CN112972483B - 巴戟天寡糖在制备治疗高原缺氧引起的机体功能障碍药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了巴戟天寡糖在制备治疗高原缺氧引起的机体功能障碍药物中的应用。巴戟天寡糖可提高耐缺氧能力、抗疲劳能力，还可以减轻脑内炎症反应；还可以治疗高原脑损伤与高原缺氧导致的机体神经‑免疫‑内分泌紊乱以及治疗认知、情绪、体能方面引起的的机体功能低下和损伤。

Description

巴戟天寡糖在制备治疗高原缺氧引起的机体功能障碍药物中 的应用

技术领域

本发明属于高原脑损伤技术领域，具体涉及巴戟天寡糖在制备治疗高原缺氧引起的机体功能障碍药物中的应用。

背景技术

高原环境中的低压低氧，作为一种非特异的刺激原，会导致未经习服急进高原者出现恶心呕吐、厌食乏力、头痛头晕、失眠及呼吸困难等相关“急性高原病”综合征的发生。研究显示，海拔6000m处的急性高原缺氧引起的机体功能障碍发病率高达75％，其中脑是该病变最易受累的器官之一，其功能异常严重威胁机体健康，急性高原脑损伤不同程度地影响了人类正常的工作和生活。

高原缺氧引起的机体功能障碍中的急性高原脑损伤主要是由高原地区典型的低压低氧条件所致。低压低氧导致器官功能障碍的机制主要包括细胞能量代谢障碍及炎性介质的大量产生。低压低氧生成的一氧化氮、氧自由基等直接破坏细胞结构，致使线粒体损伤及脱氧核苷酸链断裂，进而导致细胞能量代谢障碍和损伤甚至细胞死亡。炎症反应在低氧诱导的脑损伤中具有重要作用，它可以上调白介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素1(interleukin-1,IL-1)等促炎因子的表达，并上调血管内皮粘附分子及促凋亡蛋白的表达，促进外源性凝血而形成微循环血栓，进而加速炎症反应的发展并放大，最终诱导组织细胞凋亡。此外，炎性介质可增加水通道蛋白及其下游靶基因的表达，损伤脑微血管基膜、增加血管通透性、破坏血脑屏障进而造成血管原性脑水肿，加重病变脑组织损伤，并可导致学习、记忆、认知功能的下降。

中药巴戟天具有强筋骨、祛风湿、温补肾阳之功效。发明人前期通过大量筛选发现巴戟天有显著抗应激、抗抑郁和抗焦虑作用，进一步发现从巴戟天中提取的菊淀粉型低聚寡糖(Inulin-type oligosaccharides of morinda officinalis，IOMO)是其上述作用主要效应成分。历经长期研究，于2012年巴戟天寡糖胶囊获我国唯一的中药5类(新版1类)抗抑郁新药证书并上市至今(国药证字Z20120007)，适应症为轻、中度抑郁症，该药也是目前国内外唯一以寡糖为主要成分的抗抑郁药。临床应用中发现，该药在抗抑郁的同时，兼具有显著增强认知、调节睡眠、提高免疫力、改善焦虑等效应，上述所使用的巴戟天寡糖胶囊是从巴戟天中提取的、以菊淀粉型寡糖为主要成分(其中质量控制标准为：3-9聚寡糖含量53-70％)，由北京同仁堂股份有限公司生产。最近发明人采用该胶囊(北京同仁堂股份有限公司生产)发现其口服具有显著的抗高原脑损伤作用。

前期的巴戟天及其寡糖成分活性的授权专利包括：中药巴戟天提取物抗精神病的新用途(ZL94103414.3)，新型低聚寡糖类抗精神病药物(ZL94103415.1)，低聚寡糖在抗应激脑损伤中的用途(ZL99120251.1)，含有巴戟天寡糖的药物组合物及其制备方法(ZL200810115655.8)，巴戟天寡糖的含量测定方法(ZL200810134091.2)。

巴戟天寡糖(Inulin-type oligosaccharides of morinda officinalis，IOMO)，来源于茜草科巴戟天属(Morindaofficinalis How)的干燥根，巴戟天寡糖具有疏郁安神、补肾益智的功效，临床上可以把它用于抑郁症，像临床症状所见的就是抑郁情绪、情绪低落、提心吊胆、入睡难眠、失眠多梦、焦虑多疑、疲倦乏力、性欲的减退、耳鸣、健忘等等。

发明内容

本发明的目的在于提供巴戟天中的寡糖成分在制备治疗高原脑损伤药物中的应用。

巴戟天寡糖在提高耐缺氧药物中的应用。本发明给予小鼠灌胃处理，实验分组为Control、IOMO(50mg/kg)、IOMO(25mg/kg)、绞股蓝(100mg/kg)红景天苷(Salidroside)和乙酰唑胺(Acetazolamide)组和阳性对照组，灌胃10天，每天1次，结束后进行密闭瓶实验，50mg/kg IOMO能够提高小鼠密闭瓶缺氧实验的存活时间。25mg/kg IOMO灌胃10d的小鼠的存活时间大于100mg/kg绞股蓝组。50mg/kg IOMO灌胃7d的小鼠的存活时间大于对照组、IOMO(25mg/kg)、红景天苷(Salidroside)和乙酰唑胺(Acetazolamide)组。灌胃50mg/kgIOMO组的超过平均死亡时间的小鼠数量显著高于其他组。

巴戟天寡糖在提高抗疲劳药物的应用。本发明分别给予小鼠灌胃7d每天1次处理，进行转棒实验检测。实验分组为Control、IOMO(50mg/kg)、IOMO(25mg/kg)和红益胶囊(200mg/kg)，空白对照组小鼠给予0.5％的羧甲基纤维素钠，50mg/kg IOMO能够提高小鼠在棒时间。以120min为实验终止时间，将120min时间点小鼠在棒数量进行百分率统计，50mg/kg IOMO实验组的小鼠在棒数量百分率提高。

巴戟天寡糖在减轻缺氧导致脑内炎症反应药物中的应用。本发明分别给予小鼠灌胃10d，实验分组为Control、IOMO(50mg/kg)、IOMO(25mg/kg)和阳性对照组，给予小鼠腹腔注射LPS(5mg/kg)和LPS联合低氧(模拟海拔7000m)暴露24h，上升、下降速度均为30m/s，LPS和LPS联合低氧刺激能够上调小鼠海马组织炎症因子IL-6的水平，且LPS联合低氧组明显高于单纯LPS组，与对照组小鼠相比，50mg/kg IOMO显著降低LPS联合低氧暴露下小鼠海马组织IL-6和TNF-α的水平。对小鼠脑内小胶质细胞标志物Iba-1染色，LPS联合低氧刺激可导致对照组小鼠海马小胶质细胞激活表现为小胶质细胞数量增多并且由静息状态下的分枝状变为激活态的阿米巴样,50mg/kg IOMO预处理显著降低LPS联合低氧暴露下小鼠海马组织小胶质细胞活化(n＝4-6)。

本发明还公开了巴戟天寡糖在制备治疗高原脑损伤与高原缺氧导致的机体神经-免疫-内分泌紊乱的药物中的应用。

本发明还公开了巴戟天寡糖在制备治疗认知、情绪、体能方面引起的的机体功能低下和损伤的药物中的应用。

有益效果：本发明的研究结果显示巴戟天寡糖可提高耐缺氧能力，巴戟天寡糖还可以提高抗疲劳能力，巴戟天寡糖还可以减轻脑内炎症反应。

附图说明

图1为IOMO预处理提高小鼠在棒时间图，其中A为实验流程图，B为空白对照组及处理组的小鼠在棒时间，C为120min时间点小鼠在棒数量百分比图。

图2为IOMO预处理提高小鼠密闭瓶缺氧实验的存活时间图，其中A为实验流程图,分别给予小鼠灌胃处理，实验分组为Control、IOMO(50mg/kg)、IOMO(25mg/kg)和阳性对照组；B为25mg/kg IOMO和100mg/kg绞股蓝(Gypenosides，GYP)处理组小鼠密闭瓶缺氧实验的存活时间图；C为对照组、IOMO(50mg/kg)处理组小鼠密闭瓶缺氧实验的存活时间图；D为对照组、IOMO(50mg/kg)、IOMO(25mg/kg)、红景天苷(Salidroside)和乙酰唑胺(Acetazolamide)组小鼠密闭瓶缺氧实验的存活时间图。

图3为IOMO预处理减轻高原缺氧暴露下小鼠脑内炎症反应图，其中A为实验流程图，B为LPS和LPS联合低氧刺激炎症因子IL-1β的水平图，C为LPS和LPS联合低氧刺激能够上调小鼠海马组织炎症因子IL-6的水平图，D为LPS和LPS联合低氧刺激能够上调小鼠海马组织炎症因子TNF-α的水平图，E为对小鼠脑内小胶质细胞标志物Iba-1染色显示图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

本实验采用C57BL/6J、雄性、8周龄的健康成年小鼠为对研究对象，购于斯贝福动物技术有限公司。所有的实验动物管理及实验均遵守中华人民共和国卫生部动物实验管理条例和军事医学院实验动物管理条例。

研究药品巴戟天寡糖胶囊为北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产，每粒装300mg(巴戟天寡糖含量150mg，其中3-9聚寡糖含量53-70％)。巴戟天寡糖分为低(25mg/kg)、高剂量组(50mg/kg)，溶于0.5％的羧甲基纤维素钠。不同实验中选择的阳性对照药分别为100mg/kg绞股蓝(Gypenosides，GYP)，200mg/kg红益胶囊，100mg/kg红景天苷(Salidroside)和200mg/kg乙酰唑胺(Acetazolamide)，分别溶于0.5％的羧甲基纤维素钠，不同实验中均以0.5％的羧甲基纤维素钠作为空白对照。给予小鼠IOMO、阳性对照药、空白对照灌胃，每天1次，连用7/10d。

在本实验中所有数据采用均值±标准误(Mean±SD)表示，采用GraphpadPrism7.0软件进行分析和作图，图像资料采用Image J软件进行处理。组间比较采用t-test和One-way ANOVA进行统计学分析，P<0.05为显著性差异。

实施例1IOMO预处理提高小鼠的抗疲劳能力的转棒试验

灌胃结束后，次日，分别将小鼠放置于转棒疲劳仪上，调节转棒速度为30r/min，测定小鼠第三次从转棒仪跌落的时间。测试前，小鼠提前3d以10r/min进行训练，每天训练10min，目的是通过适应训练，让小鼠学会转棒爬行。如图1中A所示，分别给予小鼠灌胃7d处理，实验分组为Control、IOMO(50mg/kg)、IOMO(25mg/kg)和红益胶囊(200mg/kg)，灌胃结束于次日进行转棒实验检测。空白对照组小鼠给予0.5％的羧甲基纤维素钠，结果如图1中B所示，50mg/kg IOMO能够提高小鼠在棒时间。以120min为实验终止时间，将B图中120min时间点小鼠在棒数量进行百分率统计(n＝5，10)，结果如图1中C所示，50mg/kg IOMO实验组的小鼠在棒数量百分率提高。

实施例2IOMO预处理提高小鼠存活时间的密闭瓶缺氧试验

选取C57BL/6J、雄性、8周龄的健康成年小鼠,适应环境3d后，随机分组,每组10只，各组小鼠每日灌胃一次,连续7/10d,末次给药后3h后,将小鼠单个置于装有约5g钠石灰的250mL的广口瓶中,以凡士林涂抹瓶口密闭,观察并用秒表记录动物死亡时间。如图2中A所示，分别给予小鼠灌胃处理，实验分组为Control、IOMO(50mg/kg)、IOMO(25mg/kg)和阳性对照组，于最后一次灌胃结束后3h进行密闭瓶实验。如图2中C所示，对照组小鼠给予0.5％的羧甲基纤维素钠，处理组小鼠给予50mg/kg IOMO(羧甲基纤维素钠配置)灌胃10d，50mg/kgIOMO能够提高小鼠密闭瓶缺氧实验的存活时间。灌胃10d的小鼠在密闭瓶缺氧实验的存活时间如图2中B所示，25mg/kg IOMO灌胃10d的小鼠的存活时间大于100mg/kg绞股蓝(Gypenosides，GYP)组。灌胃7d的小鼠在密闭瓶缺氧实验的存活时间如图2中D所示，50mg/kg IOMO灌胃7d的小鼠的存活时间大于对照组、IOMO(25mg/kg)、红景天苷(Salidroside)和乙酰唑胺(Acetazolamide)组(*，p<0.05，n＝10)。D图Control组小鼠的平均死亡时间为52.5min，将各组超过平均死亡时间的小鼠数量进行百分比统计，灌胃50mg/kg IOMO组的超过平均死亡时间的小鼠数量明显高于其他组。

实施例3IOMO预处理减轻高原缺氧暴露下小鼠脑内炎症反应试验1.LPS联合低压低氧处理

实验组小鼠腹腔注射5mg/kg的LPS工作液，对照组小鼠注射等体积0.9％注射用生理盐水。腹腔注射结束后置于低压低氧舱，低压低氧舱原理是通过舱外抽气泵不断对舱内抽气来模拟高原低氧环境。实验操作如下：实验组小鼠被放置于低压低氧舱中，设置参数使低压低氧舱的湿度维持在40％-50％，温度为22-24℃，以30m/s的速度连续抽空气5min，使海拔高度上升至7000m，维持24h，对照组小鼠放置在该舱外相同位置。

2.小鼠脑组织灌流固定

给予小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉后，固定在手术台，打开胸腔暴露心脏；灌流针头插进左心室同时将右心房剪开，打开开关，暗红色的液体从右心房流出，0.9％肝素生理盐水冲洗2min后心脏流出澄清液体，4％多聚甲醛灌注10min，小鼠全身呈现僵硬状态，提示灌流成功；打开颅骨取出完整的脑组织，浸泡于提前配好的15％蔗糖中；24h后观察到脑组织由于脱水沉于瓶子的底部，更换30％的蔗糖，约24h后脑组织再次沉于底部提示脱水成功。取出脑组织，吸取表面多余的水分；OCT包埋后-20℃冷冻2h；迅速进行切片，厚度为40μm，切好的脑片置于PBS中，4℃存放。

3.冰冻脑切片免疫荧光

弃PBS，每孔加入0.3％Triton-X-100打孔，室温15min。弃打孔液，0.01MPBS洗涤3次，每次5min。加入封闭液(5％BSA配)，室温封闭60min，封闭结束直接加入一抗(Iba-1，WAKO，1：500；GFAP，DAKO，1：500)，混匀，4℃过夜。次日取出，0.01M PBS洗涤3次，每次5min，标记相应的荧光二抗，室温，2h，0.01M PBS洗涤3次，每次5min。贴片，用含DAPI封片剂封片，置于荧光显微镜下观察并拍照分析。

4.Real-time PCR检测mRNA的表达

(1)组织RNA的提取

腹腔注射1％的戊巴比妥钠溶液(60mg/kg)，待小鼠充分麻醉后颈椎脱臼处死，取脑，于冰上分离大脑皮层和海马。将一侧海马组织加入1ml TRIzol裂解液，研磨仪将其充分匀浆，将上述匀浆液转移至新的无RNA酶的离心管中，室温静止5min，加入200μl三氯甲烷，剧烈摇晃15s后，室温静置10min，预冷低温离心机，离心(4℃，12000g，15min)。小心吸取上层水相约400μl移至新离心管中，加入400μl等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；离心(4℃，12000g，15min)，弃上清。向离心管中加入1ml 75％乙醇(DEPC水配)，轻轻弹动底部的白色沉淀，离心(4℃，7500g，5min)，重复上述步骤(9)，弃上清，超净台晾干，待底部RNA白色沉淀变为半透明时加入20μlDEPC水。紫外分光光度计对样品中RNA浓度以及纯度进行测定，其RNA溶液A260/A280比值范围为1.8-2.1，证明RNA纯度较高。

(2)RNA反转录成cDNA

根据测得的RNA浓度进行计算，每个样品取1μg RNA行反转录，剩余的-80℃保存。RNA反转录体系及反应条件如下：

基因组DNA的去除

反应条件：42℃，2min。

配制逆转录反应体系

反应条件：37℃，15min；85℃，5s。

(3)Real-time PCR

目的基因引物序列如下：

以β-actin作为内参

Real-time PCR反应体系：

每个样品设置3个重复孔，每孔反应体系为20μl。Real-time PCR反应条件：

循环数为40

溶解曲线：

实验结果如图3中A-E所示，图3A中分别给予小鼠灌胃10d，实验分组为Control、IOMO(50mg/kg)、IOMO(25mg/kg)和阳性对照组，给予小鼠腹腔注射LPS(5mg/kg)和LPS联合低氧(7000m)暴露24h，上升、下降速度均为30m/s，图3中B-D中，LPS和LPS联合低氧刺激能够上调小鼠海马组织炎症因子IL-6的水平，且LPS联合低氧组明显高于单纯LPS组，与对照组小鼠相比，50mg/kg IOMO显著降低LPS联合低氧暴露下小鼠海马组织IL-6和TNF-α的水平(**，p<0.01，n＝4-7)。对小鼠脑内小胶质细胞标志物Iba-1染色如图3中E所示，LPS联合低氧刺激可导致对照组小鼠海马小胶质细胞激活表现为小胶质细胞数量增多并且由静息状态下的分枝状变为激活态的阿米巴样,50mg/kg IOMO预处理显著降低LPS联合低氧暴露下小鼠海马组织小胶质细胞活化(n＝4-6)。

上述实施例1-3显示，1.IOMO预处理提高小鼠密闭瓶实验耐缺氧能力；2.IOMO预处理提高小鼠抗疲劳能力；3.IOMO预处理减轻小鼠脑内炎症反应。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.巴戟天寡糖在制备治疗高原缺氧引起的机体功能障碍药物中的应用，其特征在于，所述治疗高原缺氧引起的机体功能障碍药物为提高耐缺氧药物或减轻脑内炎症反应药物。

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