JP2011500559A

JP2011500559A - イチイ属の形成層または前形成層由来植物幹細胞株を含む抗癌組成物

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Publication number: JP2011500559A
Application number: JP2010528812A
Authority: JP
Inventors: ジョンヒョンパク; ミンジュンイム; イルソクオ; デヒイ; ジョンチャンイ; ウンギョンイ; ヨンウチン
Original assignee: Unhwa Corp
Current assignee: Unhwa Corp
Priority date: 2007-10-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2011-01-06
Also published as: CN101842112B; AU2008202078A1; AU2008202078B2; EP2227247A1; KR20090037358A; KR101073985B1; RU2440820C2; CA2700236A1; EP2227247A4; RU2010117202A; HK1144382A1; US8790927B2; US20100272692A1; CN101842112A; MX2010003934A; US20130315877A1; AU2008311515A1; WO2009048306A1

Abstract

本発明はイチイ属の形成層または前形成層由来細胞株（ｃｅｌｌｌｉｎｅ）、その破砕物、その抽出物またはその培養液を有効性分として含む癌の予防または治療用組成物に関する。本発明による細胞株、その破砕物、その抽出物またはその培養液は既存の薬物治療剤の副作用を最小化して、人体に安全であり、かつ癌の成長に直接係わって癌の死滅を誘導し、癌発生時に現れる新生血管形成を抑制させる抗癌活性を示すため、癌の予防、治療及び症状緩和に有用である。

Description

本発明はイチイ属の形成層、または前形成層由来細胞株（ｃｅｌｌｌｉｎｅ）、その破砕物、その抽出物またはその培養液を有効性分として含む癌の予防または治療用組成物に関する。

アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）は、細胞内部において予定された信号に従ってあらゆる遺伝子及び蛋白質の発現と活性が調節されて起こる能動的な死であり、その過程を通して生成されたアポトソーム（ａｐｏｐｔｏｓｏｍｅ）は周辺の細胞やマクロファージ等の食細胞作用によって除去されることによって、炎症を誘発しない。このようなアポトーシスは生命体の多様な正常生理的現象において頻繁に観察されるが、多くの疾患の発病過程にも深く係わっていると知られている。即ち、異常アポトーシスの発生は脳神経退行性疾患（ｎｅｕｒｏｇｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒ）、免疫系異常（ｉｍｍｕｎｅｄｉｓｏｒｄｅｒ）、そして心臓血管系疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ）等の原因となる可能性があり、細胞死滅の非正常的な抑制は癌の原因になる。

アポトーシスが正常な調節過程から抜け出して、非正常的に生じたり抑制されて現れる疾病をより詳しく調べると、ｐ５３、ｐ１６及びＢｃｌ−２等の遺伝子の異常発現によって誘導される癌、ＨＩＶヘルペス及びインフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウィルスによる感染症、Ｉ型糖尿病（Ｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｅｓ）、リューマチ関節炎（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）と筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａｇｒａｖｉｓ）等のような自己免疫疾患がある。個体を構成する各細胞のアポトーシスは、遺伝的に損傷を受けた細胞や分化刺激剤によって不適切な分化の誘導による腫瘍の進行を防ぐために、これらの異常細胞を個体から除去するための手段、即ち回復不可能な遺伝的傷を持った細胞を個体から除去するための一般的な手段である。この概念は一般的に使用される抗癌剤が癌細胞の増殖抑制と係わるアポトーシス過程を介して、癌細胞の死滅を誘導するという事実によってサポートされている（Barry, M.A. et al., Biochem Pharmacol., 40:2353, 1990; Hickman, J.A., Cancer Metastasis Rev., 11:121, 1992）。

従って、アポトーシスのプロセスの攪乱は、損傷した細胞、及び損傷が始まった細胞の生存とそれらの細胞の成長を誘導するため、アポトーシスの抑制は発癌過程において重要な役割を果たす。それと共に、癌予防効果がある物質はこのような異常細胞の死滅を誘導し、これらによるアポトーシスの誘発は少なくともこれらの癌予防活性と係わっていると報告されて来た（Fesus, L., J. Cell Biochem., 22:151, 1995; Reddy, B.S., Cancer Res., 57:420, 1997）。

一方、癌の発生の機序や治療に対する研究のために莫大な研究費を投資してきたが、いまだに癌は難治性疾病として残り、多くの治療法は副作用を招くことが明らかになっている（Goodman et al., Cancer Res., 9:2295, 1987）。従って、癌を抑制する新しい薬品研究及び製剤開発に多くの努力を注いでおり、特に副作用の少ない天然物における抗癌物質の開発に関する研究に関心が集中している。

本発明者のうちの一部は脱分化による変異の問題を解決して安定的に増殖が可能であり遺伝的安全性が高い形成層または前形成層由来細胞株の提供方法を開発して、前記細胞株のうちのイチイ属由来細胞株を培養する場合パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）が高収率で得られることを確認した後、国際特許出願（ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００１５４４号）した経緯があるが、イチイ属の形成層または前形成層由来細胞株自体の抗癌効果はまだ報告されていない状態である。

そこで、本発明者は既存の抗癌剤の副作用を最小化して抗癌活性が優秀な天然物由来抗癌組成物を開発しようと鋭意努力した結果、イチイ属の形成層または前形成層から誘導された同質な細胞株、その破砕物、その抽出物及びその培養液が癌細胞死滅活性を示すことを確認して、本発明の完成に至った。

国際特許出願ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００１５４４号韓国登録特許第０５３３１２０号

本発明の目的は既存の抗癌剤の副作用を最小化した癌の予防及び治療活性を示す天然物由来組成物を提供することにある。

課題を達成するための手段

前記目的を達成するために、本発明はイチイ属の形成層または前形成層由来の、以下の特性を持つ細胞株（ｃｅｌｌｌｉｎｅ）、その破砕物、その抽出物及びその培養液のいずれか一つ以上を含む癌の予防または治療用医薬組成物を提供する:
（ａ）多数個の液泡（ｖａｃｕｏｌｅ）を持つ形態学的特徴を示し;
（ｂ）先天的未分化状態（ｉｎｎａｔｅｌｙｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）であり;及び
（ｃ）同質な細胞株（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｃｅｌｌｌｉｎｅ）である。
本発明はさらに、前記細胞株、その破砕物、その抽出物及びその培養液のいずれか一つ以上を含む癌の予防または改善用機能性食品を提供する。
本発明はまたさらに、前記細胞株、その破砕物、その抽出物及びその培養液のいずれか一つの癌の予防または治療用用途を提供する。

本発明はまたさらに、前記細胞株、その破砕物、その抽出物及びその培養液のいずれか一つ以上を利用することを特徴とする癌の予防または治療方法を提供する。

本発明の他の特徴及び具現例は次の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明らかになる。

本発明による細胞株の誘導過程、前形成層及び形成層の層分離後の様子及び脱分化された細胞とイチイ属の前形成層由来細胞との間の比較を示す写真である。皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）にＨ_２Ｏ_２で処理して老化を誘導する際に、本発明による細胞株抽出物の抗酸化活性を示すＲＯＳ量を比較したグラフとＤＣＦＨ蛍光撮影写真である（ｐ−ＷＥ：前形成層蒸留水抽出物、Ｃ−ＷＥ：形成層蒸留水抽出物）。本発明による細胞株を投与してから２週間後の対照群と細胞株投与群のマウスの癌組織の大きさを外観的に比較した写真である。本発明による細胞株を投与してから３週間の対照群及び細胞株投与群の癌組織の体積を示すグラフである。本発明による細胞株を投与してから３週間後の対照群と細胞株投与群のマウスから癌組織を摘出して撮影した写真である。本発明による細胞株を投与してから３週間後、癌組織を摘出して内部組織を撮影した写真である。本発明による細胞株抽出物を各癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に大腸癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に肺癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に前立腺癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に骨癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に口腔癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に皮膚癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に白血病細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に子宮癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に皮膚癌（ヒト）細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に膵臓癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に乳癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に胃癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に腎臓癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のメタノール抽出物を濃度毎に肝臓癌細胞株に処理後、細胞死滅の程度を示した写真である。本発明による細胞株のパクリタキセル含有有無の分析結果を示すグラフである。

他に定義されない限り、本明細書において使われた全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練した専門家によって、通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使われた命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常使われている。

本発明の詳細な説明などに使われる主要用語の正義は次のようになる。
本願において「形成層（ｃａｍｂｉｕｍ）」とは、植物の幹と根を太くして、植物が体積生長できるようにする組織である。形成層は細胞分裂が最も活発に起きる分裂組織であり、植物組織培養の切片体として使用時、細胞の高速かつ大量生産が可能であると報告されている（韓国登録特許第０５３３１２０号）。

本願において「前形成層（ｐｒｏｃａｍｂｉｕｍ）」とは、始原細胞群から派生した１次分裂組織をいい、１次分裂組織の形成層は中間に永久組織の介入なしにこれから由来する。

本願において「破砕物」とは、細胞を、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などを利用した化学的方法または物理的方法などで破砕して得た細胞溶解物を意味し、細胞株の「抽出物」とは細胞を溶媒に溶かして、分離した物質であり、蒸留または蒸発を利用して濃縮される。

本願において「先天的未分化状態（ｉｎｎａｔｅｌｙｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）」とは、脱分化過程を経て未分化状態で存在するのではない、本来から分化前状態を維持することをいう。

本発明は一観点において、イチイ属の形成層または前形成層由来細胞株、その破砕物、その抽出物及びその培養液のいずれか一つ以上を有効性分として含む癌の予防または治療用組成物に関する。

本発明によるイチイ属の形成層または前形成層由来細胞株は（ａ）多数個の液泡（ｖａｃｕｏｌｅ）を持つ形態学的特徴を示し;（ｂ）先天的未分化状態（ｉｎｎａｔｅｌｙｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）であり;及び（ｃ）同質な細胞株（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｃｅｌｌｌｉｎｅ）であることを特徴とする。また、さらに（ａ）懸濁培養時に単細胞状態で存在し;（ｂ）イチイ属の形成層または前形成層以外の組織由来細胞株と比べて、生長速度が速く、安定するように培養され;及び（ｃ）イチイ属の形成層または前形成層以外の組織由来細胞株と比べて、生物反応器でおいてシェアストレス（ｓｈｅａｒｓｔｒｅｓｓ）に対して低い感受性を有することを特徴とする。

本発明において、前記細胞株は以下の工程を含む分離方法によって取得されたことを特徴とする:
（ａ）イチイ属の形成層または前形成層含有組織を取得する工程；
（ｂ）前記取得された形成層または前形成層含有組織を培養して、形成層または前形成層から増殖する形成層または前形成層の層（ｃａｍｂｉｕｍｏｒｐｒｏｃａｍｂｉｕｍｌａｙｅｒ）と、前記形成層または前形成層以外の部分から無定形に増殖するカルス層を誘導する工程；及び
（ｃ）前記形成層または前形成層の層（ｃａｍｂｉｕｍｏｒｐｒｏｃａｍｂｉｕｍｌａｙｅｒ）から細胞株（ｃｅｌｌｌｉｎｅ）を回収する工程。

この時、前記工程（ｃ）は３〜５重量％の原糖（ｒａｗｓｕｇａｒ）または砂糖；及びジャスモン酸メチル（ｍｅｔｈｙｌｊａｓｍｏｎａｔｅ）、真菌類抽出物、細菌類抽出物、酵母（ｙｅａｓｔ）抽出物、キトサン、グルコマンナン（ｇｌｕｃｏｍａｎｎａｎ）、グルカン（ｇｌｕｃａｎ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、安息香酸（ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ）、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄ）、ＳＴＳ、モバロナロネイトＮ−ベンゾリグリシン（ｍｅｖａｌｏｎａｌｏｎａｔｅＮ−ｂｅｎｚｏｌｙｇｌｙｃｉｎｅ）、ＡＢＡ、ＳＮＰ、ＩＰＰ、ＢＨＴ、ＣＣＣ、エセフォン（ｅｔｈｅｐｈｏｎ）、馬尿酸（ｈｉｐｐｕｒｉｃａｃｉｄ）、硝酸二アンモニウムセリウム（ａｍｍｏｎｉｕｍｃｅｒｉｃｎｉｔｒａｔｅ）、ＡｇＮＯ_３、硫酸バナジル（ｖａｎａｄｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、ｐ−アミノ安息香酸（ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ブラシノステロイド（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅ）、及び酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）からなる群から選択される物質；を含む培地で増殖させた後、前記増殖した細胞株を回収するのが望ましい。この時、前記ジャスモン酸メチルは１１０〜１００μＭの含有量で含むのが望ましい。

本発明において使用した培地は、通常の植物組織培養のための培地であり、例えば、Ｎ６培地、ＳＨ培地、ＭＳ培地、ＡＡ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰＭ培地、ＬＰ培地、Ｗｈｉｔｅ培地、ＧＤ培地、ＤＫＷ培地、ＤＣＲ培地などがあるが、これに限定されるのではない。

本発明において、前記抽出物は、蒸留水、アルコール、アセトン、ＤＭＳＯ（ＤｉｍｅｔｈｙｌＳｕｌｆｏｘｉｄｅ）及びこれらの混合溶媒からなる群から選択される溶媒を利用して抽出されることを特徴としている。

本発明の一実施例においては本発明によるイチイ属の形成層由来細胞株及び前形成層由来細胞株がＨ_２Ｏ_２によって誘導される活性酸素種を抑制する効果があることを確認して、抗酸化効果があることを確認した。体内において生成された酸素種（ＲＯＳ）は、細胞内ＤＮＡ、蛋白質及び脂質など、細胞を構成する分子と結合して、細胞突然変異を起こして細胞の正常機能を阻害することによって癌組織形成に係わっているため、癌を予防する効果があることが確認できた。

本発明の他の実施例においては、本発明によるイチイ属の形成層由来細胞株及び前形成層由来細胞株をマウスに投与した後、癌組織を摘出して観察した結果、本発明によるイチイ属の形成層由来細胞株及び前形成層由来細胞株が癌組織の成長を阻害して抗癌機序の一環として血管生成を抑制させ、免疫細胞の癌組織内の流入を高めることを確認した。

本発明の他の実施例においては、さらに、大腸癌、口腔上皮癌、肺癌、前立腺癌、骨癌、白血病、子宮癌、皮膚癌、膵臓癌、乳癌、胃癌、腎臓癌、及び肝臓癌の細胞株に対して各々前記細胞株の蒸留水抽出物、メタノール抽出物及びアセトン抽出物を処理して、癌細胞死滅効果を確認した。即ち、本発明による細胞株抽出物はこれに限定されないが、大腸癌、口腔上皮癌、肺癌、前立腺癌、骨癌、白血病、子宮癌、皮膚癌、膵臓癌、乳癌、胃癌、腎臓癌、及び肝臓癌の治療及び予防に効果的であることが明らかになった。

従って、本発明においては前記細胞株破砕物及びその培養液を含む組成物が癌の予防及び治療効果を示すことを提示する具体的な実施例がないとしても、前記のように調べた通り前記細胞株及びその抽出物が癌の予防及び治療に活性を持つのを確認しており、本発明による細胞株破砕物及びその培養液を含む組成物の場合においても癌の予防及び治療効果を示せるということは当業界において通常の知識を有する者には明らかである。

本発明の他の実施例においてはさらに、本発明の細胞株のパクリタキセル含有の有無を測定した。本発明による細胞株を、エリシターを含む培地で培養した場合、高い濃度でパクリタキセルを生産することができるが、パクリタキセル生産が可能な条件で培養しないかまたは生産しないように特定条件で処理した本発明による細胞株は、パクリタキセルを含むか否かを実験してＬＣｄａｔａを分析した結果、パクリタキセルを含まないことが明らかになり、これはイチイ属から生産されると分かったパクリタキセルの作用ではない本細胞株自体の抗癌活性特性であると思われる。また、本発明による細胞株は経口投与時にも効果があるのが特徴として現れるため、経口投与時効果がなくて、注射剤で使用されているパクリタキセルの作用と認められない。

本発明による細胞株、その破砕物、その抽出物、及びその培養液のいずれか一つ以上を含む癌の予防または治療用組成物は、前記細胞株、その破砕物、その抽出物、及びその培養液のいずれか一つ以上を各々単独で含むか一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含んで医薬組成物として提供可能であり、前記細胞株または細胞株の破砕物、抽出物または培養液は、疾患及びその重症の程度、患者の年令、体重、健康状態、性別、投与経路、及び治療期間などにより適切な薬学的に有効量で医薬組成物に含まれることができる。

前記において「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容されヒトに投与される時、通常胃腸障害、目まいのようなアレルギー反応またはこれと類似する反応を起こさない組成物をいう。前記担体、賦形剤、及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポルビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。

前記医薬組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、及び防腐剤などをさらに含んでもよい。また、本発明の医薬組成物は哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供することができるように、当業界に公知の方法を用いて、剤形化される。剤形は粉末、顆粒、錠剤、乳剤、シロップ、エアゾール、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であってもよい。

本発明はまた他の観点において、前記イチイ属の形成層または前形成層由来細胞株、その破砕物、その抽出物、及びその培養液のいずれか一つ以上を含む癌の予防または改善用機能性食品に関する。

本願において「機能性食品」とは、一般食品に本発明による細胞株、その細胞株の破砕物、抽出物または培養液を添加することによって、機能性の向上した食品を意味する。例えば、本発明の細胞株または細胞株抽出物の抗癌効果を利用して、癌の予防及び改善用機能性食品を製造することができる。

本発明の機能性食品は多様な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤、ペプチド酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含んでもよい。

以下、実施例を介して本発明をより一層詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するものであって、下記実施例は多様な他の形態に変形されるため、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないのは、当業界において通常の知識を有する者には明白である。

特に、下記実施例においてはイチイ属の形成層または前形成層由来細胞株及びその抽出物の癌の予防及び抑制効果を確認したが、その破砕物またはその培養液を使用しても同様の結果が得られるということは当業界において通常知識を有する者には明白である。

［実施例１］イチイ属の形成層または前形成層由来細胞株の製造
１−１：植物材料の準備
イチイ属の一種（Ｔａｘｕｓｓｐｐ.）の小枝及び幹を各々採取した後、直ちに抗酸化剤１００ｍｇ／Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ、ＤＵＣＨＥＦＡ、ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）溶液に沈積して輸送・保管した。

その後、１％ベノミル（ｂｅｎｏｍｙｌ、ＤｏｎｇｂｕＨａｎｎｏｎｇＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｒｅａ）、１％ダコニール（ｄａｃｏｎｉｌ、ＤｏｎｇｂｕＨａｎｎｏｎｇＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｒｅａ）、１％ストレプトマイシン（ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｉｎｓｕｌｐｈａｔｅ、ＤＵＣＨＥＦＡ、ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、０．１％セフォタキシン（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅｓｏｄｉｕｍＤＵＣＨＥＦＡ、ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の混合溶液に２４時間前処理後、フェノール化合物（ｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄ）と残存化学物質を取り除くために水道水（ｔａｐｗａｔｅｒ）で３０分間洗浄した。そして、７０％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ、ＤＣＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｒｅａ）に１分、３０％過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ、ＬＧＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｒｅａ）に１５分、１％ＣＬＯＲＯＸ溶液に１５分、及び３％ＣＬＯＲＯＸ溶液に５分の表面殺菌後、３〜４回洗浄した。

１−２：小枝及び幹から前形成層及び形成層組織分離
前記殺菌過程を経た小枝及び幹の外側組織を縦方向に引っ張ると簡単に剥がれた。剥がれた組織は木部、前形成層（小枝）または形成層（幹）、師部、皮層、表皮で構成されるが、剥がれた組織の最内側組織、即ち、木部が培地面に当たるように培養した。

１−３：イチイ属の前形成層及び形成層由来細胞株誘導工程
初期培養４〜７日目に前形成層及び形成層から細胞分裂が肉眼上で観察され、培養１５日目以後に師部、皮層及び表皮で形成された層から脱分化による無定形のカルスが誘導され始めた。しかし、培養期間中ずっと木部は細胞分裂が起きず、形成層の層（layer）との分離が自然に行われた。培養３０日経過後、形成層の層（ｌａｙｅｒ）と師部を含んだ上層、即ち無定形のカルス層に分離し始め（図１（ａ））、２層が自然に分離する時まで待って完全分離されると各々異なるシャーレ（Ｐｅｔｒｉｄｉｓｈ）に分離培養した（図１（ｂ））。図１（a）において上部は師部・皮層・表皮を含む組織を、中間部は形成層を、底部は木部を各々示し、矢印は形成層の層と師部・皮層・表皮を含む組織間の分離を示す。また、図１（ｂ）においてＡは細胞間の分裂における差により不規則に増殖する師部・皮層・表皮を含む組織由来細胞株を、Ｂは細胞間の分裂が均一であって、一定の板状で増殖する形成層由来細胞株を、Ｃは細胞分裂が起きない木部を示す。また、図１（ｃ）は前形成層由来細胞株を誘導する様子を示す。図１（ｃ）においてＡは培養３０日後小枝を調べたものであり、前形成層（ｂｏｔｔｏｍ）が１次師部、皮層、表皮で構成された組織から由来したカルス細胞と分離するのを示す写真で、Ｂは培養３５日後の写真であり誘導された前形成層の層を分離して培養した様子を示し、Ｃは培養４０日後の写真であり前形成層の層を分離した後１次師部、皮層、表皮から構成された組織のカルスが増殖する様子を示す。

前記のように分離した後、生長率が良い白くてやわらかくなった部分を誘導培地と同じ新しい培地に２１日目毎に継代した。

一方、前形成層及び形成層由来細胞株のみを誘導するために使用した培地を表１に示す。

培地に生長調節剤としてオーキシン（Ａｕｘｉｎ）を１〜３ｍｇ／Ｌの濃度で添加した。培養は２５±１℃に調節された暗室で実施された。

一方、比較のため、イチイ属の胚（ｅｍｂｒｙｏ）と葉（ｎｅｅｄｌｅ）切片体を消毒した後、前記表１の培地で培養した。その結果、胚（ｅｍｂｒｙｏ）と葉（ｎｅｅｄｌｅ）切片体は脱分化によってカルスが形成することを観察できた。胚及び葉切片体から誘導されたカルスは師部を含む組織と同様に多くの細胞間の分裂速度の差によって不定形になり、生長率が不安定で、褐変し易い傾向を示す。褐変及び凝集した胚及び葉切片体から誘導されたカルスは自身が分泌するフェノール化合物によって生長が鈍くなって最後には壊死した。即ち、６ケ月後から胚（ｅｍｂｒｙｏ）と葉（ｎｅｅｄｌｅ）から誘導されたカルスは維持及び培養が難しかった。それに対して、前形成層及び形成層由来細胞は２０ヶ月以上の長期培養時において細胞の生長率、生長パターン、及び凝集度が変わることなく安定的に維持されて、大量培養が可能であった。

１−４：分離した細胞株の増殖工程及び特性観察
前記前形成層及び形成層由来細胞株を下記表２の液状培地が含まれたフラスコに入れて、暗条件で２５±１℃で１００ｒｐｍの回転式攪拌機（ｓｈａｋｅｒ）で培養した。継代培養周期は２週間に固定することによって培養細胞が常に対数生長期状態で高い活力を維持できるようにした。

一方、胚及び葉由来カルス（ｃａｌｌｕｓ）も前記表２の培地２で培養して、本発明による前形成層及び形成層由来細胞株と比較した。

細胞凝集度（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅＣＸ３１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）を調べたところ、表３と同様に本発明による細胞株は懸濁培養時９０％以上の単細胞状態で存在することが確認でき、図１（ｄ）に示すように、多数個の液泡（ｖａｃｕｏｌｅ）を持つ形態学的特徴を示し、未分化状態であることが確認できた。図１（ｄ）のイチイ属の前形成層由来細胞において矢印で表示された部分が液泡を示す。

一方、大量培養の可能性を調べるために、３Ｌの内容積を有する空気浮揚式生物反応器（ａｉｒｌｉｆｔｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ、ソンウォンサイテク、Ｋｏｒｅａ）で胚（ｅｍｂｒｙｏ）・葉（ｎｅｅｄｌｅ）由来カルスと前形成層及び形成層由来細胞を培養した。培地は表２の液状培地を使用し、暗条件で２５±１℃で一定に維持した。

その結果、表４に示されたように、本発明によるイチイ属の前形成層及び形成層由来細胞培養物の倍加時間は４〜５日であり、フラスコと反応器との間に差が生じないか却って短縮されたことが示されたのに対して、異質な細胞株の胚（ｅｍｂｒｙｏ）・葉（ｎｅｅｄｌｅｓ）由来培養物の倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅ）はフラスコ１２日に対して反応器（ｒｅａｃｔｏｒ）では２１日と長くなったことが分かった。即ち、フラスコ培養時に本発明による細胞株が２〜３倍程度の高い増殖率を示すことを確認し、大量反応器においては本発明による細胞株が形成層または前形成層以外の組織由来細胞株と比べて、５〜６倍の高い増殖率を示すことを確認した。これは他組織由来の異質な細胞株は反応器内における生長輪生成と培養中の植物培養体凝集性と細胞壁が固く、剪斷に対する感受性で細胞生存率（ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が急激に減少したのが原因であると判断された。

本発明によるイチイ属の前形成層及び形成層由来細胞株は生物反応器内の生長輪面積を非常に小さく形成して、培養器に簡単な刺激を与えて培地を動かすと内壁のリング（ｒｉｎｇ）が簡単に除去された。また凝集が小さく、多くの液泡（ｖａｃｕｏｌｅ）を持っていて、剪断に対する感受性が弱く、細胞生存率（ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の低下をもたらさないことが明らかになった。即ち、本発明による細胞株は大量培養のための生物反応器で攪拌作用に伴うシェアストレスに対し低い感受性を有するため、生物反応器内で急速かつ大量生長が可能であることを確認した。この時、フラスコ培養時の増殖率差と大量培養器における増殖率差を考慮すると、本発明によるイチイ属の前形成層または形成層由来細胞株がイチイ属の前形成層または形成層以外の組織由来細胞株と比べて、シェアストレスに対し２〜３倍の低い感受性を有することが分かった。

１−５：糖及びジャスモン酸メチルの処理
前記実施例１−４のように１４日間懸濁培養した細胞株を滅菌水に原糖３〜５重量％（ｇ／Ｌ）及びジャスモン酸メチル１００μＭを添加した培地で１０日間暗培養した後、細胞を回収して次の実験を行った。

［実施例２］イチイ属の前形成層または形成層由来細胞株の抽出物製造
実施例１において製造された細胞株から次の通り工程毎に有効物質を抽出した。
（ｉ）培養液を取り除いた前記細胞株５００ｇに５００ｍＬの蒸留水を加えて、５０℃で６時間攪拌させながら溶解させた。
（ii）前記溶解後、３，０００ｇで１０分間遠心分離させ、上層液を取ることによって蒸留水可溶性物質を得た。
（iii）前記蒸留水可溶性物質を得た後、残った蒸留水不溶性物質に５００ｍＬのメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）を添加して、室温で６時間攪拌して溶解させた。
（iv）前記溶解後、３，０００ｇで１０分間遠心分離して、上層液を取ることによってメタノール可溶性物質を得た。
（ｖ）前記メタノール可溶性物質を得た後、残ったメタノール不溶性物質に５００ｍＬのアセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）を添加して、室温で６時間攪拌して溶解させた。
（vi）前記溶解後、３，０００ｇで１０分間遠心分離して、上層液を取ることによってアセトン可溶性物質を得た。
（vii）前記で得た蒸留水、メタノール、アセトン可溶性物質を、回転真空濃縮機を利用して濃縮した。
（viii）濃縮試料を、凍結乾燥器を利用して乾燥させて、細胞培養液、メタノール、アセトンに溶かして、蒸留水抽出物、メタノール抽出物、アセトン抽出物を得た。

［実施例３］イチイ属の形成層または前形成層由来細胞株抽出物の抗酸化活性測定
抗酸化効果と癌の予防との相関関係が知られており、本発明による細胞株が癌を予防する効果があるか調べるために次の実験を行った。

３−１：皮膚線維芽（ＨＤＦ、Ｈｕｍａｎｄｉｐｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞培養
ＨＤＦ細胞は胎児の陰茎包皮から分離培養した。細胞培養液はＤＭＥＭ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅＧｉｂｃｏｌｉｆｅｔｅｃｈ. Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉｅａ）培地に５６℃で３０分間加熱して、非動化した牛胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ、ＵＳＡ）を１０％、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）とストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（１００μｇ/ｍＬ）及び３００μｇ／ｍＬ−グルタミンを添加して調製した。細胞は前記培養液を使用して、３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、通常細胞が互いに融合する直前である３〜４日間隔で継代培養し、継代培養により２０継代以下の若い（Ｙｏｕｎｇ）細胞、２１−４９継代のｍｉｄｄｌｅ細胞と５０継代系以上の老化細胞とに分けた。

３−２：Ｈ _２Ｏ _２によって誘導される活性酸素種測定
前記皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｃｅｌｌ）に実施例２で取得した抽出物中蒸留水抽出物を利用して、活性酸素種を誘導するＨ_２Ｏ_２を処理した時、活性酸素種を阻害するか否かを確認するために、活性酸素種（ＲＯＳ：ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）を測定する実験を行った。

細胞内活性酸素の測定は活性酸素に敏感なＤＣＦＤＡ（２'、７'−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ、ＦｌｕｋａＣａｔ３５８４７ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、ＵＳＡ）蛍光ｄｙｅを使用してＦａｃｓｃａｎａｎａｌｙｓｉｓを利用して分析した。各々のＰＤによるＨＤＦ細胞を１００ｍｍプレートに育てた後、５μＭ濃度のＤＣＦＤＡを暗所の状態で処理して、３０分間３７℃で反応させた後、ＰＢＳで２回洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ処理で細胞を回収した。以後９００ｒｐｍで４分間遠心分離して、細胞を集めた後各々細胞１０，０００個当り活性酸素を測定した（図２（ａ）、（ｂ））。

５×１０^５の細胞を６ウェルプレートに分株後、各実験によりＨ_２Ｏ_２を単独で処理し、実施例２で取得した抽出物を共に処理した。実施例２において取得した抽出物中蒸留水抽出物を１０〜１００μｇ/ｍＬ処理したが、望ましくは蒸留水抽出物５０μｇ/ｍＬ処理した後、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２〜３回洗浄して、再度ＨＢＳＳに３０分程度安定化させた。１０μＭのＤＣＦＤＡ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＵＳＡ）で処理後、暗所の状態で、３７℃で１時間染色し、ＨＢＳＳで３回洗浄後、蛍光顕微鏡で観察した（図２（ｃ））。

ＨＤＦ細胞にＨ_２Ｏ_２２００μＭと実施例２で取得した細胞株の蒸留水抽出物を１０〜１００μｇ/ｍＬで処理したが、望ましくは５０μｇ/ｍＬを処理して細胞の形態の変化程度を観察した。

Ｈ_２Ｏ_２を細胞に処理して２４時間経過すると、ＨＤＦ細胞は酸化的ストレスによって、活性酸素（ＲＯＳ）を発生するようになる。非蛍光性であるＤＣＦＤＡは活性酸素によって酸化されて、強い蛍光を示すＤＦＣになるため、これを測定することができる。本実施例においては、測定のためにＦＡＣＳＣＡｌｉｂｕｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＡｎａｌｙｔｉｃＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ、ＵＳＡ）を使用した。

その結果、図２に示したように、イチイ属の形成層由来細胞株抽出物及びイチイ属の前形成層由来細胞株抽出物は共に活性酸素種（ＲＯＳ）の生成が抑制されることが示された（Ｐ−ＷＥ：前形成層蒸留水抽出物、Ｃ−ＷＥ：形成層蒸留水抽出物）。即ち、二つの細胞株抽出物は共に活性酸素種の生成を抑制することを確認することができた。

優れた抗酸化力を有する物質は、細胞酸化による細胞損傷を抑制する有効物質であり、体内において生成された酸素種（ＲＯＳ）は細胞内ＤＮＡ、蛋白質及び脂質など細胞を構成する分子と結合して、細胞突然変異を起こして細胞に正常な機能を阻害することによって癌組織形成に係わるようになる。

従って、前記実験において本発明によるイチイ属の形成層由来細胞株及び前形成層由来細胞株が、抗酸化効果があることを確認し、本発明によるイチイ属の形成層由来細胞株及び前形成層由来細胞株が癌を予防する効果があることが示された。

［実施例４］イチイ属の形成層及び前形成層から誘導される細胞株の投与に伴う抗癌活性効果
（１）実験にはＤａｍｏｏｌＳｃｉｅｎｃｅ（大田市儒城区老隠洞）から購入したＢａｌｂ／Ｃマウスを一般的な動物飼育規定に従って飼育した。通常６周齢のマウスを購入して、５日ほど適応させた後、１×１０^６個のＣＴ−２６大腸癌細胞株（韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ８０００９）を、背中の右側部分の皮下に注入した。

癌細胞導入して３日前後に、殆どのマウスには粟の大きさの癌細胞の成長が観察されて、従って３日目から実施例１から分離した形成層由来細胞株と前形成層由来細胞株を各々自由に給餌させた。対照群は通常の栄養分が含まれていた飼料を給餌させて、前記細胞株投与は同じ飼料を細かく砕いた後、１：１の割合で前記細胞株を添加して、同様形の飼料に作った後、自由給餌させた。この時、細胞株の１日平均投与量はマウス１匹当り細胞生中量（ｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ）２〜３ｇであった。その他全ての仕様条件は同様にし、３週間後の癌細胞の大きさを観察した。実験には対照群と前記細胞株給与群を１５匹ずつ（形成層由来細胞株７匹、前形成層由来細胞株８匹）にし、この実験を３回行った。

（２）細胞株投与後３週間における癌細胞の大きさ観察結果
本発明による細胞株投与後２週経過時点においてモデルマウスにおける癌組織の大きさを観察した結果、図３に示したように、対照群と比べて、形成層由来細胞株及び前形成層由来細胞株を投与した細胞株投与群において癌組織の成長が阻害されるのを確認することができた。

また、図４に示したように、細胞株投与後３週経過した時点において細胞株投与群における癌組織の体積は１００ｍｍ^３程度であるが、対照群は細胞株投与群の６倍以上の体積を有することが示された。それと共に図５に示したように、癌組織を摘出して撮影した結果、外見的にその体積に大きい差があることが分かった。摘出された癌組織の重さを測定した結果、対照群の平均重さは２.１６ｇであるのに対して、細胞株投与群においては癌組織の平均重さが０．２１ｇであって約１／１０であると分かった。これにより癌細胞の全般的な成長を阻害することを確認でき、癌の予防及び治療効果があることが分かった。

（３）一方、前記対照群と細胞株投与群において癌組織摘出後、倍率を変えて内部組織を観察して、その結果は図６に示した。

観察結果、対照群においては全般的にアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）と呼ばれる細胞死滅を示す部分がなく、全領域において組織が緻密で分裂中の細胞（図６（ａ）のｂ部分）が多い特徴を示した。このような分裂状態の細胞が多いことは対照群においては癌組織が成長し続けて膨張していることを意味する。

しかし、細胞株投与群においては組織が緻密でなく、アポトーシスボディ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｏｄｙ、図６（ｂ）のｃ部分）と呼ばれる核が凝縮されたり多くの組織に分裂している様子が観察される細胞が殆どであった。このようなアポトーシスボディ（ａｏｐｔｏｓｉｓｂｏｄｙ）は対照群においては殆ど現れない。

その他に非常に特徴的な現象を示すのは赤血球の染色で（図６（ａ）のａ部分）、これは組織内の血管を断片的に示すもので、対照群においては多くの血管が見られるが細胞株投与群においては全く見られない。また、細胞株投与群の場合、免疫細胞と予測される丸い核が見られる細胞が相当部分観察されており（図６（ｂ）のｄ部分）、これは対照群においては殆ど見られなかった。

そこで、本発明のイチイ属の形成層または前形成層から誘導される細胞株は、癌の成長に直接係わって、細胞死滅を誘導することによって癌組織の全般的な成長を制御させて癌を予防する効果及び治療する効果があることが確認できた。また、癌発生時に現れる新生血管形成を抑制させ、免疫細胞の癌組織内の流入を高めて、強い免疫作用を誘導することによって強い抗癌活性を示すことが分かる。

［実施例５］イチイ属の形成層または前形成層由来細胞株抽出物の製造及び癌細胞死滅活性
（１）癌細胞培養
− ヒト癌細胞株：口腔上皮癌細胞株（ＫＢｃｅｌｌ、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ１００１７）、肺癌細胞株（ＨＣＣ９５、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ７００９５）、前立腺癌細胞株（ＰＣ−３、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ２１４３５）、骨癌細胞株（Ｕ２−ＯＳ、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ３００９６）、白血病細胞株（Ｋ−５６２、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ１０２４３）、子宮癌細胞株（ＨｅＬａ、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ１０００２）、皮膚癌細胞株（ＨＴ１０８０、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ１０１２１）、膵臓癌細胞株（ＭＩＡＣａＰａ−２、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ２１４２０）、乳癌細胞株（ＭＣＦ−７、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ３００２２）、胃癌細胞株（ＡＧＳ、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ２１７３９）、腎臓癌細胞株（Ｃａｋｉ−１、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ３００４６）、肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２、韓国細胞株銀行、ＫＣＬＢ８８０６５）

− マウス癌細胞株：皮膚癌細胞株（Ｂ１６Ｆ１０、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ８００８）、大腸癌細胞株（ＣＴ−２６、韓国細胞株銀行ＫＣＬＢ８０００９）
− 細胞培養：前記癌細胞株は細胞によりＲＰＭＩとＤＭＥＭ培地で培養した。培養液には５６℃で３０分間加熱して、非動化した牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）とストレプトマイシン（１００μｇ/ｍＬ）及び３００μｇ/ｍＬ−グルタミンを添加した。細胞株は前記培養液を使用して３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、通常細胞が互いに融合する直前である３〜４日間隔をおいて継代培養し実験には３０継代以下の細胞だけを使用した。

− 抽出物の処理及び細胞死滅活性測定：６ウェルプレートの培養容器に１×１０^５個の細胞を各々培養して、細胞が容器に完全に付着される６時間後に蒸留水、メタノール、アセトン抽出物（１５０、４００、８００μｇ/ｍＬ培養液）で処理後、１日目から３日目まで細胞死滅の程度を実験した。細胞の増殖はＭＴＴ（３−[４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ]−２、５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）方法で測定した。

成長の低下程度は何も処理しない陰性対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、メタノールとアセトンを添加させた対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）、そして抗癌剤でイチイ属由来パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ｓｉｇｍａ）で処理した陽性対照群と相互比較した。与えられた時間により３７℃で加温した細胞培養液で２回洗浄後、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬｗｉｔｈｏｕｔｐｈｅｎｏｌｒｅｄ）１ｍＬを加えて、４時間再培養させた。上層液を取り除いて生成されたｆｏｒｍａｚｅｎ沈殿物にＤＭＳＯを１ｍＬ入れて溶解させ、５７０ｎｍで吸光度を測定した。生存細胞数は処理３日目に５０％メタノールで固定して、付着された生存細胞はクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ）染色して観察した。

（２）抽出物処理に伴う実験の結果
− 蒸留水、メタノール、アセトン抽出物（８００μｇ/ｍＬ）を各々の細胞に処理させて、処理３日目の生存細胞
各々の抽出物は培養液を取り除いて蒸留水、エタノール、アセトンの順で各々溶かした後、細胞に処理させた結果、殆どの実験細胞においてメタノール抽出物が最も高い細胞死滅活性を示し、これは１０μｇ／ｍＬの濃度のパクリタキセルで処理した陽性対照群（図７のＴａｘｏｌ（パクリタキセル、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ））と類似する死滅効果を示した。

次に蒸留水とアセトン抽出物も死滅効果を示したが全般的にメタノール抽出物に比較して低い活性を示した。それに対して、メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）とアセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）だけを処理した対照群（図７のｖｅｈｉｃｌｅ）は細胞死滅に全く影響を及ぼさなかった。

これにより細胞株の抽出物には癌細胞死滅活性を示す物質が含まれていることが分かった。次の工程においてはメタノール抽出物を濃度毎に処理して、死滅の程度を実験した。

− メタノール抽出物の濃度毎処理に伴う細胞死滅活性
メタノール抽出物を２００ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶かして、実験細胞株に培養液１ｍＬに１５０、４００、８００μｇの濃度で添加させた。添加１日目から３日目まで１日間隔で細胞成長をＭＴＴ方法で測定し、３日目における生存細胞はメタノール固定後クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ）染色した。１４個の癌細胞株の結果は図８乃至図２１に示した通りである。

前記結果から本発明によるイチイ属の形成層または前形成層由来細胞株のメタノール抽出物は濃度依存的に１４個の癌細胞において細胞死滅活性を示す。８００μｇ／ｍＬの濃度は全ての細胞株において強い活性を示し、これは陽性対照群であるパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ１０μｇ／ｍＬ）の細胞死滅と似たような結果を示した。それに対して、ＣＴ−２６（図８）とＢ１６Ｆ１０（図１３）においては陽性対照群よりも高い細胞死滅活性を示す。それは、陽性対照群において使用されたパクリタキセル及び本発明による細胞株のメタノール抽出物の量的な差は実験に使用したパクリタキセルは純粋精製された物質であるのに対して、細胞株の抽出物は多くの化合物が混ざり合った状態に起因するものである。従って、純粋精製過程を経ると本発明による細胞株の細胞死滅活性はより一層向上すると判断される。

［実施例６］イチイ属の形成層または前形成層由来細胞株のパクリタキセル含有有無調査
一方、本発明による細胞株の抗癌活性がパクリタキセルによる活性でないことを立証するために次のように本発明による細胞株のパクリタキセル含有の有無を調べた。

本実験に使用されたパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、Ｔａｘｏｌ）標準試料はｓｉｇｍａから購入し移動相としてはＪ.Ｔ. Ｂａｋｅｒ社のＨＰＬＣ用ｗａｔｅｒ、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、ｍｅｔｈａｎｏｌを０．２μｍフィルターで濾過した後に使用した。

前記実施例１において製造された細胞株０．２ｇをＭｅＯＨ０．４ｍＬ入れて５分間ｖｏｒｔｅｘ後、１時間の間室温から抽出した。この抽出液を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、０．２μｍフィルターで濾過した後ＵＰＬＣで定量分析した。

ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）分析は、ＵＰＬＣＢＥＨＣ１８ｃｏｌｕｍｎ（１００ｍｍ×２．１ｍｍｉ.ｄ、１．７μｍ）を利用して、標準試料と比較して定量分析した。移動相としては水とアセトニトリルの勾配で、流速は０．４ｍＬ、ＵＶ２２７ｎｍで検出した。

吸光度２２７ｎｍ及び２８０ｎｍでパクリタキセル標準試料（ｔａｘｏｌｓｔａｎｄａｒｄ）をＵＰＬＣで分析した結果、図２２（ａ）に示すように保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ）が４．６７分に現れた。それと共に、２２７ｎｍと２８０ｎｍでＵＶａｂｓｏｒｂａｎｃｅｒａｔｉｏが約０．０５になるとパクリタキセルであると報告されていたが（Ｃａｓｔｏｒ＆Ｔｙｌｅｒ１９９３）、本実験においてパクリタキセル標準試料を測定した結果、Ａ（２８０ｎｍ）/Ａ（２２７ｎｍ）＝０．０４８であった。

これに対して、本発明による細胞株（ｓａｍｐｌｅ）を吸光度２２７ｎｍと２８０ｎｍにおいてＵＰＬＣで分析した結果、図２２（ｂ）に示すようにｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅが４．７０分に現れた。それと共に、細胞株（Ｓａｍｐｌｅ）抽出物測定結果、２２７ｎｍと２８０ｎｍでＵＶａｂｓｏｒｂａｎｃｅｒａｔｉｏが、Ａ（２８０ｎｍ）/Ａ（２２７ｎｍ）＝１．２４であり、パクリタキセルが含まれていないことが分かった。

さらにパクリタキセル標準試料と本発明による細胞株抽出液のＰＤＡｓｐｅｃｔｒｕｍｓを分析した結果、図２２（ｃ）及び（ｄ）に示したように本発明による細胞株にパクリタキセルが含まれていないことが示された。

［実施例７］医薬製剤製造例
［製剤例１］錠剤の製造
実施例１において製造された細胞株抽出物１００ｍｇをトウモロコシ澱粉１００ｍｇ、乳糖１００ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合して、通常の錠剤製造方法により製造した。

［製剤例２］カプセル剤の製造
実施例１において製造された細胞株抽出物５００ｍｇを軟質ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。

［製剤例３］シロップ剤の製造
実施例１において製造された細胞株１ｇ、異性化糖１０ｇ、マンニトール５ｇ、適量の精製水の含有量で通常の液製剤の製造方法により１００ｍＬのシロップ剤を製造した。

［製剤例４］注射剤の製造
実施例１において製造された細胞株抽出物２００ｍｇをポリオキシエチレン水素化カストロオイルを含む生理食塩水２００ｍｇに加熱溶解させて、混合抽出物を０．１％の濃度で含む注射剤を製造した。

［実施例８］機能性食品の製造：機能性飲料の製造
［製造例１］
実施例１において製造した細胞株２００ｍｇを９６ｍＬの水に溶解させた後、補助剤としてビタミンＣ５００ｍｇ、矯味剤としてクエン酸、オリゴ糖を各々１ｇ加え、保存材として安息香酸ナトリウム０．０５ｇを加えた後、精製水を加えて、全量を１００ｍＬにして機能性飲料を製造した。

［製造例２］
実施例１において製造した細胞株抽出物２００ｍｇを９６ｍＬの水に溶解させた後、補助制としてビタミンＣ５００ｍｇ、矯味剤としてクエン酸、オリゴ糖を各々１ｇ加え、保存材として安息香酸ナトリウム０．０５ｇを加えた後、精製水を加えて、全量を１００ｍＬにして機能性飲料を製造した。

産業上利用の可能性

以上説明したように、本発明による細胞株、その破砕物、その抽出物、及びその培養液は天然物由来組成物として既存の薬品治療剤の副作用を最小化して、人体に安全であり、かつ癌の成長に直接係わって、癌細胞死滅を誘導して、癌発生時に現れる新生血管形成を抑制させる抗癌活性を示すため、癌の予防、治療、及び症状緩和に有用な長所がある。

以上で本発明の内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者には、このような具体的技術は単に望ましい実施様態に過ぎない。これによって、本発明の範囲が制限されるのではない点は明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項及びそれらの等価物によって定義されるべきである。

Claims

イチイ属の形成層または前形成層由来の、以下の特性を持つ細胞株、その破砕物、その抽出物及びその培養液のいずれか一つ以上を含む癌の予防または治療用医薬組成物:
（ａ）多数個の液泡を持つ形態学的特徴を示し;
（ｂ）先天的未分化状態であり;及び
（ｃ）同質な細胞株である。
前記細胞株は以下の特性をさらに持つことを特徴とする請求項１に記載の癌の予防または治療用医薬組成物:
（ａ）懸濁培養時に単細胞状態で存在し;
（ｂ）イチイ属の形成層または前形成層以外の組織由来細胞株と比べて、生長速度が速く、安定するように培養され;及び
（ｃ）イチイ属の形成層または前形成層以外の組織由来細胞株と比べて、生物反応器でおいてシェアストレスに対して低い感受性を有する。
前記細胞株は以下の工程を含む分離方法によって取得されたことを特徴とする請求項１に記載の癌の予防または治療用医薬組成物:
（ａ）イチイ属の形成層または前形成層含有組織を取得する工程；
（ｂ）前記取得された形成層または前形成層含有組織を培養して、形成層または前形成層から増殖する形成層または前形成層の層と、前記形成層または前形成層以外の部分から無定形に増殖するカルス層を誘導する工程；及び
（ｃ）前記形成層または前形成層の層から細胞株を回収する工程。
前記工程（ｃ）は３〜５重量％の原糖または砂糖；及びジャスモン酸メチル、真菌類抽出物、細菌類抽出物、酵母抽出物、キトサン、グルコマンナン、グルカン、フェニルアラニン、安息香酸、サリチル酸、アラキドン酸、ＳＴＳ、モバロナロネイトＮ−ベンゾリグリシン、ＡＢＡ、ＳＮＰ、ＩＰＰ、ＢＨＴ、ＣＣＣ、エセフォン、馬尿酸、硝酸二アンモニウムセリウム、ＡｇＮＯ_３、硫酸バナジル、ｐ−アミノ安息香酸）、ブラシノステロイド（、アルギン酸ナトリウム）、及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される物質；を含む培地で増殖させた後、前記増殖した細胞株を回収することを特徴とする請求項３に記載の癌の予防または治療用医薬組成物。
前記抽出物は、蒸留水、アルコール、アセトン、ＤＭＳＯ及びこれらの混合溶媒からなる群から選択される溶媒を利用して抽出されることを特徴とする請求項１に記載の癌の予防または治療用医薬組成物。
前記癌は大腸癌、口腔上皮癌、肺癌、前立腺癌、骨癌、白血病、子宮癌、皮膚癌、膵臓癌、乳癌、胃癌、腎臓癌、及び肝臓癌のいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の癌の予防または治療用医薬組成物。
イチイ属の形成層または前形成層由来の、以下の特性を持つ細胞株、その破砕物、その抽出物及びその培養液のいずれか一つ以上を含む癌の予防または改善用機能性食品:
（ａ）多数個の液泡を持つ形態学的特徴を示し;
（ｂ）先天的未分化状態であり;及び
（ｃ）同質な細胞株である。
前記細胞株は以下の特性をさらに持つことを特徴とする請求項７に記載の癌の予防または改善用機能性食品:
（ａ）懸濁培養時に単細胞状態で存在し;
（ｂ）イチイ属の形成層または前形成層以外の組織由来細胞株と比べて、生長速度が速く、安定するように培養され;及び
（ｃ）イチイ属の形成層または前形成層以外の組織由来細胞株と比べて、生物反応器でおいてシェアストレスに対して低い感受性を有する。
前記細胞株は以下の工程を含む分離方法によって取得されたことを特徴とする請求項７に記載の癌の予防または改善用機能性食品:
（ａ）イチイ属の形成層または前形成層含有組織を取得する工程；
（ｂ）前記取得された形成層または前形成層含有組織を培養して、形成層または前形成層から増殖する形成層または前形成層の層と、前記形成層または前形成層以外の部分から無定形に増殖するカルス層を誘導する工程；及び
（ｃ）前記形成層または前形成層の層から細胞株を回収する工程。