych znaczników w linii komórkowej NB4 (po 5 dniach)

CD33 CD11b CD15

	A	B	Ia	Ib	A	B	Ia		A	B	Ia	Ib
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
RA	87,1	-	1,6	-	71,9	-	2,6	73,1	-	9,7	-	-
G	95,8	-	4,8	-	73,8	-	1,0	32,1	-	0,9	-	-
SG1	96,9	-	5,2	-	77,3	-	0,8	30,0	-	0,3	-	-
IGI	94,6	-	5,0	-	71,5	-	1,0	28,7	-	0,6	-	-
SG2	95,3	-	4,6	-	72,1	-	1,2	29,4	-	1,0	-	-

184 296 cd. tabeli

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
IG2	87,8		4,6	-	54,6	10,9	1,3	4,5	15,0	30,0	1,3	4,1
SG3	64,2	-	1,7	-	29,1	-	2,0	19,2	-	0,3	-	-
G+RA	39,8	-	1,6	-	11,6	-	2,1	23,6	-	1,5	-	-
SG1+RA	35,1	15,5	0,7	3,1	31,7	-	1,6	-	64,7	-	-	2,1
SG2+RA	45,4	21,4	1,0	7,1	59,8	-	1,0	-	75,1	-	-	5,5
IG2+RA	71,6	-	1/1	-	80,2	-	1,9	83,7	-	11,0	-	-

Uwaga: W skojarzonym leczeniu stosowano 1 pM RA i 7,5 pM G (lub jego frakcji). W kolumnach A i B przedstawiono procent imunopozytywnych komórek w populacji (to jest niosących konkretny białkowy znacznik różnicowania). W kolumnie B pokazano pojawienie się różnych populacji komórek w odniesieniu do różnicowania określonego intensywnością ekspresji znacznika W kolumnach I_A i I_B podano średnią intensywność ekspresji znacznika różnicowania w przeliczeniu na komórkę (jednostki arbitralne).

Hipoteza, że β-car⁰* wpływa na komórki na poziomie transkrypcji jądrowego DNA poprzez oddziaływanie z wyżej wymienioną rodziną, receptorów dalej poparto wynikami skojarzonego działania kwasem retinowym i β-car⁰* na linię komórkową IMR32. Podobnie jak w przypadku NB4, zaobserwowano działanie antagonistyczne lub synergiczne (zależnie od stężenia obydwu związków) (patrz, tabela 7a). Przykładowo, ekspresja neurofilamentu NF (znacznik wskazujący, że komórki zróżnicowały się w neurony) jest maksymalna przy stężeniu 1 pM RA i 5 pM β-caro* gdy stosuje się obydwa związki osobno. Przy zastosowaniu łącznym w tych stężeniach ich działanie znosiło się wzajemnie, zaś ekspresja NF była podobna do występującej w kontroli (antagonizm). Gdy jednak stężenie RA zostało zwiększone do 2,5 pM, a stężenie β-caro* obniżono do 3 pM wówczas ekspresja NF była wyższa niż w przypadku każdego z tych związków osobno (synergia). Ekspresja kwaśnego białka włókienek gleju GFAP (znacznik wskazujący na różnicowanie w kierunku komórek glejowych), która jest wzmacniana przez obydwa związki, wskazuje na ich wzajemne działanie. Na przykład, podczas gdy kwas retinowy jest najbardziej aktywny przy niskim stężeniu około 1 pM, obecność β-caro* zwiększa jego optymalne stężenie do 10 pM, zależnie od stężenia β-caro* (tabela 13a).

Tabela 13a

Działanie β-car⁰* (G) oddzielnie i w połączeniu z kwasem all-trans-retinowym na ekspresję wybranych znaczników w linii komórkowejIMR32 (po 48 godzinach)

NF GFAP

RA (pM)	β-CARo* (pM)	%	Intensywność	%	Intensywność
1	2	3	4	5	6
0	0	96,0	4,3	65,0	1,7
1	0	96,4	14,2	94,4	18,4
2,5	0	97,2	11,9	90,5	6,1
5	0	95,5	8,4	87,5	5,2
10	0	92,0	7,9	83,1	4,0
0	3	90,6	7,7	91,5	5,2
0	5	98,7	53,0	87,0	sa
0	7,5	96,1	8,6	94,2	8,7
0	10	95,8	8,5	88,1	4.5
1	5	94,1	6,4	98,2	22,4
1	7,5	94,7	7,5	87,4	5,6
1	10	98,2	17,6	89,7	6,2
2.5	3	98,3	70,0	.....gZTL·	5.6

184 296 cd. tabeli

1	2	3	4	5	6
2,5	5	94,7	7,2	97,9	21,7
2,5	7,5	98,7	222	92,7	10,4
2,5	10	93,0	6,1	97,6	20,4
5	3	97,5	17,0	79, 1	3,4
5	5	94,7	7,1	90,3	4,8
5	7,5	953	9,1	96,8	18,4
5	10	96,7	15,0	97,4	18,5
10	3	93,4	6,6	89,6	5,3
10	5	94,5	7,7	89,5	7,0
10	7,5	90,6	7,7	93,3	7,9
10	10	95,1	7,0	97,0	15,9

Działanie β-car”* na cykl komórkowy

Rozmieszczenie populacji komórek poddanej działaniu β-car⁰* pomiędzy trzy fazy cyklu komórkowego (faza G1 - komórki spoczynkowe, faza S - (etap syntezy DNA), faza G2 (podwojenie chromosomów) pokazuje nagromadzenie komórek w fazie S. Nie występuje blok G1. Spowodowane jest to wydłużeniem czasu trwania cyklu komórkowego. Stwierdzono, że komórki poddane działaniu β-car”* kończą cykl po 36 godzinach, podczas gdy długość cyklu komórkowego w kontroli i dobranych próbkach poddanych działaniu kwasu retinowego wynosiła, odpowiednio, 22 i 18 godzin. Dane te uzyskano metodą cytometrii przepływowej, w której określono zawartość wewnątrzkomórkowego DNA w komórkach z synchronizowanej populacji. Próbki pobierano co 5 godzin przez okres 48 godzin. Stosowano dwa rodzaje komórek: komórki rosnące w zawiesinie (komórki białaczki NB4) i rosnące jako komórki przylegające (mioblasty L6).

Inne własności biologiczne

Działanie β-car⁰* obniża poziom komórkowego glutationu i zwiększa wrażliwość linii komórek nowotworowych na działanie konwencjonalnych leków chemoterapeutycznych. Bardzo często klasyczne leki przeciwnowotworowe są nieskuteczne, gdyż komórki nowotworowe nabierają odporności na ich działanie. W wielu przypadkach, zjawisko to jest związane ze zwiększonym poziomem glutationu (GSH), który chroni komórki nowotworowe przed działaniem składników czynnych leków’ i powoduje ich usuwanie z komórki. Dime potOme w tabeli 14 wykazują, że β-cjro* ma zdolności do znacznego obniżania poziomu GSH w linii komórkowej raka sutka myszy, którą zastosowano do oszacowania aktywności przeciwnowotworowej. Wyniki podane w tabeli 14 są bardzo korzystne w porównaniu z działaniem sulfoksyiminy butioniny (BSO), która jest bardziej toksycznym inhibitorem biosyntezy GSH i jest aktualnie badana jako lek przeciwnowotworowy.

Tabela 14

Działanie β-car”’ na poziom glutationu w mysiej linii komórkowej raka sutka DA-3

β-caro* (μΜ)	GSH (nmol/mg białka)
0	30
5	38
10	6
20	3

Korzyści z obniżenia poziomu GSH w komórkach są przedstawione jako żywotność komórek DA-3 (zastosowano test MTT), podanych działaniu β-car”' i melfalanu, który jest

184 296 znany jako klasyczny środek przeciwnowotworowy. Dane w tabeli 15 pokazują, że IC₅0 mdl falanu został gwałtownie zredukowany w obecności niskich stężeń β-caro* (przedstawione graficznie na fig. 23a i 23b).

Sugeruje to, że równoczesne podawanie β-caro* z konwencjonalnym środkiem przeciwnowotworowym, takim jak melfalan, będzie zwiększało podatność komórek nowotworowych na działanie leków przeciwnowotworowych. Może być to przydatne w dwóch celach: a) przy tej samej dawce można uzyskać wyższe stężenie leku w komórce nowotworowej; b) konieczne są mniejsze dawki do uzyskania działania terapeutycznego dzięki czemu następuje obniżenie niepożądanego działania ubocznego wynikającego z ogólnej wysokiej toksyczności melfalanu.

Tabela 15

Działanie utlenionego β-karotenu na IC₅0melfalanu w modelu mysiej linii komórkowej raka sutka DA-3, oznaczone w teście MTT

β-car* (μΜ)	IC50 melfalanu (ąM)
0,0	100
5,0	40
7,5	44
10,0	6,6
20,0	6,8

Toksyczność i aktywność przeciwnowotworowa β-caro* _m,₍o

Działanie przeciwnowotworowe β-caro* w innych zwierzęcych modelach, przeszczepy ksenogeniczne u myszy nagich

Badanie aktywności przeciwnowotworowej β-car* rozszerzono na badanie działania na wzrost nowotworu powstałego z przeszczepienia ludzkich komórek raka jajnika A2780 na myszy nagie. Na fig. 24 pokazano, że dootrzewnowe podawanie β-caro* znacznie hamuje wzrost bardziej agresywnego nowotworu (w porównaniu z modelem DA-3).

Przeciwnowotworowe działanie frakcji β-car⁰* i pokrewnych substancji

Stosowano model gruczolakoraka sutka myszy D1-DMBA-3 (DA-3). Wyniki pokazane na fig. 25a i 25b wskazują, że pewne frakcje były przynajmniej tak silne (frakcje SG, FI, F2) lub silniejsze (frakcje F1.1, F1.2, F1.3) niż β-caro* mimo stosowania ich w niższych stężeniach niż β-caro* Siła działania ketoaldehydu (związek 1, fig.8) jest uderzająca.

W tabeli 16 pokazano zmierzoną objętość nowotworu względem kontroli (grupa otrzymująca tylko nośnik) badaną po 28 dniach trwania doświadczenia W przeciwieństwie do zaobserwowanych uprzednio własności β-caro* jak widać, przynajmniej w przypadku frakcji F1 występuje działanie zależne od dawki.

Tabela 16

Aktywność przeciwnowotworowa in vivo β-caro* j j_eg_O frakcji w modelu DA-3

Próbka	Dawka (mg/kg ciała)	względny rozmiar nowotworu po 28 dniach
1	2	3
β-caro*	25	0,36
SG1	25	0,30
LSG	25	0,49
F1	5	0,72
	10	0,49
	25	0,37
F2	25	0,33
F1. 1	10	0,30
F1.2	10	0,47

184 296 cd. tabeli

1	2	3
F1. 3	10	0,47
Ketoaldehyd	10	0,44
20% etanol	N/A	(1,00)

Zbadano alternatywną drogę podawania na tym samym modelu stosując frakcje F1 i F2. Dane w tabeli 17 wykazują, że obydwie frakcje podawane doustnie (p.o.) były co najmniej tak samo aktywne jak przy podawaniu dootrzewnowym (i.p.).

Tabela 17

Porównanie aktywności przeciwnowotworowej in vivo frakcji F1 i F2 podawanych i.p. i p.o. w modelu DA-3

Próbka; 25 mg/kg ciała	Względny rozmiar nowotworu po 21 dniach
F2 p.o.	0,50
F2 i. p.	0,48
F1 p.o.	0,34
F1 i. p.	0,43
20% etanol	(1.00)

184 296

Absorbancja

Liczba falowa cnr 1

184 296

Absorbancja Absorbancja

Liczba falowa cm'i

Liczba falowa cnr!

184 296

Dzień

Fig. 12

184 296

Likopen

Kwas retinowy

Fig. 14

Zmniejszenie MW---1 Polimery o wysokim ciężarze cząsteczkowym (HMW)

Związki orgamczne/oligomery o średnim ciężarze cząsteczkowym (MMW)

Niskocząsteczkowe związki organiczne (LMW)

Fig. 15

184 296

GO-Hśal

LMW+MMW j Preparatywna chromatografia kolumnowa GPC i l |lśg'| I MSG I

Związki organiczne LMW (41%i Pozostałość MMW (59%)

Fig 17

184 296

mRU iae;

180F1

140'

120100'

804 i

sbH

J

0^J

Fig. 18b

Czas w minutach

184 296 mRU mfiU

Czas w minutach

Fig. 19a

Fig. 19b

Czas w minutach

184 296

O

CE ε

2200-j

2B00-;

LC r 2 t a. 4

ΕΒΓ2-5 . Π

4QQta ts

JLZl—i

Fig. 20a

25

Czas w minutach mRU

Fig. 20b

C/as \\ minutach

184 296

Stężenie (μΜ)

Fig. 22a

184 296

Fig. 24

184 296

Dzień

Fig. 25b

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzące od pokrewnych sprzężonych polienów, użyteczne jako nietoksyczne środki wywołujące różnicowanie komórkowe, środki cytostatyczne i środki przeciwnowotworowe, otrzymywane w reakcji utleniania karotenoidów, retinoidów lub pokrewnych sprzężonych związków polienowych, znamienne tym, że składają się z mieszaniny polimerów mającej w widmie absorpcyjnym w podczerwieni szerokie bezkształtne pasmo absorpcyjne przy około 3450 cm'¹, dwa silne, węższe pasma wielopikowych absorpcji przy około 2950 i 1700 cm', odpowiednio, i szerokie kompleksowe pasmo pomiędzy około 1500 i 750 cm' z około sześcioma pikami, przy czym mieszanina zawiera związki polimerowe o ciężarze cząsteczkowym od około 300 do 8000 Daltonów, środkową frakcję związków o ciężarze cząsteczkowym około 900 Daltonów i niskocząsteczkowe związki zawierające między innymi: 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienal o wzorze 1, a gdy karotenoidem jest β-karoten to mieszanina zawiera dihydroaktynidiolid o wzorze 2, β-cyklocytral o wzorze 3, β-jonon o wzorze 4, 5, 6-epoksy^-jonon o wzorze 5, 4-okso^jonon o wzorze 6, β-jonylidenoacetaldehyd o wzorze 7 i 5,6-epoksy^-jonylidenoacetaldehyd o wzorze 8.
2. 2. Utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzące od pokrewnych sprzężonych polienów, według zastrz. 1, znamienne tym, że są otrzymane przez utlenianie w organicznym rozpuszczalniku.
3. 3. Utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzące od pokrewnych sprzężonych polienów, według zastrz. 1, znamienne tym, że są otrzymane przez utlenianie w stanie stałym.
4. 4. Utlenione karotenoidy, retinoidy i utlenione mieszaniny pochodzące od pokrewnych sprzężonych polienów, według zastrz. 1, znamienne tym, że zawierają związki polimerowe o ciężarze cząsteczkowym powyżej 300 Daltonów.
5. 5. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienal.
6. 6. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki, rozcieńczalnik lub nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienal.
7. 7. Zastosowanie 2-metylo-6-okso-2,4-heptadienalu do wytwarzania leku do leczenia nowotworów u ludzi i zwierząt.
8. 8. Sposób wytwarzania utlenionych karetonoidów, retinoidów i utlenionych mieszanin pochodzących od pokrewnych sprzężonych polienów, polegający na kontaktowaniu karetonoidów, retinoidów lub pokrewnych sprzężonych polienów z tlenem, znamienny tym, że karotenoid, retinoid, lub pokrewny, sprzężony związek polienowy poddaje się reakcji z tlenem, w organicznym rozpuszczalniku lub w stanie stałym, przy czym tlen dodaje się w kilkakrotnym nadmiarze w stosunku do jego molekularnego zużycia przez karetonoid, retinoid lub pokrewny sprzężony związek polienowy.
9. 9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że reakcji z tlenem poddaje się β-karoten, likopen lub kantaksantynę.

   * * *

   184 296