CN105267356B - 一种巴戟天寡糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种巴戟天寡糖及其制备方法,所述的寡糖含量50‐99%,其包括双聚糖、三聚糖、四聚糖、五聚糖、六聚糖、七聚糖、八聚糖、九聚糖,所述的巴戟天寡糖具有调节免疫作用,制备方法能够产业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,尤其是涉及一种巴戟天寡糖及其制备方法。
背景技术
巴戟天,为双子叶植物茜草科药用植物,入药的部位为地下的干燥根。药材根扁圆柱形式圆柱形,略弯曲,长度不等,直径1-2cm,表面灰黄色或灰黄棕色,有的微带紫色,具纵皱及深陷的横纹,有的呈缢缩状或皮部横向断离而露出木部,形如鸡肠。质坚韧,折断面不平,皮部厚5-7mm,淡紫色,木部直径2-4mm。气微,味苦,略涩。传统功效有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿。经研究,其主要成分为14种蒽醌化合物、环烯醚萜、低聚糖、多糖类,有机酸类,氨基酸,挥发性成分以及微量元素等等。糖类是巴戟天的主要成分之一,含量占50%以上。从巴戟天中分得了葡萄糖、甘露糖,巴戟素、耐斯糖(nystose),1F-果呋喃糖基耐斯糖(1F-fructofuranosyl nystose)、菊淀粉[即(2-1)果呋喃糖基蔗糖]型六聚糖(hexasaccharide)和七聚糖(heptasaccharide)等多种低聚糖。有研究表明5~7年生巴戟天总糖的含量可超过50%。对巴戟天水溶性部分的研究发现其中含有低聚糖类成分。崔承彬等从巴戟天根中分离鉴定出4个水溶性低聚糖类单体:耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、菊淀粉系列的六聚糖和七聚糖,均为菊淀粉型低聚糖(亦称寡糖),具有抗抑郁活性。冯峰等从巴戟天活性部分提取出6个寡糖化合物,分别为蔗糖(Ⅰ)、耐斯糖(Ⅱ)、菊粉六糖(Ⅲ)、β-D-果吡喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖(Ⅳ)、β-D-果吡喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖(Ⅴ)、β-D-果吡喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖-(2→1)-β-D-果呋喃糖(Ⅵ)。
巴戟天的主要药理作用
1 壮阳作用
丁平等通过巴戟天水提液、巴戟天体积分数80%乙醇提取物、巴戟天寡糖结晶对环磷酰胺(CTX)引起的精子减少模型雄性小鼠的生精子作用及对性器官的影响进行了研究。结果与CTX组小鼠相比,巴戟天水溶液组、巴戟天体积分数80%乙醇提取物及巴戟天总寡糖结晶组小鼠平均精子数分别升高。实验显示,3种巴戟大提取物促进精子生成作用的强弱顺序为巴戟天寡糖结晶、巴戟天80%乙醇提取物、巴戟天水提液。其中巴戟天总寡糖结晶作用最强,由此推断巴戟天促进小鼠生精作用的物质基础可能是巴戟天总寡糖的提取物,且这一药理作用与巴戟天传统的补肾作用较吻合,值得进一步深入研究。
2 抗抑郁作用
张中启等通过大鼠,小鼠强迫性游泳和大鼠获得性无助抑郁模型,观察了不同批次的巴戟天寡糖(MOs)对其的影响,发现MOs能逆转大鼠的逃避行为缺欠,表明其具有一定的抗抑郁作用。亦有研究表明,巴戟天寡糖能够增加原代培养的海马神经元树突及分支数目,巴戟天寡糖对海马神经可塑性具有调节作用,该作用可能是其抗抑郁作用机制之一。
3 抗肿瘤作用
祝海燕表明,从海巴戟中得到的citrifolinoside和citrifolininA,对紫外线(UVB)诱导的、在肿瘤诱发和生长中起重要作用的蛋白活化剂AP-1有显著抑制作用,也是目前为止发现的惟一两种具有此活性的环烯醚萜类化合物。付嘉等用S180瘤株制备荷瘤动物模型,以红细胞C3b受体花环率(RBC-C3bRR),红细胞免疫复合物花环率(RBC-1CR),外周血T淋巴细胞亚群,血清IL-2含量测定为指标,对巴戟天水提液的抗肿瘤作用进行观察发现,巴戟天水提液对荷瘤小鼠的上述4项指标均有明显作用,由此表明巴戟天水提液能够提高荷瘤机体的抗肿瘤功能。
4 对免疫系统作用
吴岩斌等通过LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞系建立炎症细胞模型以筛选巴戟天体外抗炎的有效部位,发现以正丁醇所萃取的成分有明显的量效关系。
赵辉等用体外细胞培养法观察巴戟天对丝裂原诱导的健康老人淋巴细胞增殖及对丝裂原诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响,以及小鼠巨噬细胞产生肿瘤坏死因子(TNF)的影响,结果表明巴戟天可促进刀豆蛋白A(ConA)活化的人体淋巴细胞增殖,可促进ConA和细菌多糖(LPS)活化的小鼠淋巴细胞的增殖,并能提高小鼠巨噬细胞产生TNF的水平。陈小娟等认为巴戟天的多糖提取物能够增加幼鼠的胸腺重量,提高小鼠巨噬细胞吞噬能力,并可提高小鼠免疫特异玫瑰花结形成细胞(RFC)的形成。陈忠等通过对巴戟天水提取物的研究发现,巴戟天水提液对小鼠具有增强细胞免疫的功能,可增加小鼠的单核吞噬细胞系统的廓清率,并增强巨噬细胞吞噬细胞的能力。冯昭明通过对巴戟天低聚糖的研究发现,其对小鼠胸腺T淋巴细胞增殖反应有明显的促进作用,表明巴戟天中低聚糖类成分有促进细胞免疫的作用。而陈小娟等巴戟天多糖能够提高小鼠巨噬细胞吞噬能力。
陈岚等通过完全Freund's佐剂诱导大鼠类风湿性关节炎和0.6%冰醋酸致小鼠疼痛扭体模型,分别以大鼠足踝关节周径、炎症介质PGE:含量,小鼠扭体次数为指标,观察巴戟天提取物对实验性类风湿性关节炎的作用。巴戟天提取物具有一定的抗类风湿性关节炎作用。在临床上可能通过抑制滑膜内衬巨噬细胞样细胞恶性增殖及TNF.d合成而对RA滑膜炎的发展进程具有一定程度的阻断作用。
徐超斗等通过LACA纯系小鼠的脾淋巴细胞进行体外增殖培养以及绵羊红细胞应激小鼠免疫作用,以溶血空斑试验。结果均为增强作用,认为巴戟天寡糖具有增强免疫系统作用。
上述药理试验证明,巴戟天除具有补肾壮阳、袪风湿等作用外,还具有抗抑郁、提高细胞免疫功能、防治冠心病、降低胆固醇、抗癌、补肾健脑和抗炎镇痛等多种生理作用。因此,巴戟天这种传统的中药具有比较广泛的应用前景和开发利用价值。但对巴戟天的化学成分以及药理作用方面的研究还不够透彻和全面,很多工作仍有待进一步深入研究,以便为巴戟天的临床应用及开发提供理论依据。
MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。在细胞学实验中,MTT法常用于细胞毒性、细胞活性和细胞增殖的检测。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。李红艳等在不同细胞增殖检测方法对比研究中指出,检测细胞存活与增殖的方法很多,主要包括观察DNA合成含量和直接检测细胞代谢活性两种,而前者由于掺入同位素操作复杂并存在放射性污染等缺点,难以得到广泛的应用。而自1983年Mosmann建立MTT法以来,由于其简单、经济、快速、无放射性污染等特点,已成为细胞生物学及相关领域一种分析细胞活性、生长增殖的常用方法。本研究测定巴戟天寡糖对J774巨噬细胞增殖的影响,拟采用MTT法。
寡糖,通常指的是2-9个单糖通过糖苷键连接起来而形成直链或支链的一类糖。研究表明,在小鼠体内实验中,巴戟天寡糖能促进小鼠脾细胞增殖加速。而巨噬细胞,在机体免疫反应的各个环节,都起到关键的调节作用。本研究以与免疫系统密切相关的J774巨噬细胞为载体,观察巴戟天寡糖对J774巨噬细胞增殖的影响,探讨其免疫调节作用。
由于寡糖单体并未有明显活性的报道,且分离过程会增加工业化生产的成本,所以以巴戟天的寡糖部位入药较为合理。广州中医药大学对巴戟天总寡糖的纯化作了研究,但是制备过程较为复杂,至少需要7个具体步骤,且得率不高。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种巴戟天寡糖,具有调节机体免疫功能作用。
本发明提供了上述巴戟天寡糖的制备方法,该方法操作简单,寡糖收率高,纯度高,适合产业化生产。
本发明还提供了该寡糖在制备治疗调节机体免疫的药物中的应用。
本发明通过以下技术方案实现:
一种巴戟天寡糖,所述的寡糖含量50-99%(优选巴戟天寡糖含量为80-99%),所含寡糖成分的高效液相指纹图谱中含有单峰面积占总峰面积的百分比超过3%的共有峰为8个峰,以峰3为参照峰,其它峰相对保留时间和相对峰面积为表1、附图3-I。
表1 共有峰的相对保留时间就相对峰面积
优选为表2
表2 共有峰的相对保留时间就相对峰面积
上述巴戟天寡糖的液相指纹图谱是通过下述高效液相色谱条件测定得到:蒸发光检测器、蒸发室温度50-90℃、雾化器温度50-90℃、氮气流速1.0-1.8SLM。
色谱柱:两性离子键合硅胶为填充剂,50×2.1mm,5-10μm,
流动相:酸水‐乙腈,梯度洗脱。
流速:0.1‐0.5mL/min。
上述流动相优选0.1-0.5酸水-乙腈溶液,所述的酸优选甲酸或乙酸,进一步优选0.2%甲酸水-乙腈溶液。
优选色谱条件
高效液相色谱仪:蒸发光检测器、蒸发器温度70℃、雾化器温度50℃、氮气流速1.2SLM;
色谱柱:两性离子键合硅胶为填充剂,50×2.1mm,5μm,
流动相:0.2%甲酸(A)-乙腈溶液(B),按照表3梯度洗脱;
流速:0.3mL/min。
表3 流动相梯度表
本发明所述巴戟天寡糖,还包括寡糖成分的准分子离子峰质荷比[M-H]-分别为341、503、665、827、989、1151、1313、1475;所述质荷比[M-H]-为665的碎片离子质荷比为711[M+COOH]-、所述质荷比[M-H]-为827的碎片离子质荷比为873[M+COOH]-、所述质荷比[M-H]-为989的碎片离子质荷比为1035[M+COOH]-,所述质荷比[M-H]-为1151的碎片离子质荷比为1197[M+COOH]-,所述质荷比[M-H]-为1313的碎片离子质荷比为1359[M+COOH]-。
上述质谱的准分子离子峰是通过下述质谱条件得到的:
具体为:所述的质谱条件:鞘气(sheath gas):50arb、辅助气(aux gas):15arb、尾气(sweep gas):0arb、离子源喷雾电压(ispray voltage):4kV、离子源毛细管温度(capillary temp):350℃、离子源毛细管电压(capillary voltage):‐35V、透镜电压(tubelens):‐110V。
本发明所述的巴戟天寡糖,包括成分巴戟天双聚糖、巴戟天三聚糖、巴戟天四聚糖、巴戟天五聚糖、巴戟天六聚糖、巴戟天七聚糖、巴戟天八聚糖、巴戟天九聚糖中一种或多种。
上述所述的巴戟天双聚糖的含量4-9%,巴戟天三聚糖的含量3-7%,巴戟天四聚糖含量4‐9%和巴戟天五聚糖含量4‐9%。
优选所述的巴戟天双聚糖的含量6-8%,巴戟天三聚糖的含量4-5%,巴戟天四聚糖含量5‐7%和巴戟天五聚糖含量5‐7%。
所述巴戟天寡糖成分双聚糖、三聚糖、四聚糖、五聚糖、六聚糖、七聚糖、八聚糖、九聚糖的分子量及分子式见表4和总离子流图2。
表4 寡糖成分表
所述的寡糖又称低聚糖,通常指的是2-9个单糖通过糖苷键连接起来而形成直链或支链的一类糖。
所述的双聚糖(简称双糖或二糖)是指:双糖是指单糖分子中的半缩醛的羟基和另一个单糖分子的羟基共失一分子水而生成的化合物。两分子单糖以糖苷键相互连接成双糖的结构多种多样。常见的双糖包括但不限于:蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、异麦芽糖、龙胆二糖、海藻糖和乳糖等。本发明所述的巴戟天二糖为蔗糖。
所述的三聚糖(简称三糖)是指:三分子单糖以糖苷键连接而组成的化合物之总称。天然存在的三糖,包括但不限于龙胆属(龙胆)根中的龙胆三糖,甘蔗的棉子糖(棉子糖命名为O-α-D-半乳糖吡喃基-(1→6)-α-D-葡糖吡喃基-β-D-果糖呋喃苷),松柏类分泌的松三糖、车前属(Plantago)种子中分离出的车前三糖(Planteose),有麦芽三糖等。本发明所述的巴戟天三糖为蔗果三糖。
所述的四聚糖(简称四糖)是指:四分子单糖以糖苷键连接而组成的寡糖。天然存在的四糖,包括但不限于麦芽四糖、蔗果四糖、纤维四糖、耐斯糖、水苏四糖等。本发明所述的巴戟天四糖为耐斯糖。
所述的五聚糖(简称五糖)是指:五分子单糖以糖苷键连接而组成的寡糖。天然存在的五糖,包括但不限于麦芽五糖、葡果五糖、壳五糖、木五糖、巴戟天菊淀粉型五糖、纤维五糖等。本发明所述的巴戟天五糖为巴戟天菊淀粉型五糖。
所述的六聚糖(简称六糖)是指:六分子单糖以糖苷键连接而组成的寡糖。天然存在的六糖包括但不限于木六糖、壳六糖、纤维六糖、菊淀粉型六聚糖、麦芽六糖等。本发明所述的巴戟天六糖为巴戟天菊淀粉型六糖。
所述的七聚糖(简称七糖)是指:七分子单糖以糖苷键连接而组成的寡糖。天然存在的七糖包括但不限于麦芽七糖、木七糖、壳七糖、纤维七糖、葡果七糖、菊淀粉型七糖等。本发明所述的巴戟天七糖为巴戟天菊淀粉型七糖。
所述的八聚糖(简称八糖)是指:八分子单糖以糖苷键连接而组成的寡糖。天然存在的八糖包括但不限于麦芽八糖、木八糖、壳八糖、纤维八糖、葡果八糖、菊淀粉型八糖等。本发明所述的巴戟天八糖为巴戟天菊淀粉型八糖。
所述的九聚糖(简称九糖)是指:九分子单糖以糖苷键连接而组成的寡糖。天然存在的九糖包括但不限于麦芽九糖、木九糖、壳九糖、纤维九糖、葡果九糖、菊淀粉型九糖等。本发明所述的巴戟天九糖为巴戟天菊淀粉型九糖。
本发明还提供了巴戟天寡糖的制备方法,该方法简单,易于操作,制得的寡糖含量高达到50‐99%,优选巴戟天寡糖含量为80-99%。
本发明所述的巴戟天寡糖是通过如下方法制备得到的:
(1)水提醇沉:取巴戟天的干燥根,加水煎煮提取,浓缩.加乙醇沉淀,放置过夜,取上清液:
(2)活性炭吸附:上清液回收乙醇至无醇味,加水稀释,加活性炭进行吸附,静置过夜,取滤液;
(3)大孔树脂除杂过滤:滤液上大孔树脂柱,水洗脱,浓缩洗脱液,得浸膏,冷冻干燥得到巴戟天寡糖白色粉末。
优选步骤(1),取巴戟天的干燥根,碎成粗粉,加4-10倍量水煎煮提取0.5-3小时,过滤浓缩至相对密度1.1-1.5g/mL(60℃)后,加70-100%乙醇沉淀至含醇量为50-80%,放置过夜,取上清液。
进一步优选步骤(1),取巴戟天的干燥根,碎成粗粉,加6-8倍量(最佳为7倍量)水煎煮提取1-2小时,(最佳为1.5小时,)过滤浓缩至相对密度1.2-1.3g/mL(最佳为1.2g/mL)(60℃)后.加85-95%乙醇沉淀至含醇量为60-80%(最佳为95%乙醇沉淀至含醇量为60-70%),放置过夜,取上清液。
上述步骤(1)中所述的过滤浓缩至相对密度1.1-1.5g/mL(优选1.2-1.3g/mL,最佳1.2g/mL)可以避免过多杂质的留在滤液中,减少了步骤(2)、(3)的工作量。醇沉浓度50-80%(优选60-80%,最佳60-70%),可以保证有效寡糖的提取更完全,过高的醇浓度能够导致寡糖随多糖及其大极性杂质一起沉淀而造成损失。
进一步优选步骤(2)上清液回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度1.2-1.6g/mL(60℃)加2-6倍量水稀释,加浸膏重0.1-1倍量的活性炭进行吸附,静置过夜,滤过。
优选步骤(2),上清液回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度1.4-1.6g/mL(60℃)(最佳1.4g/mL),加2-4倍量(最佳3倍量)水稀释,加浸膏重0.1-0.5倍量(最佳0.3倍量)的活性炭进行吸附,静置过夜,滤过。
步骤(2)的活性炭吸附能力及用量对除杂过程尤为关键,主要除去一些色素类物质。
进一步优选步骤(3),滤液上大孔树脂柱,2-8倍(最佳4-6倍)柱体积水洗脱,浓缩洗脱液,冷冻干燥得到巴戟天寡糖白色粉末。
本发明所述的大孔树脂柱型号包括但不限于AB-8柱、D101柱、D201柱、D301柱、HPD100柱、HPD300柱、HPD600柱、NKA-9柱、DA201型、D—型、SIP系列、X—5型、GDX104型、LD605型、LD601型、CAD—40型、DM—130型、R—A型、CHA—111型、WLD型(混合型)、H107型等。优选AB-8柱、D101柱,最优选为D101柱。本发明所述的树脂型号及水用量可以保证寡糖成分从大孔树脂柱上被洗脱下来,去除一些小极性物质。
本发明提供了还有巴戟天寡糖的制剂,其是由本发明还提供用本发明的巴戟天寡糖作为药物活性成分制备成的药物制剂,本发明的药物制剂,包括按重量百分比组合物为0.1-99.9%,其余为药学上可接受的载体。优选本发明的中药组合物浸膏粉与辅料的重量比为3:1-1:3,最佳为浸膏粉与其他辅料用量比为1:1。
本发明的药物制剂可以是任何可药用的剂型,按照常规方法制备,这些剂型包括:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂,优选的是口服剂型,如:胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等,更优选为胶囊剂、颗粒剂、片剂和口服液。
本发明所述的载体为药学上常用的载体选自甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠,一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的上述组成中均是按照重量份作为配比,在生产中可按照相应比例增大或减少,如大规模生产可以以公斤或吨为单位,小规模生产可以以mg为单位计。重量可以增加或减少,但各组成之间的生药材重量配比比例不能改变。
本发明的以上重量比例是经过科学筛选出的,对于特殊病人如重症或轻症可以相应增加或减少调整相应的比例,但是增减或减少不超过300%,功效不变。
为了更好的阐述本发明的有益效果,通过下述试验例来说明。
试验例一 寡糖测定方法苯酚-硫酸法测巴戟天寡糖含量
原理:植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡糖。苯酚-硫酸法测定可溶性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚反应,产生一种橙红色化合物,在一定范围内其颜色深浅与糖的含量成正比,且在485nm波长下有最大吸收峰,故可用可见光分光光度法在485nm下测定。
标准曲线的制定:
表5
试剂/管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 6 |
0.1047mg/mL(蔗糖) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
水/ml | 2 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 |
按上表5加样,然后顺序加入7%苯酚水溶液1mL,再加入5mL浓硫酸,室温下放置30min,然后以空白为参比在485nm处用可见光分光光度法测定。
样品溶液的制备:
精密称取实施例1制备得到的巴戟天寡糖0.01541g于100mL量瓶中,加蒸馏水溶解至刻度,摇匀,精密量取0.3mL巴戟天寡糖溶液,精密加入1.7mL水,然后顺序加入7%苯酚水溶液1mL,再加入5mL浓硫酸,室温下放置30min,制得样品溶液在485nm处用可见光分光光度法测定。
结果:巴戟天寡糖样品中寡糖含量为:(0.218/0.231)*100%=94.4%。
试验例二药效学试验
药物:实施例一制备
精密称取巴戟天寡糖固体1.00g,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基溶解,使成浓度为100mg/mL的药液。在超净工作台中过0.22um微孔滤膜以去除杂菌,存放于15mL离心管中备用。
1J774巨噬细胞的培养
1.1.1 J774巨噬细胞的复苏
根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号,从-80℃冰箱中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。迅速将冻存管放入37℃的恒温水浴锅中解冻,并不断摇动,使管内的固体迅速融化,在2min内完全融化完毕。外周经消毒后迅速转移进已含有适量10%胎牛血清的高糖DMEM培养基的中号细胞培养瓶中,轻轻水平摇动培养瓶使细胞均匀散开。放置于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中孵育24小时。
1.1.2J774巨噬细胞的传代
倒置细胞显微镜下观察细胞,当观察到细胞数量占整个视野40~50%时,需要传代培养。在超净工作台下,用巴氏吸管吸取培养瓶中原有的培养基轻轻吹打培养瓶有细胞的一面,把J774巨噬细胞吹打下来。注意力度以免损伤J774导致其激活分化。1000转/min低速离心5min,弃去上清,加入新的培养基轻轻吹打均匀细胞,重新接种于新的培养瓶中。传代比例为1:2。
1.1.3 J774巨噬细胞的日常培养
J774巨噬细胞经过37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中常规培养24h后需要换液一次,否则由于生存环境恶化,细胞会被激活,细胞形态发生变化,变现为伸出伪足,分泌物增多,以及增殖速度下降等等。超净工作台下,用巴氏吸管小心吸去原培养基,加入适量的PBS轻轻清洗培养瓶有细胞一面,清洗2次。最后加入适量新的培养基,放置于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中继续培养。
1.1.4 J774巨噬细胞的冻存
待细胞长至细胞培养瓶40~50%时,用巴氏吸管吸取培养瓶中原有的培养基轻轻吹打培养瓶有细胞的一面,把J774巨噬细胞吹打下来。1000转/min低速离心5min,弃去上清,根据细胞数量,用适量的含20%FBS培养基,10%DMSO的冻存液冻存细胞。分装于冻存管中,每管1.5mL。先置于4℃的冰箱放置30min,在转移到-20摄氏度的冰箱中放置2h,最后转移到-80℃超低温冰箱中保存。
1.2J774巨噬细胞的生长曲线
1.2.1 细胞分组
取对数生长期细胞,于倒置细胞显微镜下血细胞计数板计数,调整细胞浓度为2×103个/mL、5×103个/mL、1×104个/mL、2×104个/mL、3×104个/mL、4×104个/mL、5×104个/mL、6×104个/mL、7×104个/mL,100μL/孔接种到96孔培养板中,并增加一组调零空白对比,每组6个复孔,并每孔加入100μL的高糖DMEM培养基使每孔培养基容量为200μL。放置于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养,培养时间分别为24h、48h、72h。除去第一块培养24h不需要作换液处理外,其余培养48h、72h的96孔板分别每24h换培养基一次。
1.2.2 MTT比色法检测J774巨噬细胞的生长曲线
待细胞培养到所需时间后,加入MTT(5mg/mL)溶液20μL/孔,继续放置于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养4h,小心弃去上清,每孔加入100μL DMSO,置于摇床上低速震荡10min使生成的甲臜结晶充分溶解,于OD570处测量每孔的吸光值。将每组6孔的OD值取平均值。绘制生长曲线,从中选择适合实验的细胞接种密度。
1.3 巴戟天寡糖活性浓度的筛选
1.3.1 梯级浓度设计
把巴戟天寡糖溶液由100mg/mL用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,梯级稀释至0.3906、0.7812、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100mg/mL浓度用于活性浓度筛选。
1.3.2 细胞分组
取对数生长期细胞,按照1.2.3.2检测出最适合实验的细胞接种密度(3X104个/mL,100μL/孔)接种于96孔板中,约6h后,待J774巨噬细胞完全贴壁,实验分组按空白对照组和巴戟天寡糖给药组(终浓度分别为0.1953、0.3906、0.7812、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50mg/mL),每组设置6个复孔。
1.3.3 MTT比色法检测巴戟天寡糖对J774巨噬细胞增殖的影响
待细胞贴壁后,吸弃上清,按上述分组给药,每孔终体积为200μL。37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中24h后,加入MTT(5mg/mL)溶液20μL/孔,继续培养4h,弃上清,每孔加入150μL DMSO,置摇床上低速震荡10min使结晶物充分溶解,于OD570处测量每孔吸光值。
1.4 MTT的制备
取一只Sigma 0.25g分装的噻唑蓝MTT,加入装有50mL的PBS的离心管中,超声处理约10min至完全溶解后,表面用70%乙醇棉球消毒后置于超净工作台中用0.22μm微孔滤膜滤过,分装于2.5mL PB管中,放4℃冰箱中避光保存。在配置以及保存过程中,容器采取铝箔包裹避光处理。
1.5 统计学处理
实验数据以(x±s)表示,应用SPSS 18.0软件对数据进行统计学处理,P<0.05为差异具有统计学意义。
2 数据分析与结果
2.1 J774巨噬细胞的生长曲线
通过MTT比色法测定,以2×102个/孔、5×102个/孔、1×103个/孔、2×103个/孔、3×103个/孔、4×103个/孔、5×103个/孔、6×103个/孔、7×103个/孔密度接种的J774巨噬细胞的72小时生长曲线图如图1所示。
表6、7、8为J774巨噬细胞MTT测量OD值。
表6 J774巨噬细胞24h生长曲线OD值
表7 J774巨噬细胞48h生长曲线OD值
表8 J774巨噬细胞72h生长曲线OD值
根据生长曲线图1,J774巨噬细胞以3×103个/孔的密度接种后快速进入指数增长期。而其中,2~5×103个/孔的密度在24~72h内呈明显的指数增长,为了保证实验结果的线性,MTT吸光度最好在0~0.7范围内。因此,综合考虑选择3×103个/孔密度进行种板较为合适。
2.2 巴戟天寡糖成分对J774巨噬细胞增殖的影响(MTT比色法)
含巴戟天寡糖0.1953、0.3906、0.7812、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50mg/mL的高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)作用于J774巨噬细胞,并设置无药对照组(K),在药物作用后的第24h和48h以酶标仪检测OD570值,并将巴戟天寡糖不同浓度组的OD值和空白对照组进行比较。
由表9-11分析可知,显示巴戟天寡糖对J774巨噬细胞有一定的增殖活性,在浓度0.1953mg/mL时,具显著性差异(P<0.05)。随浓度的增加,其效应也相应增强。3.125mg/mL时达峰值,与无药对照组(K)比较,J774巨噬细胞的增殖活性最高增强1.18倍,由6.25mg/mL的效果开始有所降低,可能是药物浓度过大,物理损伤细胞导致。
表9 J774巨噬细胞给药24h,48h后的相对增殖率
*与对照相比,P<0.05 注:相对增殖率=(给药组OD/对照组OD)×100%
表10 J774巨噬细胞给药24h后OD均值
注:分组K为未给药空白对照,其余给药组浓度单位为mg/mL
表11 J774巨噬细胞给药48h后OD均值
注:分组K为未给药空白对照,其余给药组浓度单位为mg/mL
3 小结与讨论
巴戟天为传统补肾类常用中药,补益类中药一般具有较强的免疫提高功能,而大量实验和临床研究证实,许多具有补益功效的中药所含的糖类具有肯定的调节机体免疫功能作用,如促进免疫细胞增殖与分化,活化免疫细胞,分泌免疫调节因子等等。本课题尝试把巴戟天寡糖成分应用于J774巨噬细胞的增殖影响上,测定其是否能对J774巨噬细胞的增殖产生促进作用。
实验结果显示,巴戟天寡糖对J774巨噬细胞的增殖有一定的促进作用,但起效速度一般,符合巴戟天传统味辛,甘;性微温的特性。其增殖作用有药物上浓度的依赖性,在0.1953mg/mL~3.125mg/mL浓度下,对J774巨噬细胞的增殖促进作用逐步增强,而6.25mg/mL、12.5mg/mL虽然仍呈增殖促进作用,但效果不及3.125mg/mL时高,经分析是药物浓度过高,对细胞产生物理损伤导致。巴戟天寡糖成分对J774巨噬细胞增殖的促进机制尚不明确,有待进一步研究。
本发明权利范围及具体实施例均具有上述药理作用。
本发明制备方法与现有技术相比具有的优点如下:
(1)寡糖收率高于40%,且杂质少。
(2)步骤合理,操作工序少,降低生产成本和寡糖的损失。
(3)工艺过程不涉及有毒有害试剂,比较环保。
附图说明
图1 J774巨噬细胞株生长曲线图(MTT法)(n=6)。
图2为巴戟天寡糖的LC-MS/MS的总离子流图。
其中图2-A双糖[M-H]-341、图2-B三糖[M-H]-503、图2-C四糖[M-H]-m/z 665;[M+COOH]-m/z 711、图2-D-1图2-D-2五糖[M-H]-m/z 827;[M+COOH]-m/z 873、图2-E六糖[M-H]-m/z 989;[M+COOH]-m/z 1035、图2-F七糖[M-H]-m/z 1151;[M+COOH]-m/z 1197、图2-G八糖[M-H]-m/z 1313;[M+COOH]-m/z 1359、图2-H九糖[M-H]-m/z 1475
图3巴戟天寡糖指纹图谱;
其中图3-A,二糖对照品原液图谱、
图3-B,三糖对照品原液图谱、
图3-C,四糖对照品原液图谱、
图3-D,五糖对照品原液图谱、
图3-E,稀释3倍混合对照品图谱、
图3-F,稀释6倍混合对照品图谱、
图3-G,稀释15倍混合对照品图谱、
图3-H,稀释30倍混合对照品图谱、
图3-I,样品指纹图谱图谱。
具体实施方式
以下通过最佳实施示例,对本发明的工艺进一步加以详细说明。该实例仅用于说明本发明,而对本发明没有限制。
实施例1
巴戟天药材500g,碎成粗粉,加6倍量水提取三次,每次1h,合并提取液,浓缩至500mL,相对密度约为1.2g/mL。放冷,加95%乙醇至乙醇浓度为60%,放置过夜,过滤,回收乙醇,浓缩至250mL,相对密度约为1.4g/mL。加水稀释至1L,加入100g活性炭吸附过夜,过滤,滤液通过D101大孔树脂柱吸附,以水洗脱4个柱体积,合并洗脱液,浓缩后冷冻干燥,得巴戟天寡糖总提物217g,巴戟天寡糖205g,其中二糖14.94g、三糖9.14g、四糖13.00g、五糖12.98g。
实施例2:
巴戟天药材500g,碎成粗粉,加7倍量水提取三次,每次1.5h,合并提取液,浓缩至500mL,相对密度约为1.2g/mL。放冷,加95%乙醇至乙醇浓度为65%,放置过夜,过滤,回收乙醇,浓缩至250mL,相对密度约为1.4g/mL。加水稀释至1L,加入150g活性炭吸附过夜,过滤,滤液通过D101大孔树脂柱吸附,以水洗脱5个柱体积,合并洗脱液,浓缩后冷冻干燥,得巴戟天寡糖总提物209g,巴戟天寡糖207g,其中二糖18.63g、三糖14.49g、四糖18.62g、五糖18.57g。
实施例3
巴戟天药材500g,碎成粗粉,加8倍量水提取三次,每次2h,合并提取液,浓缩至500mL,相对密度约为1.2g/mL。放冷,加95%乙醇至乙醇浓度为70%,放置过夜,过滤,回收乙醇,浓缩至250mL,相对密度约为1.4g/mL。加水稀释至1L,加入200g活性炭吸附过夜,过滤,滤液通过D101大孔树脂柱吸附,以水洗脱6个柱体积,合并洗脱液,浓缩后冷冻干燥,得巴戟天寡糖总提物201g,巴戟天寡糖161g,其中二糖9.67g三糖8.05g四糖8.05g、五糖8.07g。
实施例4
巴戟天药材500g,碎成粗粉,加4倍量水提取三次,每次3h,合并提取液,浓缩至500mL,相对密度约为1.1g/mL。放冷,加乙醇至乙醇浓度为60%,放置过夜,过滤,回收乙醇,浓缩至250mL,相对密度约为1.1g/mL。加水稀释至1L,加入200g活性炭吸附过夜,过滤,滤液通过AB-8大孔树脂柱吸附,以水洗脱4个柱体积,合并洗脱液,浓缩后冷冻干燥,得巴戟天寡糖总提物190g,巴戟天寡糖95g。其中二糖3.8g、三糖2.85g、四糖3.82g、五糖3.86g。
实施例5
巴戟天药材500g,碎成粗粉,加10倍量水提取1次,每次0.5h,合并提取液,浓缩至500mL,相对密度约为1.6g/mL。放冷,加80%乙醇至乙醇浓度为50%,放置过夜,过滤,回收乙醇,浓缩至250mL,相对密度约为1.6g/mL。加水稀释至1L,加入200g活性炭吸附过夜,过滤,滤液通过D101大孔树脂柱吸附,以水洗脱2个柱体积,合并洗脱液,浓缩后冷冻干燥,得巴戟天寡糖总提物211g,巴戟天寡糖179g。其中二糖14.94g、三糖9.14g、四糖13.00g、五糖12.98g。
实施例6
巴戟天药材1500g,碎成粗粉,加8倍量水提取三次,每次2h,合并提取液,浓缩至500mL,相对密度约为1.4g/mL。放冷,加95%乙醇至乙醇浓度为70%,放置过夜,过滤,回收乙醇,浓缩至250mL,相对密度约为1.4g/mL。加水稀释至1L,加入500g活性炭吸附过夜,过滤,滤液通过AB-8大孔树脂柱吸附,以水洗脱8个柱体积,合并洗脱液,浓缩后冷冻干燥,得巴戟天寡糖总提物599g,巴戟天寡糖539g。其中二糖14.94g、三糖9.14g、四糖13.00g、五糖12.98g。
实施例7
巴戟天药材500g,碎成粗粉,加6倍量水提取1次,每次3h,合并提取液,浓缩至500mL,相对密度约为1.5g/mL。放冷,加95%乙醇至乙醇浓度为80%,放置过夜,过滤,回收乙醇,浓缩至250mL,相对密度约为1.4g/mL。加水稀释至1L,加入100g活性炭吸附过夜,过滤,滤液通过D101大孔树脂柱吸附,以水洗脱4个柱体积,合并洗脱液,浓缩后冷冻干燥,得巴戟天寡糖总提物250g,巴戟天寡糖235g。其中二糖18.80g、三糖11.75g、四糖16.46g、五糖16.45g。
实施例8巴戟天寡糖的指纹图谱
仪器与试药:
仪器:美国Agilent 1260系列液相色谱仪,美国Agilent 380‐ELSD蒸发光散射检测器
色谱柱:色谱柱:Merck,柱(150×2.1mm,5μm,)
巴戟天寡糖样品:按照实施例1制备
对照品:蔗糖对照品,批号:111507-201303。三糖对照品,批号:AWG0714;耐斯糖对照品,批号:AWG0714;五糖对照品,批号:AWG0714;均购自和光纯药工业株式会社。
试剂:色谱级乙腈(Merck,Germany),三重蒸馏水自制,其他分析纯试剂购自广州化学试剂厂。
色谱条件与系统适用性试验 以两性离子键合硅胶为填充剂;以0.2%甲酸为流动相A,乙腈为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;流速0.3mL/min;蒸发器温度:70℃,雾化器温度:50℃,氮气流速:1.2SLM。以四糖(耐斯糖)峰计算理论塔板数计算应该不低于20,000。
表12 流动相梯度表
对照品溶液的制备 精密称取二糖、三糖、四糖(耐斯糖)和五糖对照品适量,加水制成浓度为1mg/mL的对照品贮备液,再依次稀释3倍、6倍、15倍及30倍,得一系列混合对照品溶液,上述溶液用前通过0.45μm微孔滤膜,取续滤液即得。
表13 对照品配制
供试品溶液的制备 精密称取巴戟天寡糖约20mg和40mg,加水溶解,定容至10mL,摇匀,通过0.45μm微孔滤膜,取续滤液,即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪测定。
结果:
取10批巴戟天寡糖样品,按照上述测定方法测定,见图3-I中峰面积大于3%的共有色谱峰为8个,分别命名为峰1-8.其中峰1为二糖,峰2为三糖、峰3为四糖、峰4为五糖。
表14 对照品色谱峰面积及对照时间
表15 巴戟天寡糖样品指纹图谱
以峰3四糖峰为参照峰,其他峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积如下表16。
表16 相对保留时间及相对峰面积
表17 巴戟天寡糖每mg样品含待测成分的量
实施例9巴戟天寡糖的质谱分析
仪器与试药:
仪器:液质联用仪:美国Thermo Scientific Accela U‐HPLC液相仪,Thermo LTQORBIT TRAP质谱仪。
色谱条件:以两性离子键合硅胶为填充剂;以0.2%甲酸为流动相A,乙腈为流动相B,按表12中的规定进行梯度洗脱;流速0.3mL/min。
质谱条件:鞘气(sheath gas):50arb、辅助气(aux gas):15arb、尾气(sweepgas):0arb、离子源喷雾电压(ispray voltage):4kV、离子源毛细管温度(capillarytemp):350℃、离子源毛细管电压(capillary voltage):‐35V、透镜电压(tube lens):‐110V。
巴戟天寡糖样品:按照实施例1制备
供试品制备:取巴戟天寡糖约0.025g,精密称定,加50%甲醇水溶液使溶解,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
检测方法精密吸取供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪测定。总离子流图扫描范围为50‐2000Da。
结果如表4
表4 寡糖成分表
Claims (8)
1.一种用于免疫调节的巴戟天寡糖,其特征在于,所述的寡糖含量50-99%,所含寡糖成分的高效液相指纹图谱中含有单峰面积占总峰面积的百分比超过3%的共有峰为8个峰,以峰3为参照峰,其它峰相对保留时间和相对峰面积:
所述巴戟天寡糖通过下述方法制备得到:
(1)水提醇沉:取巴戟天的干燥根,加4-10倍量水煎煮0.5-3小时,过滤浓缩至60℃相对密度1.1-1.5g/mL后,加70-100%乙醇沉淀至含醇量为50-80%,放置过夜,取上清液:
(2)活性炭吸附:上清液回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度1.2-1.6g/mL,用2-6倍量水稀释,用浸膏重0.1-1倍量的活性炭进行吸附,静置过夜,滤过取滤液;
(3)大孔树脂除杂过滤:滤液上AB-8或D101大孔树脂柱,2-8倍柱体积水洗脱,浓缩洗脱液,得浸膏,冷冻干燥得到巴戟天寡糖白色粉末。
2.如权利要求1所述的用于免疫调节的巴戟天寡糖,其特征在于,所述的高效液相色谱仪条件为:蒸发光散射检测器:蒸发室温度50-90℃、雾化器温度50-90℃、氮气流速1.0-1.8SLM;
色谱柱:两性离子键合硅胶为填充剂;
流动相:酸水-乙腈,梯度洗脱;
流速:0.1-0.4mL/min。
3.如权利要求1所述的用于免疫调节的巴戟天寡糖,其特征在于,所述寡糖成分的准分子离子峰质荷比[M-H]-分别为341、503、665、827、989、1151、1313、1475;所述质荷比[M-H]-为665的碎片离子的质荷比为711[M+COOH]-、
所述质荷比[M-H]-为827的碎片离子的质荷比为873[M+COOH]-、
所述质荷比[M-H]-为989的碎片离子的质荷比为1035[M+COOH]-、
所述质荷比[M-H]-为1151的碎片离子的质荷比为1197[M+COOH]-、
所述质荷比[M-H]-为1313的碎片离子的质荷比为1359[M+COOH]-。
4.如权利要求3所述的用于免疫调节的巴戟天寡糖,其特征在于:所述的寡糖成分的准分子离子峰是通过下述质谱仪测定出来的,质谱条件包括鞘气sheath gas:50arb、辅助气aux gas:15arb、尾气sweep gas:0arb、离子源喷雾电压ispray voltage:4kV、离子源毛细管温度capillary temp:350℃、离子源毛细管电压capillary voltage:-35V、透镜电压tube lens:-110V。
5.权利要求1所述的用于免疫调节的巴戟天寡糖,其特征在于,所述寡糖包括成分巴戟天双聚糖、巴戟天三聚糖、巴戟天四聚糖、巴戟天五聚糖、巴戟天六聚糖、巴戟天七聚糖、巴戟天八聚糖、巴戟天九聚糖中一种或多种。
6.如权利要求5所述的用于免疫调节的巴戟天寡糖,所述的巴戟天双聚糖的含量4-9%,巴戟天三聚糖的含量3-7%,巴戟天四聚糖含量4-9%和巴戟天五聚糖含量4-9%。
7.如权利要求1所述的用于免疫调节的巴戟天寡糖,其特征在于,是通过下述方法制备得到的:
步骤(1),取巴戟天的干燥根,碎成粗粉,加6-8倍量水煎煮1-2小时,过滤浓缩至相对密度1.2-1.3g/mL后.加85-95%乙醇沉淀至含醇量为60-80%,放置过夜,取上清液;
步骤(2)上清液回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度1.4-1.6g/mL,加2-4倍量水稀释,用浸膏重0.1-0.5倍量的活性炭进行吸附,静置过夜,滤过;
步骤(3)滤液上D101大孔树脂柱,4-6倍柱体积水洗脱,浓缩洗脱液,冷冻干燥得到巴戟天寡糖白色粉末。
8.如权利要求1所述的巴戟天寡糖在制备治疗免疫调节药物中的应用。
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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巴戟天有效成分及其药理作用实验研究进展;郑素玉,陈健;《世界中西医结合杂志》;20121231;第7卷(第9期);823-825,828 |
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