CN108578422B

CN108578422B - 一种治疗肝癌的药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN108578422B
Application number: CN201810845662.7A
Authority: CN
Inventors: 马丽芳; 陶玉泉; 徐鑫; 蔡枫
Original assignee: Shanghai traditional chinese medicine hospital
Current assignee: Shanghai traditional chinese medicine hospital
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN108578422A

Abstract

本发明涉及一种治疗肝癌的药物组合物及其应用，所述的药物组合物其药物活性组分为丹参酮IIA和淫羊藿苷，重量比为(1‑100):1。本发明证实了丹参酮IIA和淫羊藿苷联用可以发挥协同作用，显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移，促进肝癌细胞的凋亡，并上调肝癌细胞中抑癌基因Smad7的表达，从而发挥抗肝癌作用；动物实验表明，丹参酮IIA和淫羊藿苷联用可以协同抑制荷瘤大鼠肿瘤体积的增长，降低肿瘤组织中HMGB1和VEGF表达。本发明为临床肝癌药物开发提供了新的思路。

Description

一种治疗肝癌的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体地说，是一种治疗肝癌的药物组合物及其应用。

背景技术

肝癌是目前世界上第二大肿瘤相关死亡的疾病，而肝细胞肝癌占了其中的90％以上，仅中国就占了新增病例和死亡人数的一半以上，2015年新增病例466,100人，死亡422,100人。在中国，所有肿瘤中肝癌的生存率是最低的，而且5年的相对存活率只有10.1％。肝细胞肝癌的预后差、治愈率低，中医药治疗可以最大限度地延长患者的生存期，改善生存质量，提高生存率。

中医认为肝癌是一种以气血亏虚为本，气血湿热瘀毒互结为标的虚实错杂的病证，治疗应扶正祛邪，标本兼治。丹参是抗肿瘤常用药，最早见于《神农本草经》，有活血祛瘀、养血安神、凉血消痈的功效。《本经》曰：“主心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚；破症除瘕，止烦满，益气。”。丹参酮IIA是中药丹参根中提取的主要单体成分之一，近年来越来越多的研究表明丹参酮IIA具有抗炎、抗氧化、细胞毒性和抗肿瘤的作用，它可以改善血液循环，治疗慢性肝炎和肝纤维化。淫羊藿苷为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、或朝鲜淫羊藿的干燥茎叶提取物。据报道，能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，具有补肾壮阳、抗衰老、抗肿瘤等功效。

南昌大学2011年硕士论文“丹参酮IIA诱导肝癌细胞SMMG-7721凋亡及机制研究”，公开了丹参酮IIA可以通过抑制细胞周期和诱导细胞凋亡两种方式抑制肝癌细胞生长，其抑制作用呈时间和剂量依赖性，丹参酮IIA可以促进凋亡蛋白caspase-3的活化，PARP蛋白的剪切，下调凋亡抑制蛋白XIAP，但是对Survivin mRNA的表达没有影响。

专利文献CN101596202A，公开日2009.12.09，公开了丹参酮IIA乳剂在治疗肝部疾病中的应用，具体地，丹参酮IIA乳剂静脉给药后，药物能迅速靶向分布至肝脏，用于治疗脂肪性肝炎、病毒性肝炎、肝纤维化及肝癌等肝病，效果良好。

期刊文献《时珍国医国药》2011年第9期刊出的论文“淫羊藿苷抗肝癌细胞HepG2迁移机制的研究”，使用不同浓度淫羊藿苷作用HepG2细胞24h后，粘附实验检测了细胞粘附率，划痕损伤实验检测了迁移速度，得出淫羊霍苷抑制HepG2细胞粘附和运动，发挥抑制肿瘤转移作用的结论。

专利文献CN106995829A，公开日2017.08.01，公开了酶法转化淫羊藿总黄酮制备的淫羊藿苷元针对肝癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌的增殖抑制作用十分显著。

然而目前未见丹参酮IIA和淫羊藿苷联合抗肝癌的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种药物组合物。

本发明的再一的目的是，提供所述的药物组合物的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供所述的药物组合物的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗肝癌的药物组合物，所述的药物组合物其药物活性组分为丹参酮IIA和淫羊藿苷。

作为本发明的一个优选例，所述的丹参酮IIA和淫羊藿苷的重量比为(1-100):1。

更优选地，所述的丹参酮IIA和淫羊藿苷的重量比为(2-4):1。

最优选地，所述的丹参酮IIA和淫羊藿苷的重量比为3.5:1。

作为本发明的一个优选例，所述的药物组合物还包含除丹参酮IIA和淫羊藿苷以外的药物活性组分。

作为本发明的一个优选例，所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体。

更优选地，所述的药学上可接受的载体选自乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂和助溶剂。

作为本发明的一个优选例，所述的药物组合物被制成颗粒剂、片剂或胶囊剂的剂型。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤：将丹参酮IIA和淫羊藿苷按重量比混合，加入药学上可接受的载体。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。

本文中，所述的乳化剂诸如乙酰化单甘油脂肪酸酯、乙酰化双甘油脂肪酸酯、蔗糖酯、山梨糖醇脂、大豆磷脂、月桂酸单甘油酯、丙二醇脂肪酸酯、硬脂酰乳酸钙、双乙酰酒石酸、单硬脂酸甘油酯、改性大豆磷脂等。所述的赋形剂诸如硬脂酸镁、微晶纤维素、乳糖、奶糖、高分子量的聚乙二醇等。所述的填充剂诸如淀粉、甘露醇、硅酸、糊精、磷酸氢钙、纤维素等。所述的粘合剂诸如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶、淀粉浆、羟丙基淀粉、改良淀粉、预胶化淀粉、糊精、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮胶浆、明胶浆。所述的湿润剂诸如甘油等。所述的崩解剂诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉、木薯淀粉、海藻酸、羟丙基淀粉、改良淀粉、羧甲基淀粉钠、微晶纤维素、瓜耳胶、苍耳胶、黄原胶等。所述的吸收促进剂诸如季铵化合物、泡腾剂、环糊精、维生素D及其衍生物、胡椒碱等。所述的调味剂可以是酸味剂、甜味剂，诸如磷酸、乳酸、酒石酸、偏酒石酸、苹果酸、延胡索酸、乙酸、琥珀酸、木糖醇、甜菊糖、甜蜜素、天门冬酰苯丙氨酸甲酯、薄荷油等。所述的着色剂可以是植物着色剂、动物着色剂或微生物着色剂，诸如甜菜红、姜黄、叶绿素、紫胶红、胭脂虫红、红曲着色剂等。所述的助溶剂诸如β-环糊精、麦芽糊精、吐温、乙醇、司盘类、十二烷基硫酸钠、丙二醇、聚乙二醇、甘油等。但所述的药学上的常规载体不仅限于上述种类。此外，对于本领域技术人员而言，还知晓本发明的药物组合物可根据现有技术中的方法制备成任意可接受的形式。

本发明的优点在于提供了一种药物组合物，其活性成分为丹参酮IIA和淫羊藿苷，丹参酮IIA和淫羊藿苷联用可以发挥协同作用，显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移，促进肝癌细胞的凋亡，并上调肝癌细胞中抑癌基因Smad7的表达，从而发挥抗肝癌作用，动物实验表明，丹参酮IIA和淫羊藿苷联用可以协同抑制荷瘤大鼠肿瘤体积的增长，降低肿瘤组织中HMGB1和VEGF表达，且当丹参酮IIA和淫羊藿苷的重量比在2-4的范围内，效用最为明显。本发明为临床肝癌药物开发提供了新的思路。

附图说明

图1.CCK8增殖实验结果，可以看出各组药物对肝癌细胞增殖均有一定的抑制作用，其中TSA+ICA(3.5:1)组细胞活性最小，丹参酮IIA和淫羊藿苷表现出协同抑制的作用。

图2.本发明药物组合物处理组与DMSO处理组48小时后细胞的光学显微镜图片及相对细胞数的变化情况，可以看出本发明药物组合物对肝癌细胞增殖具有明显的抑制作用。

图3.免疫荧光染色凋亡蛋白Cleaved Caspase Substrate的表达情况，发现本发明药物组合物处理后Cleaved Caspase Substrate表达明显增多，说明细胞凋亡增加。

图4.用划痕实验检测本发明药物组合物处理肝癌细胞Bel-7404后，不同时间点细胞迁移的变化，可以看出本发明药物组合物对细胞迁移具有明显的抑制作用。

图5.本发明药物组合物促进Smad7mRNA的表达。结果显示，本发明药物组合物处理组Smad7表达水平显著上升。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

以下实施例中，所述丹参酮IIA结构式为淫羊藿苷结构式为宝藿苷I结构式为

实施例1本发明的药物组合物(一)

称取丹参酮IIA 1.0g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例2本发明的药物组合物(二)

称取丹参酮IIA 1.5g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例3本发明的药物组合物(三)

称取丹参酮IIA 2.0g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例4本发明的药物组合物(四)

称取丹参酮IIA 2.5g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例5本发明的药物组合物(五)

称取丹参酮IIA 3.0g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例6本发明的药物组合物(六)

称取丹参酮IIA 3.5g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例7本发明的药物组合物(七)

称取丹参酮IIA 4.0g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例8本发明的药物组合物(八)

称取丹参酮IIA 4.5g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例9本发明的药物组合物(九)

称取丹参酮IIA 5.0g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例10本发明的药物组合物(十)

称取丹参酮IIA 10.0g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例11本发明的药物组合物(十一)

称取丹参酮IIA 50.0g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例12本发明的药物组合物(十二)

称取丹参酮IIA 100.0g，淫羊藿苷1.0g，混合均匀。

实施例13本发明药物组合物的颗粒剂

按实施例1-12任一所述的重量比称取丹参酮IIA和淫羊藿苷，加入常规药用载体，制粒，干燥，整粒，分装10g/袋。

实施例14本发明药物组合物的片剂

按实施例1-12任一所述的重量比称取丹参酮IIA和淫羊藿苷，加入常规药用载体，粉碎制粒，压制成片剂。

实施例15本发明药物组合物的胶囊剂

按实施例1-12任一所述的重量比称取丹参酮IIA和淫羊藿苷，加入常规药用载体，粉碎制粒，填充装胶囊。

实施例16本发明药物组合物对肝癌细胞的生物学作用

一、实验方法

1.细胞培养：人肝癌细胞Bel-7404和SMMC-7721用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，于37℃、5％CO₂，95％饱和湿度的培养箱中培养，实验用细胞均处于对数生长期。2-3天常规消化传代1次，细胞消化使用胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25％)。

2.配制丹参酮IIA、淫羊藿苷、宝藿苷I储存：丹参酮IIA是红色结晶状，淫羊藿苷是淡黄色针状结晶粉末，宝藿苷I为黄色针状结晶，均用二甲亚砜(DMSO)溶解，配成10mM储备液，经0.22μm滤器过滤，置于-20℃避光储存备用。

3.CCK8实验：将5×10³个处于对数生长期的肝癌细胞接种至96孔板中，每孔加入100μl完全培养基，每个样本设置3个复孔，再加上一个空白孔作为空白对照(避免误差)，放置于37℃、5％CO₂、95％饱和湿度培养箱中培养6h待细胞贴壁后，对照组更换为100μl含有二甲亚砜的新鲜完全培养基，加药处理组包括：TSA组更换为含有4.0μg/ml丹参酮IIA的培养基；ICA组更换为含有4.0μg/ml淫羊藿苷的培养基；BHS I组更换为含有4.0μg/ml宝藿苷I的培养基；TSA+ICA(2:1)组更换为含有2.67μg/ml丹参酮IIA+1.33μg/ml淫羊藿苷的培养基；TSA+ICA(3:1)组更换为含有3.0μg/ml丹参酮IIA+1.0μg/ml淫羊藿苷的培养基；TSA+ICA(3.5:1)组更换为含有3.11μg/ml丹参酮IIA+0.89μg/ml淫羊藿苷的培养基；TSA+ICA(4:1)组更换为含有3.2μg/ml丹参酮IIA+0.8μg/ml淫羊藿苷的培养基；TSA+BHS I(3.5:1)组更换为含有3.11μg/ml丹参酮IIA+0.89μg/ml宝藿苷I的培养基；TSA+BHS I(4:1)组更换为含有3.2μg/ml丹参酮IIA+0.8μg/ml宝藿苷I的培养基。培养24h后，吸去培养基，1×磷酸缓冲盐溶液清洗三遍，更换为含有10％CCK8试剂的新鲜培养基，培养1-4h，观察颜色变化，待培养基颜色变为黄色时，取出，用酶标仪读取在波长为450nm处的吸光度值，根据吸光度值计算细胞活性。细胞活性％＝(处理组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。本实验至少重复3次。

4.克隆形成实验：使用胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25％)消化处于对数生长期的肝癌细胞，重悬进行细胞计数，按1×10³细胞密度接种于6孔板中，各实验组细胞设置3个复孔。每孔加入2ml完全培养基，以“十”字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀，放置于37℃、5％CO₂、95％饱和湿度培养箱中培养6h待细胞贴壁后，对照组更换为2ml含有二甲亚砜的新鲜完全培养基，加药处理组更换为含有3.11μg/ml丹参酮IIA+0.89μg/ml淫羊藿苷的培养基2ml，继续培养8天。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去培养基，用1×磷酸缓冲盐溶液小心清洗三遍，用4％多聚甲醛固定细胞15分钟，风干，用0.1％结晶紫染色15分钟，自来水冲洗三次，风干拍照。克隆形成率＝克隆数/接种细胞个数×100％。

5.划痕实验：在6孔板背面用直尺画出每孔3条横线穿过孔，按5×10⁴/cm²的细胞密度将处于对数生长期的肝癌细胞接种于6孔板中，放置于37℃、5％CO₂、95％饱和湿度培养箱中培养，待细胞融合率达到90％时，用200μl枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线在细胞层上划痕。划痕后1×磷酸缓冲盐溶液清洗三遍，去除脱落的细胞，对照组更换为2ml含有二甲亚砜的新鲜完全培养基，加药处理组更换为3.11μg/ml丹参酮IIA+0.89μg/ml淫羊藿苷的培养基，继续培养。按照0h、12h、24h时间点选取同一视野进行拍照，使用Image J图像处理软件对划痕进行分析，计算迁移率。迁移率＝划痕0小时伤痕面积/划痕24小时伤痕面积。

6.实时荧光定量PCR检测基因拷贝数：

6.1收集细胞：按照每个孔5×10⁵的细胞密度将处于对数生长期的肝癌细胞接种于6孔板中，放置于37℃、5％CO₂、95％饱和湿度培养箱中培养6h待细胞贴壁后，对照组更换为2ml含有二甲亚砜的新鲜培养基，加药处理组更换为3.11μg/ml丹参酮IIA+0.89μg/ml淫羊藿苷的培养基2ml，继续培养24小时。培养24h后，吸去培养基，1×磷酸缓冲盐溶液清洗一遍，用0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，用离心机以1000×rpm离心5分钟收集细胞。

6.2提取细胞总RNA：上一步收集的细胞用离心机以1000×rpm离心5分钟，细胞收集到1.5ml离心管中，每管加入1ml Trizol，用枪头轻轻吹打混匀，室温静置5min，每管加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀30s，待充分乳化后，用离心机4℃12000×g离心20min。将上清转移至新的1.5ml离心管中(注意不要吸到中间蛋白层)，向吸出的上清中加入等体积预冷的异丙醇，上下轻柔颠倒EP管，混匀后置于-20℃静置20min。用离心机4℃12000×g离心10min以获取RNA。沉淀即为RNA，弃上清，加入250μl DEPC水配制的冷70％冷乙醇溶液，清洗RNA，混匀后用离心机4℃12000×g离心10min，弃去乙醇，室温风干沉淀，注意不要让目的RNA降解，加入30μl DEPC水溶解RNA，分光光度计测定RNA浓度与A260/280值后置于-80℃保存备用。

6.3逆转录合成cDNA：根据6.2测定的RNA浓度，取3000ng总RNA，5×qRT sμper-Mix2μl，剩余用无酶超纯水补至10μl，在PCR仪中逆转录合成cDNA，逆转录条件：25℃10min，42℃30min，85℃5min，cDNA分装后置于-20℃保存。

6.4实时荧光定量PCR：取正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)1μl(引物序列见表1)，2×SYBR Green qPCR Mix 10μl，待检cDNA模板2μl，50×ROX Dye2 0.4μl，无酶去离子水5.6μl。每个反应设置3个复孔，同时设置无模板对照。经优化qPCR的反应条件如下：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火及延伸45s，40个循环。设置在延伸阶段收集荧光信号，Qμant Stμdio软件分析得到样本中各基因的循环阈值(Cq值)。qPCR反应结束后进行熔解曲线检测，95℃15s，60℃60s，95℃15s，1个循环。每个样本实验重复3次。根据循环数(CT)值计算mRNA的变化率。

表1实时荧光定量PCR引物序列

7.免疫荧光实验：将细胞爬片置于24孔板中，按照每个孔1×10³的细胞密度将处于对数生长期的肝癌细胞接种于24孔板中，每孔加入500μl完全培养基，放置于37℃、5％CO₂、95％饱和湿度培养箱中培养6h待细胞贴壁后，对照组更换为500μl含有二甲亚砜的新鲜完全培养基，加药处理组更换为含有3.11μg/ml丹参酮IIA+0.89μg/ml淫羊藿苷的培养基500μl。培养24h后，吸去培养基，1×磷酸缓冲盐溶液清洗一遍，5分钟，用4％多聚甲醛室温固定20min，弃去甲醛，用1×磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞三次，每次5min。每孔加入200μl封闭液室温封闭1小时(封闭液配方：1.5ml FBS，0.5ml Goat-serμm，50μl Triton X-100，用PBS配至50ml)。用封闭液稀释一抗，一抗稀释比例按抗体说明书，4℃孵育过夜。回收抗体，用1×磷酸缓冲盐溶液清洗细胞3次，每次5分钟。每孔加入200μl二抗(二抗用封闭液稀释，一般1:500)，室温闭光孵育1h。用1×磷酸缓冲盐溶液清洗细胞3次，每次5分钟。孵育DAPI(定位细胞核，呈蓝色)20min，1×磷酸缓冲盐溶液清洗细胞3次，每次5分钟。抗荧光淬灭封片剂封片，将玻片有细胞面朝下放于封片剂上，避光，共聚焦显微镜镜检拍照。

二、实验结果

1.各组药物对肝癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

用丹参酮IIA、淫羊藿苷、宝藿苷I或它们的组合物处理肝癌细胞，通过CCK8实验检测各组药物对肝癌细胞增殖的影响。图1为CCK8增殖实验结果，可以看出各组药物对肝癌细胞增殖均有一定的抑制作用，其中TSA+ICA(3.5:1)组细胞活性最小，丹参酮IIA和淫羊藿苷表现出协同抑制的作用。用丹参酮IIA和淫羊藿苷处理肝癌细胞，通过细胞功能实验检测丹参酮IIA和淫羊藿苷对肝癌细胞增殖、迁移、凋亡的变化。图2为本发明药物组合物处理组与DMSO处理组48小时后细胞的光学显微镜图片及相对细胞数的变化情况，可以看出本发明药物组合物对肝癌细胞增殖具有明显的抑制作用。图3为免疫荧光染色凋亡蛋白CleavedCaspase Substrate的表达情况，可见本发明药物组合物处理后Cleaved CaspaseSubstrate表达明显增多，说明细胞凋亡增加。图4是用划痕实验检测本发明药物组合物处理肝癌细胞Bel-7404后，不同时间点细胞迁移的变化，可以看出本发明药物组合物对细胞迁移具有明显的抑制作用。

用本发明药物组合物处理肝癌细胞，通过实时荧光定量PCR法检测本发明药物组合物处理后肝癌细胞中RNA的变化，尤其是Smad7的变化情况，从而从RNA层面检测本发明药物组合物处理后肝癌细胞中Smad7的变化情况。结果见图5，图5显示本发明药物组合物处理组Smad7表达水平显著上升。

实施例17本发明药物组合物对大鼠移植性肝癌的抑制作用

一、实验材料和方法

1.实验动物与主要试剂

雄性SD大鼠，鼠龄8周，体质量180-220g，购自上海斯莱克动物有限公司；Walker-256皮下荷瘤大鼠购自中国科学院上海实验动物中心。

丹参酮IIA(TSA)、淫羊藿苷(ICA)、宝藿苷I(BHS I)购自美国Sigma公司。其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

逆转录试剂盒、荧光定量realtime RT-PCR试剂盒购自TakaRa公司。

紫外分光光度计购自上海谱元仪器有限公司，7500型快速实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

2.实验方法

2.1大鼠移植瘤模型的制备

将皮下荷瘤大鼠断颈处死后，局部消毒，取出皮下瘤体，去除纤维组织，挑选肿瘤边缘鱼肉样无出血、坏死的肿瘤组织，用特制双刀片切成1mm³大小的瘤块以备种植用。将SD大鼠用20％乌拉坦0.5ml/100g行腹腔注射麻醉。切口处去毛、消毒，在上腹约1.5-2cm处作正中切口，显露肝左叶，用眼科剪刺破肝包膜，在包膜下作0.5-1cm的隧道，将备好的瘤组织块用眼科镊植入，确认瘤组织未退出、无出血，立即关腹。

2.2动物分组

将SD大鼠随机分为两组，其中假手术组6只，其余大鼠做种植肝癌手术，术后将存活大鼠再随机分组，组别包括假手术组、模型组、TSA组、ICA组、BHS I组、TSA+ICA(2:1)组、TSA+ICA(3:1)组、TSA+ICA(3.5:1)组、TSA+ICA(4:1)组、TSA+BHS I(3.5:1)组、TSA+BHS I(4:1)组，每组6只。假手术组只手术，不移植肿瘤组织；其余各组均移植肿瘤组织，同时给予相应药物灌胃，药物使用大豆油溶解，给药剂量为药物活性成分总量50mg/kg，给药体积50ml，每天灌胃一次。各组动物于移植术后12天处死，分离肿瘤组织和正常肝组织备用。

2.3肿瘤体积的测定

分离肿瘤组织，测量肿瘤最大径和与最大径垂直的最宽径。肿瘤体积

＝a×b²/2，a为肿瘤最大径，b为最大径垂直的最宽径。

2.4HMGB1、VEGF表达的检测

取50-100mg肿瘤组织，Trizol法提取总RNA，使用逆转录试剂盒转录得到cDNA，通过实时荧光定量PCR检测HMGB1、VEGF的表达量：取正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)1μl(引物序列见表2)，2×SYBR Green qPCR Mix 10μl，待检cDNA模板2μl，50×ROX Dye2 0.4μl，无酶去离子水5.6μl。每个反应设置3个复孔，同时设置无模板对照。经优化qPCR的反应条件如下：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火及延伸45s，40个循环。设置在延伸阶段收集荧光信号，Qμant Stμdio软件分析得到样本中各基因的循环阈值(Cq值)。qPCR反应结束后进行熔解曲线检测，95℃15s，60℃60s，95℃15s，1个循环。每个样本实验重复3次。根据循环数(CT)值计算mRNA的变化率。

表2实时荧光定量PCR引物序列

2.5数据处理

数据以均数±标准差表示，应用SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计学处理，统计学方法采用χ²检验，当P<0.05时认为有统计学意义。

三、实验结果

1.各组荷瘤大鼠肿瘤体积

各组瘤大鼠肿瘤体积测定结果见表3，从表中可以看出，各组药物均具有显著的抑瘤作用，荷瘤大鼠肿瘤体积与模型组相比均具有统计学意义(P<0.05or P<0.01)。其中，TSA+ICA(3.5:1)组抑瘤率最高，为83.91％，并且与其他组荷瘤大鼠肿瘤体积相比具有统计学意义(P<0.05or P<0.01)。TSA、ICA、BHS I三种药物相比较，抑瘤作用的大小顺序为：TSA>BHS I>ICA。然而从结果可以看出，TSA、ICA联用可以发挥显著的协同作用，TSA和BHS I之间不具有协同作用。因此，针对肝癌药物的开发，TSA、ICA联用是一种较为有效的治疗方案。

表3各组荷瘤大鼠肿瘤体积

注：与模型组相比较，*P<0.05，**P<0.01；与TSA+ICA(3.5:1)组相比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.各组荷瘤大鼠肿瘤组织HMGB1、VEGF的表达量

各组荷瘤大鼠肿瘤组织HMGB1、VEGF表达量的检测结果见表4，从表中可以看出，模型组荷瘤大鼠肿瘤组织中HMGB1、VEGF的表达量显著升高，而各用药组肿瘤组织中HMGB1、VEGF的表达量相比于模型组均有所显著下降，表明各药物均能显著下调肿瘤组织中HMGB1、VEGF的表达。

表4各组荷瘤大鼠肿瘤组织HMGB1、VEGF表达量

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市中医医院

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<400> 3

ccttagccga ctctgcgaac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgccaccacg caccagtgtg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagaaggtgg tgaagcaggc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtaatgcctt tgcccttcta t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

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<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggatgggttt gtcgtgtttc 20

Claims

1.一种治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物其药物活性组分由丹参酮IIA和淫羊藿苷组成，所述的丹参酮IIA和淫羊藿苷的重量比为3.5:1。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包含药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体选自乳化剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂和助溶剂。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物被制成颗粒剂、片剂或胶囊剂的剂型。

5.权利要求1-4任一所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将丹参酮IIA和淫羊藿苷按重量比混合，加入药学上可接受的载体。

6.权利要求1-4所述的药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。