JP6445879B2 - 皮膚を修復し活性化するための医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、損傷した皮膚を修復し、活性化するための組成物およびその製造方法に関するものであり、より詳細には、植物に含まれる物質を主成分とする皮膚修復活性化剤およびその製造方法に関するものである。

現在、ヒトの皮膚の細胞を活性化する方法として、１）皮膚のマッサージや温熱療法等の物理的方法によるもの、２）植物抽出物や人工薬剤等の皮膚塗布による化学的方法によるもの、３）ビタミン類等の経口投与による方法が一般的である。

近年、高い皮膚活性作用を有し、かつ副作用の少ない物質として、植物由来の天然成分が注目されている（非特許文献１）。例えば、ヘナやプルーンは、抗炎症作用や抗アレルギー作用が見出されている（特許文献１および２）

クワ（桑）の葉は、皮膚の美白効果や紫外線遮断効果が指摘されており、その利用が期待されている（特許文献２および３）。

非特許文献１ くらしの薬草と漢方薬 水野瑞夫、太田瑞夫 新日本法規出版ＫＫ。平成２６年８月

特許文献１ 特開２００１−３３５４９６

特許文献２ 特開２００３−２６７８８２

特許文献３ 特開２００５−２９８５１１

しかしながら、上記特許文献１−３においては、桑の葉抽出液の皮膚上皮細胞に対する細胞増殖効果あるいは紫外線に対する抵抗性の向上など，皮膚上皮細胞に対する有効濃度や投与量の最適化はなされていない。

さらに、紫外線等で損傷した皮膚を修復し、活性化する薬剤の開発も十分には進んでいない。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、損傷した皮膚を修復し、活性化すし、かつ副作用が小さい薬剤を実現することにある。

本発明の医薬組成物は、上記課題を解決するために、桑から抽出された抽出物を含有する、皮膚を活性化するための医薬組成物である。

本発明の医薬組成物では、前記抽出物は、前記桑の若葉、成熟葉、茎、根または種子から抽出されたものであることが好ましい。

本発明の医薬組成物では、前記抽出液体が水溶性であることが好ましい。

本発明の医薬組成物は、皮膚塗布形態であることが好ましい。

本発明の医薬の製造方法は、上記課題を解決するために、極性溶媒を用いて桑から抽出された抽出物を得る工程を包含する、皮膚を活性化するための医薬の製造方法である。

抽出を効果的に行うために、抽出炉内をマイナスイオン化すると共に、低圧状態にすることも含有する。

本発明の医薬の製造方法では、前記抽出物は、前記桑の若葉、成熟葉、茎、根または種子から抽出されたものであることが好ましい。

本発明の医薬の製造方法では、前記極性溶媒が水であることが好ましい。

本発明の医薬組成物は、上記課題を解決するために、前記桑の若葉、成熟葉、茎、根または種子から抽出された抽出物を含有することを特徴としている。

本発明を用いることにより、副作用を生じさせることなく正常細胞および傷ついた細胞の正常細胞への再分化によって皮膚を活性化することができ、紫外線の照射量が増大している現在、人々の紫外線対策に大いに役立つものと考えられる。また、形態学的には紫外線照射で紡錘形の形態がやや膨化したがほとんど変化を示さなかった。さらに、紫外線照射によって細胞増殖能は大きく低下して半分以下となるが桑の葉抽出液添加によって細胞増殖能は回復して １２％から１６％添加したものでは ６０％以上の回復が認められた。さらにまた、紫外線照射によって傷害された皮膚上皮細胞 の１型コラーゲン産生能力が桑の葉抽出液によって回復することが示された。

（１．医薬組成物、およびその製造方法） 本実施の形態の医薬組成物は、桑から抽出された抽出物を含有するものであって、正常細胞および傷ついた細胞の正常細胞への再分化によって皮膚を活性化するために用いられるものである。以下に、本実施の形態の医薬組成物およびその製造方法について説明する。

本発明において使用される桑としては特に限定されず、適宜公知の桑を用いることが可能である。桑は、野生種のものであってもよいが、人工的に培養されたものが使用されてもよい。なお、今回はララベリーを使用した。

また、抽出物を抽出するための桑の部位としては特に限定されない。例えば、上記桑の部位としては、桑の若葉、成熟葉、茎、根または種子を用いることが好ましい。

抽出に用いる極性溶媒としては特に限定されない。例えば、水、アルコール水溶液（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなど）、またはこれらの混合溶液を用いる。尚、最も良い抽出方法は、エキス抽出構造体（装置）で抽出炉内をマイナスイオン雰囲気として低圧で抽出するのが望ましい。よって、抽出液は１００％植物から抽出したものである。目的とする物質を効果的に抽出するとともに、医薬組成物を簡便に作製するという観点からは、上記の極性溶媒の中では、水を用いることも一考である。

上記極性溶媒の温度は特に限定されないが、上記抽出炉表面温度としては特に限定されないが、例えば、５０℃〜１００℃であることが好ましく、７０℃〜１００℃であることが更に好ましく、９０℃〜１００℃であることが最も好ましい。上記構成によれば、薬効を低下させることなく、目的とする物質の抽出効果を上昇させることができる。なお、上述した様々な事項を考慮すれば、極性溶媒としては、熱水（例えば、沸騰水など）を用いることが最も好ましい。

桑から抽出物を抽出するときの具体的な操作も特に限定されず、適宜公知の方法に基づいて行うことでも良い。例えば、超音波照射機、攪拌機、加温器、加圧器、真空器などを用いて抽出することが可能である。例えば、上記溶媒として水を用いる場合には、桑を沸騰水によって煮沸することによって、目的とする物質を抽出すればよい。なお、煮沸する時間としては特に限定されないが、例えば、１０分間〜３０分間であることが好ましく、１５分間〜２５分間であることが更に好ましく、２０分間であることが最も好ましい。上記構成によれば、目的とする物質に無駄な熱をかけることなく、当該物質を効果的に抽出することができる。なお、当該抽出操作の間、抽出液に対して超音波処理を行ったり、当該抽出液を攪拌することが可能である。

本実施の形態の医薬組成物は、正常細胞および傷ついた細胞の正常細胞への再分化によって皮膚を活性化するために用いられ得る。

本実施の形態の医薬組成物は、桑抽出物以外に薬学的に受容可能な担体を含んでもよい。医薬組成物中に使用される薬学的に受容可能な担体は、医薬組成物の投与形態および剤型に応じて選択され得る。

本明細書中で使用される場合、薬学的に受容可能な担体としては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機の担体物質が用いられ、当該担体物質は、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、または崩壊剤、あるいは、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、または無痛化剤などとして医薬組成物中に配合され得る。

上記賦形剤としては特に限定しないが、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどを用い得る。

上記滑沢剤としては特に限定しないが、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどを用い得る。

上記結合剤としては特に限定しないが、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを用い得る。

上記崩壊剤としては特に限定しないが、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどを用い得る。

上記溶剤としては特に限定しないが、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどを用い得る。

上記溶解補助剤としては特に限定しないが、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどを用い得る。

上記懸濁剤としては特に限定しないが、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子を用い得る。

等張化剤としては特に限定しないが、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどを用い得る。

緩衝剤としては特に限定しないが、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などを用い得る。

無痛化剤としては特に限定しないが、例えば、ベンジルアルコールなどを用い得る。

防腐剤としては特に限定しないが、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などを用い得る。

抗酸化剤としては特に限定しないが、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などを用い得る。

本実施の形態の医薬組成物は、製薬分野における公知の方法によって製造され得る。

本実施の形態の医薬組成物における桑抽出物の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮して設定され得る。例えば、当該医薬組成物を用いたときに後述の投与量範囲で桑抽出物を投与し得るような量であれば特に限定されない。

本実施の形態の医薬組成物が経口剤の形態をとる場合には、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが医薬用担体として利用され得る。また経口剤を調製する際に、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合してもよい。

本実施の形態の医薬組成物が非経口剤の形態をとる場合には、当該分野において公知の方法に従って、希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに、本発明の有効成分を溶解ないし懸濁させ、所望により殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより、本実施の形態の医薬組成物を調製することができる。

本実施の形態の医薬組成物は、製剤形態に応じた適切な投与経路で投与され得る。投与方法も特に限定されず、内用、外用、または注射によって投与することができる。本実施の形態の医薬組成物が注射剤としての形態を備えていれば、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し易い。よって、本実施の形態の医薬組成物は、流体であっても固体であってもよく、エアロゾルの形態であってもよい。

本実施の形態の医薬組成物の投与量は、その形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され得る。一般的には、製剤中に含有される有効成分の投与量としては、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動可能であって、上記投与量よりも少ない量で十分な場合もあるし、あるいは上記投与量よりも多い量が必要な場合もある。

投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で行ってもよいし、または数回に分けて行ってもよい。また、本実施の形態の医薬組成物は、そのまま皮膚塗布するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることも可能である。

本実施の形態の医薬組成物に使用され得る薬学的に受容可能な賦形剤は、一般に、組成物の重量の５％〜９９．９％、好ましくは２５％〜８０％を構成し、そして、他の補助剤の不存在においては、組成物の残余部分を構成し得る。好ましくは、賦形剤の重量の少なくとも８０重量％が水である。好ましくは、水が、医薬組成物の少なくとも５０重量％、最も好ましくは６０〜８０重量％を構成する。

〔実施例１：桑抽出液による上皮細胞の細胞増殖試験〕
桑の葉を、抽出炉内をマイナスイオン雰囲気とし、低圧で液体成分を抽出した。得られた抽出液は桑の葉の約５０重量パーセントであり、この抽出液を滅菌したフィルター（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）に通し、滅菌された抽出液を得た。

次いで、上記桑抽出液の皮膚活性化を検討する対象である細胞について説明する。

細胞は、理化学研究所セルバンクより供与された ＮＨＳＦ４６日本人皮膚由来正常 ２倍体線維芽細胞株を用いた。

次いで、ＮＨＳＦ４６日本人皮膚由来正常 ２倍体線維芽細胞株は、ＭＥＭα＋１０％ＦＢＳに３７℃， ＣＯ_２濃度（％） ５％で３日間培養した後、０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎにより継代したものを用いた。

細胞増殖試験は ， ２枚の９６ｗｅｌｌプレートに細胞を血球計算盤で計数し ５×１０^３ ／ｗｅｌｌに調整した細胞を ＭＥＭα＋１０％ＦＢＳ培地１００µｌと共に幡種し、３７℃培養で １日後に十分に発育したことを確認した。２枚の９６ｗｅｌｌプレートの１枚には、１５Ｗの紫外線灯から６０ｃｍの距離をおいて３０分照射し、紫外線照射群および紫外線非照射群の２群を用意した。この２群には，桑の葉抽出液を用時希釈して ０％ （ｃｏｎｔｒｏｌ）， ８， １０， １２， １４， １６， １８，
２０， ２２， ２４， ２６， ２８％となるよう調整した培地と置き換えた。ブランクおよび陰性対照のウェルには新鮮培地を加えた。 ３７℃の炭酸ガスインキュベーター内で ２４時間培養したのち、プレートを取り出し、形態学的に観察した。

さらに，同仁化学研究所の Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ 溶液を各ウェルに １０ μｌずつ添加した後，炭酸ガスインキュベーター内に戻し，１時間、呈色反応を行なった。マイクロプレートリーダーで ４５０ ｎｍの吸光度を測定し、下記の式により細胞生存率を算出した。
細胞生存率 （％）＝［（Ａｓ−Ａｂ）／（Ａｃ−Ａｂ）］×１００
Ａｓ： 検体の吸光度 （ 細胞、試薬，桑の葉抽出液 ）
Ａｃ： 陰性対照の吸光度 （ 細胞，試薬，桑の葉抽液無し ）
Ａｂ： ブランク吸光度 （ 培地，試薬，細胞無し ）
実験は３回行い，統計学的処理を行った。

その結果、形態学的に観察したものが図１である。形態学的には紫外線照射で紡錘形の形態がやや膨化したがほとんど変化を示さなかった。この程度の紫外線の影響を受けた上皮細胞を使用した上皮細胞増殖試験の結果が図２である。

図２は非照射，照射の桑の葉抽出液無添加状態の細胞増殖数値に対する比で表した。紫外線照射で明らかに細胞蔵増殖は抑制された。非照射群では １４％桑の葉抽出液添加で約
１５％の増殖能の増強が見られた。 ２８％以上の桑の葉抽出液添加培地でのみ細胞数がコントロールよりも減少したが、桑の葉抽出液の濃度を上げることで培地濃度が低下して低栄養状態になったものと考えられる。紫外線照射によって細胞増殖能は大きく低下して半分以下となるが桑の葉抽出液添加によって細胞増殖能は回復して １２％から１６％添加したものでは ６０％以上の回復が認められた。 １８％以上の濃度では細胞増殖能は回復せずに無添加レベルまで低下した。過剰な投与は細胞増殖能を向上させることが出来ないが紫外線障害からの上皮細胞の増殖能回復には本実験で認められたように至適濃度の桑の葉抽出液の添加で大きな効果が得られた。

〔実施例２：桑抽出液の上皮細胞に対する１型コラーゲン発現試験〕
１型コラーゲン発現試験では ６ ｃｍデッシュ １２枚に細胞を血球計算盤で計数し １００×１０^３ ／ｄｉｓｈに調整した細胞を ＭＥＭα＋１０％ＦＢＳ培地４ ｍｌと共に幡種し、３７℃培養で１日後に十分に発育したことを確認した後、デッシュ ６枚に紫外線 ３０分照射し、紫外線非照射群と照射群の２群に分割した。

細胞を紫外線照射群と非照射群の ２群に分け，各々を桑の葉抽出液添加群と無添加群に分けて遺伝子の１型コラーゲン ｍＲＮＡの発現状態を調べた。

桑の葉抽出液を用時希釈してデッシュ ３枚ずつ ０％ （ｃｏｎｔｒｏｌ）， １２％になるよう調整した培地と置き換えた。 ３７℃の炭酸ガスインキュベーター内で ２４
時間培養した。この後， ＰＢＳ溶液にて洗浄，市販の ＲＮＡ抽出試薬によって ＲＮＡを抽出， ＲＴ−ＰＣＲ法によって細胞の１型コラーゲンの ｍＲＮＡ発現状態を計測した。

その結果、図３に示すように桑の葉抽出液無添加群では照射細胞の １型コラーゲンの発現は照射によって ８０％ほどに減少している。また非照射細胞に桑の葉抽出液を添加した場合は、２倍以上の１型コラーゲンの発現が認められた。紫外線照射細胞の場合も桑の葉抽出液添加によって １型コラーゲンの発現が非照射細胞とほぼ同等の発現を示し，紫外線照射によって傷害された皮膚上皮細胞 の１型コラーゲン産生能力が桑の葉抽出液によって回復することが示された。

実施例１および実施例２より、桑の葉より抽出された抽出液は、正常ヒト上皮細胞の増殖を助長し、さらに、紫外線によって障害された上皮細胞の回復にも役に立つことが判明した。

なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。

本発明を用いれば、損傷した皮膚を修復し、活性化し、かつ副作用が小さい医薬を提供することができるので、医薬分野の発展に大いに寄与することができる。

ＭＫＮ４５ヒト上皮由来細胞に対する紫外線の影響を示す図である。 桑の抽出液によるＭＫＮ４５ヒト上皮由来細胞に対する増殖作用を示す図である。 桑の抽出液によるＭＫＮ４５ヒト上皮由来細胞に対するコラーゲン生成を示すグラフである。

Claims (1)

1. 桑の葉を、抽出炉内をマイナスイオン雰囲気とし、低圧で液体成分を抽出し、滅菌し た、フィルターに通し、滅菌された抽出液であって、該桑の葉抽出液のみを有効成分とす る正常細胞及び傷ついた細胞の正常細胞への細分化によって皮膚を活性化するための医薬 組成物。