CN101842112A - 含有来自紫杉形成层或原形成层的植物干细胞系的抗癌组合物 - Google Patents

含有来自紫杉形成层或原形成层的植物干细胞系的抗癌组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN101842112A
CN101842112A CN200880111207A CN200880111207A CN101842112A CN 101842112 A CN101842112 A CN 101842112A CN 200880111207 A CN200880111207 A CN 200880111207A CN 200880111207 A CN200880111207 A CN 200880111207A CN 101842112 A CN101842112 A CN 101842112A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell line
procambia
layer
cell
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200880111207A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101842112B (zh
Inventor
朴重铉
林敏政
吴日锡
李大熙
李政昶
李恩景
陈荣雨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Luquan Industrial Co ltd
Original Assignee
UNWHA BIOTECH CORP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UNWHA BIOTECH CORP filed Critical UNWHA BIOTECH CORP
Publication of CN101842112A publication Critical patent/CN101842112A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101842112B publication Critical patent/CN101842112B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/13—Coniferophyta (gymnosperms)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

本发明涉及用于预防或治疗癌症的组合物，所述组合物含有作为活性成分的来自紫杉形成层或原形成层的细胞系；其溶解产物；其提取物或者其培养基。与常用抗癌剂相比，所述细胞系、溶解产物、提取物和培养基具有更小的副作用，在癌症生长中直接涉及以诱导癌细胞死亡，并以抑制在癌发生中出现的血管生成而显示抗癌活性。因此，所述细胞系、溶解产物、提取物和培养基对于预防、治疗和缓解癌症来说是有用的。

Description

含有来自紫杉形成层或原形成层的植物干细胞系的抗癌组合物
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗癌症的组合物，所述组合物含有作为活性成分的来自紫杉形成层或原形成层的细胞系；其溶解产物；其提取物或者其培养基。
背景技术
凋亡是根据程序化信号通过细胞中各种基因表达和蛋白质活性的调节而发生的细胞死亡的主动过程。通过该过程形成的凋亡体通过吞噬细胞诸如周围细胞(surrounding cell)或者巨噬细胞(macrophage)的作用而被除去，使它们不引起炎症。这种凋亡在活的有机体的各种正常生理过程中频繁地被观察到并且已知其在各种疾病的发展过程中深深地涉及。也就是说，异常凋亡的发展可导致神经变性疾病、免疫疾病和心血管疾病，并且凋亡的异常抑制可引起癌症。
由凋亡的异常发展和抑制引起的疾病的更具体的例子包括由诸如p53、p16和Bcl-2基因的异常表达诱导的癌症，HIV Herpes和流感病毒引起的感染，以及自体免疫疾病诸如1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化和重症肌无力。个体的细胞凋亡是从个体中除去异常细胞即基因不可恢复的损伤细胞的常规机制，以便防止由基因受到损伤的细胞或者由分化刺激的不恰当分化的诱导引起的肿瘤的发展。这种观念得到常用抗癌剂通过与癌细胞增殖的抑制有关的凋亡过程诱导癌细胞死亡的事实的支持(Barry，M.A.等人，Biochem Pharmacol.，40：2353，1990；Hickman，J.A.，Cancer Metastasis Rev.，11：121，1992)。
因此，凋亡过程的紊乱诱导了损伤细胞和开始受到损伤的细胞的生存以及这些细胞的生长，因此凋亡的抑制在致癌过程中起到重要作用。另外，已经报道具有癌症预防效果的物质诱导了这些异常细胞的凋亡，并且由这些物质引起的凋亡的诱导至少与其防癌活性有关(Fesus，L.，J.Cell Biochem.，22：151，1995；Reddy，B.S.，Cancer Res.，57：420，1997)。
同时，在有关癌症的发展机制和治疗的研究上已经付出了高昂的研究费用，但是癌症仍然为不可治愈的疾病，并且各种癌症治疗会引起副作用(Goodman等人，Cancer Res.，9：2295，1987)。因此，已经付出了许多努力来研究并开发用于抑制癌症的新的药物和制剂，特别是，有关具有很小副作用的来自天然材料的抗癌物质的开发已经引起了兴趣。
本发明的一些发明人开发了提供克服去分化引起的变异问题的来自形成层或原形成层的细胞系的方法，其可稳定增殖并具有很高的遗传稳定性，并且发现，当对这些细胞系中来自紫杉的细胞系进行培养时，以很高的产量得到紫杉醇(PCT/KR2006/001544)。但是，来自紫杉形成层或原形成层的细胞系本身的抗癌效果仍未见报道。
因此，本发明的发明人付出了极大的努力来开发来自天然物质的抗癌组合物，其与常用抗癌剂相比具有更小的副作用，并显示了极佳的抗癌活性，结果发现，来自紫杉形成层(Taxus cambium)或原形成层(procambium-)的细胞系、其溶解产物、其提取物或者其培养基显示了癌细胞杀死活性，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供来自天然物质的组合物，其与现有的抗癌剂相比具有更小的副作用并显示了预防和治疗癌症的活性。
为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供了预防和治疗癌症的药物组合物，其含有选自包括来自紫杉形成层或原形成层的细胞系、其溶解产物、其提取物以及其培养基的任何一种或多种，所述细胞系具有下列特征：
(a)其形态学特征为具有大量的液泡；
(b)其处于天然未分化的状态；并且
(c)其为同质的细胞系。
在另一方面，本发明提供了预防或改善癌症的功能食品，其含有选自包括来自紫杉形成层或原形成层的细胞系、其溶解产物、其提取物以及其培养基的组的任何一种或多种。
在还一方面，本发明提供了来自紫杉形成层或原形成层细胞系、其溶解产物、其提取物以及其培养基的预防或治疗癌症的用途。
在又一方面，本发明提供了预防或治疗癌症的方法，所述方法包括使用选自下组的任何一种或多种：所述来自紫杉形成层或原形成层的细胞系、其溶解产物、其提取物以及其培养基。
通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将是容易想到的。
附图说明
图1示出了显示根据本发明的细胞系诱导过程的照片、分离的原形成层和形成层的图像以及去分化细胞与来自紫杉原形成层细胞之间的比较。
图2示出了ROS的量的比较图形与DCFH荧光照片，其显示了当通过使用H2O2处理而诱导人类皮肤二倍体成纤维母细胞(diploidfibroblasts，HDFs)的老化时，根据本发明的细胞系提取物的抗氧化活性。在图2中，p-WE：原形成层的蒸馏水提取物；C-WE：形成层的蒸馏水提取物。
图3示出了显示根据本发明的细胞系给药2周后对照组与细胞系给药组之间的癌组织大小比较的照片。
图4是显示根据本发明的细胞系给药三周时对照组与细胞系给药组的体积的图表。
图5是根据本发明的细胞系给药三周时从小鼠身上切割下来的对照组和细胞给药组的癌组织的照片。
图6是在根据本发明的细胞系给药三周后切割下来的癌组织的内部组织的照片。
图7示出了显示使用根据本发明的细胞系提取物处理癌细胞系之后的细胞死亡程度的照片。
图8是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理结肠癌细胞系之后的细胞死亡程度的照片。
图9是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理肺癌细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图10是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理前列腺癌细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图11是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理骨肉瘤细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图12是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理口腔癌细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图13是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理皮肤癌细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图14是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理白血病细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图15是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理子宫癌细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图16是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理皮肤癌(人类)细胞系之后细胞死亡程度的照片
图17是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理胰腺癌细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图18是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理乳腺癌细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图19是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理胃癌细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图20是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理肾癌细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图21是显示使用根据本发明的各种浓度的细胞系的甲醇提取物处理肝癌细胞系之后细胞死亡程度的照片。
图22图解显示了根据本发明的细胞系中紫杉醇存在性的分析结果。
具体实施方式
除非特别限定，这里使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常所理解的具有相同含义。一般说来，这里使用的各种术语的定义在本领域是公知且常用的。
在本发明的具体实施方式中使用的主要术语的定义如下。在本文中，术语“形成层”指的是使茎和根加厚以允许植物体积加权(volumetrically)生长的组织。据报道当形成层，在其中发生最活跃的细胞分裂的分生组织被用作植物组织培养的外植体时，细胞的快速大量生产成为可能(韩国专利10-0533120)。
在本文中，术语“原形成层”指的是来自初始细胞组的初级分生组织，并且作为初级分生组织的形成层来自原形成层而不需永久组织的介入。
在本文中，术语“溶解产物”指的是通过经化学方法例如使用去垢剂或物理方法破碎细胞得到的细胞溶解产物。术语细胞系的“提取物”指的是通过将细胞溶解在溶剂中并分离细胞得到的物质，并且提取物可通过蒸馏或蒸发浓缩。
在本文中，术语“天然未分化”的意思是细胞不以经过去分化步骤的未分化状态存在，而是天然保持为前分化状态。
在一个方面，本发明涉及用于预防或治疗癌症的药物组合物，其含有选自下组的任何一种或多种，包括来自紫杉形成层或原形成层的细胞系、其溶解产物、其提取物以及其培养基。
根据本发明的来自紫杉形成层或原形成层的细胞系具有如下特征：
(a)其形态学特征为具有大量的液泡；
(b)其处于天然未分化的状态；并且
(c)其为同质的细胞系。
根据本发明的来自紫杉形成层或原形成层的细胞系的其他特征在于：(a)其在悬浮培养过程中以单个细胞存在；(b)与来自紫杉形成层或原形成层以外的其他组织的细胞系相比，其具有较高的生长速度并可被稳定培养；以及(c)与来自紫杉形成层或原形成层以外的其他组织的细胞系相比，其在生物反应器中具有对剪切应力较低的敏感性。
根据本发明的细胞系优选使用包括下列步骤的分离方法得到：
(a)得到含有紫杉形成层或原形成层的组织；
(b)通过培养得到的含有形成层或原形成层的组织，诱导从形成层或原形成层增殖的形成层层或原形成层层，并诱导从形成层或原形成层以外的其他组织增殖的无定形愈伤组织层；以及
(c)收集来自形成层层或原形成层层的细胞系。
在分离方法中，步骤(c)优选通过在培养基中增殖组织然后收集增殖的细胞系来进行，所述培养基含有3-5wt％的粗糖或糖以及至少一种选自下组的物质，包括甲基茉莉酮酸酯(methyl jasmonate)、真菌提取物、细菌提取物、酵母提取物、壳聚糖、葡甘露聚糖、葡聚糖、苯丙氨酸、苯甲酸、水杨酸、花生四烯酸(arachonic acid)、STS、mevalonalonateN-benzolyglycine、ABA、SNP、IPP、BHT、CCC、乙烯利(ethephon)、马尿酸(hippuric acid)、硝酸铯铵(amminoium ceric nitrate)、AgNO3、硫酸氧钒、p-氨基苯甲酸、油菜素类固醇(brassinosteroid)，藻酸钠、醋酸钠。这里，甲基茉莉酮酸酯优选以10-100μM的量被包含。
在本发明中使用的培养基是用于植物组织培养的常用培养基，其例子可包括但不限于：N6培养基、SH培养基、MS培养基、AA培养基、LS培养基、B5培养基、WPM培养基、LP培养基、White培养基、GD培养基、DKW培养基、DCR培养基等等。
在本发明中，提取物优选使用选自下组的溶剂得到，包括蒸馏水、乙醇、丙酮、DMSO(二甲亚砜)以及它们的混合溶剂。
在本发明的一个实施例中，发现本发明的来自紫杉形成层的细胞系和来自原形成层的细胞系具有抑制由H2O2诱导的活性氧的效果，表明它们具有抗氧化效果。由于体内产生的活性氧(ROS)通过与细胞分子诸如细胞内DNA、蛋白质和脂类结合引起细胞突变，并且通过抑制细胞的正常功能而参与了肿瘤组织的形成，可以看到本发明的细胞系具有抗癌效果。
在本发明的另一个实施例中，本发明的来自紫杉形成层的细胞系和来自原形成层的细胞系被给药到小鼠，然后观察从小鼠中切割下来的癌组织。结果显示，本发明的来自紫杉形成层的细胞系和来自原形成层的细胞系抑制了肿瘤组织的生长，作为抗肿瘤基质之一抑制血管生成(angiogenesis)，并增强了免疫细胞浸润到肿瘤组织中。
在本发明的还一实施例中，结肠癌、口腔癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤、白血病、子宫癌、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、肾癌和肝癌分别使用细胞系的蒸馏水提取物、甲醇提取物和丙酮提取物的处理以便检查提取物对癌细胞死亡的效果。结果显示，根据本发明的细胞系提取物对于下列癌症的预防和治疗是有效的，包括但不限于：结肠癌、口腔癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤、白血病、子宫癌、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、肾癌和肝癌。
因此，如上所述，发现细胞系及其提取物具有预防和治疗癌症的活性。因此，即便在本发明中，不存在显示含有细胞系的溶解产物或培养物的组合物显示预防和治疗癌症效果的特定实施例，对本领域技术人员来说显而易见的是，根据本发明的细胞系的溶解产物和培养基也可显示预防和治疗癌症的效果。
在本发明的又一实施例中，分析了本发明的细胞系中紫杉醇的存在性。当根据本发明的细胞系在含有诱导子(elicitor)的培养基中培养时，其可产生高浓度的紫杉醇。没有在允许紫杉醇产生的条件下培养或者在特定条件下处理以便不产生紫杉醇的本发明的细胞系被检测以便检查其是否含有紫杉醇，并且分析了LC数据。结果显示，细胞系不含紫杉醇。因此，考虑本发明的细胞系的抗癌活性不是已知由紫杉产生的紫杉醇的作用，而是细胞系本身的抗癌活性。另外，由于当口服给药时根据本发明的细胞系显示了抗癌效果，本发明的细胞系的抗癌效果不被认为是用作注射液的紫杉醇的作用，因为当口服给药时紫杉醇是无效的。
根据本发明的含有细胞系、其溶解产物、其提取物以及其培养基的组的任何一种或多种的用于预防和治疗癌症的组合物可以作为含有一种或多种选自下组的药物组合物：单独或者与至少一种药物学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂结合的细胞系、其溶解产物、其提取物以及其培养基。基于疾病及其严重程度、患者年龄、体重、健康状况和性别、给药途径和治疗周期，细胞系、其溶解产物、其提取物以及其培养基可以作为药物组合物以治疗上的有效量而被包含。
在本文中，术语“药物学上可接受的组合物”指的是当给药到人类时生理上可接受并且不引起胃病、过敏反应诸如眩晕或类似反应的组合物。
所述载体、赋形剂或稀释剂的例子可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、藻酸盐、白明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。
药物组合物可另外含有填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂和防腐剂。而且，本发明的药物组合物可使用本领域公知的方法制成制剂，使其在给药到哺乳动物之后能够提供快速、持续或延迟的活性成分释放。制剂可以是粉末、颗粒、片剂、乳液、糖浆、气雾剂、软和硬凝胶胶囊、无菌注射液、无菌粉末等。
在另一方面，本发明提供了用于预防或改善癌症的功能性食品，其含有选自下组的一种或多种，该组包括：来自紫杉形成层或原形成层的细胞系、其溶解产物、其提取物或者其培养基。
在本文中，术语“功能性食品”指的是通过加入根据本发明的细胞系、细胞系的溶解产物、提取物或者培养基而改善其功能的食品。例如，本发明的细胞系或者细胞系提取物的抗癌效果可被用于制备预防并缓解癌症的功能性食品。
本发明的功能性食品可包括各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂诸如合成调味剂和天然调味剂、着色剂、填充剂、胃酸或其盐、海藻酸或其盐、有机酸、保护性凝胶增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、在含碳饮料中使用的碳化剂。
实施例
此后，将参照实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅仅用于解释的目的，而不是用于限制本发明的范围，因为这些实施例可被修改成其他各种形式。
特别是，虽然来自紫杉形成层或原形成层的细胞系及其提取物的癌症预防效果和癌症抑制效果在下列实施例中被确认，但对本领域技术人员来说显而易见的是，使用细胞系的溶解产物或培养基可提供与使用细胞系或其提取物的结果相同的结果。
实施例1：来自紫杉形成层或原形成层的细胞系的制备
1-1：植物材料的制备
分别收集Taxus spp.的嫩枝和茎，然后将其立即浸泡在100mg/L的抗氧化剂、L-抗坏血酸(DUCHEFA，The Netherlands)中。然后，将它们运输并储存。
然后，使用1％苯菌灵(benomyl，Dongbu Hannong Chemical，Korea)，1％的百菌清(daconil，Dongbu Hannong Chemical，Korea)，1％的硫酸链霉素(sterptomycin sulphate，DUCHEFA，The Netherlands)和0.1％的氨噻胍头孢菌素钠(cefotaxime sodium，DUCHEFA，The Netherlands)的混合溶液将植物预处理24小时，然后用自来水洗涤30分钟以便除去酚化合物和剩余的化学物质。然后，将植物在70％的乙醇(DC Chemical，Korea)中1分钟，30％的过氧化氢(LG Chemical，Korea)中15分钟，1％的CLOROX溶液中15分钟和3％的CLOROX溶液中5分钟进行表面灭菌，然后用水洗涤3-4次。
1-2：从嫩枝和茎中分离原形成层和形成层
将已经进行灭菌处理的嫩枝和茎的外层组织通过沿着长度方向拉动它们很容易去皮。将去皮的组织暴露出木质部、原形成层(嫩枝)或者形成层(茎)，韧皮部、皮层和表皮，然后将它们以使去皮组织的最内侧组织即木质部与培养基接触的方式进行培养。
1-3：来自紫杉原形成层和形成层的细胞系的诱导
在初始培养的4-7天，肉眼观察到来自原形成层和形成层的细胞的分裂，并在培养15天之后，通过去分化形成的无定形愈伤组织开始从由韧皮部、皮层和表皮构成的层中被诱导。但是，在整个培养过程中，在木质部中没有发生细胞分裂，因此形成层层与木质部自然分离。培养30天后，组织开始分成形成层层和含有韧皮部的上层，即无定形愈伤组织层(图1(a))，并且在组织完全自然分成两层之后，将这些层分别在不同培养皿中培养(图1(b))。在图1(a)中，上部表示含有韧皮部、皮层和表皮的组织，中部表示形成层，底部表示木质部，并且箭头表示形成层层与含有韧皮部、皮层和表皮的组织之间的分离。在图1(b)中，“A”表示来自含有韧皮部/皮层/表皮的组织的细胞系，其由于细胞之间分裂的差别而不规则增殖，“B”表示来自形成层的细胞系，其通过规则的细胞分裂增殖形成均匀的细胞层，“C”表示木质部，其中不发生细胞分裂。图1(c)显示了来自原形成层的细胞系被诱导。在图1(c)中，“A”显示培养30天后观察到的嫩枝，其为显示原形成层(底部)与来自包括初级韧皮部、皮层和表皮的组织的愈伤组织细胞分离的照片，“B”是在培养35天之后的照片，显示诱导的原形成层层被分离并培养，“C”是培养40天后的照片，显示包括初级韧皮部、皮层和表皮的组织的愈伤组织在原形成层层分离之后增殖。
在如上所述分离组织之后，将其具有良好生长速度的白色易碎部分在与诱导培养基相同的新鲜培养基中以21天为间隔传代培养，同时，仅仅用于诱导来自原形成层和形成层的细胞系的培养基在下表1中显示。
将生长调节因子生长素以1-3mg/L的浓度加入到培养基中，在受控暗室中25±1℃下培养。
表1：用于从Taxus spp.诱导细胞系的培养基(培养基1)
Figure GPA00001091825300111
Figure GPA00001091825300121
为了比较，将紫杉胚芽和针叶外植体(needle explant)灭菌，然后在表1的培养基中培养。结果，可以观察到胚芽和针叶外植体通过去分化形成愈伤组织。与含有韧皮部的组织的情况类似，由胚芽和针叶外植体诱导的愈伤组织由于各种细胞之间的分裂速度的差异而具有不规则的形状，显示不稳定的生长速度并且很容易变褐。由胚芽和针叶外植体诱导的褐色聚合愈伤组织由于从其分泌的苯酚化合物而显示缓慢生长，并最终死亡。也就是说，在培养6个月之后，由胚芽和针叶外植体诱导的愈伤组织难以保持并培养。但是，当将它们长期培养超过20个月时，来自原形成层和形成层的细胞系得以稳定保持而在它们的生长速度、生长模式和聚合方面没有变化表明大规模细胞培养是可能的。
1-4：分离的细胞系的生长和特性的观察
将来自原形成层和形成层的细胞系置于含有下表2中所示的液体培养基的烧瓶中。然后，将烧瓶中的细胞系在旋转摇床中100rpm、25±1℃下培养。传代设定为2周，使培养的细胞在指数生长期可始终保持较高的活力。
表2：用于来自Taxus spp.的细胞系的悬浮培养基(培养基2)
Figure GPA00001091825300131
同时，将来自胚芽和针叶的愈伤组织也在表2的培养基2中培养并将其与来自本发明的原形成层和形成层的细胞系进行比较。
使用生物学显微镜CX31(Olympus，Japan)观察细胞聚集的程度。结果，如下表3所示，可以看到当悬浮培养时根据本发明的细胞系超过90％的细胞以单细胞存在。如图1(d)所示，可以观察到根据本发明的细胞系的形态学特征为存在大量的液泡并处于未分化状态。图1(d)中的箭头表示来自紫杉原形成层的细胞的液泡。
表3：紫杉长期培养的细胞聚集类型
Figure GPA00001091825300141
同时，为了检查大规模细胞培养的可能性，将来自胚芽/针叶的愈伤组织和来自原形成层和形成层的细胞在内体积为3L的气升式生物反应器(airlift bioreactor，Sung-Won Cytec，Korea)中培养。培养在黑暗条件下在表2中的液体培养基中25±1℃下进行。
结果，如在下表4中看到的那样，观察到根据本发明的来自紫杉原形成层和形成层的细胞培养物在生物反应器中的倍增时间为4-5天，这与在烧瓶中一样或者与在烧瓶中相比更短，而来自胚芽/针叶的细胞系的非同质细胞培养物的倍增时间在烧瓶中为12天，但在生物反应器中为21天。换言之，可以看到当在烧瓶中培养时，与来自紫杉原形成层或形成层以外的其他组织的细胞系相比，根据本发明的细胞系显示了大约高出2-3倍的生长速度，并且当在生物反应器中培养时，与来自原形成层或形成层以外的其他组织的细胞系相比，根据本发明的细胞系显示了大约高出5-6倍的生长速度。这被认为是由于在培养过程中在生物反应器中形成生长环、植物细胞凝集以及刚性细胞壁对剪切应力的灵敏度而使细胞活力迅速下降的原因。
根据本发明的来自原形成层和形成层的细胞系在生物反应器中形成非常小的生长环，并且当简单刺激被施加到培养器中以摇动培养基时，在其内壁上形成的生长环容易地被消除。而且，显示本发明的细胞系具有较低的凝集并且含有大量的液泡，因此对剪切应力具有较低的灵敏度，从而使细胞活力不降低。换言之，观察到根据本发明的细胞系对大量生产中在生物反应器中的摇动产生的剪切应力具有较低的灵敏度，因此可在生物反应器中迅速大量生产。考虑到烧瓶培养和生物反应器培养之间细胞系的生长速度的差别，可以看到根据本发明的来自紫杉原形成层或形成层的细胞系对剪切应力的灵敏性比来自紫杉原形成层或形成层以外的组织的细胞系低2-3倍。
表4
Figure GPA00001091825300151
1-5：使用糖和甲基茉莉酮酸酯处理
将在实施例1-4中描述的已经悬浮培养14天的细胞系在培养基(含有无菌水，3-5wt％(g/L)的粗糖和100μM的甲基茉莉酮酸脂)中在黑暗条件下培养10天，然后收集细胞并在随后的实验中使用。
实施例2：来自紫杉原形成层或形成层的细胞系的提取物的制备
按照如下步骤从实施例1中制备的细胞系中提取活性成分。
(i)将已经除去培养基的500g细胞系在在50℃下在500mL蒸馏水中搅拌6小时使其溶解。
(ii)在溶解完全之后，将细胞溶液以3,000g离心10分钟，并收集上清液，由此得到蒸馏水溶解的物质。
(iii)在得到蒸馏水溶解的物质之后，将剩余的蒸馏水不溶性物质在室温下在500mL甲醇中搅拌6小时使其溶解。
(iv)在溶解完全之后，将细胞溶液以3,000g离心10分钟，并收集上清液，由此得到甲醇溶解的物质。
(v)在得到蒸馏水溶解的物质之后，将剩余的甲醇不溶性物质在室温下在500mL丙酮中搅拌6小时使其溶解。
(vi)在溶解完全之后，将细胞溶液以3,000g离心10分钟，并收集上清液，由此得到丙酮溶解的物质。
(vii)将如上所述得到的蒸馏水、甲醇和丙酮溶解的物质使用旋转真空蒸发仪浓缩。
(viii)使用冷冻干燥器将浓缩的样品干燥并溶解在蒸馏水、甲醇和丙酮中，由此得到细胞培养物的蒸馏水提取物、甲醇提取物和丙酮提取物。
实施例3：来自紫杉形成层或原形成层的细胞系提取物的抗氧化活性的测定
由于抗氧化效果与预防癌症之间的关系是已知的，进行下面的检测以便检查根据本发明的细胞系是否具有预防癌症的效果。
3-1：人类二倍体成纤维母细胞(HDF)的培养
将HDF细胞从胎儿阴茎包皮中分离并培养。通过将56℃加热30分钟失活的10％的胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，Utah，USA)、100单位/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素和300μg/mL的谷氨酸加入到DMEM培养基(Invitroge Gibco life tech.Vienna，Austria)中制备培养基。将细胞在上面描述的培养基中在5％CO2培养箱中在37℃的温度和95％湿度下培养并以3-4天为间隔在细胞即将开始彼此融合之前传代。根据传代次数(代数)将传代细胞分成不超过20代的早期培养细胞、21-49代的中期培养细胞以及超过50代的晚期培养细胞。
3-2：由H2O2诱导的活性氧的测定
为了检查当使用实施例2中得到的提取物中的蒸馏水提取物处理皮肤二倍体成纤维母细胞(HDF细胞)时由H2O2诱导的活性氧是否被抑制，进行了活性氧(ROS)的测定。
细胞内活性氧的测定通过使用对活性氧敏感的DCFDA(2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸(dichlorofluorescin diacetate)，Fluka Cat 35847Molecular Probes，USA)荧光染料的Facscan分析来进行。根据每PD的HDF细胞在100-mm培养板上生长，然后使用5μM的DCFDA在黑暗条件下37℃培养30分钟。然后，使用PBS将细胞洗涤两次并通过使用胰岛素-EDTA处理进行收集。然后，通过900rpm离心4分钟收集细胞，然后测定每10,000个细胞的活性氧(图2(a)和2(b))。
将5x105个细胞分散到6孔板中，然后单独或者与在实施例2中得到的提取物结合使用H2O2处理。作为提取物，在实施例2中得到的提取物中的蒸馏水提取物以10-100μg/mL、优选50μg/mL的浓度被使用。然后，将细胞使用HBSS(Hank′s平衡盐溶液)洗涤2-3次并在HBSS中固定大约30分钟。然后，使用10μM的DCFDA(Molecular Probes USA)在黑暗条件中37℃下将细胞染色1小时，使用HBSS洗涤3次，然后使用荧光显微镜观察(图2(c))。
如上所述，将HDF细胞使用200μM的H2O2和在实施例2中得到的10-100μg/mL(优选50μg/ml)的蒸馏水提取物处理，观察细胞的形态学变化。
在细胞使用H2O2处理之后24小时，HDF细胞通过氧化应力(oxidativestress)产生活性氧(ROS)。由于非荧光DCFDA通过活性氧被氧化形成显示强荧光的DCF，可测定活性氧。在该实施例中，FACS Calibur(BectonDickinson Analytic Flow Cytometer，USA)被用于测定。
结果，如图2所示，来自紫杉形成层的细胞系提取物和来自紫杉原形成层的细胞系提取物都抑制了活性氧(ROS)的产生。在图2中，P-WE：原形成层的蒸馏水提取物，C-WE：形成层的蒸馏水提取物。也就是说，可以观察到两种细胞系提取物都抑制活性氧的产生。
具有极佳抗氧化活性的物质是抑制由细胞氧化引起的细胞损伤的活性物质，并且在体内产生的活性氧(ROS)与细胞分子诸如细胞内DNA、蛋白质和脂类结合引起细胞突变，并通过抑制细胞的正常功能在癌组织形成中涉及。
因此，由于在上面的实验中发现本发明的来自紫杉形成层的细胞系和来自原形成层的细胞系具有抗氧化效果，本发明的来自紫杉形成层的细胞系和来自原形成层的细胞系具有预防癌症的效果。
实施例4：通过来自紫杉形成层和原形成层的细胞系给药的抗癌活性
(1)在该实施例中，根据一般动物饲养规则饲养从Damool Science(Daejeon，Korea)购买的Balb/C小鼠。特别是，购买6周龄小鼠并饲养大约5天。然后，将1x 106CT-26结肠癌细胞(Korean Cell Line BankKCLB80009)皮下注射到小鼠背部的右部。
在注射癌细胞之后大约3天，观察到癌细胞生长到大约与去皮栗子相等的尺寸。因此，从癌细胞注射3天开始，将在实施例1中得到的来自形成层的细胞系和来自原形成层的细胞系自由喂养小鼠。对照组喂养含有常规养分的鼠饲料，并且细胞系给药通过将细胞系以1∶1的比例加入到精细粉碎的相同饲料制备成具有与常规饲料相同形状的饲料并允许小鼠自由接近制备的饲料来进行。这里，细胞系的每天平均剂量为2-3g细胞鲜重/小鼠。对照组与试验组之间所有的其他条件都相同，并观察3周癌细胞的大小。在实验中，对照组和细胞系饲养组每组包括15只动物(7只动物用于来自形成层的细胞系，8只动物用于来自原形成层的细胞系)，并将该实验重复3次。
(2)细胞系给药三周后癌细胞尺寸的观察结果
在根据本发明的细胞系给药之后2周，观察模型小鼠中癌组织的大小。结果，如图3所示，可以观察到与对照组相比使用来自形成层的细胞系和来自原形成层的细胞系给药的组中癌组织的生长受到抑制。
而且，如图4所示，在使用细胞系给药之后3周，使用细胞系给药的组中癌组织的体积大约为100mm3，而对照组显示癌组织的体积比细胞系给药的组的体积大6倍。另外，癌组织被切除并被拍照，结果，如图5所示，对照组与细胞系给药组之间在体积方面存在明显差别。测定了切除的癌组织的重量，结果观察到，对照组中癌组织的平均重量为2.16g，相反细胞系给药组中癌组织的平均重量为0.21g，大约是对照组的1/10。因此，可以发现根据本发明的细胞系抑制了癌细胞的常规生长，表明这些细胞系具有预防和治疗癌症的效果。
(3)同时，将癌组织从对照组和细胞系给药组切除，然后在不同放大倍数下观察其内部组织。观察结果在图6中显示。
在观察结果中，对照组特征是没有显示被称为凋亡的细胞死亡区域，其整个区域中的组织致密，并且正在分裂的细胞(在图6(a)中由“b”表示的部分)很大。正在分裂的细胞很大的事实意味着对照组中的癌组织继续生长并膨大。
但是，在细胞系给药组中，组织不致密，并且大多数细胞显示被称为凋亡体的核浓缩(在图6(b)中由“c”表示的部分)或者分裂成各种组织。这些凋亡体在对照组中基本上不出现。
另外，非常具有特征性的现象是显示组织中的血管的红细胞染色(在图6(a)中由“a”表示的部分)。对照组显示许多血管，但细胞给药组不显示血管。在细胞给药组中，被预测为免疫细胞的显示圆形细胞核的细胞被显著地观察到(在图6(b)由“d”表示的部分)，但在对照组中基本上观察不到。
因此，可以看到本发明的来自紫杉形成层或者原形成层的细胞系在肿瘤生长中直接涉及以诱导细胞死亡，表明其通过抑制癌组织的正常生长而具有预防和治疗癌症的效果。另外，可以看到其抑制在癌发生中出现的血管形成并增强了免疫细胞对癌组织的浸润以诱导强免疫活性，由此显示强的抗癌活性。
实施例5：来自紫杉形成层和原形成层的细胞系提取物的制备和癌细胞杀死活性
(1)癌细胞培养
人类癌细胞系：口腔癌细胞系(KB细胞，Korean Cell Line BankKCLB10017)、肺癌细胞系(HCC95，Korean Cell Line Bank KCLB70095)、前列腺癌细胞系(PC-3，Korean Cell Line Bank KCLB21435)、骨肉瘤细胞系(U2-OS，Korean Cell Line Bank KCLB30096)、白血病细胞系(K-562，Korean Cell Line Bank KCLB10243)、子宫癌细胞系(HeLa，Korean CellLine Bank KCLB10002)、皮肤癌细胞系(HT1080，Korean Cell Line BankKCLB 10121)、胰腺癌细胞系(MIA CaPa-2，Korean Cell Line BankKCLB21420)、乳腺癌细胞系(MCF-7，Korean Cell Line BankKCLB30022)、胃癌细胞系(AGS，Korean Cell Line Bank KCLB21739)，肾癌细胞系(Caki-1，Korean Cell Line Bank KCLB30046)和肝癌细胞系(HepG2，Korean Cell Line Bank KCLB88065)。
小鼠癌细胞系：皮肤癌细胞系(B16F10，Korean Cell Line BankKCLB8008)和结肠癌细胞系(CT-26，Korean Cell Line Bank KCLB80009)。
细胞培养：根据细胞种类，将每种细胞系在RPMI或者DMEM培养基中培养。将通过56℃加热30分钟失活的10％的胎牛血清(FBS)、青霉素(100单位/mL)、链霉素(100μg/mL)和300μg/mL的谷氨酸盐加入到培养基中。将每种细胞系在培养基中37℃下在湿度为95％的5％CO2的培养箱中培养，并以3-4天为间隔在细胞即将彼此融合之前传代。在实验中，仅仅使用传代总数少于30代的细胞。
使用提取物处理并测定细胞杀死活性：1x105个细胞在6孔板中培养，并在6小时之后当细胞完全附着于6孔板时，分别使用蒸馏水、甲醇和丙酮提取物对细胞进行处理(150，400，800μg/mL的培养物)。然后，在使用提取物处理之后3天测定细胞死亡的程度。细胞的增殖根据MTT测定(3-[4，5-二甲基噻唑-2-yl]-2，5-溴化二苯基四唑)法进行测定。
将在使用提取物处理的组中细胞生长的降低程度与未使用任何物质处理的对照组、具有甲醇和丙酮加入到其中的赋形剂组以及使用来自紫杉的紫杉醇(Sigma)作为抗癌剂处理的阳性对照组进行比较。将细胞使用给定时间内加热到37℃的细胞培养基洗涤2次，然后将1mL MTT溶液(5mg/mL，不含酚红)加入到其中。然后，将细胞再次培养4小时。除去上清，并将产生的甲暨(formazen)沉淀溶解在1mL DMSO中并在570nm测定吸光度。在使用提取物处理并使用结晶紫对附着的存活细胞进行染色后3天通过使用50％的甲醇固定细胞来观察存活细胞的数目。
(2)通过使用提取物处理得到的试验结果
在分别使用蒸馏水、甲醇和丙酮提取物(800μg/mL)的处理细胞之后3天存活的细胞
将已经除去培养基的每种来自紫杉的细胞系顺序溶解在蒸馏水、甲醇和丙酮中以得到细胞系提取物，然后使用每种提取物对细胞进行处理。结果，在大多数试验细胞中甲醇提取物显示了最高的凋亡活性，并且该凋亡活性类似于使用大约10μg/mL的紫杉醇处理的阳性对照组(图7的Taxol(紫杉醇))中的凋亡效果。
蒸馏水和丙酮提取物也显示了凋亡效果，但显示了普遍低于甲醇提取物的凋亡活性。但是，仅仅使用甲醇和丙酮处理的赋形剂对照组(图7的赋形剂)不具有凋亡效果。这表明细胞系的提取物含有显示癌细胞杀死活性的物质。在接着的步骤中，使用各种浓度的甲醇提取物对细胞进行处理，并测定细胞凋亡的程度。
根据使用各种浓度的甲醇提取物处理的凋亡活性
将甲醇提取物以200mg/mL的浓度溶解在甲醇中并分别以150，400和800μg/mL的浓度加入1mL的测试细胞系培养基中。在加入甲醇提取物之后，通过MTT方法以1天为间隔从第1天到第3天测定细胞的生长，在添加甲醇提取物三天后，使用甲醇固定存活的细胞，然后使用结晶紫染色。对于14癌细胞系的测定结果在图8到图21中示出。
在上述结果中，根据本发明的来自紫杉形成层或原形成层的细胞系的甲醇提取物在14癌细胞系中以浓度依赖的方式显示了凋亡活性。800μg/mL的甲醇提取物在所有细胞系中显示了强凋亡活性，并且该凋亡活性与在阳性对照组中使用的紫杉醇(10μg/mL)的凋亡活性类似。但是，在CT-26(图8)和B16F10(图13)中，800μg/mL的甲醇提取物显示了比阳性对照组高的凋亡活性。在阳性对照组中使用的紫杉醇与根据本发明的细胞系的甲醇提取物之间的量的差别是由于紫杉醇是纯度很高的物质，而细胞系提取物是大量化合物的混合物的事实。因此认为根据本发明的细胞系的凋亡活性可通过纯化步骤进一步得到提高。
实施例6：来自紫杉形成层或原形成层的细胞系是否含有紫杉醇的测定
同时，为了证明根据本发明的细胞系的抗癌活性不是紫杉醇的活性的事实，以下列方式检查了本发明的细胞系中紫杉醇的存在。
在该实施例中使用的紫杉醇(Taxol)标准品购自Sigma，并将HPLC水(J.T.Baker)、乙腈和甲醇经0.2μm过滤器过滤然后用作流动相。
将0.2g在实施例1中制备的细胞系在0.4mL的MeOH中涡旋5分钟，然后在室温下提取1小时。将提取物13000rpm离心5分钟然后经0.2μm过滤器过滤，并通过UPLC定量分析滤液。
在UPLC(Waters，MA，USA)分析中，使用UPLC BEH C18柱(100mmx2.1mm i.d.x1.7μm)将提取物与标准品相比较定量分析。作为流动相，水和乙腈在梯度洗脱中以0.4mL/min的流速被使用，并在UV 227nm的吸光率下进行UV检测。
通过UPLC在227nm和280nm处的吸光度分析紫杉醇(taxol)标准品。结果，如图22(a)所示，保留时间(retention time)为4.67分钟。另外，据报道紫杉醇必须显示大约0.05的UV吸收比(227nm/280nm)(Castor&Tyler 1993)，并且在该实施例中测定了紫杉醇标准品，UV吸光度比值A(280nm)/A(227nm)为0.048。
同时，通过UPLC分析了根据本发明的细胞系(样品)在227nm和280nm的吸光度。结果，如图22(b)所示，保留时间为4.70分钟。另外，细胞系(样品)提取物被分析，结果，227nm和280nm的UV吸光度比值为A(280nm)/A(227nm)＝1.24，表明细胞提取物不含有紫杉醇。
另外，分析了紫杉醇标准品和根据本发明的细胞系提取物的PDA波谱。如图22(c)和图22(d)所示，分析结果显示根据本发明的细胞系不含紫杉醇。
实施例7：药物制剂的制备
制剂1：片剂的制备
将在实施例1中制备的100mg细胞系提取物与100mg玉米淀粉、100mg乳糖和2mg硬脂酸镁混合，并根据常规制作药片的方法将混合物压缩成片剂。
制剂2：胶囊剂的制备
将在实施例1中制备的500mg细胞系提取物填充到软凝胶胶囊中制备胶囊剂。
制剂3：糖浆剂的制备
将在实施例1中制备的1mg细胞系与10g异构糖、5g山梨醇和适量纯净水混合，并根据常规方法将混合物制备成100mL糖浆剂。
制剂4：注射剂的制备
将在实施例1中制备的200mg细胞系提取物加热并溶解到200mg的含有聚氧乙烯氢化蓖麻油的生理盐水中，由此制备含有浓度为0.1％的混合的提取物的注射液。
实施例8：功能性食品的制备：功能饮料的制备
制备1：将在实施例1中制备的200mg细胞系溶解在96mL水中，然后将作为填充剂的500mg维生素C、作为增香剂的柠檬酸和寡糖各1g和作为防腐剂的苯甲酸钠0.05g加入到其中。然后，将纯净水加入到其中，由此制备100mL功能饮料。
制备2：将在实施例1中制备的200mg细胞系提取物溶解在96mL水中，然后将作为填充剂的500mg维生素C、作为增香剂的柠檬酸和寡糖各1g和作为防腐剂的苯甲酸钠0.05g加入到其中。然后，将纯净水加入到其中，由此制备100mL功能饮料。
工业实用性
如上所述，根据本发明的细胞系、其溶解产物、提取物和培养基来自天然物质，与现有技术的治疗药物相比具有更小的副作用，对人体安全，在肿瘤生长中直接涉及以诱导癌细胞死亡，并显示了抑制在癌发生(carcinogenesis)中出现的血管生成的抗癌活性。因此，它们对于预防、治疗和环节癌症来说是有用的。
虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，对本领域技术人员来说容易想到的是该描述仅仅用于优选实施方式而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围由随附的权利要求书及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其含有选自下组的一种或多种的，该组包括细胞系、其溶解产物、其提取物以及其培养基，所述细胞系来自紫杉形成层或原形成层，并具有下列特征：
(a)其形态学特征为具有大量的液泡；
(b)其处于天然未分化的状态；并且
(c)其为同质的细胞系。
2.根据权利要求1所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述细胞系的其他特征为：(a)其在悬浮培养过程中以单个细胞存在；(b)与来自紫杉形成层以外的其他组织的细胞系相比，其具有较高的生长速度并可被稳定培养；以及(c)与来自紫杉形成层以外的其他组织的细胞系相比，其在生物反应器中具有对剪切应力较低的敏感性。
3.根据权利要求1所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述细胞系使用包括下列步骤的分离方法得到：
(a)得到含有紫杉形成层或原形成层的组织；
(b)通过培养得到的含有形成层或原形成层的组织，诱导从形成层或原形成层增殖形成层层或原形成层层，并诱导从形成层或原形成层以外的其他组织增殖的无定形愈伤组织层；以及
(c)收集来自形成层层或原形成层层的细胞系。
4.根据权利要求3所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，在所述其中步骤(c)通过在培养基中增殖组织然后收集增殖的细胞来进行，所述培养基含有3-5wt％的粗糖或糖以及至少一种选自下组的物质，该组包括：甲基茉莉酮酸酯、真菌提取物、细菌提取物、酵母提取物、壳聚糖、葡甘露聚糖、葡聚糖、苯丙氨酸、苯甲酸、水杨酸、花生四烯酸、STS、mevalonalonate N-benzolyglycine、ABA、SNP、IPP、BHT、CCC、乙烯利、马尿酸、硝酸铯铵、AgNO3、硫酸氧钒、p-氨基苯甲酸、油菜素类固醇、藻酸钠和醋酸钠。
5.根据权利要求1所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述提取物使用选自下组的溶剂得到，包括蒸馏水、乙醇、丙酮、DMSO以及它们的混合溶剂。
6.根据权利要求1-5任意之一所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述癌症选自下组，包括结肠癌、口腔癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤、白血病、子宫癌、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、肾癌和肝癌。
7.一种用于预防或改善癌症的功能食品，其特征在于，含有选自下组的一种或多种，该组包括细胞系、其溶解产物、其提取物以及其培养基，所述细胞系来自紫杉的形成层或原形成层并具有如下特征：
(a)其形态学特征为具有大量的液泡；
(b)其处于天然未分化的状态；并且
(c)其为同质的细胞系。
8.根据权利要求7所述的用于预防或改善癌症的功能性食品，其特征在于，所述细胞系的其他特征为：(a)其在悬浮培养过程中以单个细胞存在；(b)与来自紫杉形成层以外的其他组织的细胞系相比，其具有较高的生长速度并被稳定培养；以及(c)与来自紫杉形成层以外的其他组织的细胞系相比，其在生物反应器中具有对剪切应力较低的敏感性。
9.根据权利要求7所述的用于预防或改善癌症的功能性食品，其特征在于，所述细胞系使用包括下列步骤的分离方法得到：
(a)得到含有紫杉形成层或原形成层的组织；
(b)通过培养得到的含有形成层或原形成层的组织，诱导从形成层或原形成层增殖形成层层或原形成层层，并诱导从形成层或原形成层以外的其他组织增殖的无定形愈伤组织层；以及
(c)收集来自形成层层或原形成层层的细胞系。
CN200880111207.9A 2007-10-10 2008-10-10 含有来自紫杉形成层或原形成层的植物干细胞系的抗癌组合物 Active CN101842112B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20070102178 2007-10-10
KR10-2007-0102178 2007-10-10
PCT/KR2008/006002 WO2009048306A1 (en) 2007-10-10 2008-10-10 Anticancer composition comprising plant stem cell line derived from taxus cambium or procambium

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101842112A true CN101842112A (zh) 2010-09-22
CN101842112B CN101842112B (zh) 2014-04-23

Family

ID=40549369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880111207.9A Active CN101842112B (zh) 2007-10-10 2008-10-10 含有来自紫杉形成层或原形成层的植物干细胞系的抗癌组合物

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20100272692A1 (zh)
EP (1) EP2227247A4 (zh)
JP (1) JP2011500559A (zh)
KR (1) KR101073985B1 (zh)
CN (1) CN101842112B (zh)
AU (2) AU2008202078B2 (zh)
CA (1) CA2700236A1 (zh)
HK (1) HK1144382A1 (zh)
MX (1) MX2010003934A (zh)
RU (1) RU2440820C2 (zh)
WO (1) WO2009048306A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104854236A (zh) * 2012-09-27 2015-08-19 韩国科学技术院 源自人参的新型udp-糖基转移酶和其应用
US9670469B2 (en) 2012-09-27 2017-06-06 Intelligent Synthetic Biology Center UDP-glycosyltransferase derived from ginseng and use thereof
CN109321611A (zh) * 2018-10-22 2019-02-12 覃家日 紫杉醇的生产方法
CN111135219A (zh) * 2020-01-15 2020-05-12 好牧人干细胞生物科技有限公司 一种溶通血栓消解癌变细胞、肿瘤的植物干细胞组合物
CN111201320A (zh) * 2017-10-05 2020-05-26 医疗法人社团市川诊所 具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分或组合物的制备方法

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2386626B1 (en) 2005-10-31 2016-10-26 Unhwa Corporation Stability of secondary metabolite mass production through syncronized plant cell cultures
US8053238B2 (en) * 2005-10-31 2011-11-08 Unhwa Corporation Isolated population of plant single cells and method of preparing the same
KR101064518B1 (ko) * 2007-09-21 2011-09-19 주식회사 운화 저장근을 가지는 초본식물의 형성층 유래 식물줄기세포주 및 이의 분리방법
KR101100867B1 (ko) * 2008-05-14 2012-01-02 주식회사 운화 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물
KR101179171B1 (ko) 2008-08-14 2012-09-03 주식회사 운화 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물
AU2009300536A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Unhwa Corporation Composition for preventing or treating aids containing plant stem cell line derived from cambium of Panax ginseng including wild ginseng or ginseng as active ingredient
US9314492B2 (en) * 2008-11-06 2016-04-19 Unhwa Corporation Composition for cancer prevention or treatment containing as active ingredient plant stem cell line dervied from cambium of Panax ginseng including wild ginseng or ginseng
WO2010137879A2 (ko) * 2009-05-26 2010-12-02 주식회사 운화 버드나무과의 형성층 유래 식물줄기세포 및 이의 분리배양방법
KR101212032B1 (ko) * 2009-05-26 2012-12-12 주식회사 운화 국화과의 형성층 유래 식물줄기세포 및 이의 분리배양방법
RU2011153268A (ru) * 2009-05-28 2013-07-10 Юнхва Корпорейшн Растительная стволовая клетка, происходящая из камбия семейства solanaceae, способ ее выделения и культивирования
US8697086B2 (en) * 2010-01-19 2014-04-15 Chieh-Chou Yu Use of Antrodia camphorata for treating diseases
WO2012052854A2 (en) * 2010-10-23 2012-04-26 Unhwa Corporation Plant cell lines and methods of isolating the same
DE102013101876B3 (de) 2013-02-26 2014-06-12 Innovations- und Informationszentrum Schneiden und Fügen e.V. Verfahren zum stoffschlüssigen Fügen eines Kabels mit einem Anschlusselement sowie konfiguriertes Kabel
CN107022519B (zh) * 2017-05-16 2021-03-26 安徽农业大学 茶叶悬浮单细胞的分离培养方法
WO2019222414A1 (en) * 2018-05-16 2019-11-21 Belite Bio, Llc Fatty acid analogues and methods of use
US10987390B2 (en) * 2018-12-06 2021-04-27 Maryam Rahimi Plant stem cell product treatments
WO2023225268A1 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 The University Of Chicago Vanadyl sulfate compositions and methods of use therefor for the treatment and prevention of aging-related diseases and cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5407816A (en) * 1992-02-20 1995-04-18 Phyton Catalytic, Inc. Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of taxus species

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5019504A (en) * 1989-03-23 1991-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Production of taxol or taxol-like compounds in cell culture
US7264951B1 (en) * 1992-02-20 2007-09-04 Phyton, Inc. Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species
US5850032A (en) * 1992-04-01 1998-12-15 Union Camp Corporation Method for production of plant biological products in precocious neomorphic embryoids
JPH07508163A (ja) * 1992-04-01 1995-09-14 ユニオン・キャンプ・コーポレーション イチイ属の体細胞胚形成の誘導及びそれからのタキサン環含有アルカロイドの生産
KR950005081B1 (ko) * 1993-07-06 1995-05-18 산림청임목육종연구소 주목 종자의 씨눈 유래의 체세포배 및 체세포배성세포 혹은 그 배양배지로부터 택솔(Taxol) 및 그 유도체를 생산하는 방법
KR960008427B1 (en) 1993-07-19 1996-06-26 Lg Inf & Comm Ltd Multi-terminal connecting apparatus of pbx
KR970010602B1 (ko) * 1993-12-22 1997-06-28 주식회사 태평양 주목의 세포배양에 의한 택솔의 생산방법
KR0150347B1 (ko) * 1995-04-29 1998-10-15 박종헌 결정화에 의한 텍서스속 식물체로 부터 택솔의 정제방법
KR100533120B1 (ko) 2003-06-16 2005-12-14 주식회사 운화 바이오텍 형성층을 이용한 식물세포배양 방법
EP2386626B1 (en) * 2005-10-31 2016-10-26 Unhwa Corporation Stability of secondary metabolite mass production through syncronized plant cell cultures

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5407816A (en) * 1992-02-20 1995-04-18 Phyton Catalytic, Inc. Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of taxus species

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104854236A (zh) * 2012-09-27 2015-08-19 韩国科学技术院 源自人参的新型udp-糖基转移酶和其应用
US9670469B2 (en) 2012-09-27 2017-06-06 Intelligent Synthetic Biology Center UDP-glycosyltransferase derived from ginseng and use thereof
CN104854236B (zh) * 2012-09-27 2018-01-16 韩国科学技术院 源自人参的新型udp‑糖基转移酶和其应用
CN104854235B (zh) * 2012-09-27 2018-01-16 韩国科学技术院 源自人参的新型udp‑糖基转移酶和其应用
CN104854236B9 (zh) * 2012-09-27 2018-03-13 韩国科学技术院 源自人参的新型udp‑糖基转移酶和其应用
CN111201320A (zh) * 2017-10-05 2020-05-26 医疗法人社团市川诊所 具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分或组合物的制备方法
CN111201320B (zh) * 2017-10-05 2023-09-01 医疗法人社团市川诊所 具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分或组合物的制备方法
CN109321611A (zh) * 2018-10-22 2019-02-12 覃家日 紫杉醇的生产方法
CN111135219A (zh) * 2020-01-15 2020-05-12 好牧人干细胞生物科技有限公司 一种溶通血栓消解癌变细胞、肿瘤的植物干细胞组合物

Also Published As

Publication number Publication date
AU2008202078A1 (en) 2008-05-29
JP2011500559A (ja) 2011-01-06
US20130315877A1 (en) 2013-11-28
AU2008202078B2 (en) 2012-05-31
US8790927B2 (en) 2014-07-29
MX2010003934A (es) 2010-08-18
EP2227247A1 (en) 2010-09-15
AU2008311515A1 (en) 2009-04-16
KR20090037358A (ko) 2009-04-15
RU2440820C2 (ru) 2012-01-27
US20100272692A1 (en) 2010-10-28
EP2227247A4 (en) 2011-05-11
CA2700236A1 (en) 2009-04-16
KR101073985B1 (ko) 2011-10-17
WO2009048306A1 (en) 2009-04-16
CN101842112B (zh) 2014-04-23
RU2010117202A (ru) 2011-11-27
HK1144382A1 (zh) 2011-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101842112B (zh) 含有来自紫杉形成层或原形成层的植物干细胞系的抗癌组合物
CN103735728B (zh) 地骨皮醇提物、地骨皮甲素及乙素在制备具有神经保护作用的药物中的用途
CN104826087B (zh) 复合辣木多肽及其制备方法和应用
CN101485463B (zh) 一种具有多种保健功效的天然产品组方
CN103305455A (zh) 红豆杉植物干细胞系培育与抗癌物的提取制作方法
CN102325538A (zh) 含有源自包括野山参或人参的人参类形成层植物干细胞系作为活性成分的增强免疫用组合物
CN108892735A (zh) 一种白芨寡糖及其在促进血管新生中的应用
CN104379143A (zh) 抗癌剂
CN108348563A (zh) 含有紫草根提取物作为有效成分的用于预防、改善或治疗周围神经病变的组合物
CN104193845B (zh) 一种地木耳抗肿瘤多糖及其制备方法和应用
CN102114170B (zh) 防治心肌缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法
Hussein et al. Cytotoxicity and 1H NMR metabolomics analyses of microalgal extracts for synergistic application with Tamoxifen on breast cancer cells with reduced toxicity against Vero cells
MUNIANDY et al. Active compound, antioxidant, antiproliferative and effect on stz induced zebrafish of various crude extracts from Boletus Qriseipurpureus
CN105193795A (zh) 两种卤酚化合物在促血管生成作用方面的应用
CN106177187A (zh) 具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物
Farhan et al. Prophylactic efficacy of local Pleurotus ostreatus extract against histopathological changes induced by cyclophosphamide in mice.
CN105560302B (zh) 老鹳草水提物在制备抗血管生成类药物中的应用
KR100493708B1 (ko) 면역활성 및 항암 효과 증진용 조성물
JP6324551B2 (ja) 抗乳癌剤、抗乳癌用食品、乳癌を抑制するための方法及び抗乳癌剤の製造方法
JP2001131083A (ja) 鹿角霊芝抽出物活性物質及びそれを含む医薬、健康食品、化粧料
CN108611279A (zh) 一种囊孔附毛菌的驯化方法及驯化的囊孔附毛菌和应用
CN106860781A (zh) 一种米根霉固态发酵提取物、制备方法及其抗癌功效的应用
JPWO2007119754A1 (ja) 白血病予防用又は治療用の薬剤、並びに飲食物
KR20130067036A (ko) 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 항암 조성물
CN104523665B (zh) 双3‑甲氧基2‑羟基‑苯甲醛缩二乙烯三胺在制备抗癌药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1144382

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: CHEN RONGYU LI ENJING

Effective date: 20141124

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20141124

Address after: Jeonbuk city state

Patentee after: UNHWA Corp.

Patentee after: Chen Rongyu

Patentee after: Li Enjing

Address before: Jeonbuk city state

Patentee before: UNHWA Corp.

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1144382

Country of ref document: HK

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20170209

Address after: The British Virgin Islands of Tortola

Patentee after: WELLKEY HOLDINGS LTD.

Address before: Jeonbuk city state

Patentee before: UNHWA Corp.

Patentee before: Chen Rongyu

Patentee before: Li Enjing

CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Park Zhongxuan

Inventor after: Lin Minzhen

Inventor after: Wu Yishi

Inventor after: Li Daxi

Inventor after: Li Zhengchang

Inventor after: Li Yinqing

Inventor after: Chen Rongyu

Inventor before: Park Chongxuan

Inventor before: Lin Minzheng

Inventor before: Wu Rixi

Inventor before: Li Daxi

Inventor before: Li Zhengchang

Inventor before: Li Enjing

Inventor before: Chen Rongyu

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210209

Address after: Room 1019, building 9b, shenzhenwan science and technology ecological park, Shahe West Road, Yuehai street, Nanshan District, Shenzhen City, Guangdong Province

Patentee after: Shenzhen Zhihui Technology Industry Co.,Ltd.

Address before: Tortola Island, British Virgin Islands

Patentee before: WELLKEY HOLDINGS Ltd.

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220901

Address after: Room 3612M9, Building A, Galaxy Century, No. 3069, Caitian Road, Gangxia Community, Futian Street, Futian District, Shenzhen, Guangdong 518000

Patentee after: Shenzhen Luquan Industrial Co.,Ltd.

Address before: 518000 room 1019, building 9b, shenzhenwan science and technology ecological park, Shahe West Road, Yuehai street, Nanshan District, Shenzhen City, Guangdong Province

Patentee before: Shenzhen Zhihui Technology Industry Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right