CN103638162B - 一种巴戟天寡糖4聚糖在制备抗心肌缺血及再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents
一种巴戟天寡糖4聚糖在制备抗心肌缺血及再灌注损伤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了巴戟天提取物以及巴戟天寡糖4聚糖在制备抗心肌缺血和/或再灌注损伤及促进治疗性血管新生药物中的应用。所述的心肌缺血及再灌注损伤是心肌在血液灌注停止或不良时，即经历缺血、缺氧损伤，及重新建立循环、恢复血供后给机体带来的再次损伤。对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型及离体纯化培养的乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型均有保护作用，可显著缩小心肌梗死面积﹑减轻再灌注期心律失常的发生，有效保护心肌细胞的形态，减轻缺氧复氧对心肌细胞的损伤。所述的促进治疗性血管新生是通过一些方法的刺激包括某些药物的治疗作用增加功能性的冠状动脉分支或侧支，达到恢复缺血心肌血供，改善心脏功能的目的。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物的药物应用领域，具体涉及巴戟天寡糖在制备抗心肌缺血及再灌注损伤药物中的应用。
背景技术
冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CAD），简称冠心病，也称为缺血性心脏病，是人类常见的心血管疾病，是最主要的成人致死性心血管疾病。冠心病导致的急性心肌梗塞是目前造成心血管疾病发病率高、死亡率高的主要原因。冠心病发病持续增多，而且年轻化趋势明显。冠心病在临床上表现有严重的心肌缺血病症，严重威胁人类健康。冠心病患者的死亡率和长期预后与心肌损伤面积所决定的左心室功能相关，而心肌损伤面积是由心肌缺血的程度和时间决定的。心肌在血液供应阻断30min以上，就会引起各细胞器超微结构的改变和功能障碍，导致心肌细胞不可逆的损伤甚至死亡。心肌缺血性损伤随着缺血时间的延长而加重。
溶栓、冠脉动脉搭桥以及冠脉介入等是治疗急性心肌梗死的有效方法，这些方法可以使阻塞冠脉再通，但心肌缺血的及时再灌注，虽然可以挽救部分损伤但尚未坏死的心肌细胞，也可能加重缺血心肌的损伤，表现为心肌细胞的坏死加快，细胞肿胀，肌纤维收缩带的形成，心肌内出血以及无灌流现象，还可能产生严重的再灌注心律失常。这种冠心病发作治疗中发生的心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemical reperfusion injury,MIRI）严重影响了冠脉血运重建后即时的生存率和远期心功能的恢复。
巴戟天(Radix morinda officinalis,RMO)，为茜草科植物（Rubiaceae），是我国著名的四大南药之一，也是出口创汇的名贵药材。巴戟天具有补肾壮阳，强筋骨，祛风湿之功效，毒理实验证明它是一种安全的药物。有文献报道，5～7年生巴戟天总糖的含量可超过50%，是巴戟天化学成分的重要组成部分。活性研究显示，巴戟天糖类成分具有免疫调节、抗肿瘤、抗抑郁、抗应激、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用。发明内容
本发明对巴戟天提取物特别是提取于茜草科植物巴戟天（Morinda officinalisHow）的干燥根的巴戟天寡糖（Morindae officinalis oligosaccharides,MOO）的生物活性进行了研究。申请人意外的发现，巴戟天提取物在抗心肌缺血和/或再灌注损伤中具有明显活性。对其活性成分追踪发现其保护心肌缺血及再灌注损伤、促进血管新生作用的有效成分为菊淀粉型低聚寡糖的混合物,其中巴戟天寡糖单体中4、5、6聚糖对促进缺氧复氧损伤后的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖及小管形成作用最明显，且三者间作用相互协同。
巴戟天寡糖4聚糖分子式：C24H42O21，分子量：666.58，CAS登录号：13133-07-8，化学名称：蔗果四糖Nystose，结构式I；缩写Hex4。
巴戟天寡糖5聚糖分子式：C30H52O26，分子量：828.72，CAS登录号：59432-60-9，化学名称：蔗果五糖1F-fructofuranosylnystose，结构式II；缩写Hex5。
巴戟天寡糖6聚糖分子式：C36H62O31，分子量：990.86，化学名称：蔗果六糖Fruβ(2-1)-[Fruβ(2-1)]4-α(2-1)Glc，结构式III，缩写Hex6。
我们的研究首次发现，巴戟天4、5、6聚糖可以显著缩小心肌梗死面积，减轻缺氧复氧对心肌细胞的损伤，减少再灌注期心律失常的发生，有效保护心肌细胞的形态，促进治疗性血管新生，其治疗效果优于地奥心血康和麝香保心丸。上述心肌缺血及再灌注损伤是心肌在血液灌注停止或不良时，即经历缺血、缺氧损伤，及重新建立循环、恢复血供后给机体带来的再次损伤。
基于上述发现，本发明的目的在于提供巴戟天提取物特别是巴戟天4、5、6聚糖在制备抗心肌缺血再灌注损伤药物方面的新用途。所述的促进治疗性血管新生是通过一些方法的刺激包括某些药物的治疗作用增加功能性的冠状动脉分支或侧支，达到恢复缺血心肌血供，改善心脏功能的目的。
本发明提供了巴戟天提取物在制备抗心肌缺血、再灌注损伤或促进治疗性血管新生药物中的应用。
进一步地，所述巴戟天提取物提取于茜草科植物巴戟天的干燥根。
进一步地，本发明提供了巴戟天寡糖在制备抗心肌缺血、再灌注损伤或促进治疗性血管新生药物中的应用。优选地，所述巴戟天寡糖包含结构式I、结构式II和结构式III中所示化合物的一种或多种
进一步地，本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含巴戟天寡糖组分。优选地，所述巴戟天寡糖包含上述结构式I、结构式II和结构式III中所示化合物的一种或多种。药物组合物，其剂型可以为片剂、丸剂或胶囊剂、注射剂等。
进一步地，本发明提供了一种巴戟天寡糖4、5、6聚糖的制备方法，包括如下步骤：
1）、将巴戟天提取物溶解于水中，然后冷冻干燥；
2）、在冻结干燥物中加入吡啶，并在0℃下边搅拌，边加入无水醋酸；
3）、在温室状态下搅拌24h后，减压浓缩；
4）、残留部分加入CHCl3，用饱和苏打水、饱和食盐水清洗；
5）、用硫酸镁干燥后，再减压去除CHCl3；
6）、用化合物精制法分别提纯，展开溶媒为甲苯：乙酸乙酯=2:1→1:1→1:2→1:3→1:5，分别得到乙酰化巴戟天寡糖4、5、6聚糖单体；
7）、核磁共振检测分别确定所得到的乙酰化巴戟天寡糖4、5、6聚糖单体结构；
8）、乙酰化巴戟天寡糖4、5、6聚糖单体脱乙酰化；
将乙酰化巴戟天寡糖4、5、6聚糖单体溶解于的MeOH中，再加入的CH3ONa，在室温下搅拌2.5h后，再加入Dowex50Wx2[H+]进行中和，把树脂过滤之后，减压去除溶媒，将残留部分溶解到H2O中，通过Bio-Gel P-2Gel:10mL进行脱盐，冻结干燥后，获得白色固体；
9）、白色固体经MALDI-TOF-MS的凝胶过滤后即得到巴戟天寡糖4聚糖纯品
其中，所述心肌缺血再灌注损伤，为心肌在血液灌注停止或不良时，即经历缺血、缺氧后，循环重新建立，血供恢复后给机体带来的损伤。
本发明所述的巴戟天4、5、6聚糖提取于茜草科植物巴戟天（Morinda officinalisHow）的干燥根。
本发明所述药物是指以巴戟天4、5、6聚糖为主要活性成分，与可药用载体制成的医疗上可接受的制剂，如注射剂、片剂、丸剂或胶囊剂等。
本发明所述药物，其服用量以巴戟天4、5、6聚糖计：0.5g/次或1.5g/天。
本发明所述巴戟天4、5、6聚糖可用直接通过市售得到，也可以通过植物提取得到。
本发明通过：1.离体细胞实验系统：新生鼠心肌细胞缺氧复氧损伤、细胞凋亡，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧复氧损伤后增殖、迁移和小管形成；2.整体动物实验系统：无创性、有创性心肌缺血/梗死模型；进行了巴戟天4、5、6聚糖对心血管保护作用的研究。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供了以4、5、6聚糖为主的巴戟天寡糖新用途，其对心血管系统有很好的保护作用。
在查阅大量国内外相关文献的基础上，对巴戟天4、5、6聚糖保护心血管系统的作用进行了研究，结果证实：1）对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型及离体纯化培养的乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型均有保护作用，可显著缩小心肌梗死面积﹑减轻再灌注期心律失常的发生，有效保护心肌细胞的形态，减轻缺氧复氧对心肌细胞的损伤；2）可提高大鼠心肌细胞抗氧化酶（SOD、LDH、GSH-Px）水平，减轻大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤时脂质过氧化损伤程度，减少脂质过氧化产物MDA的生成；3）可提高大鼠心肌缺血再灌注时iNOS表达水平及NO产量，提高心肌细胞Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性；4）通过调控细胞凋亡的相关基因表达，可显著减轻心肌细胞的凋亡；5）通过降低心肌细胞缺氧/复氧损伤时ET-1含量及TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌,显著改善心肌细胞缺氧复氧损伤时的炎性反应程度；6）可改善血淤大鼠的血流动力学,抑制血小板聚集；7）巴戟天糖链可显著促进成肌细胞增殖及向心肌样细胞分化,增强成肌细胞胞核的PCNA阳性反应，提高成肌细胞内TGF-β1、TGF-β2、GATA-4基因和蛋白的表达，上调信号传导因子Smad4的表达，依剂量双向调节特异型信号传导因子p-Smad2/3及Smad7的表达。8）可有效促进血管新生，显著减轻H/R对血管内皮细胞的损伤，抑制细胞凋亡，有效促进H/R损伤的内皮细胞迁移和血管形成，提高缺血心肌微血管密度，显著诱导血管新生过程中VEGF蛋白、bFGF蛋白、Flt-1蛋白、TRPC6蛋白、ERK1/2蛋白及PDGF-B蛋白的表达。调控Notch1/Jagged1等主要信号分子蛋白表达，从而降低Notch信号和PTEN蛋白的表达。9）可激活血管内皮细胞膜上大电导钙激活钾(BKCa)通道。10）巴戟天糖链对心血管系统的保护作用有一定剂量相关性。
2、本发明采用的巴戟天4、5、6聚糖提取于纯天然原料，提取方法简单，化学结构及分子量明确，性质稳定，提取率高，质量可控。
附图说明
图1是心肌细胞形态学观察(×40)，A为正常心肌细胞，B为H/R组，C为H/R+地奥心血康组，D为H/R+4聚糖组，E为H/R+5聚糖组，F为H/R+6聚糖组；
图2是心肌细胞超微结构观察（×5000），A为正常心肌细胞，B为H/R组，C为H/R+地奥心血康组，D为H/R+4聚糖组，E为H/R+5聚糖组，F为H/R+6聚糖组；
图3是心肌梗死大体组织标本，A为正常心肌，B为MI组，C为MI+地奥心血康组，D为MI+4聚糖组，E为MI+5聚糖组，F为MI+6聚糖组；
图4是缺血心肌微血管密度(MVD)的检测，A为正常心肌，B为MI组，C为MI+麝香保心丸组，D为MI+4聚糖组，E为MI+5聚糖组，F为MI+6聚糖组；
图5是HUVEC缺氧复氧损伤(H/R)后增殖（×10），A为正常组，B为H/R组，C为H/R+麝香保心丸组，D为H/R+4聚糖组，E为H/R+5聚糖组，F为H/R+6聚糖组；
图6 HUVEC迁移（×10），A为正常组，B为H/R组，C为H/R+麝香保心丸组，D为H/R+4聚糖组，E为H/R+5聚糖组，F为H/R+6聚糖组；
图7 HUVEC小管形成（×10），A为正常组，B为H/R组，C为H/R+麝香保心丸组，D为H/R+4聚糖组，E为H/R+5聚糖组，F为H/R+6聚糖组；
图8 HUVEC小管形成（×10），A为正常组，B为H/R组，C为H/R+麝香保心丸组，D为H/R+MOO组，E为H/R+Hex4，F为H/R+Hex5，G为H/R+Hex6；
具体实施方式
本发明中所用的生化试剂、实验动物和细胞等实验材料均可通过市售渠道获得。巴戟天药材（Radix morinda officinalis）购自广东省德庆县药材公司，经河南中医学院药学院鉴定为一等品；巴戟天寡糖混合物（Morinda officinalis oligosaccharides）采用本领域常规方法制备并确定；SD/Wistar大鼠购自郑州大学实验动物中心；人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自武汉大学细胞保藏中心，上述材料也可通过其他商业途径购买获得。
实施例1
巴戟天寡糖4、5、6聚糖单体的制备：
⑴将10g巴戟天提取物溶解于80ml的H2O中，再使其冻结干燥。
⑵在8.3g的冻结干燥物中加入100ml的吡啶，并在0℃的温度下边搅拌，边加入100ml的无水醋酸。
⑶在温室状态下搅拌24h后，用减压法去除多余的媒介。
⑷残留部分再加入CHCl3，用饱和苏打水、饱和食盐水洗净。
⑸用硫酸镁干燥后，再减压去除CHCl3。
⑹用化合物精制法分别提纯（展开溶媒：甲苯：乙酸乙酯（Toluene:Ethylacetate）=2:1→1:1→1:2→1:3→1:5）。提取出623mg的乙酰化Hex4单体（Hex4perAc）。提取出623mg的乙酰化Hex5单体（Hex5perAc）。提取出74mg的乙酰化Hex6单体（Hex6 perAc）。
⑺用核磁共振方法确定Hex4perAc、Hex5perAc、Hex6perAc结构。
⑻Hex4perAc、Hex5perAc、Hex6perAc脱乙酰化：
将100mg的Hex4perAc溶解于5mL的MeOH中，再加入18mg,0.3eq的CH3Ona。在温室下搅拌2.5h后，再加入Dowex50Wx2[H+]进行中和。把树脂过滤之后，减压去除溶媒。将残留部分溶解到H2O中，通过（Bio-Gel P-2Gel:10mL）进行脱盐。冻结干燥后，可获得白色固体（57mg）。
将100mg的Hex5perAc溶解于5mL的MeOH中，再加入18mg,0.3eq的CH3Ona。在温室下搅拌2.5h后，再加入Dowex50Wx2[H+]进行中和。把树脂过滤之后，减压去除溶媒。将残留部分溶解到H2O中，通过（Bio-GelP-2Gel:10mL）进行脱盐。冻结干燥后，可获得白色固体（57mg）。
将74mg的Hex6perAc溶解于5mL的MeOH中，再加入12mg,0.3eq的CH3Ona。在温室下搅拌2.5h后，再加入Dowex50Wx2[H+]进行中和。把树脂过滤之后，减压去除溶媒。将残留部分溶解到H2O中，通过（Bio-Gel P-2Gel:10mL）进行脱盐。冻结干燥后，可获得白色固体（39mg）。
⑼将上述白色固体分别进行MALDI-TOF-MS的凝胶过滤后即得到Hex4、5、6纯品。
Hex4：纯度95%以上（NMR）；保存4℃；分子量666.578；
Hex5：纯度95%以上（NMR）；保存4℃；分子量828.7183；
Hex6：纯度95%以上（NMR）；保存4℃；分子量990.859。
实施例2
（1）离体内皮细胞及整体动物实验
<1>在新生乳鼠心肌细胞的实验系统中，采用新生（1-3d）SD/Wistar大鼠，取心脏做原代心肌细胞培养，分为正常对照组、缺氧-复氧损伤（H/R）模型组、H/R+阳性药物（地奥心血康,0.7g·L-1）对照组、H/R+Hex4(42nmol·ml-1)、Hex5(30nmol·ml-1)、Hex6(22nmol·ml-1)各组。以心肌细胞形态和心肌细胞超微结构为主要评价指标，观察巴戟天4、5、6聚糖对心肌细胞的保护作用。
<2>在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管新生模型的实验系统中，分为正常对照组、H/R模型组、H/R+阳性药物（麝香保心丸,2g·L-1）对照组、H/R+Hex4(42nmol·ml-1)、Hex5(30nmol·ml-1)、Hex6(22nmol·ml-1)各组。以血管内皮细胞增殖和内皮细胞排列成管腔结构为主要评价指标，以缺氧模型组细胞增殖和细胞排列成管腔结构数目高于正常对照组均值的两个标准差作为模型成功的评价标准。模型成功后12h内分别给与不同的药物。
给药后6h、12h、24h、48h、72h分别①用流式细胞方法测定各组血管内皮细胞的增殖；②用流式细胞仪方法分析各组细胞增殖周期。③采用transwell小室迁移实验和小管形成实验观察巴戟天4、5、6聚糖促内皮细胞的增殖及诱导其分化形成管腔的作用。
（2）整体动物实验
<1>无创性心肌缺血模型：选用SD/Wistar大鼠，将动物随机分为：空白(生理盐水)对照组、异丙肾上腺素(Isoproterenol)心肌慢性缺血损伤模型组、模型+阳性药物（地奥心血康,28mg·kg-1·d-1)对照组、模型+Hex4(24mg·kg-1·d-1)、Hex5(12mg·kg-1·d-1)、Hex6(2.8mg·kg-1·d-1)各组。除空白对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组均采用多次异丙肾上腺素腹腔注射方法制备心肌慢性缺血损伤模型，以心电图ST-T改变为判定模型成功依据。各组均于模型成功后24h内开始给与药物干预（空白组、模型组灌胃给与等容积的生理盐水，各给药组灌胃给与相应等容积不同剂量的药物）。
<2>有创性心肌梗死模型：选用SD/Wistar大鼠，随机分为假结扎组、梗死模型组、模型+阳性药物（麝香保心丸组30mg·kg·d)对照组、模型+Hex4(24mg·kg-1·d-1)、Hex5(12mg·kg-1·d-1)、Hex6(2.8mg·kg-1·d-1)各组。除假结扎组开胸分离冠状动脉后只穿线不结扎外，其余各组均于肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1～2mm处结扎冠状动脉左前降支，制备心肌梗死模型，以结扎部位下心肌变白、搏动减弱且心电图出现ST段弓背向上明显抬高为造模成功标志。各组均于造模后24h内开始药物干预（假结扎组、梗死模型组腹腔注射给与等容积的生理盐水，各给药组腹腔注射给与相应的等容积不同剂量药物）。
药物干预6w后处死动物，心肌取材：①石蜡包埋切片，行一般组织形态学观察；②HE染色检测各组大鼠缺血心肌中微血管密度（MVD），从整体水平观察巴戟天4、5、6聚糖促进血管新生的特征。
实验结果如图所示：
图1是巴戟天4、5、6对乳鼠心肌细胞形态的影响：在倒置显微镜下可以看到正常心肌细胞培养3天后，细胞成簇生长，伸出伪足，折光性强，且搏动明显。细胞形态呈现多样化，如圆形、梭形及椎形（图A）。缺氧复氧损伤后心肌细胞伪足缩短或消失，折光性下降，搏动减弱或消失（图B）。地奥心血康组心肌细胞形态较缺氧复氧损伤组有一定的改善（图C）。Hex4、Hex5、Hex6各给药组心肌细胞形态得到明显改善（图D,E,F）。
图2是巴戟天4、5、6对乳鼠心肌细胞超微结构的影响：在透射电镜下心肌细胞超微结构显示，正常细胞培养组超微结构完整、清晰，细胞器多，细胞核膜表面光滑，核中染色质疏松，密度均一（图A）。缺氧复氧模型组可见胞体变小，核膜皱缩，染色质凝集，有不均匀边集现象，部分染色质在完整的核膜下集聚呈半月体样改变，核深染，固缩，线粒体有空泡变性等凋亡典型形态特征（图B）。地奥心血康组细胞超微结构较缺氧复氧损伤组得到不同程度的改善，但仍有染色质轻度边集，核深染等形态学变化（图C）。Hex4、Hex5、Hex6各给药组细胞超微结构接近正常（图D,E,F）。
图3是巴戟天4、5、6对大鼠心肌梗死的影响：心肌梗死大体组织标本中可见，与正常组（图A）相比，心肌梗死模型组心肌呈大面积透壁性缺血坏死（图B）。地奥心血康组心肌缺血坏死面积较模型组有所减轻（图C）。Hex4、Hex5、Hex6各给药组心肌缺血坏死面积及程度均较模型组明显减轻（图D,E,F）。
图4是巴戟天4、5、6对大鼠心肌血管增生及微血管密度的影响：光镜下可见心肌切片中假结扎组、模型组、麝香保心丸组、Hex4、Hex5、Hex6各给药组均可看到新生的毛细血管；但假结扎组可见毛细血管增生不明显（图A）。模型组可见少量毛细血管增生（图B）。麝香保心丸组和Hex4、Hex5、Hex6各组可见多数增生的毛细血管（图C,D,E,F）。与假结扎组相比，模型组大鼠MVD(微血管密度)显著增多（P＜0.05）。与模型组相比，麝香保心丸组和Hex4、Hex5、Hex6各组均能显著增加MVD（P＜0.05）。
图5是巴戟天4、5、6对人脐静脉内皮细胞增殖的影响：与正常组（图A）比较，缺氧复氧损伤组HUVEC细胞增殖数量较少（图B）。与模型组相比，麝香保心丸组细胞增殖数量增多，统计学有显著性差异(P＜0.05，图C）。与麝香保心丸组相比，Hex4、Hex5、Hex6各用药组均可显著促进细胞损伤后的增殖(P＜0.05，图D,E,F）。
图6是巴戟天4、5、6对人脐静脉内皮细胞迁移的影响1(小室法)：与正常组（图A）相比，缺氧复氧损伤(H/R)模型组细胞迁移数明显减少（P<0.05，图B）。阳性对照药麝香保心丸组未表现出促进缺氧复氧损伤内皮细胞迁移的作用（图C）。Hex4、Hex5、Hex6各组可明显增加缺氧复氧损伤后细胞的迁移数目（P<0.05，图，D,E,F）。
图7是巴戟天4、5、6对人脐静脉内皮细胞迁移的影响2(划痕法)：与正常组（图A）相比，缺氧复氧损伤(H/R)模型组细胞迁移数明显减少（P<0.05，图B）。阳性对照药麝香保心丸组有促进缺氧复氧损伤内皮细胞迁移的趋势（图C）。Hex4、Hex5、Hex6各组可明显增加缺氧复氧损伤后细胞的迁移数目（P<0.05，图D,E,F）。
图8是巴戟天4、5、6促人脐静脉内皮细胞小管形成的影响：与正常组（图A）相比，MOO、Hex4、Hex5、Hex6各组细胞培养6h即可见有细胞间的相互连接形态，18h在martrigel表面形成完整的管腔样结构，并随着培养时间的延长，管腔结构增多（图D,E,F,G）。缺氧复氧损伤模型组细胞在18h后才开始相互连接，24h在基质胶表面形成完整的管腔样结构少于MOO、Hex4、Hex5、Hex6各组（图B）。阳性对照药麝香保心丸组的小管形成状况差于MOO、Hex4、Hex5、Hex6各组（图C）。经计算机图像分析软件处理得到小管形成面积显示，模型组与正常组相比差异显著（P<0.05），MOO、Hex4、Hex5、Hex6各组与模型组相比差异显著（P<0.05），模型组与麝香保心丸组相比无差异显著（P＞0.05）。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (1)
1.一种巴戟天寡糖4聚糖的制备方法，包括如下步骤：
1)、将巴戟天提取物溶解于水中，然后冷冻干燥；
2)、在冻结干燥物中加入吡啶，并在0℃下边搅拌，边加入无水醋酸；
3)、在温室状态下搅拌24h后，减压浓缩；
4)、残留部分加入CHCl3，用饱和苏打水、饱和食盐水清洗；
5)、用硫酸镁干燥后，再减压去除CHCl3；
6)、用化合物精制法提纯，展开溶媒为甲苯：乙酸乙酯＝2:1→1:1→1:2→1:3→1:5，得乙酰化巴戟天寡糖4聚糖单体；
7)、核磁共振检测确定乙酰化巴戟天寡糖4聚糖单体的结构；
8)、乙酰化巴戟天寡糖4聚糖单体脱乙酰化；
将乙酰化巴戟天寡糖4聚糖单体溶解于MeOH中，再加入CH3ONa，在室温下搅拌2.5h后，再加入Dowex50Wx2[H+]进行中和，把树脂过滤之后，减压去除溶媒，将残留部分溶解到H2O中，通过Bio-GelP-2:10mL进行脱盐，冻结干燥后，获得白色固体；
9)、白色固体经MALDI-TOF-MS的凝胶过滤后即得到巴戟天寡糖4聚糖纯品。
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