CN117064981A - 石斛来源纳米囊泡在制备促进伤口愈合药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物性原料技术领域，公开了石斛来源纳米囊泡在制备促进伤口愈合药物中的应用。本发明的石斛来源纳米囊泡由石斛经水提取分离得到，成分天然，无毒副作用，具有良好的生物相容性和安全性，因此具有广阔的应用前景。本发明的石斛来源纳米囊泡提取后经蔗糖水梯度纯化，所得的石斛来源纳米囊泡纯度高，杂质少，可口服吸收，且无组织、血管刺激性，将其应用于制备促进伤口愈合药物中，可获得优异的促进伤口愈合的效果。其中，体外实验显示其具有强大的内皮保护作用及促血管新生作用，并在小鼠动物实验中发现其良好的促伤口愈合作用，有望成为制备促伤口愈合药物的优异材料。

Description

石斛来源纳米囊泡在制备促进伤口愈合药物中的应用
技术领域
本发明属于植物性原料技术领域，特别涉及石斛来源纳米囊泡在制备促进伤口愈合药物中的应用。
背景技术
皮肤由多个复杂结构组成，并参与多种功能，包括温度调节和保护免受外部环境影响。作为物理屏障的皮肤受伤可能会导致接触有毒物质和细菌感染，从而有可能进一步损害内脏器官；当皮肤及其下方的组织受损时就会发生伤口。伤口护理是全世界医疗系统的主要负担，WHO在其2018年发布的《全球卫生统计年鉴》中提到，每年全球因伤口感染而死亡的人数超过60万，其中许多是因为缺乏适当的伤口护理。伤口愈合分为4个不同的阶段：止血期、炎症期、增殖期和重塑期，它们以重叠的方式发生。
伤口愈合需要来自皮肤和皮肤组织不同层的不同类型细胞的协调生物活性。研究表明内皮细胞促血管生成在伤口愈合的调节中发挥着重要作用。血管生成包括内皮细胞的增殖、迁移和分支以形成新的血管。内皮细胞位于血管的内膜层中，血管生成涉及局部微血管内皮细胞的激活，该内皮细胞排列在血管的内表面，并且在血管形成和修复过程中发挥着重要作用。在缺氧伤口环境的存在下，内皮细胞对缺氧反应性生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)和血小板生长因子(PDGF)作出反应。活化的内皮细胞分解肉芽组织中的细胞外基质(ECM)、增殖、迁移、形成新的细胞-细胞连接并分支形成新的毛细血管。血管生成允许输送营养物质和维持氧平衡，从而增强细胞增殖和组织再生。
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科重要的附生植物，在中国作为传统中药草药已有数千年的历史，并在许多亚洲国家被广泛用作药草。其化合物的化学分离已鉴定出多种活性化合物，包括多糖、类黄酮、生物碱和多种氨基酸。特别是，从铁皮石斛中提取的多糖、生物碱和类黄酮被认为是药物的主要生物活性成分。研究表明铁皮石斛黄酮类化合物可以修复内皮细胞损伤，维持内皮细胞功能并且刺激内皮细胞的增殖和迁移，促新的血管形成；铁皮石斛多糖可以增强内皮细胞的抵抗力，减轻细胞氧化应激和炎症反应，从而保护内皮细胞免受损害。同时也可以通过调节血管生长因子的表达和释放，促进血管新生。中医认为痤疮、脓疱和其他一些皮肤病是由阴虚和阳盛引起的。根据传统中医理论，铁皮石斛是滋阴的最佳产品，这意味着它能够治疗阴虚相关的综合症。具有修复损伤皮肤之功效
减轻血管内皮损伤、促血管生成、加速受损局部组织的血液循环，一直是促伤口愈合研究领域的热点。然而皮肤表皮受损缺乏天然的保护屏障，导致大量的细菌、炎症聚集在受损的皮肤组织，形成伤口；尽管目前有多种治疗方式，仍然无法达到理想的效果，且价格居高不下，因此，急需研究更好的有效物质，并将其用于制备更适用于伤口干预、促进伤口愈合的药物。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于石斛来源纳米囊泡在制备促进伤口愈合药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
石斛来源纳米囊泡在制备促进伤口愈合药物中的应用。
本发明技术方案中，所述药物相同或不同的分别包括治疗有效量的石斛来源纳米囊泡。
本发明技术方案中，所述的药物相同或不同的分别可采用常规方法制成各种药用剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、酒剂、酊剂、滴剂等口服给药的剂型及注射液等口服以外的给药剂型，如针剂等。
本发明技术方案中，所述的药物相同或不同的分别还可含有一种或以上药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步的，所述的赋形剂可包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂、防腐剂等。
本发明技术方案中，所述的石斛来源纳米囊泡可由石斛的茎部经提取分离得到。
进一步的，所述提取使用的提取剂可为常规使用的水或缓冲液，如加入磷酸盐的水溶液。
进一步的，所述提取可为将石斛粉碎后浸泡于提取剂中，所得浸泡液即为提取液。
进一步的，所述分离的方法可为对提取液进行超速离心进行分离。分离得到的沉淀即为石斛来源纳米囊泡(DDNV)。
进一步的，所述超速离心的速度可为100000g或以上。
进一步的，所述超速离心的时间可为10-100min。
进一步的，所述超速离心的时间可为50-100min。
进一步的，超速离心所得沉淀可用Tris-HCl等缓冲液重悬从而得到石斛来源纳米囊泡悬浮液。
进一步的，可重复进行一次或以上的超速离心。
进一步的，超速离心前可对提取液进行预离心除去杂质沉淀。
进一步的，预离心的速度可为10000g或以下。通过预离心可将分非目标物质分离除去，减少杂质对于后续超速离心分离的影响。
进一步的，所述预离心的时间可为10-60min。可进行一次或以上的预离心。
本发明技术方案中，所述分离得到的石斛来源纳米囊泡可用蔗糖水进行梯度纯化。
进一步的，所述纯化的操作具体包括将不同浓度的蔗糖水依次从高浓度到低浓度分层自下而上加入离心管中，石斛来源纳米囊泡悬浮液最后加入作为最上面一层，超速离心，将最高浓度蔗糖水和次高浓度蔗糖水夹层间的石斛来源纳米囊泡取出，得到纯化后石斛来源纳米囊泡。
进一步的，超速离心的速度可为100000g或以上。
进一步的，超速离心的时间可为2-5h。
进一步的，所用蔗糖水可为4种或以上不同浓度。
进一步的，所用蔗糖水的浓度分别为10-20wt％、25-35wt％、40-50wt％、55-60wt％等。采用的不同浓度蔗糖水的浓度梯度差优选为10wt％或以上。
进一步的，所述蔗糖水通过将蔗糖溶于Tris-HCl等缓冲液中得到。
进一步的，蔗糖水和石斛来源纳米囊泡悬浮液中所用Tris-HCl等缓冲液的浓度优选相同。
进一步的，离心管中所加入不同浓度蔗糖水的体积份数可相同。
进一步的，可通过采用注射器等方式将夹层中的石斛来源纳米囊泡取出。
进一步的，取出的石斛来源纳米囊泡可再次重悬于PBS等缓冲液，并超速离心除去其中混合的蔗糖水，得到最终的石斛来源纳米囊泡。
进一步的，石斛来源纳米囊泡经重悬得到悬浮液。
进一步的，石斛来源纳米囊泡悬浮液使用前可使用过滤器过滤以获得无菌的悬浮液。所述的过滤器可为0.22μm的过滤器。
本发明技术方案中，所述的石斛可选自铁皮石斛、金钗石斛、细茎石斛、小粉花石斛、鼓槌石斛、马鞭石斛、黄草石斛、环草石斛，蝴蝶石斛等中的至少一种。
进一步的，所述的石斛选自铁皮石斛、金钗石斛、细茎石斛等中的至少一种。
进一步的，所述的石斛优选为铁皮石斛。
本发明的石斛来源纳米囊泡由石斛经水提取分离得到，成分天然，无毒副作用，具有良好的生物相容性和安全性，因此具有广阔的应用前景。本发明的石斛来源纳米囊泡提取后经蔗糖水梯度纯化，所得的石斛来源纳米囊泡纯度高，杂质少，可口服吸收，且无组织、血管刺激性，将其应用于制备促进伤口愈合药物中，可获得优异的促进伤口愈合的效果。其中，体外实验显示其具有强大的内皮保护作用及促血管新生作用，并在小鼠动物实验中发现其良好的促伤口愈合作用，有望成为制备促伤口愈合药物的优异材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明DDNV的提取分离流程示意图。
图2为本发明DDNV的透射电镜图。
图3为显微镜下(20X)观察皮肤组织对DIL-DDNV摄取的荧光图。其中，DAPI为核染色，呈现为蓝染，DIL-DDNV聚集于胞质，呈现为红染。
图4为DDNV对HUVEC增殖活力的影响效果图。
图5为DDNV对HUVEC迁移能力的影响效果图。
图6为DDNV对HUVEC成管能力的影响效果图。
图7为DDNV干预后QPCR结果显示KDR、CD31基因表达效果图。
图8为DDNV促进伤口愈合效果图。
图9为DDNV促进伤口愈合HE染色观察图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。
一实施方式，石斛来源纳米囊泡在制备促进伤口愈合药物中的应用。
一实施例中，石斛来源纳米囊泡由石斛的茎部经提取分离得到。
一实施例中，提取使用的提取剂为常规使用的水；另一实施例中，提取使用的提取剂为加入磷酸盐的水溶液。
一实施例中，所述提取为将石斛粉碎后浸泡于提取剂中，所得浸泡液即为提取液。
一实施例中，所述分离的方法为对提取液进行超速离心进行分离。分离得到的沉淀即为石斛来源纳米囊泡(DDNV)。
一实施例中，所述超速离心的速度为100000g或以上；另一实施例中，所述超速离心的速度为135000g。
一实施例中，所述超速离心的时间为10-100min。
一实施例中，超速离心所得沉淀用Tris-HCl等缓冲液重悬从而得到石斛来源纳米囊泡悬浮液。一实施例中，所用Tris-HCl的浓度为20mmol/L。
一实施例中，重复进行一次或以上的超速离心。
一实施例中，超速离心前对提取液进行预离心除去杂质沉淀。
一实施例中，预离心的速度为10000g或以下。通过预离心可将分非目标物质分离除去，减少杂质对于后续超速离心分离的影响。
一实施例中，所述预离心的时间为10-60min。
一实施例中，进行一次或以上的预离心。
一实施方式，所述分离得到的石斛来源纳米囊泡用蔗糖水进行梯度纯化。
一实施例中，所述纯化的操作具体包括将不同浓度的蔗糖水依次从高浓度到低浓度分层自下而上加入离心管中，石斛来源纳米囊泡悬浮液最后加入作为最上面一层，超速离心，将最高浓度蔗糖水和次高浓度蔗糖水夹层间的石斛来源纳米囊泡取出，得到纯化后石斛来源纳米囊泡。
一实施例中，超速离心的速度为100000g或以上；另一实施例中，超速离心的速度为150000g。
一实施例中，超速离心的时间为2-5h；另一实施例中，超速离心的时间为3h。
一实施例中，所用蔗糖水为4种或以上不同浓度。
一实施例中，所用蔗糖水的浓度为10-20wt％、25-35wt％、40-50wt％、55-60wt％等。采用的不同浓度蔗糖水的浓度梯度差优选为10％或以上。
一实施例中，所述蔗糖水通过将蔗糖溶于Tris-HCl等缓冲液中得到。一实施例中，所用Tris-HCl的浓度为20mmol/L。
一实施例中，蔗糖水和石斛来源纳米囊泡悬浮液中所用Tris-HCl等缓冲液的浓度优选相同。
一实施例中，离心管中所加入不同浓度蔗糖水的体积份数相同。
一实施例中，超速离心后，可见DDNV的组分分布在不同浓度蔗糖水的层间(见图1)。
一实施例中，通过采用注射器等方式将夹层中的石斛来源纳米囊泡吸取出来。
一实施例中，取出的石斛来源纳米囊泡再次重悬于PBS等缓冲液，并超速离心除去其中混合的蔗糖水，得到最终的石斛来源纳米囊泡。
一实施例中，石斛来源纳米囊泡经重悬得到悬浮液。
一实施例中，石斛来源纳米囊泡悬浮液使用前使用过滤器过滤以获得无菌的悬浮液。所述的过滤器为0.22μm的过滤器。
一实施例中，石斛来源纳米囊泡由通过包括以下步骤方法得到：将石斛清洗干净、晾干，破壁机破碎，加入双蒸水浸泡，分离得到上清液，对上清液在10000g下进行多次的预离心，如可依次在300g、2000g、10000g下分别离心10-30min，分别取上清液，弃去沉淀，以除去非目标物质；预离心后的上清液在离心力100000g或以上(如135000g)进行超速离心，离心时间可为10-100min，所得沉淀即为石斛来源纳米囊泡，超速离心后的上清液可保留用于实施例中进行对比使用；利用Tris-HCl重悬，得到悬浮液。将蔗糖溶于Tris-HCl中，分别制备得到质量浓度为10-20wt％、25-35wt％、40-50wt％、55-60wt％的蔗糖水溶液(如15％、30％、45％、60％)，不同浓度蔗糖水的浓度梯度差为10wt％或以上(如15wt％)，将不同浓度的蔗糖水分别取2-3体积份(如2.5体积份)依次从高浓度到低浓度分层自下而上加入离心管中，石斛来源纳米囊泡悬浮液取1-2体积份(如1体积份)最后加入作为最上面一层，超速离心，将最高浓度蔗糖水和次高浓度蔗糖水夹层间的石斛来源纳米囊泡取出，取出的石斛来源纳米囊泡再次重悬于PBS等缓冲液，并超速离心除去其中混合的蔗糖水，得到最终的石斛来源纳米囊泡。具体操作流程示意图见图1。
一实施例中，利用PBS重悬最终的石斛来源纳米囊泡，得到石斛来源纳米囊泡悬液。
一实施例中，还对石斛来源纳米囊泡悬液采用0.22μm过滤器进行过滤。通过过滤器的过滤可得到无菌的石斛来源纳米囊泡悬液。
一实施例中，超速离心后的上清液同样采用0.22μm过滤器进行过滤，得到无菌的上清液用于进行对比使用。
一实施例中，纯化过程中超速离心后，可见DDNV的组分分布在不同浓度蔗糖水的层间(见图1)。
一实施例中，利用透射电镜对DDNV进行形态学鉴定。由透射电镜(TecnaiG2SpiritTwin+GATAN 832.10W)观察可见，DDNV呈类圆形或椭圆形的囊泡(见图2)，如托盘状，直径分布在50-200nm。
一实施例中，利用颗粒跟踪分析仪(NanoSight NS300)测定最终DDNV悬浮液中DDNV的粒径及其颗粒数。结果显示DDNV平均直径为81.9±2.0nm，颗粒浓度为1.1411个/mL。
实施例1：小鼠皮肤组织对DDNV的摄取
(1)DIR-DDNV的配置：10mg DIR荧光染料探针与1011个颗粒数的DDNV共孵育，37℃避光孵育30min，使得DDNV与DIR充分结合，随后进行超速离心，4℃下135000g、70min离心，弃上清，加入1ml PBS重悬，得到DIR-DDNV悬浮液；
(2)将8周龄的C57小鼠，麻醉并剃掉背部毛发。随后，使用注射器将200mL Tris-HCl(阴性对照)或DIR标记的DDNV皮内注射到背部皮肤中(背部皮下注射以蛋白浓度计算10mg/mLDIR标记(红色)外泌体5μL，以20mmM Tris-HCL为阴性对照)。发近红外荧光的亲脂性碳氰酸酯DiOC18(7)(“DiR”)在水中发弱荧光，但在掺入膜中后会发出极其明亮且光稳定的荧光。第二天，皮肤组织被采集、冷冻并冷冻切片，厚度为10um。用10mg/mL DAPI染色后，使用荧光显微镜对样品进行观察和拍照。
(3)如图3显示，皮肤组织细胞核蓝染，细胞质可见点状红色荧光信号，为摄取入胞的DIR-DDNV。
实施例2：DDNV对HUVEC的增殖活力的影响
人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)购买自上海中乔新舟生物科技有限公司(zqxzbio，ZQ0446)。
(1)处理分组：①NC(空白对照组)；②石斛上清液组(0.025ug/mL)；③-⑤分别为不同浓度的DDNV组，1×109个/mL、5×107个/mL、2.5×108个/mL。
(2)将P6代HUVEC接种于96孔板中，每孔5000个细胞，待细胞贴壁；将石斛上清液和DDNV悬浮液按照组别②-⑤的加入浓度分别加入其中，37℃下干预6h，更换完全ECM培养基，继续培育24h；每孔按10:1的体积比例加入CCK-8试剂，在37℃下孵育2h，紫外分光光度计检测450nm的吸光度。结果如图4所示。
结果显示，相比空白组及石斛上清液组，本发明DDNV组在不同浓度下均显著促进细胞增殖。
实施例3：DDNV对HUVEC的迁移能力的影响
(1)处理分组：①NC(空白对照组)；②石斛上清液组(0.025ug/mL)；③-⑤分别为不同浓度的DDNV组，1×109个/mL、5×107个/mL、2.5×108个/mL。
(2)将P6代HUVEC接种于96孔板中，待细胞融合度达到70％后，将石斛上清液和DDNV悬浮液按照组别②-⑤的加入浓度分别加入其中，37℃下干预6h，更换完全ECM培养基，继续培育24h；待细胞生长至90％融合后，用200uL无菌移液枪枪头在细胞单层上划痕。然后用PBS清洗分离的细胞，重新加入低血清(1％)ECM培养基立即置于显微镜下拍照(0h)及24h在显微镜下观察HUVECs上的细胞迁移情况并成像。结果见图5。
结果显示，相比空白组及石斛上清液组，本发明DDNV组在不同浓度下均显著促进细胞的迁移。
实施例4：DDNV对HUVEC的体外成管能力的影响
(1)处理分组：①NC(空白对照组)；②石斛上清液组(0.025ug/mL)；③-⑤分别为不同浓度的DDNV组，1×109个/mL、5×107个/mL、2.5×108个/mL。
(2)将P6代HUVEC接种12孔板中，待细胞融合度达到70％后，将石斛上清液和DDNV悬浮液按照组别②-⑤的加入浓度分别加入其中，37℃下干预12h，更换完全ECM培养基，继续培育24h；
(3)用预冷的枪头吸取基质胶，往预冷的96孔板上样，每孔80uL，铺平孔底，放进培养箱孵育30-60mins。
(4)孵育完成后，将步骤(2)培养的细胞按照分组每孔加入1万个细胞，设置3个复孔，37℃培养箱继续培养6h、9h拍照，于倒置显微镜下进行拍照。结果见图6，为干预后9h的效果图。
结果显示，相比空白组及石斛上清液组，本发明DDNV组在不同浓度下均显著促进细胞的体外成管。
实施例5：DDNV对HUVEC中伤口愈合相关基因表达水平的影响
(1)处理分组：①NC(空白对照组)；②-④分别为不同浓度的DDNV组，1×109个/mL、5×107个/mL、2.5×108个/mL。
(2)使用q-PCR实验进行分析：将HUVEC细胞以105个/孔的浓度接种到6孔板中，37℃培养24h，将DDNV悬浮液按照组别②-④的加入浓度分别加入1×109个/mL、5×107个/mL、2.5×108个/mL的DDNVs其中干预37℃培养24h，根据制造商的说明，使用AG RNA分离试剂盒从细胞沉淀中分离总RNA。分离RNA后，按照制造商的说明进行cDNA合成。使用SYBR GreenMaster Mix(Applied BiosystemsTM)进行q-PCR实验，使用iCycler q-PCR系统(CFX96 RT-PCR系统，Bio-Rad)进行q-PCR反应循环。结果见图7。
KDR是一种受体酪氨酸激酶，它在内皮细胞中表达，并参与了血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成等过程。CD31是一种细胞间黏附分子，它在内皮细胞表面表达，并参与了血管内皮细胞的黏附和细胞间相互作用，用Q-PCR实验验证KDR和CD31的表达，可以相互验证DDNV是否可以调控内皮细胞促血管新生。
由图可见，本发明DDNV组在不同浓度干预下，HUVEC细胞中的KDR和CD31的表达明显上调，表明本发明DDNV可以促血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成能力、从而促进了血管生成。
实施例6：小鼠伤口愈合模型测试
(1)对象：8周龄大雄性C57小鼠；
(2)处理分组：①对照组(PBS皮下注射200uL/只)；②石斛上清液组(将蛋白浓度5ug/mL的石斛上清液皮下注射200uL/只，)；③DDNV组(将蛋白浓度5ug/mL的DDNVs皮下注射200uL/只)。
(3)具体步骤
①提前一天备皮及脱毛；
②将暴露的皮肤用75％酒精消毒。第二天使用腹腔注射250mg/kg三溴乙醇麻醉小鼠，也可麻醉后去毛；
③在距离背部中线和四肢等距离使用无菌的活检组织打孔器及无菌剪刀在小鼠背部构造两个直径为6mm的圆形全层皮肤伤口；
④每天按分组进行在伤口的边缘皮下注射干预分别在0、7、14天进行体重称量及记录伤口的愈合情况；
⑤第14天在超净台腹腔麻醉处理进行创面周围组织取材、石蜡切片、HE染色；
结果如图8-9所示。由图可见，相比对照组及石斛上清液组，本发明DDNV组可显著促进伤口愈合，且效果显著优于石斛上清组。
通过对小鼠损伤皮肤的HE染色观察，可见对照组表皮局部变薄，皮肤附属结构形态不均；而石斛上清组的表皮细胞增生增厚、角化过度，毛囊毛根减少；本发明DDNV组的皮肤附属结构形态正常且完整；结果表明，本发明DDNV可促进皮肤损伤愈合。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.石斛来源纳米囊泡在制备促进伤口愈合药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物采用常规方法制成各种药用剂型，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、酒剂、酊剂、滴剂的口服给药的剂型及注射液的口服以外的给药剂型。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物还含有一种或以上药学上可接受的载体或赋形剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的石斛来源纳米囊泡由石斛的茎部经提取分离得到。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述分离的方法为对提取液进行超速离心进行分离；所述超速离心的速度为100000g或以上。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述分离得到的石斛来源纳米囊泡用蔗糖水进行梯度纯化。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述纯化的操作具体包括将不同浓度的蔗糖水依次从高浓度到低浓度分层自下而上加入离心管中，石斛来源纳米囊泡悬浮液最后加入作为最上面一层，超速离心，将最高浓度蔗糖水和次高浓度蔗糖水夹层间的石斛来源纳米囊泡取出，得到纯化后石斛来源纳米囊泡。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所用蔗糖水的浓度分别为10-20wt％、25-35wt％、40-50wt％、55-60wt％。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：采用的不同浓度蔗糖水的浓度梯度差为10wt％或以上。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：超速离心的速度为100000g或以上。
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谢登超: "铁皮石斛来源天然脂质纳米囊泡在溃疡性结肠炎口服治疗中的应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊），医药卫生科技辑》, no. 4, 5 April 2022 (2022-04-05), pages 057 - 282 *

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