CN103142578B - 一种丹酚酸a冻干粉针及其制备药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丹酚酸A冻干粉针用于制备预防和治疗缺血性心脏病药物的用途，所述丹酚酸A冻干粉针包括含丹酚酸A主份原料，填充剂和抗氧剂；其中所述冻干粉针的各成份按下列重量配比制成：含丹酚酸A主份原料10g～80g，填充剂10g～80g，抗氧剂为制成总量的0.01％～0.2％，其中所述填充剂为甘露醇、葡萄糖、乳糖中的任意一种或几种，所述抗氧剂选自维生素C、硫脲、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠中的任意一种或几种，其中所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量大于93％，小于100％，还包括4个其他成分：紫草酸0.1％～2％，迷迭香酸0.1％～2％，丹酚酸B0.1％～2％，丹酚酸C0.1％～2％。

Description

一种丹酚酸A冻干粉针及其制备药物用途

技术领域

本发明涉及一种丹酚酸A冻干粉针及其制备药物用途。

技术背景

缺血性心脏病(IHD)是由于冠状动脉循环改变引起冠状动脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害，最常见的原因是冠状动脉粥样硬化、冠状动脉血栓及冠状动脉痉挛，约占缺血性心脏病的90％左右。其共同点是由于心肌供血不足所致氧的供需矛盾而造成心肌缺血、缺氧，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作，从而发生一系列病理生理改变及症状，引起心绞痛发作，甚至发生心肌梗塞而危及生命。根据冠状动脉病变的部位、范围及病变严重程度、心肌缺血程度，临床分五类：无症状型心肌缺血、心绞痛型、心肌梗死型、缺血性心肌病型、猝死型。以心绞痛、心肌梗死、心源性猝死较为常见。而这些因冠脉病理改变引起的心脏病统称为冠状动脉性心脏病简称冠心病。因此一般情况下所说的缺血性心脏病主要指冠心病、心绞痛。心脏没有“氧仓库”，完全依赖心肌血供，所以一旦缺血，立刻会引起缺氧。氧是心肌细胞活动必不可少的物质，正常心肌细胞摄取血液氧含量达65～75％，其它组织仅摄取10～25％。心肌缺氧的直接后果是心肌细胞有氧代谢减弱，产能减小，使心脏活动时必需的能量供应不足，引起心绞痛、心律失常、心功能下降。同时，代谢的废物也不能被有效及时地清除，易产生不利影响。缺血、缺氧、缺能量，最终会影响心脏的收缩功能。若有20％～25％的心肌停止收缩，通常会出现左室功能衰竭；若有40％以上的心肌不能收缩，就会有重度心泵功能衰竭。如果这种情况突然发生，就会出现非常危险的心源性休克。急性心肌梗死就常与这种情况相关。心肌缺血还会损害舒张功能。收缩不良和舒张不良结合起来，可引起复杂的物质代谢紊乱和心肌电活动失常。

因此改善心脏血管功能，增加心肌的供血供氧、降低氧的消耗，改善心肌代谢，缓解心绞痛，减小心肌梗死面积是药物治疗的主要目的。目前治疗缺血性心脏病主要包括药物治疗和介入(PICA)或搭桥等手术治疗。心绞痛发作时一般用硝酸脂类药物，如舌下含化硝酸甘油，起效快，但是只能用于救急，缓解症状，不能从根本上治疗心肌缺血。缓解期用药包括硝酸酯类、他汀类、ACEI、β受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、溶栓药(尿激酶、链激酶等)及中药等。能量代谢障碍是心肌缺损伤的使动因素之一，近年来，通过优化调节心肌能量代谢发挥抗心绞痛的一类促代谢类药物亦颇受关注，有望成为新的一类治疗或辅助药物。而目前主要以冠脉血运重建术、尽快恢复血流灌注为原则的缺血性心脏病基础治疗方法，亦存在不可忽视的风险：动物实验和临床研究发现，随着血运的恢复，某些受损的心肌细胞功能及结构破坏反而加重，即发生心肌缺血再灌注损伤(myocardialischemiareperfusioninjury，MIRI)。再灌注损伤是在心肌缺血后，再灌注的早期，氧化应激反应导致心肌中产生大量氧自由基、超氧阴离子，连同细胞及线粒体内钙超载等因素加速心肌细胞凋亡及坏死，使得心肌梗死范围扩大、心功能迅速恶化。临床表现为在闭塞的冠状动脉再通及梗死区血液灌流重建后一段时间内，有的患者发生血压骤降、心功能不全、心律失常甚至猝死等一系列病情恶化的现象。临床实践中如心肌梗死溶栓再通后、冠脉搭桥、心脏移植、心脏骤停心脏复苏后、体外循环心脏手术后等均存在再灌注损伤问题。如何做到既保证尽早恢复缺血组织的血流，又减轻甚至解除再灌注损伤的发生便成为又一冠心病防治中的重要课题。

世界卫生组织在《全球疾病负担》报告中发出警告，心血管系统疾病已成为全球范围的主要死因。统计数据显示，全球每年近2000万人突发急性心血管病，致死亡数占全球死亡的30％以上，其中43％死于冠心病。在地域分布上，80％以上的心血管疾病死亡发生在低中等收入国家。据报道，美国每年约有45～50万人死于心脏性猝死，而其中以缺血性心脏病(冠心病)占猝死原因的80％以上。近几十年，冠心病发病率在我国逐年增高，目前在各类心脏病中居首位。2010年中国国家统计数据显示，中国超过40％的人死于心血管疾病。冠心病的有效防治已成为不容忽视的全球性公共健康问题，这类疾病防治药物的研制已连续被列为我国“十一五”、“十二五”创新药物重大专项研究的重点内容，且将成为今后很长一段时间重点研究的药物类别，有着重大的社会意义和经济价值。

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根及根茎，具有活血化瘀、凉血消痈及养血安神的功效。丹参作为中医传统活血化瘀的药物，因疗效确切，自70年代开始广泛用于临床各科，成为临床应用最多最广的药物之一。因具有改善微循环、扩张冠脉、抑制血栓形成、抑制血小板聚集、保护缺血心肌等药理作用，其制剂的近代临床实践主要应用于缺血性心、脑血管疾病。常用含丹参的治疗心肌缺血的中成药有：丹参片、复方丹参片、心可舒、冠脉宁等；囊括了扩张冠状动脉、增加冠脉流量、降低血黏度和血凝、抑制血小板聚集、保护缺血心肌和改善微循环等药理作用。适用于血瘀症的胸痹病人以及心绞痛急性发作等。

丹参的药效物质基础是其中的水溶性酚酸类化合物，包括丹酚酸A-G、迷迭香酸及其甲酯、丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸等，以抗氧化、抗凝和抗炎为特点、同时具有保护脉管内皮细胞、降脂、升高HDL、抗凝、激活纤溶、抑制纤维蛋白原合成、螯合钙铁离子等多种有益的药理作用；其中以丹酚酸A活性最强。丹酚酸A可以提高损伤后大鼠心肌H9c2细胞存活率，抑制细胞凋亡，并有很强的抗氧化作用，可明显减轻线粒体损伤。因此丹酚酸A可通过减轻心肌细胞凋亡、提高机体抗氧化能力和保护心肌线粒体等机制对缺血心肌有保护作用。丹酚酸A对心肌缺血再灌注损伤亦具有明显的保护作用，而且作用优于丹酚酸B(林治荣等.丹酚酸A与丹酚酸B抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的比较研究[D].时珍国医国药，2011，22(2)：412-424)。

但是，丹酚酸A的天然含量极低(约为丹参药材的0.01-0.06％)，使得原药材成本过高，分离纯化难度过大，严重制约着药物的开发和研究，成为其产业化的瓶颈。另外，现有技术中，也有实验证实丹酚酸B通过酯水解脱羧和苯并二氢呋喃环开环反应进行降解可转化成丹酚酸A，但上述现有技术的转化过程无法控制，转化副产物多，主产物丹酚酸A的产率较低。

尽管现有技术中也有一些专利文献提出试图克服现有技术中存在的缺陷，但都仅仅是单纯的尝试升温、改变pH值或提高转化前丹酚酸类化合物的浓度等等，没有任何一项专利或现有技术深入、全面地研究转化反应都包括哪些主要影响因素，更没有任何一项专利或现有技术提出这些因素如转化前丹酚酸类化合物的浓度、pH值、温度、时间等彼此之间如何协同作用共同对丹酚酸A产率产生影响。

在此基础上，更很少有其他发明人或现有技术提出尝试在转化中加入催化剂以使反应更加充分，目前现有技术中涉及到了采用催化剂进行转化的相关内容仅存于在2010年4月6日同一日提交的两份专利申请文件中，这两份专利申请文件分别是申请号为2010101436787，发明名称为“一种催化转化丹酚酸B制备丹酚酸A的方法”的专利申请以及申请号为2010101436876，发明名称为“一种初步纯化丹酚酸B转化原料的方法”的专利申请。在这两份专利申请的说明书中，虽然公开了催化转化丹酚酸B制备丹酚酸A的技术内容，但其催化剂为尿素，尿素与丹酚酸B的摩尔比为(0.4～0.6)∶1，要求消耗和加入尿素非常高，因此生产成本非常高。并且，在上述两份专利申请文件中，也同样并未关注pH值及其他相关因素协同对丹酚酸A产率产生的影响。再者，其转化原料为经联合色谱法初步纯化的丹参水提物，其中丹酚酸B≥50％，这对转化原料的纯度及提纯工艺均要求较高，工艺也较为复杂，进一步增加了生产成本。更为关键的是，尽管其申请文件中声称“使用本方法制备的丹酚酸A丹酚酸B定向转化率≥10％，甚至达60％”。但由于尿素实际上并没有开环、脱水、脱羧作用，仅有成酯作用，因此，其转化率根本达不到60％，并且该申请文件的具体实施例中的转化率最高仅为53％，而且多个实施例的转化率仅为10％、20％和30％。这与实际产业化的要求仍有很大差距。

丹酚酸A是由丹参素和咖啡酸缩合而成，含有多个酚羟基、羟基、酯键等活泼基团，其对光和热不稳定，暴露空气易氧，由于丹酚酸A的上述理化特性，制成丹酚酸A制剂，其稳定性并保证丹酚酸A药理作用成为制剂的关键技术。

发明内容

为克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种丹酚酸A冻干粉针用于预防和或治疗缺血性心脏病方面的用途。

本发明提供一种丹酚酸A冻干粉针用于制备预防和治疗缺血性心脏病药物的用途，所述丹酚酸A冻干粉针包括含丹酚酸A主份原料，填充剂和抗氧剂；其中所述冻干粉针的各成份按下列重量配比制成：含丹酚酸A主份原料10g～80g，填充剂10g～80g，抗氧剂为制成总量的0.01％～0.2％，其中所述填充剂为甘露醇、葡萄糖、乳糖中的任意一种或几种，所述抗氧剂选自维生素C、硫脲、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠中的任意一种或几种，其中所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量大于93％，小于100％，还包括4个其他成分：紫草酸0.1％～2％，迷迭香酸0.1％～2％，丹酚酸B0.1％～2％，丹酚酸C0.1％～2％，所述丹酚酸A冻干粉针采用下制备方法获得：

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约1mm～5mm颗粒，每次加3～15倍量、45～95℃水温浸提取，同时以10～50转/分速度搅拌，或加3～15倍量水煎煮提取，共提取1～3次，每次提取1～4小时；提取液减压浓缩至相对密度1.0～1.25(60℃)，加入乙醇使含醇量在50％～85％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；或者

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径约1mm～5颗粒，每次加3～15倍量30％～60％乙醇回流提取，每次提取1～4小时，共提取1～3次；减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；

上述丹参提取液加水稀释至每1ml含丹酚酸B1～30mg，水溶液用碱调pH至3.565，加入与丹酚酸B摩尔百分比0.1～3％氯化锌作为催化剂，在100～140℃温度加热转化1～6小时；

转化液调pH值至2.5～4.5，静置、离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A1～10mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶35～1∶70，树脂柱径高比为1∶4～1∶30，分别用1～8倍柱体积水、1～10倍柱体积10％～40％乙醇洗脱，除去杂质，再用2～10倍柱体积20％～60％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的20％～60％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；

水溶液浓缩至每1ml含1-10mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶5～1∶25，树脂柱径高比为1∶4～1∶25，分别用1～10倍柱体积水、5～20倍柱体积20％～60％乙醇溶液洗脱除杂，再用4～15倍柱体积40％～90％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的40％～90％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；

水溶液浓缩，调酸pH至2.0～4.0，用水溶液1-8倍量的叔丁基甲基醚，分2～6次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A1g～10g的萃取液，加入1～3倍量硅胶，搅拌，挥干；

把搅拌样硅胶加到已装好的5～20倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶4～1∶25，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱6～30倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱6～30倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加5～20倍量水溶解，微波真空干燥，得所述含丹酚酸A主份原料，

取含丹酚酸A主份原料10g～80g加注射用水1500～2800ml搅拌使溶解，用碱调pH值4.0～5.0，再加入所述填充剂使其溶解，再加入所述抗氧剂，搅拌使溶解混匀，再加入活性炭0.5～2g搅拌吸附，滤过除去活性炭，加注射用水灌装成瓶，送入冻干机再进行冷冻干燥，

其中所述冷冻干燥包括如下步骤：

A、冷冻：以20℃～30℃/h速度降温至-40℃～-45℃，保温冷冻10～16小时；

B、升华：抽真空至0.3mbar以下，在10～14小时内将冻结的丹酚酸A丹酚酸A制剂温度上升到-23℃～-27℃，维持-23℃～-27℃真空干燥6～8小时；

C、干燥：继续升温，以0.5℃～1.0℃/min均匀升温至40℃～45℃，维持40℃～45℃干燥2～5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

优选的，其中所述冻干粉针的各成份按下列重量配比制成：含丹酚酸A主份原料20g～60g，填充剂20g～60g，抗氧剂为制成总量的0.02％～0.1％，其中所述含丹酚酸A主份原料中：丹酚酸A94％～97％，紫草酸0.2％～1.5％，迷迭香酸0.2％～1.5％，丹酚酸B0.2％～1.5％，丹酚酸C0.4％～2.0％。

优选的，其中所述填充剂用量为20mg～40mg/2ml～3ml。

优选的，微波真空干燥温度：20-100℃，回差温度1-5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟。

优选的，微波真空干燥温度：50-85℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟。

优选的，微波真空干燥温度：55-80℃，回差温度2-3℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率25-60KW，干燥120-140分钟。

优选的，其中所述的用于预防和治疗缺血性心病的药物可用于治疗以下病症的一种或几种：冠心病、心绞痛、缺血性心肌病、心肌梗死、心肌缺血性卒中、争性冠状动脉综合症、冠状动脉狭窄、心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化。

优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善缺血心脏血流动力学的用途。

优选的，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善缺血性心脏心功能的用途。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于增加缺血性心脏的冠脉血流量的用途。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于减少缺血性心脏心肌梗死范围的用途。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于缩小心肌缺血范围的用途。

优选的，其中的述的丹酚酸A冻十粉针用于减轻心肌缺血程度的用途。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于保护心肌细胞膜结构调节心肌酶活性的用途。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于抑制缺血心肌组织炎症反应的用途。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于保护心肌线粒体损伤的用途。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于改善心肌代谢的用途。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于改善心肌代谢的用途包括用于改善以下心肌代谢的一种或几种：心肌氧自由基代谢、脂肪酸代谢、能量代谢。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于降低心肌耗氧量的用途。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于改善血液流变学的用途。

优选的，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于抑制血栓形成的用途。

本发明提供的丹酚酸A冻干粉针主药是丹酚酸A主份原料，通过对丹参的提取、转化、纯化、干燥工艺，得到了以丹酚酸A为主的主份原料：经过系统的筛选和优化，首先比较确定了起始原料丹酚酸B的提取溶剂和提取方法，由于丹酚酸B水溶性较好，确定了采用水提取或低浓度醇提取，又由于丹酚酸B热稳定性较差，确定了采用热水温浸提取并加搅拌提取方法，或用低浓度乙醇回流提取，使提取溶度低于100℃，保持丹酚酸B不被破坏，通过正交实验确定了最佳溶剂用量和提取时间，得到了适应工业化生产的丹酚酸B最佳提取工艺的。

本发明与现有技术对比表明：起始原料用丹参药材直接提取即可进行投料转化，不需对丹酚酸B进行纯化后再进行转化，即本发明催化转化反应中，反应原料丹酚酸B不需要高纯度，例如不需要丹酚酸B的纯度≥50％。一般认为反应原料越纯越好，然而，本发明的催化转化反应中，丹酚酸B纯度高低对转化反应效果没有影响。相反，丹酚酸B纯度＞50％时不但产生大量杂质，且没有提高转化率，因此，本发明取得了预料不到的技术效果。

再者，本发明通过反复实验比较，首先确定了对丹酚酸A主份原料产率产生重要影响的因素如转化前丹酚酸类化合物的浓度、pH值、温度、时间等。在此基础上，又通过付出大量的时间、物质和精力反复实验对温度、pH值、时间、丹酚酸B的浓度及其他相关条件进行了研究，以及这些因素彼此之间如何协同作用共同对丹酚酸A主份原料产率产生影响，从而确定了丹酚酸B转化丹酚酸A的需要控制的最佳温度、pH值、时间等，并将丹酚酸B起始浓度控制在1mg/ml～30mg/ml，从而使得本发明丹酚酸A转化率更加明显优于其他转化条件。化学反应中，反应物的纯度与浓度常常影响反应的效果。一般情况下对反应物有浓度要求，且认为浓度高比浓度低好。本发明的催化转化反应中，丹酚酸B的浓度高低对转化反应效果没有影响。相反，可能是由于高温转化的原因，丹酚酸B纯度高不但产生大量杂质，且没有提高转化率。而且含丹酚酸B水溶液中丹酚酸B的浓度并非越高越好，30mg/ml以上浓度转化率反而低，效果更差。因此，本发明在节约成本和生产周期方面，取得了预料不到的技术效果，具有创造性。在现有技术没有给出任何技术启示的情况下，本领域技术人员如果仅从理论上推断，是不可能得出在上述各条件参数下将丹酸B转化成丹酚酸A主份原料具有更好的转化效果的结论。

更为重要的是，本发明通过创造性的劳动，发现氯化锌作为催化剂能显著提高丹酚酸B转化丹酚酸A主份原料的转化率，转化率非常稳定的能达到接近60％，多数情况都可以超过60％，这在以往任何一项现有技术中都是不可能的，因此，取得了预料不到的技术效果。

由于丹酚酸A含量较低，经转化后丹酚酸A含量大提高，但还含大量杂质，因此，分别选择了弱极性和非极性大孔吸附树脂进行粗分离，再选择聚酰胺、溶剂萃取、硅胶分离，并对不同流份进行测定，去除杂质部分后，将丹酚酸A含量从10％左右提高到80％，至90％，至93％，至96％。

进一步，在显著提高转化率的同时，本发明通过适于实际产业应用的纯化步骤，尤其是通过一系列的分离、洗脱处理等步骤后，没有采用传统的常压干燥，并从真空干燥、喷雾干燥、微波真空干燥方法中优选了微波真空干燥，从而彻底克服了以往干燥温度过高，干燥时间过长及对丹酚酸A的破坏大的缺陷；而冷冻干燥时间过长，成本极高且冷冻干燥所得的提取物无法完全去除溶剂残留问题。

另外，本发明还可以将低浓度与高浓度的丹酚酸B混合，只需配成合适的起始转化浓度即可，同样可以达到转化成丹酚酸A主份原料的的目的。因此，这种转化原料的制备工艺非常简单，生产成本降低的同时也非常适于实际产业中的应用。

丹酚酸A主份原料除含主要成分丹酚酸A之外，还含少量丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸C；丹酚酸A通过清除自由基，减轻膜脂质过氧化引起的流动性和通透性变化，阻止离子的异常通透和酶的漏出，从而降低了由于心肌缺血再灌注而引起的损伤，对心肌缺血有保护作用。丹酚酸A主份原料可剂量依赖性地抑制腺苷二磷酸(ADP)、凝血酶、花生四烯酸、胶原或U46619诱导的血小板聚集，降低血小板中cAMP水平，以及减少ADP引起的血小板P选择素的表达和纤维蛋白原结合，从而阻止ADP引起的血小板白细胞聚集，对动脉粥样硬化及栓塞形成有防治作用；

丹酚酸A主份原料中的丹酚酸B是丹参及其制剂丹参注射液、香丹注射液的主要有效成分，与丹酚酸A主份原料一样对心肌缺血有保护作用，对动脉粥样硬化及栓塞形成有防治作用；丹酚酸B可以有效减少实验性心肌梗死大鼠的梗死灶范围，增加梗死灶内成纤维细胞和毛细血管数；可以降低急性心肌缺血模型大鼠的左室舒张末期压，升高左室内压最大上升及下降速率，大剂量应用对左室收缩和舒张功能均有显著提高作用；对家兔心肌缺氧一复氧损伤模型，丹酚酸B具有负性频率、增加冠脉流量和降低冠脉流出液中肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平的作用，可减轻心肌细胞损伤。丹酚酸B可剂量依赖性地减少H₂O₂所致内皮细胞LDH外漏和MDA生成，并提高NO释放，还能有效抑制H₂O₂存在下CD54表达和增加中性粒细胞黏附率，表明丹酚酸B具有减轻H₂O₂所致内皮细胞的氧化性损伤，降低血管内皮细胞表面细胞黏附分子表达和抑制中性粒细胞黏附的作用，并认为这是丹酚酸B抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机制；紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸C作用与丹酚酸A类同，均有较强的抗氧化作用，能清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，其作用强度高于维生素C、维生素E，是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一。迷迭香酸还有助于防止自由基造成的细胞受损，因此降低了癌症和动脉硬化的风险。

丹酚酸A主份原料中的紫草酸还有抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，预防动脉粥样硬化、血管狭窄和血管内膜增生，具有扩血管作用。能抑制尿酸和过超氧阴离子自由基的形成、抑制过氧化物的产生，有消炎和降尿酸的作用。体外能抑制促黄体激素释放的作用。

丹酚酸A主份原料中的丹酚酸C还通过抑制微管蛋白聚合诱导细胞有丝分裂阻滞从而诱导凋亡，具有抗肿瘤细胞增殖活性。

丹酚酸A主份原料中的丹酚酸A、丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸C组合后具有共同的心肌缺血保护作用，降低了由于心肌缺血再灌注而引起的损伤。对动脉粥样硬化及栓塞形成的有防治作用，使其比丹酚酸A单体化合物单独使用作用更强，同时还有消炎和降尿酸的作用、降低了癌症和动脉硬化的风险。

本发明提供的丹酚酸A冻干粉针，是在上述制备丹酚酸A主份原料工艺基础上，根据丹酚酸A的化学与物理特性，从影响药物稳定的附加剂，剂型、容器、外界如空气、光线、水分，杂质等产生化学反应反而导致药剂的分解进行创造性的实验分析。通过筛选制剂处方，反复试验，选择了甘露醇、葡萄糖、乳糖等，制成冻干粉针，粉针成型良好，块状物疏松，孔隙、色泽均匀，并且稳定性非常高，通过加入少量抗氧剂，解决了由于空气、光线、水分，杂质等产生化学反应导致的药物分解。将丹酚酸A制成合适的制剂，解决了丹酚酸A制成注射剂稳定性问题，通过选择合适的辅料与剂型，保证了丹酚酸A药理作用，为临床提供安全、有效的丹酚酸A注射制剂。

我们根据丹酚酸A的理化特性，通过选择合适的剂型，筛选了不同的辅料，优选了不同的制备工艺及工艺参数，制备出了稳定、安全、有效、质量可控的丹酚酸A冻干粉针。

本发明与现有技术对比表明：本发明通过创造性的劳动，最终确定了冻干速度降温速度及冷冻时间，升华时升温速度与温度，确定真空升华时间，明确了干燥升温速度和温度，及干燥时间；创造性的明确定了冷冻降温速度与温度、升华升温速度与温度干燥升温速度与温度及时间之间的复杂关系，以及适宜的数值范围的确定等，从而才最终获得了稳定的冻干粉针剂。

重要的是，采用本发明制备方法制成的丹酚酸A冻干粉针完全可以不改变丹酚酸A原有的化学属性；制成的丹酚酸A冻干粉针与丹酚酸A相比具有水溶性好、热稳定性高、复溶性好等特点。

更为重要的是，本发明中的原料药丹酚酸A通过碱液将pH值调整到适合范围，再通过加入甘露醇等，使其更易于冷冻干燥，并且不影响药性，而且制成冻干粉针后主药丹酚酸A的含量有所提高，而丹酚酸B的含量有所降低，不会使制剂作用降低，反而会使制剂作用加强，起到了意想不到的效果。

另一方面，本发明还提供了其用于预防和或治疗缺血性心脏病药物的用途，并且通过大量实验证明：

经过实验数据对比可知，模型组缺血再灌注60min，CBF、+dp/dt_max、-dp/dt_max明显下降，LVEDP显著增高。与模型组比较，阳性药物组、丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组、丹酚酸A单体化合物组上述指标均有明显改善，能抑制缺血再灌注引起的冠脉流量减少、左室舒张压上升、左室内压最大上升速率下降、左室内压最大下降速率下降。且丹酚酸A冻干粉针组高剂量组与阳性药物组效果相当，效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物组。实验结果显示丹酚酸A冻干粉针能减轻大鼠离体心脏缺血再灌注损伤程度，提示丹酚酸A冻干粉针能明显改善冠脉血流量、改善离体心脏主动脉舒张功能和受损心肌的舒缩功能、保护心脏缺血再灌注损伤。

经对心肌缺血大鼠心电及心功能影响的实验数据对比可知，结扎冠状动脉致大鼠长期心肌缺血模型大鼠心电图ST段显著提高，其HR、动脉压、LVSP、+dp/dt_max、-dp/dt_max均显著下降，模型组大鼠心肌收缩功能明显降低，静脉给药7d后，各药物组大鼠ST段明显下降；各项指标综合显示，各药物组中以丹酚酸A冻干粉针中、高剂量对长期心肌缺血大鼠的心电及心功能指标改善效果最为明显，提示丹酚酸A冻干粉针能降低心肌缺血大鼠ST段的升高、改善心率、增高其动脉压、改善心肌舒缩力，且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物，对心肌缺血大鼠的心电及心脏功能有明显的改善作用。

经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针能使心肌缺血大鼠血清中SOD活性增高，抑制MDA的生成，降低血清内AST、CK和LDH活性，说明丹酚酸A冻干粉针能抑制氧自由基产生，提高心肌组织的抗氧化能力，保护心肌细胞膜，减少酶的溢出，改善心肌的能量供应，降低缺血对心肌的损伤程度，从而起到心肌缺血保护作用。

经过实验数据对比可知，心肌缺血模型组大鼠出现明显的心肌缺血梗死，梗死范围达53％左右；与模型组相比，不同剂量丹酚酸A冻干粉针注射给药7d后，大鼠的心肌梗死范围显著降低，并呈现一定的量效关系。同剂量丹酚酸A冻干粉针较丹酚酸A单体化合物组大鼠心肌梗死范围更小。提示丹酚酸A冻干粉针能缩小心肌梗死范围，减轻心肌缺血损伤及心梗程度，对心肌缺血具有明显治疗作用。

光镜和电镜结果提示，丹酚酸A冻干粉针能明显改善心肌缺血大鼠的心肌病理改变，减轻心肌病理损伤，可用于缺血性心脏病的治疗。且作用效果比同剂量的丹酚酸A单体化合物更明显。

观察大鼠心肌缺血-再灌不同时间心肌梗死范围，模型组大鼠心肌缺血1.5h，再灌注6h后心肌梗死严重，且在恢复灌注48h内，梗死范围逐步增大，心肌损伤加剧。经过实验数据对比可知，与模型组比较，不同剂量丹酚酸A冻干粉针能明显缩小心肌梗死范围，减轻心肌缺血再灌损伤，且心肌梗死范围并不随缺血再灌时间延长而扩大；各剂量组之间存在一定剂效关系，且优于同剂量丹酚酸A单体化合物。提示丹酚酸A冻干粉针能缩小实验性心肌缺血再灌注大鼠的心肌梗死范围，减轻心肌损伤程度，对心肌缺血-再灌注损伤具有较好的防治作用。

经过实验数据对比可知，大鼠在心肌缺血-再灌注24h，心肌组织SOD、GSH-Px、CAT酶活显著下降，MDA、XOD酶活显著升高，提示大鼠心肌缺血-再灌注后，过氧化产物堆积严重，心肌清除过氧化产物能力显著下降，缺血再灌引起大量氧自由基产生导致心肌损伤加重。药物组与模型组比较，心肌组织SOD、GSH-Px、CAT酶活不同程度升高，MDA、XOD酶活不同程度降低，丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组效果最明显。提示丹酚酸A能增强心肌清除自由基能力，抑制氧自由基产生，增强大鼠心肌抗氧化能力，抑制心肌缺血-再灌注损伤。

经过实验数据对比可知，结扎犬冠状动脉后60min到结扎后180min期间(即给药后45min到药后165min期间)，各药物组犬心外膜电图ST段抬高总数(∑-ST)持续下降，与模型组比较均有显著性差异；恢复再灌注后，各药物组∑-ST与模型组比较亦显著降低。丹酚酸A冻干粉针各剂量组之间存在一定量效关系，丹酚酸A冻干粉针中剂量组∑-ST下降幅度与0.5mg/kg注射用盐酸地尔硫卓组相当，丹酚酸A冻干粉针比同剂量丹酚酸A单体化合物组的∑-ST下降更明显。提示丹酚酸A冻干粉针能减轻实验缺血-再灌注犬的心肌缺血程度，且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物。提示其能保护心肌缺血损伤，对缺血性心脏病具有良好的治疗作用。

经过实验数据对比可知，结扎犬冠状动脉后60min到结扎后180min期间(即给药后45min到药后165min期间)，各药物组犬心外膜电图N-ST仍持续降低，且与模型组比较均有显著性差异；恢复再灌注后，各药物组N-ST与模型组比较亦显著降低。丹酚酸A冻干粉针各剂量组之间存在一定量效关系，丹酚酸A冻干粉针中剂量组N-ST减少率与0.5mg/kg注射用盐酸地尔硫卓组相当，丹酚酸A冻干粉针比同剂量丹酚酸A单体化合物组的N-ST减少明显。提示丹酚酸A冻干粉针能减少实验缺血-再灌注犬的心肌缺血范围，且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物。提示其能保护心肌缺血损伤，对缺血性心脏病具有良好的治疗作用。

经过实验数据对比可知，模型组犬心肌缺血-再灌注后，心肌梗死较重。丹酚酸A冻干粉针、注射用盐酸地尔硫卓、丹酚酸A单体化合物均能显著减少实验犬心肌梗死范围，且以丹酚酸A冻干粉针高剂量组犬心肌梗死比值最小，丹酚酸A冻干粉针中剂量组心肌梗死范围小于同剂量丹酚酸A单体化合物组。与模型组比较，丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组能极显著减少梗死心肌占心脏及心室的比重，丹酚酸A冻干粉针低剂量犬心肌梗死区占心脏及心室的比重亦明显降低，提示丹酚酸A冻干粉针能剂量依赖性地缩小实验犬心肌梗死范围，能保护心肌缺血-再灌注损伤，用于治疗缺血性心脏病。且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物。

经过实验数据对比可知，结扎犬冠状动脉形成心肌缺血，给药后45min至给药后225min(即结扎60min至240min)，各药物治疗组冠脉流量与给药前比较，增加了25.3％～52.6％之间；以丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组、注射用盐酸地尔硫卓组最为显著，增幅分别为52.6％、40.2％、36.7％。丹酚酸A冻干粉针中剂量组增幅高于同剂量丹酚酸A单体化合物组。提示丹酚酸A冻干粉针能促进侧枝循环开放，增加心肌缺血时的冠脉血流量，从而对抗心肌缺血，保护心肌缺血损伤，提示其在防治缺血性心脏病方面有一定的用途。

经过实验数据对比可知，丹酚酸A冻干粉针给药后15min(即缺血30min)能显著抑制LVEDP升高、抑制±dp/dt_max下降、抑制犬LVW减少、降低TPR，给药后45min(即缺血60min后)能显著抑制CO下降；呈剂量依赖性；有优于同剂量丹酚酸A单体化合物的趋势。提示丹酚酸A冻干粉针给药后，能改善心肌缺血犬血流动力学指标，增强实验犬的心肌收缩力、改善心肌舒缩功能，降低外周阻力，抑制心输出量减少、提高心脏的泵血功能，改善心肌血液供应，改善心肌缺血状态及心功能，发挥抗心肌缺血作用。

经过实验数据对比可知，心肌缺血模型组犬血清中CK、LDH、AST、CK-MB显著升高，说明结扎冠脉缺血后，犬心肌线粒体破坏，心肌细胞损伤，心肌酶被释放出来致血清中心肌酶活升高。丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组比较，能不同程度地降低犬心肌缺血4h后血清中CK、LDH、AST、CK-MB活性，且呈剂量依赖性；中剂量丹酚酸A冻干粉针组比同剂量丹酚酸A单体化合物组效果更显著。说明丹酚酸A冻干粉针能能稳定心肌细胞膜，减少心肌缺血损伤时心肌酶的溢出，对缺血心肌具有明显保护作用。

经过实验数据对比可知，模型组犬在缺血4h后，血清中游离脂肪酸(FFA)、过氧化脂质(LPO)显著升高，提示心肌缺血后心肌脂肪酸代谢出现障碍，将会抑制葡萄糖氧化主要酶的活性，从而增加心肌耗氧量，扩大心肌梗塞范围。而丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组比较，能显著降低心肌缺血犬血清中FFA、LPO含量，且呈剂量依赖关系。提示丹酚酸A冻干粉针能显著抑制血清中FFA水平升高，改善心肌脂肪酸代谢，降低乳酸的堆积，增加单位氧耗的产能量，降低心肌耗氧量，从而改善心功能，抑制心肌梗塞范围，保护心肌缺血损伤。

经过实验数据对比可知，模型组犬心肌缺血4h后血清中MDA含量显著升高，SOD、GSH-Px活性显著下降，提示犬心肌缺血后，氧自由基生成明显增加，体内清除氧自由基的酶活显著降低，而氧自由基会通过一系列氧化反应影响细胞的正常结构和功能，加剧心肌缺血损伤程度。丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组比较，能显著降低心肌缺血犬血清中MDA的含量，同时使血清中SOD、GSH-Px活性明显增强，且呈一定的剂效关系；提示丹酚酸A冻干粉针能通过某种机制抑制脂质过氧化过程，减少氧自由基生成，同时又能提高内源性抗氧化酶活性而减轻氧自由基对心肌的损伤，提高缺血心肌的抗氧化能力而发挥抗心肌缺血作用。且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物。

经过实验数据对比可知，不同剂量的丹酚酸A冻干粉针能不同程度地减少心肌耗氧量以及氧利用率，其中丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组缺血120min(即给药后105min)氧利用率较给药前分别降低了近20％、16％。说明丹酚酸A冻干粉针能降低心肌耗氧量及氧利用率，改善心肌氧的供需平衡，改善心室功能，发挥保护缺血心肌的作用，防治心肌缺血。

经过实验数据对比可知，不同剂量丹酚酸A冻干粉针能使心肌缺血犬血液粘度、血浆粘度、红细胞压积及血小板粘附率不同程度地降低，明显降低血浆中纤维蛋白含量；各剂量组之间呈一定剂效趋势；提示丹酚酸A冻干粉针能降低血粘度，抑制血小板粘附聚集，预防血管内血栓形成，改善心肌缺血犬血液流变学，改善微循环，能用于防治缺血性心脏病。

经过实验数据对比可知，不同剂量的丹酚酸A冻干粉针能显著减轻大鼠血栓湿、干重，对血栓形成具有明显的抑制作用；各剂量组之间呈一定的量效关系，且抑制效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物。提示丹酚酸A冻干粉针具有抑制大鼠体内血栓形成的作用，提示其可用于防治血栓所致的缺血性心脏病。

医学和药学研究人员无法预先在不做相关实验的前提下，预先得知丹酚酸A冻干粉针具有上述的良好用途。

附图说明

图1.丹酚酸A核磁共振氢谱图；

图2.丹酚酸A核磁共振碳谱图；

图3.紫草酸核磁共振氢谱图；

图4.紫草酸核磁共振碳谱图；

图5.迷迭香酸核磁共振氢谱图；

图6.迷迭香酸核磁共振碳谱图；

图7.丹酚酸B核磁共振氢谱图；

图8.丹酚酸B核磁共振碳谱图；

图9.丹酚酸C核磁共振氢谱图；

图10.丹酚酸C核磁共振碳谱图；

图11.混合对照品溶液HPLC图；

图12.紫草酸对照品溶液HPLC图；

图13.迷迭香酸对照品溶液HPLC图；

图14.丹酚酸B对照品溶液HPLC图；

图15.丹酚酸A对照品溶液HPLC图；

图16.丹酚酸C对照品溶液HPLC图；

图17.丹酚酸A主份原料HPLC图；

图18.注射用丹酚酸A冻干曲线图；

图19.注射用丹酚酸A冻干真空曲线图。

具体实施方式

实施例1

取丹参药材，粉碎成6目颗粒，每次加7倍量92℃水，温浸提取3次，同时以25转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.20(60℃)，加入乙醇使含醇量在70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B20mg，水溶液用10％氢氧化钠调pH至4.0，加入0.5％ZnCl₂作为催化剂，120℃温度加热转化4小时，转化液用20％磷酸调pH值至2.5，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A3mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶50，树脂柱径高比为1∶10，分别用3倍柱体积水、5倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用4倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、12倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20％磷酸调pH至2.5，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入1～3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的15倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷∶叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱10倍柱体积，正戊烷∶叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱10倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加12倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度50℃，回差温度4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率60KW)130分钟，得丹酚酸A主份原料。

经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为94.57％，紫草酸含量0.663％；迷迭香酸含量1.16％；丹酚酸B含量1.24％；丹酚酸C含量1.48％。

实施例2

取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加7倍量90℃水，温浸提取3次，同时以25转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.16(60℃)，加入乙醇使含醇量在70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B20mg，水溶液用10％氢氧化钠调pH至3.5，加入0.5％ZnCl₂作为催化剂，120℃温度加热转化4小时，转化液用20％磷酸调pH值至2.5，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A3mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶50，树脂柱径高比为1∶10，分别用3倍柱体积水、5倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用4倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、12倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20％磷酸调pH至2.5，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入1～3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的15倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱10倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱10倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度50℃，回差温度2℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率20KW)120分钟，得含丹酚酸A主份原料。

经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为95.23％，紫草酸含量0.70％；迷迭香酸含量1.08％；丹酚酸B含量1.21％；丹酚酸C含量1.48％。

实施例3

取丹参药材，切成饮片，每次加8倍量85℃水温浸提取3次，同时以20转/分速度搅拌，每次温浸提取2.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.20(60℃)，加入乙醇使含醇量在75％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B15mg，水溶液用10％氢氧化钾调pH至5.0，加入0.6％ZnCl₂作为催化剂，在120℃温度加热转化3.5小时，转化液用15％盐酸调pH值至2.5，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶45，树脂柱径高比为1∶8，分别用3.5倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积45％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的45％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶9，树脂柱径高比为1∶7，分别用4倍柱体积水、10倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用15％盐酸调pH至2.6，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.8g的萃取液，加入2～3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的13倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正戊烷叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酸酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度60℃，回差温度2.5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10KW)130分钟，得含丹酚酸A主份原料。

经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为96.03％，紫草酸含量0.60％；迷迭香酸含量1.01％；丹酚酸B含量1.08％；丹酚酸C含量1.27％。

实施例4

取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加9倍量85℃水温浸提取2次，同时以30转/分速度搅拌，每次温浸提取3.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.18(60℃)，加入乙醇使含醇量在75％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B18mg，水溶液用10％碳酸钠调pH至5.2，加入0.6％ZnCl₂作为催化剂，在123℃温度加热转化4.5小时，转化液用15％硝酸调pH值至2.8，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A6mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40，树脂柱径高比为1∶7，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶8，树脂柱径高比为1∶8，分别用4倍柱体积水、9倍柱体积40％乙醇溶液洗脱除杂，再用7倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A10mg水溶液；水溶液用15％硝酸调pH至2.6，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收乙酸甲酯，制成每1ml含丹酚酸A0.7g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶7，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱9倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度60℃，回差温度3℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率5KW)100分钟，得含丹酚酸A主份原料。

经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为94.72％，紫草酸含量0.76％；迷迭香酸含量1.13％；丹酚酸B含量1.26％；丹酚酸C含量1.46％。

实施例5

取丹参药材，切成饮片，每次加10倍量80℃水温浸提取3次，同时以15转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.12(60℃)，加入乙醇使含醇量在70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B20mg，水溶液用10％碳酸氢钠调pH至4.4，加入0.8％ZnCl₂作为催化剂，在128℃温度加热转化4.0小时，转化液用20％硫酸调pH值至2.6，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40，树脂柱径高比为1∶7，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶15，分别用4倍柱体积水、7倍柱体积35％乙醇溶液洗脱除杂，再用6倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用20％硫酸调pH至2.8，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入2.5倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的9倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正戊烷∶叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度65℃，回差温度4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率12KW)110分钟，得含丹酚酸A主份原料。

经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为95.23％，紫草酸含量0.69％；迷迭香酸含量1.17％；丹酚酸B含量1.25％；丹酚酸C含量1.47％。

实施例6

取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加9倍量85℃水温浸提取3次，同时以20转/分速度搅拌，每次温浸提取2.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.1(60℃)，加入乙醇使含醇量在70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B10mg，水溶液用20％柠檬酸钠调pH至5.5，加入0.4％ZnCl₂作为催化剂，在132℃温度加热转化3.5小时，转化液用20％醋酸调pH值至26，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶35，树脂柱径高比为1∶8，分别用3倍柱体积水、4.5倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用6倍柱体积40％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的40％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含8mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶12，树脂柱径高比为1∶18，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积30％乙醇溶液洗脱除杂，再用5倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20％醋酸调pH至2.7，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入2倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加12倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度65℃，回差温度5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率15KW)90分钟，得含丹酚酸A主份原料。

经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为95.24％，紫草酸含量0.69％；迷迭香酸含量1.07％；丹酚酸B含量1.21％；丹酚酸C含量1.46％。

实施例7

取丹参药材，粉碎成直径约2mm颗粒，每次加9倍量88℃水温浸提取3次，同时以22转/分速度搅拌，每次温浸提取3.5小时；提取液减压浓缩至相对密度1.24(60℃)，加入乙醇使含醇量在75％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B13mg，水溶液用10％氢氧化钠调pH至3.6，加入0.5％ZnCl₂作为催化剂，在133℃温度加热转化4.5小时，转化液用10％盐酸调pH值至2.7，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶40，树脂柱径高比为1∶9，分别用4倍柱体积水、4倍柱体积22％乙醇洗脱，除去杂质，再用6倍柱体积43％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的43％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每ml含10mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶15，树脂柱径高比为1∶20，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积30％乙醇溶液洗脱除杂，再用5倍柱体积60％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的60％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用10％盐酸调pH至2.8，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的12倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶10，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱6倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱7倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度50℃，回差温度1℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率3KW)150分钟，得含丹酚酸A主份原料。

经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为95.02％，紫草酸含量0.75％；迷迭香酸含量1.12％；丹酚酸B含量1.26％；丹酚酸C含量1.46％。

实施例8

取丹参药材，切成饮片，每次加9倍量90℃水温浸提取3次，同时以25转/分速度搅拌，每次温浸提取3小时；提取液减压浓缩至相对密度1.13(60℃)，加入乙醇使含醇量在75％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味；加水稀释至每1ml含丹酚酸B20mg，水溶液用10％碳酸钠调pH至3.5，加入1.0％ZnCl₂作为催化剂，在135℃温度加热转化4.5小时，转化液用15％硫酸调pH值至3.0，离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A5mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶36，树脂柱径高比为1∶9，分别用3倍柱体积水、4倍柱体积25％乙醇洗脱，除去杂质，再用5倍柱体积45％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的45％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；水溶液浓缩至每1ml含6mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶10，树脂柱径高比为1∶10，分别用4倍柱体积水、8倍柱体积45％乙醇溶液洗脱除杂，再用8倍柱体积65％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的65％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至每1ml含丹酚酸A10mg水溶液；水溶液用15％硫酸调pH至2.7，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A0.6g的萃取液，加入3倍量硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的10倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶8，以正戊烷、叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用正戊烷-叔丁基甲基醚(4∶6)洗脱8倍柱体积，正戊烷-叔丁基甲基醚(6∶4)洗脱8倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥温度80℃，回差温度4℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率60KW)120分钟，得含丹酚酸A主份原料。

经测定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量为95.34％，紫草酸含量0.62％；迷迭香酸含量1.10％；丹酚酸B含量1.23％；丹酚酸C含量1.47％。

实施例9

取实施例3制成的含丹酚酸A主份原料80g，加注射用水2800ml搅拌使溶解，用10％氢氧化钠调pH值4.5，加入甘露醇60g使溶解，再加入维生素C0.5g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭2g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以20℃/h速度降温至-40℃，保温冷冻16小时；抽真空至0.3mbar以下，在10小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-25℃，维持-25℃真空干燥8小时；继续升温，以0.5℃/min均匀升温至41℃，维持41℃干燥3小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

实施例10

取实施例4制成的含丹酚酸A主份原料20g，加注射用水1800ml搅拌使溶解，用10％氢氧化钠调pH值4.6，加入甘露醇40g使溶解，再加入维生素C0.3g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭1g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至2000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以30℃/h速度降温至-45℃，保温冷冻10小时；抽真空至0.3mbar以下，在14小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-27℃，维持-27℃真空干燥6小时；继续升温，以1.0℃/min均匀升温至45℃，维持45℃干燥2小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

实施例11

取实施例5制成的含丹酚酸A主份原料10g，加注射用水1500ml搅拌使溶解，用10％氢氧化钠调pH值4.6，加入甘露醇20g使溶解，再加入维生素C0.8g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭1.2g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至2000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以25℃/h速度降温至-42℃，保温冷冻12小时；抽真空至0.3mbar以下，在13小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-23℃，维持-23℃真空干燥7小时；继续升温，以0.8℃/min均匀升温至42℃，维持42℃干燥4小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

实施例12

取实施例6制成的含丹酚酸A主份原料30g，加注射用水2000ml搅拌使溶解，用20％碳酸钠调pH值4.6，加入甘露醇20g、乳糖10g使溶解，再加入硫脲0.5g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭1.0g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至2000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以29℃/h速度降温至-44℃，保温冷冻14小时；抽真空至0.3mbar以下，在11小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-26℃，维持-26℃真空干燥6.5小时；继续升温，以0.6℃/min均匀升温至43℃，维持43℃干燥3.5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

实施例13

取实施例7制成的含丹酚酸A主份原料35g，加注射用水2500ml搅拌使溶解，用10％氢氧化钾调pH值4.6，加入葡萄糖30g使溶解，再加入亚硫酸氢钠3g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭1.5g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以27℃/h速度降温至-43℃，保温冷冻11小时；抽真空至0.3mbar以下，在12.5小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-24℃，维持-24℃真空干燥7.5小时；继续升温，以0.7℃/min均匀升温至40℃，维持40℃干燥5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

实施例14

取实施例8制成的含丹酚酸A主份原料40g，加注射用水2700ml搅拌使溶解，用10％氢氧化钠调pH值4.6，加入葡萄糖20g、乳糖20g使溶解，再加入焦亚硫酸钠4g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭1.5g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以28℃/h速度降温至-41℃，保温冷冻13小时；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-25.5℃，维持-25.5℃真空干燥6.5小时；继续升温，以0.9℃/min均匀升温至44℃，维持44℃干燥3.5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

实施例15

取实施例1制成的含丹酚酸A主份原料60g，加注射用水2700ml搅拌使溶解，用10％氢氧化钠调pH值4.6，加入甘露醇40g使溶解，再加入维生素C2g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭2g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以24.5℃/h速度降温至-42.5℃，保温冷冻11.5小时；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-24.5℃，维持-24.5℃真空干燥6.5小时；继续升温，以0.55℃/min均匀升温至42.5℃，维持42.5℃干燥2.5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

实施例16

取实施例2制成的含丹酚酸A主份原料70g，加注射用水2800ml搅拌使溶解，用10％氢氧化钠调pH值4.6，加入甘露醇40g使溶解，再加入维生素C2g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭2g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以28.5℃/h速度降温至-44.5℃，保温冷冻11.5小时；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-24.5℃，维持-24.5℃真空干燥6.5小时；继续升温，以0.75℃/min均匀升温至43.5℃，维持43.5℃干燥3小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

实施例17

取市售丹酚酸A单体化合物原料(丹酚酸A含量99.62％)40g，加注射用水2700ml搅拌使溶解，用10％氢氧化钠调pH值4.6，加入葡萄糖20g、乳糖20g使溶解，再加入焦亚硫酸钠4g，搅拌使溶解，混匀，加入活性炭1.5g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以28℃/h速度降温至-41℃，保温冷冻13小时；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-25.5℃，维持-25.5℃真空干燥6.5小时；继续升温，以0.9℃/min均匀升温至44℃，维持44℃干燥3.5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

实验例1：丹酚酸A主份原料分析方法及分离、结构鉴定研究

一、丹酚酸A主份原料分析方法研究

1.仪器与试药

仪器：Watcrsc2695高效液相色谱仪，Empower2色谱工作站，2998二极管阵列检测器；Sartoriuscp225D十万分之一电子天平。

色谱柱：YMCC₁₈色谱柱(250×4.6mm，5μm)；

试剂：甲醇为色谱纯，水为Millipore制备的超纯水，其他试剂均为分析纯。

迷迭香酸对照品、丹酚酸B对照品均购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用；紫草酸对照品、丹酚酸C对照品均购自上海海灿生物科技有限公司，丹酚酸A对照品为自制，经纯度标化含量为99.52％。

2.对照品溶液及供试品溶液的制备

2.1对照品溶液的制备：分别精密称取紫草酸对照品约10.00mg、迷迭香酸对照品约10.00mg、丹酚酸B对照品约10.00mg、丹酚酸C对照品约10.00mg、丹酚酸A对照品约10.00mg，置不同100ml量瓶中，分别加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取紫草酸对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸B对照品、丹酚酸C对照品各10ml，置不同100ml量瓶中，分别加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液。精密吸取上述储备溶液各10ml，置同一100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备精密称取实施例1样品约10.00mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密吸取10ml至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

3.色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；检测波长：286nm；柱温30℃；理论板数按丹酚酸A峰计算应不低于10000。

0～10分钟时，甲醇的比例由30％升至40％，0.1～0.5％磷酸水溶液的比例由70％降至60％；10～30分钟时，甲醇的比例由40％升至55％，0.1～0.5％磷酸水溶液的比例由50％降至45％；30～60分钟时，甲醇的比例由55％升至80％，0.1～0.5％磷酸水溶液的比例由45％降至20％。

在上述条件下，5个对照品的色谱峰保留时间见表1，HPLC图谱见图11～17。

表1.各对照品的色谱峰保留时间结果

4.线性关系的考察

精密吸取上述混合对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇稀释成系列标准溶液。精密吸取上述标准溶液各10μl注入液相色谱仪，按“3.色谱条件与系统适用性试验”项下色谱条件计算峰面积，分别以峰面积积分值为纵坐标，各浓度对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线。结果表明混合对照品溶液在如下范围内成良好的线性关系，见表2。

表2.混合对照品溶液线性关系结果

5.精密度试验

取混合对照品溶液，照“3.色谱条件与系统适用性试验”项下色谱条件测定，重复进样6次。结果表明该方法的精密度良好，见表3。

表3精密度试验结果

6.稳定性试验

取供试品溶液，照“3.色谱条件与系统适用性试验”项下色谱条件测定，每隔一定时间进样一次，结果供试品溶液中各成分在24小时内峰面积无明显变化，表明供试品溶液的稳定性良好，见表4。

表4稳定性试验结果

7.重复性试验

取本丹酚酸A主份原料，加甲醇制成供试品溶液6份，照“3.色谱条件与系统适用性试验”项下色谱条件测定。结果表明该方法重复性良好，见表5。

表5.重复性试验结果

8.回收率试验

采用加样回收试验，取已知含量的丹酚酸A主份原料10mg，精密称定，平行6份，分别按各组分含量等比例加入相应的对照品溶液，按2.3项下方法制备供试品溶液，测定并计算各成分的加样回收率以及RSD。结果表明该方法的准确度良好，见表6。

表6.回收率试验结果

二、丹酚酸A主份原料分离、结构鉴定研究

将实施例1得到上述含丹酚酸A主份原料分别以CG161M大孔吸附树脂、ODS、SephadexLH-20柱层析分离，以水∶乙醇梯度洗脱，水的比例为80～20％，乙醇的比例为20～80％，分段收集洗脱液，合并相同组分，结晶，可以得到丹酚酸A，紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸C的单体化合物，测定所述单体化合物，其中：

丹酚酸A，分子式：C₂₆H₂₂₂O₁₀，分子量：494.45，结构如下：

丹酚酸A理化性质及波谱数据，见图1，2。

丹酚酸A(SalvianolicaeidA)，淡黄色粉末，易容易甲醇、水。ESIMSm/z：493[M-H]^-，518[M+Na]⁺，分子式：C₂₆H₂₂O₁₀，分子量：494.45；¹H(600MHz，CD₃OD)和¹³CNMR(150MHz，CD₃OD)数据如下：

¹NMR(CD₃OD，600MHz)δ：2.96(1H，dd，J＝14.4，8.4Hz，H-7``)，3.06(1H，dd，J＝14.4，4.2Hz，H-7``)，5.17(1H，dd，J＝9.0，4，2Hz，H-8``)，6.27(1H，d，J＝16.2Hz，H-8`)，6.54(1H，dd，J-7.8，1.8Hz，H-6``)，6.63(1H，d，J＝7.8Hz，H-5``)，6.65(1H，d，J＝16.2，Hz，H-7)，6.72(1H，d，J＝8.4Hz，H-4`)，6.74(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)，6.76(1H，d，J＝1.8Hz，H-2``)，6.88(1H，dd，J＝8.4，1.8Hz，H-6)，7.05(1H，d，J＝1.8Hz，H-2)，7.11(1H，d，J＝8.4Hz，H-5`)，7.14(1H，d，J＝16.2Hz，H-8)；8.06(1H，d，J＝16.2Hz，H-7`).

¹³CNMR(CD₃OD，150MHz)δ：36.6(C-7``)，73.3(C-8``)，112.6(C-2)，113.4(C-5)，114.2(C-8`)，114.9(C-4`)，115.1(C-5``)，116.0(C-2``)，118.7(C-5`)，119.6(C-6)，119.3(C-8)，120.6(C-6``)，124.7(C-6`)，127.0(C-1)，127.9(C-1``)，130.0(C-1`)，136.5(C-7)，

143.1(C-3)，143.9(C-3``)，144.8(C-4``)，145.1(C-2`)，145.4(C-4)，146.0(C-7`)，146.9(C-3`)，167.3(C-9`)，172.1(C-9``).

紫草酸，其分子式：C₂₇H₂₂O₁₂，分子量：538.46，结构如下：

紫草酸理化性质及波谱数据，见图3，4。

紫草酸(lithospermicacid)，淡黄色粉末，易容易甲醇、水。ESIMSm/z：539[M+H]⁺.537[M-1]^-，560[M+Na]^-，492[M-COOH]^-；分子式：C₂₇H₂₂O₁₂，分子量538.45；¹H(600MHz，CD₃OD)和¹³CNMR(150MHz，CD₃OD)数据如下：

¹NMR(CD₃OD，600MHz)δ：3.02(1H，dd，J＝14.4，9.6Hz，H-7``)，3.06(1H，dd，J＝14.4，3.0Hz.H-7``)，4.25(1H，dd，J＝5.4Hz，H-8`)，4.97(1H，dd，J＝9.6，3.0Hz，H-8``)，5.88(1H，d，J＝5.4Hz，H-7`)，6.31(1H，d，J＝16.0Hz，H-8)，6.59(1H，dd，J＝8.0，1.8Hz，H-6``)，6.65(1H，d，J＝8.0Hz，H-5``)，6.73(1H，dd，J＝8.4，2.0Hz，H-6`)，6.74(1H，d，J＝1.8Hz，H-2``)，6.74(1H，d，J＝8.4Hz，H-5`)，6.83(1H，d，J＝8.4Hz，2.4Hz，H-5)，6.97(1H，d，J＝2.0Hz，Hz，H-2`)，7.13(1H，d，J＝8.4Hz.H-6)；7.93(1H，d，J＝16.0Hz，H-7).

¹³CNMR(CD₃OD.150MHz)δ：37.3(C-7``)，59.9(C-8`)，76.7(C-8``)，88.9(C-7`)，112.4(C-2``)，114.6(C-5``)，114.9(C-5`)，115.7(C-8)，116.1(C-2`)，117.2(C-6``)，119.5(C-6)，119.9(C-6`)，123.5(C-1)，129.3(C-2)，129.8(C-1``)，133.4(C-1`)，142.4(C-7).143.3(C-4)，143.4(C-3``)，144.7(C-4``)，145.1(C-3`)，145.1(C-4`)，147.4(C-3)，167.8(C-9)，176.5(C-9``)，178.5(C-9`).

迷迭香酸，迷迭香酸的分子式：C₁₈H₁₆O₈，分子量：360.31，结构如下：

迷迭香酸理化性质及波谱数据，见图5，6。

迷迭香酸(Rosmarinicacid)，白色粉末，易容易甲醇、水。ESIMSm/z：359[M-H]^-，383[M+Na]⁺；分子式：C₁₈H₁₆O₈，分子量360.31；¹H(600MHz，CD₃OD)和¹³CNMR(150MHz，CD₃OD)数据如下：

¹NMR(CD₃OD，600MHz)δ：3.01(1H，dd，J＝14.4，8.4Hz，H-7`)，3.10(1H，dd，J＝14.4，4.2Hz.H-7`).5.18(1H，dd，J＝8.4，4.2Hz，H-8`)，6.27(1H，d，J＝16.0Hz，H-8)，6.61(1H，dd，J＝7.8，1.8Hz，H-6`)，6.70(1H，d，J＝7.8Hz，H-5`)，6.75(1H，d，J＝1.8Hz，H-2`)，6.78(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)，6.95(1H，dd，J＝8.4，2.4Hz，H-6)，7.04(1H，d，J＝1.8Hz，H-2)，7.55(1H，d，J＝16.0Hz，H-7)；

¹³CNMR(CD₃OD，150MHz)δ：36.6(C-7`)，73.2(C-8`)，113.1(C-8)，113.9(C-2)，114.9(C-5).115.1(C-5`).116.2(C-2`)，120.4(C-6)，121.8(C-6`)，126.3(C-1)，127.9(C-1`)，143.9(C-3)，144.8(C-4)，145.5(C-3`)，146.4(C-4`)，148.4(C-7)，167.1(C-9)，172.1(C-9`).

丹酚酸B，其分子式：C₃₆H₃₀O₁₆，分子量：718.61，结构如下：

丹酚酸B理化性质及波谱数据，见图7，8。

丹酚酸B(SalvianolicacidB)，淡黄色粉末，易容易甲醇、水。ESIMSm/z：717[M-H]^-，741[M+Na]⁺；分子式：C₃₆H₃₀O₁₆，分子量718.62；¹H(600MHz，CD₃OD)和¹³CNMR(150MHz，CD₃OD)数据如下：

¹NMR(CD₃OD，600MHz)δ：2.80-3.10(2H，m，H-7``)，2.80-3.10(2H，m，H-7```)，4.35(1H，d，J＝4.8Hz，H-8``)，5.15-5.19(1H，m，H-8`)，5.15-5.19(1H，m，H-8```)，5.85(1H，d，J＝4.8Hz，H-7``)，6.20(1H，d，J＝16.2Hz，H-8)，6.31(1H，dd，J＝8.1，2.1Hz，H-6`)，6.52(1H，d，J＝2.4Hz，H-2```)，6.54(1H，d，J＝7.8Hz，H-5``)，6.62(1H，d，J＝2.1Hz，H-2`)，6.66(1H，dd，J＝8.1，2.4Hz，H-6```)，6.70(1H，d，J＝7.8Hz，H-5`)，6.74(1H，d，J＝8.1Hz，H-5```)，6.75(1H，dd，J＝7.8，2.4Hz，H-6``)，6.76(1H，d，J＝2.4Hz，H-2``)，6.83(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)，7.16(1H，d，J＝8.4Hz，H-6)，7.52(1H，d，J＝16.2Hz，H-7)；

¹³CNMR(CD₃OD，150MHz)δ：36.111(C-7```)，36.51(C-7`)，56.58(C-8``)，73.28(C-8)，74.19(C-8```)，86.93(C-7``)，111.99(C-2``)，115.01(C-5``)，115.04(C-5`)，115.13(C-2`)，115.18(C-2```)，115.95(C-8)，116.20(C-6``)，116.97(C-5```)，117.04(C-5)，120.37(C-6)，120.89(C-6```)，123.28(C-1)，125.04(C-2)，127.55(C-1`)，127.85(C-1```)，132.27(C-1``)，142.20(C-7)，143.70(C-3```)，143.72(C-4```)，143.88(C-4``)，144.57(C-3``)，144.73(C-4`)，145.23(C-3`)，145.39(C-3).147.71(C-4)，166.66(C-9)，170.92(C-9```)，171.17(C-9``)，172.29(C-9`).

丹酚酸C，其分子式：C₂₆H₂₀O₁₀，分子量：492.43，结构如下：

丹酚酸C理化性质及波谱数据，见图9，10。

丹酚酸C(SalvianolicacidC)，淡黄色粉末，易容易甲醇、水。ESIMSm/z：491[M-H]^-.515[M+Na]⁺；分子式：C₂₆H₂₀O₁₀，分子量492.43；¹H(600MHz，CD₃OD)和¹³CNMR(150MHz，CD₃OD)数据如下：

¹NMR(CD₃OD，600MHz)δ：3.07(1H，dd，J＝13.8，8.4Hz，H-7``)，3.15(1H，dd，J＝13.8，4.2Hz，H-7``)，5.25(1H，dd，J＝8.4，4.2Hz，H-8``)，6.46(1H，d，J＝15.9Hz，H-8)，6.46(1H，dd，J＝8.1，2.1Hz，H-2``)，6.72(1H，d，J＝8.1Hz，H-3``)，3.74(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)，6.80(1H，d，J＝2.4Hz，H-6``)，6.88(1H，d，J＝7.8Hz，H-5`)，7.20(1H，s，，H-8`)，7.36(1H，d，J＝7.8Hz，H-6)，7.37(1H，dd，J＝7.8Hz，2.4Hz，H-6`)，7.40(1H，d，J＝2.4Hz，2.1Hz，H-2`)，7.94(1H，d，J＝15.9Hz，H-7)；

¹³CNMR(CD₃OD，150MHz)δ：36.2(C-7``)，73.3(C-8``)，97.9(C-8`)，110.4(C-5)，112.0(C-2`)，113.5(C-8)，114.9(C-5``)，115.4(C-5`)，116.3(C-2``)，117.4(C-6`)，118.2(C-1)，120.5(C-6``)，122.0(C-1`)，125.0(C-6)，128.0(C-1``)，131.3(C-2)，143.0(C-3)，

143.8(C-7)，144.0(C-3``)，144.6(C-4)，144.8(C-4``)，145.3(C-2`)，146.7(C-4`)，158.0(C-7`)，167.3(C-9)，172.4(C-9``).

实验例2：丹酚酸B的提取

1.1提取溶剂及提取方法的确认

称取丹参药材400g，按中国药典丹参项下方法测定丹酚酸B含量，平均分成4份，按下述试验方案进行试验：

实验1：取丹参药材100g，每次加8倍量水在80℃温浸提取1.5小时，共温浸提取三次，合并提取液，测定丹酚酸B并计算提取率，结果如表7。

实验2：取丹参药材100g，每次加8倍量水在80℃温浸提取1.5小时，同时以10～50转/分速度搅拌，共温浸搅拌提取三次，合并提取液，测定丹酚酸B并计算提取率，结果如表7。

实验3：取丹参药材100g，每次加8倍量水煎煮1.5小时，共煎煮三次，合并提取液，测定丹酚酸B并计算提取率，结果如表7。

实验4：取丹参药材100g，每次加8倍量50％乙醇回流提取1.5小时，共提取三次，合并提取液，测定丹酚酸B并计算提取率，结果如表7。

表7.提取溶剂及提取方法实验结果

上述实验结果显示，采用50％乙醇做提取溶剂对丹酚酸B提取率有影响，50％乙醇提取优于水提取，但与水温浸加搅拌提取差异不大，水提取过程中搅拌和不搅拌的两种提取方式对丹酚酸B的提取率有影响，煎煮提取可能是由于温度较高，对丹酚酸B提取有影响。

1.2正交试验法优选提取工艺

1.2.1水提取工艺的优化研究：根据以上的试验结果，水提取工艺以提取时间(A)、提取次数(B)、溶剂量(C)、提取温度(D)四项作为考察因素，每一因素设三个水平，按L9(3⁴)正交表进行正交试验设计(表8、表9)，考察指标为丹酚酸B的提取率。

表8.提取因素水平表

表9.提取工艺正交试验结果表

表10.方差分析结果

F_0.05(2，2)＝19.00F_0.01(2，2)＝99.00

水提取方差分析结果表明，各试验因素对丹酚酸B的提取转移率均无显著性差异，故本发明丹酚酸B的水提取条件为加3～15倍量水、在45～95℃下温浸提取1-3次，同时以10～50转/分速度搅拌，每次提取1～4小时或者每次加3～15倍量煎煮提取，每次提取1～4小时，共提取1～3次。

1.2.2醇提取工艺的优化研究：根据以上的试验结果，醇提取工艺以提取时间(A)、提取次数(B)、溶剂量(C)、乙醇浓度(D)四项作为考察因素，每一因素设三个水平，按L9(3⁴)正交表进行正交试验设计(表11、表12)，考察指标为丹酚酸B的提取率。

表11.提取因素水平表

表12.提取工艺正交试验结果

表13.方差分析结果

F_0.05(2，2)＝19.00F_0.01(2，2)＝99.00

醇回流提取方差分析结果表明，各试验因素对丹酚酸B的提取转移率均无显著性差异，故本丹酚酸B的提取条件为加3～15倍量30％～60％乙醇回流提取1～3次，每次提取1～4小时。

1.3丹酚酸B原料制备

根据上述正交实验优化工艺，取丹参药材10kg，每次加8倍量水在80℃温浸提取1.5小时，同时以10～50转/分速度搅拌，共温浸搅拌提取3次，滤过，合并滤液，提取液减压浓缩至相对密度1.10～1.25(60℃)，加入乙醇使含醇量在60％，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，真空干燥、得丹酚酸提取物4.15kg，测得丹酚酸B含量为10.25％。

实验例3：丹酚酸B转化丹酚酸A主份原料工艺比较

实验1：取1.3项下制备的丹酚酸B原料约30g，配制成200ml溶液，加10％氢氧化钠溶液调pH值至4.5；

实验2：取1.3项下制备的丹酚酸B原料约30g，配制成200ml溶液，加10％氢氧化钠溶液调pH值至4.5，加1.0％ZnCl₂；

实验3：取含丹酚酸B(含量51.54％)原料约6g，加纯化水稀释至丹酚酸B浓度为15mg/m溶液，加尿素，使之与丹酚酸B的摩尔比为0.5；

上述各实验组置于同一高压反应釜中，在120℃下反应4.0小时，冷却，计算丹酚酸A产率。

表14.丹酚酸B转化丹酚酸A主份原料实验结果

表14结果显示，丹酚酸B高纯度对转化没有影响，不需要纯化至50％以上进行转化，丹酚酸B转化为丹酚酸A主份原料过程中，调节pH值，加入1.0％ZnCl₂，可以大大提高丹酚酸A主份原料的产率。

实验例4：丹酚酸B转化丹酚酸A主份原料工艺优化

上述实验研究证明，丹酚酸B纯度不是影响丹酚酸B转化丹酚酸A主份原料的因素，但加入一定的催化剂影响丹酚酸B转化丹酚酸A主份原料，因此，我们对各实验组均加入1％ZnCl₂作为催化剂，对影响丹酚酸B转化为丹酚酸A主份原料的其他因素：丹酚酸B浓度(A)、pH(B)、温度(C)、时间(D)进行正交试验，每一因素设三个水平，按L9(3⁴)正交表进行试验设计(表15、表16)，考察指标为丹酚酸A主份原料的产率。

表15.转化因素水平表

表16.转化工艺正交试验结果

表17.方差分析结果表

*F_0.05(2，2)＝19.00△F_0.01(2，2)＝99.00

方差分析结果显示，对本次正交试验按照直观分析优选出的最佳条件是A₃B₂C₂D₂，因素A(丹酚酸B浓度)对丹酚酸A主份原料产率有一定影响，从K值分析，浓度高于30mg/ml对提高丹酚酸B转化为丹酚酸A的效果没有影响，而且形成的杂质更多，因此，转化前丹酚酸B浓度宜选择1～30mg/ml；因素B(pH)、因素C(温度)对丹酚酸A主份原料产率有极显著性差异，提示丹酚酸B转化过程中应严格控制pH及温度，可以成功的实现丹酚酸B较高产率的向丹酚酸A主份原料转化。

实验例5：催化剂ZnCl₂用量对转化的影响

按上述丹酚酸B转化丹酚酸A主份原料工艺优化条件，取丹酚酸B原料，加纯化水200ml，制成丹酚酸B浓度为15mg/ml的溶液，调节pH为4.5，转化温度为120℃，转化时间为4小时，按与丹酚酸B摩尔百分比计，分别加入不同量的催化剂ZnCl₂，结果见表18。

表18.催化剂ZnCl₂用量对转化影响实验结果

催化剂ZnCl₂用量对转化影响实验结果表明，催化剂用量≥0.02％即可产生55.65％转化率，优选催化剂用量0.1％～3.0％，更优选0.5％～2.0％.催化剂用量＞3％后，转化率不再有明显提高。

实验例6：催化剂对丹酚酸B转化丹酚酸A主份原料的催化作用

按上述丹酚酸B转化丹酚酸A主份原料工艺优化条件，取丹酚酸B原料，加纯化水200ml，制成丹酚酸B浓度为15mg/ml的溶液，调节pH为4.5，转化温度为120℃，转化时间为4小时，分别加入不同品种和不同剂量的催化剂进行转化，结果见表19。

表19.不同催化剂对丹B转化丹A主份原料的影响

表19结果显示，以上4种催化剂均可以作为丹酚酸B转化反应中的催化剂，且各催化剂用量与丹酚酸B摩尔百分比为0.5％～3.0％，丹酚酸A主份原料的产率≥40％。转化率超过60％，但综合评定，采用ZnCl₂最优。

实验例7：丹酚酸A主份原料的大孔吸附树脂纯化

取丹酚酸A主份原料转化溶液13份，置预处理好的各型号大孔树脂100g中，摇床动态吸附8小时后，装柱，依次用水洗洗脱3个柱体积、20％乙醇洗脱5个柱体积、70％乙醇洗脱5个柱体积，收集70％乙醇含丹酚酸A主份原料洗脱液部分，进行丹酚酸A含量测定，洗脱液蒸干计算干膏量，结果见表20。

表20.大孔树脂型号的确认

结果表明：以上13种大孔树脂对丹酚酸A主份原料的吸附效果良好，且用不同浓度的乙醇梯度洗脱可以很好的去除杂质，得到含量大于75％的丹酚酸A主份原料洗脱液，以HPD-100得干膏量最大，主份原料含量高，树脂吸附量大。

实验例8：丹酚酸A主份原料的聚酰胺柱层析纯化

取大孔吸附树脂纯化后的丹酚酸A主份原料溶液3份，置预处理好的各型号树脂100g中，摇床动态吸附8小时后，装柱，依次用水洗洗脱3个柱体积、20％乙醇洗脱5个柱体积、70％乙醇洗脱5个柱体积，收集70％乙醇洗脱液进行丹酚酸A含量测定，部分洗脱液蒸干计算干膏量，结果见表21。

表21.树脂型号的确认

结果表明：以上3种树脂对丹酚酸A的吸附效果良好，且用不同浓度的乙醇梯度洗脱可以很好的去除杂质，得到含量约为90％的丹酚酸A主份原料洗脱液；以聚酰胺得干膏量最多，含量高吸附量大。

实验例9：丹酚酸A主份原料的萃取纯化

将聚酰胺柱层析纯化后的70％乙醇洗脱液减压回收乙醇，调pH值2.0～4.0，再用正丁醇、叔丁基甲基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、乙醇提取5次，分离有机溶剂相，回收溶剂，干燥，得丹酚酸A主份原料，测定丹酚酸A含量，结果见表22。

表22.萃取用有机溶剂的确认

表22结果表明：正丁醇由于极性大，丹酚酸A主份原料量最多，但其丹酚酸A含量没得到明显提高，乙醚由于极性偏小，水溶性杂质少，丹酚酸A含量高，但得到的丹酚酸A主份原料量少，其他提取溶剂叔丁基甲基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯得到的丹酚酸A主份原料量较大，丹酚酸A含量均得到提高；以叔丁基甲基醚得提取物多、丹酚酸A含量高。

实验例10：丹酚酸A主份原料的硅胶柱层析纯化

取萃取纯化后的丹酚酸A主份原料萃取液12份，每份含丹酚酸A10g，加入20g的硅胶，搅拌，挥干；把搅拌样硅胶加到已装好的100g干硅胶柱上，分别以石油醚、正戊烷、正庚烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、叔丁基甲基醚组成的两相溶剂为洗脱剂，HPLC或薄层色谱检测，收集丹酚酸A主份原料洗脱液，洗脱液蒸干，得干膏，测定丹酚酸A含量，结果见表23。

表23.洗脱剂的确认

结果表明：丹酚酸A主份原料用正相硅胶柱色谱时，采用正戊烷-叔丁基甲基醚组成的两相溶剂为洗脱剂，梯度洗脱，可以很好的去除杂质，得到高纯度的丹酚酸A主份原料洗脱液。

实验例11：丹酚酸A主份原料干燥方法研究

取硅胶纯化洗脱后的洗脱液4份，每份含丹酚酸A100g，浓缩至无稠膏状，加10倍量水溶解后分别采用真空干燥、冷冻真空干燥、喷雾干燥、微波真空干燥得丹酚酸A主份原料，对该丹酚酸A主份原料进行检测，结果见表24。

表24.丹酚酸A主份原料干燥方法检测结果

结果表明：采用冷冻真空干燥时间过长，成本过高，且有机溶剂残留严重；真空干燥时间略长，喷雾干燥时间短但瞬间温度较高；微波真空干燥干燥温度低，时间短，所得丹酚酸A主份原料各项指标良好。

经过进一步的实验确定，微波真空干燥适宜范围选择为温度：20-100℃，回差温度1-5℃，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟。

实验例12：丹酚酸A冻干粉针辅料的初步筛选

冻干粉针一般需加适量辅料，辅料主要包括填充剂和抗氧剂，主要用于以下目的：增加注射剂中成分的溶解性，粉针成型时需加入辅料作为支撑体，改善成型性，调节粉针固含物重量，调节渗透压，抗氧剂主要作用是保持制剂稳定。

我们取丹酚酸A主份原料与不同填充剂和维生素C制成冻干粉针。

表25.处方填充剂筛选表

按表25配方取丹酚酸A主份原料，加制成总量90％的注射用水搅拌使溶解，用10％氢氧化钠调pH值4.5，加入辅料使溶解，混匀，加入活性炭2g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以28℃/h速度降温至-42℃，保温冷冻12小时；抽真空至0.3mbar以下，在11小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-25℃，维持-25℃真空干燥6.5小时：继续升温，以0.8℃/min均匀升温至40℃，维持40℃干燥5小时后，将样品温度降至室温，加盖，观察成型性，见表26。

表26.不同填充剂对成型性影响结果

从表26实验结果可知，加入不同量的填充剂，对成型性的影响较大，甘露醇、葡萄糖、乳糖对冻干制剂效果较好，冻干粉疏松度良好、孔隙均匀，因此作为选用辅料，低于20mg成型性及复溶性一般。

实验例13：不同填充剂与抗氧剂对冻干制剂型的影响

根据填充剂实验结果，分别选择甘露醇、葡萄糖、乳糖进行验证性研究，并对抗氧剂进行比较研究，分别选择维生素C、硫脲、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠作为抗氧剂，实验方案见表27，并与不加抗氧剂处方进行比较，实验结果见表28。

表27不同填充剂与抗氧剂初步筛选

按表27配方取丹酚酸A主份原料，加制成总量90％的注射用水搅拌使溶解，用10％氢氧化钠调pH值4.5，加入辅料使溶解，混匀，加入活性炭2g搅拌吸附，滤过，除去活性炭；加注射用水至3000ml，检测中间体含量，pH值，检测合格后用0.22μm微孔滤膜滤过，滤液灌装于无菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡胶塞，共制成1000瓶，装盘，灌装完成后，送入冻干机，关闭箱门，开启冻干机，以25℃/h速度降温至-42℃，保温冷冻14小时；抽真空至0.3mbar以下，在10～14小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-25℃，维持-23℃真空干燥7小时；继续升温，以0.6℃/min均匀升温至44℃，维持44℃干燥2小时后，将样品温度降至室温，加盖，观察成型性，见表28。

表28.不同填充剂与抗氧剂对成型性及制剂质量的影响结果

表28实验结果显示，加入不同量填充剂甘露醇、葡萄糖、乳糖对制剂成型性较好，冻干粉疏松度良好、孔隙均匀，用量选择20mg～40mg/2ml～3ml成型性及复溶性均较好。加入水溶性维生素C、硫脲、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠对主成分的丹酚酸A含量及其他成分均有一定影响，丹酚酸含量略有升高，丹酸酸B含量有所下降，制剂效果更优。

实验例14：冻干条件研究

3.1冻干条件优选：冷冻条件中主要有两个因素：对成型性的影响：冻结速度、真空干燥前冻体的温度；对冻干速率的影响：真空冻干时的升温曲线。

在冻干机上如下优选：

a、药液在冻干机中以20-30℃/小时的冷冻速度冷却至-40℃～-45℃，保温冷冻10～16小时，抽真空至0.3mbar以下，在10～14小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-23℃～-27℃，维持-23℃～-27℃真空干燥6～8小时；

b、药液在冻干机中先以20-30℃/小时的冷冻速度冷却至-25℃，保温冷冻5～8小时，再冷冻至-40℃～-45℃，保温冷冻5～8小时，抽真空至0.3mbar以下，在10～14小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-23℃～-27℃，维持-23℃～-27℃真空干燥6～8小时；

c、药液在冻干机中以20-30℃/小时的冷冻速度冷却至-15℃，保温冷冻5～8小时，再冷冻至-40℃～-45℃，保温冷冻5～8小时，抽真空至0.3mbar以下，在10～14小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-23℃～-27℃，维持-23℃～-27℃真空干燥6～8小时；

以上三种试验结果：1、药液以20-30℃/小时直接冷冻至-40℃～-45℃，粉体较均匀，无裂隙，干燥时间短。2、粉体不均匀，有裂隙，3、冻干时间长，粉体不均匀，有裂隙因此，选择药液冷冻时以20-30℃/小时的冷冻速度直接降至-40℃～-45℃，粉体较均匀，无裂隙，可节省冻干时间。

3.2中试冻干曲线

冻干曲线是指冻干过程中产品温度或搁板温度随时间而变化的关系曲线。冻干曲线的形状与产品的性能、装量的多少、分装容器的种类以及设备条件等多种因素有关。我们在中试生产时选择的冻干机为4000瓶规模，基本符合大生产要求。即在1～4小时将温度降至-40℃～-45℃，在该温度下保持10～16小时，再在10～14小时将温度上升到-23℃～-27℃并保持6～8小时，然后在6～9小时将温度上升到40℃～45℃并保持2～5小时，冻干曲线如图18和图19所示。

实验例15：制剂稳定性研究

取实施例10、11、12样品，按药品稳定性实验研究有关技术要求，将以上三个批号样品在室温条件下，按0个月、1个月、2个月、3个月、6个月间隔，定期检查样品性状、复溶性及澄清度、pH值、丹酚酸A含量、总杂质的变化情况，结果见表29。

表29稳定性实验结果

表29稳定性实验观察结果显示，冻干粉针剂在室温条件下丹酚酸A稳定，其他成分亦无明显变化，制剂外观性状良好，制剂复溶性好，pH值稳定，溶液澄清。

以下实验用丹酚酸A冻干粉针均取实施例14制备方法所获得的样品，丹酚酸A单体化合物冻干粉针取实施例17制备方法所获得的样品。

实验例16：丹酚酸A冻干粉针对SD大鼠离体心脏再灌注损伤的保护作用

雄性SD大鼠，体重(280±20)g；由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK(京)2007-0006。腹腔麻醉后迅速开胸，轻轻提起心脏，剪断上下腔静脉、肺动脉、主动脉及心脏周围的组织，迅速将心脏连同一段主动脉取出，主动脉根部保留约0.5～1em的长度，备心脏插管用。立即移至预先备好的含氧K-H液(4℃左右)中，轻轻挤压心脏使心室内的剩余血液排出，清洗心脏残留血液，悬挂于Langendorff灌流装置上，将心脏主动脉升支接于灌流的套管上，并以棉线结扎固定。立即以含氧K-H液、恒温(37±0.5)℃进行灌流；灌注压70mm汞柱，流速(11.5±0.5)ml/min。K-H液成分(g/L)：NaCl：6.9025；KCl：0.3517；CaCl₂：0.2837；无水MgSO₄：0.1424；KH₂PO₄：0.1611；NaHCO₃：2.0916；Glu：2.0837；调pH值7.4。在左心房侧壁剪一小口，将小乳胶水囊通过房室口插入左心室。乳胶水囊和相连的导管内充满超纯水，导管的另一端通过三通管接压力换能器，彻底清除内部的大小气泡。通过微调注水器调节心室内水囊的水量使心室舒张末压维持在4-6mmHg范围。左室内压稳定30min后再进行试验。用量筒记录每一分钟心脏的冠脉流量；压力换能器信号通过桥式放大器输入多道记录系统，进行实时信号采集和处理。

实验分7组：正常对照组：以含氧K-H液持续灌流120min；模型组：以含氧K-H液灌流15min后，停灌25min，再恢复含氧K-H液灌流60min；丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组(1.0、0.5、0.25mg/L)，阳性药物组(盐酸地尔硫卓0.3mg/L)，丹酚酸A冻干粉针单体化合物组(0.5mg/L)：在恢复灌流时用不同浓度的含药灌注液灌流，并持续整个再灌注过程。

各组记录停灌前以及再灌后从第10min开始，每隔10min的冠脉流量(CBF)、左心室舒张压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(+dp/dt_max)和左室内压最大下降速率(-dp/dt_max)，n＝8。

表30.丹酚酸A冻干粉针对大鼠离体心脏再灌注60min血流动力学的影响

(n＝8)

注：与正常对照组比较：#P＜0.01，##P＜0.001；与模型组比较：△P＜0.05，*P＜0.01，**P＜0.001

与正常对照组比较，模型组缺血再灌注60min，CBF、+dp/dt_max、-dp/dt_max明显下降(P＜0.01或P＜0.001)，LVEDP显著增高(P＜0.001)。与模型组比较，阳性药物组、丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组、丹酚酸A单体化合物组上述指标均有明显改善，能抑制缺血再灌注引起的冠脉流量减少、左室舒张压上升、左室内压最大上升速率下降、左室内压最大下降速率下降。且丹酚酸A冻干粉针组高剂量组与阳性药物组效果相当，且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物组。丹酚酸A冻干粉针不同剂量组之间存在剂量依赖性。实验结果显示丹酚酸A冻干粉针能减轻大鼠离体心脏缺血再灌注损伤程度，提示丹酚酸A冻干粉针能明显改善冠脉血流量、改善离体心脏主动脉舒张功能和受损心肌的舒缩功能、保护心脏缺血再灌注损伤。

实验例17：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血大鼠心电及心功能的影响

雄性SD大鼠，(250±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK(京)2007-0006。动物随机分为模型组、阳性药物组(注射用盐酸地尔硫卓1.5mg/kg)、丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组(2.5、5.0、10.0mg/kg)、丹酚酸A单体化合物组(5.0mg/kg)；同时设假手术组。

20％乌拉坦腹腔麻醉大鼠，固定。气管插管后接呼吸机，按10～12ml潮气量、80次/min的频率给予呼气，持续正压呼吸，吸∶呼比为1∶1。此时接心电图机测量大鼠正常心电图。沿胸骨左缘第3、4肋骨间开胸，挤出心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间找出冠状动脉左前降支，在左冠状动脉前降支起始部下2mm处以圆形无创缝合针6-0丝线穿线，迅速结扎左冠状动脉前降支(假手术组只穿线不结扎)，并用一带凹槽的小塑料管垫在结扎部位，两端线头在其上结扎，缝合胸壁，恢复自主呼吸。手术完毕即刻观测大鼠心电图，以左室前壁呈紫绀及II导联心电图显示S-T段弓背向上明显抬高并持续30min以上为造模成功。

各组动物于造模成功后尾静脉注射相应药物(假手术组和模型组注射等体积的生理盐水)，每天注射两次，连续7d。末次给药后30min，动物腹腔麻醉，经颈总动脉插管至左心室，由压力转换器连接多道智能生理信号采集分析系统，术后稳定30min，记录心率(HR)、动脉压、左心室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升速率(+dp/dt_max)和左室内压最大下降速率(-dp/dt_max)；同时插肢体电极监测标准II导联心电图。

表31.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血大鼠心电及心功能的影响(n＝10)

注：与假手术组比较：#P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

实验结果显示，与假手术组比较，结扎冠状动脉致大鼠长期心肌缺血模型大鼠心电图ST段显著提高(P＜0.01)，其HR、动脉压、LVSP、+dp/dt_max、-dp/dt_max均显著下降(P＜0.01)，模型组大鼠心肌收缩功能明显降低。与模型组比较，静脉给药7d后，各药物组大鼠ST段明显下降、各项心功能指标有不同程度改善(P＜0.05或P＜0.01)；且各项指标综合显示，各药物组中以丹酚酸A冻干粉针中、高剂量对长期心肌缺血大鼠的心电及心功能指标改善效果最为明显，丹酚酸A冻干粉针各剂量组间呈一定量效关系，提示丹酚酸A冻干粉针能降低心肌缺血大鼠ST段的升高、改善心率、增高其动脉压、改善心肌舒缩力，且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物，对心肌缺血大鼠的心电及心脏功能有明显的改善作用。

实验例18：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血大鼠血清中酶活及自由基代谢的影响

实验例17各组大鼠在心电及心功能指标测定结束后，腹主动脉取血，取血清，按检测试剂盒说明书操作，测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量以及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性。

表32.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血大鼠血清中酶活及自由基代谢影响

(n＝10)

注：与假手术组比较：#P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

心肌缺血时产生大量的氧自由基，对心肌造成损伤，SOD、MDA是反映氧自由基损伤的客观指标；广泛存在于心肌细胞中的心肌酶AST、LDH、CK的活性能反映出心肌缺血的损伤程度。与假手术组比较，心肌缺血模型组大鼠血清中SOD明显降低，MDA、AST、LDH、CK显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，经各药物治疗后，给药组大鼠血清中SOD有不同程度的升高，而MDA、AST、LDH、CK均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)；且以丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组及阳性药物组药效尤为显著。实验结果提示，丹酚酸A冻干粉针能使心肌缺血大鼠血清中SOD活性增高，抑制MDA的生成，降低血清内AST、CK和LDH活性，说明丹酚酸A冻干粉针能抑制氧自由基产生，提高心肌组织的抗氧化能力，保护心肌细胞膜，减少酶的溢出，改善心肌的能量供应，降低缺血对心肌的损伤程度，从而起到心肌缺血保护作用。

实验例19：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血大鼠心肌梗死范围的影响

取实验例18采血结束后的大鼠，立即取心脏，生理盐水清洗，剪去右心房，分离出左心室，吸去多余水分后称左心室湿重。在结扎线以下，平行房室沟方向将其切成相等厚度的5片，放入1％TTC染液中，37℃恒温染色10min，未梗塞区被染成红色，梗塞区不被染色呈灰白色，梗塞区称重，计算梗塞区重占左心室重的百分比，即心肌梗塞范围。

表33.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血大鼠心肌梗死范围的影响(n＝10)

注：与假手术组比较：#P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01

心肌缺血模型组大鼠出现明显的心肌缺血梗死，梗死范围达53％左右；与模型组相比，不同剂量丹酚酸A冻干粉针注射给药7d后，大鼠的心肌梗死范围显著降低(P＜0.01)，并呈现一定的量效关系。同剂量丹酚酸A冻干粉针较丹酚酸A单体化合物组大鼠心肌梗死范围更小。提示丹酚酸A冻干粉针能缩小心肌梗死范围，减轻心肌缺血损伤及心梗程度，对心肌缺血具有明显治疗作用。

实验例20：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血大鼠心肌病理组织学和超微结构的影响

动物造模及分组给药同实验例17。给药结束后第二天，动物处死，取心脏，生理盐水冲洗，切取左心室，各组随机取部分动物的左心室，于10％甲醛中，经固定、冲洗、脱水后，二甲苯浸透，石蜡包埋，切片，HE染色，封片。光镜下观察心肌显微结构。取随机剩余动物的左心室，于3％戊二醛溶液中固定，经各级脱水，用环氧丙烷浸透，环氧树脂Epon812包埋，65℃聚合，切片，电镜观察心肌细胞超微结构。

结果显示，光镜下观察假手术组动物心肌排列整齐，心脏横纹清晰，仅有极个别肌核轻度增生，心肌间质未见炎细胞浸润，无出血坏死。模型组与假手术组比较，心肌纤维明显肿胀、变性，排列紊乱，心肌横纹大部分消失，肌核明显增生，肌间隙纤维增生较多，大量炎细胞浸润，部分标本心肌组织坏死，肌糖原被溶解样，有明显灶状心肌梗死。不同剂量丹酚酸A冻干粉针组、阳性药物(注射用盐酸地尔硫卓)组以及丹酚酸A单体化合物组与模型组比较，病变均明显减轻，心肌纤维轻度肿胀，排列尚有序，横纹较清晰，肌核轻度增生，心肌间质无出血，有少量不等的炎性细胞浸润，丹酚酸A冻干粉针低剂量组及丹酚酸A单体化合物组仅个别动物心肌呈轻度变性；各治疗组之间对比观察，丹酚酸A冻干粉针高、中剂量及阳性药物组心肌肿胀及炎性浸润最轻，对缺血心肌组织有更明显保护作用。

透射电镜下观察可见假手术组动物心肌细胞Z线规则，各肌节清晰，肌丝分布均匀、排列紧密整齐，三联体明显，线粒体结构完整，嵴多、清晰且排列有序。模型组与假手术组比较，肌原纤维排列紊乱，并可见坏死肌纤维，线粒体明显增大，空泡变性，嵴稀少或排列混乱，且不清晰，肌节缩短、结构紊乱，肌丝断裂、坏死或溶解；细胞核膜结构不连续，病理改变十分明显。丹酚酸A冻干粉针低剂量组及丹酚酸A单体化合物组线粒体结构基本完整，部分线粒体空泡变性，肌丝排列尚整齐，部分嵴模糊不清，超微结构的改变明显轻于模型组；丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组、阳性药物组心肌细胞Z线基本规则，线粒体结构基本完整、极少部分线粒体肿胀，嵴基本清晰，肌丝排列基本整齐，细胞核结构完整，超微结构显示病变明显改善。

光镜和电镜结果提示，丹酚酸A冻干粉针能明显改善心肌缺血大鼠的心肌病理改变，减轻心肌病理损伤，可用于缺血性心脏病的治疗。且作用效果比同剂量的丹酚酸A单体化合物更明显。

实验例21：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血-再灌注损伤SD大鼠心肌梗死范围的影响

雄性SD大鼠，(280±20)g，随机分为7组：假手术组、模型组、注射用盐酸地尔硫卓组(1.5mg/kg)、丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组(10.0、5.0、2.5mg/kg)、丹酚酸A单体化合物组(5.0mg/kg)。

20％乌拉坦腹腔麻醉大鼠，固定。气管插管后接呼吸机，按10～12ml潮气量、80次/min的频率给予呼气，持续正压呼吸，吸∶呼比为1∶1。此时接心电图机测量大鼠正常心电图。沿胸骨左缘第3、4肋骨间开胸，挤出心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间找出冠状动脉左前降支，在左冠状动脉前降支起始部下2mm处以圆形无创缝合针6-0丝线穿线，迅速结扎左冠状动脉前降支(假手术组只穿线不结扎)，并用一带凹槽的小塑料管垫在结扎部位，两端线头在其上结扎，记录心电图。以左室前壁呈紫绀及II导联心电图显示S-T段弓背向上明显抬高并持续20min以上为造模成功；心肌缺血90分钟后，松开线，拔去管垫，实现再灌注。关胸，缝合，恢复自主呼吸。在结扎即刻尾静脉注射给药(假手术组和模型组给予等容积的生理盐水)，此后每隔2h给药一次，共给药4次；分批于再灌6h、24h、48h后麻醉动物(再灌24、48h组动物在手术当天4次给药结束后第二天始仍每天注射给药两次，直至取材)，固定，剖胸取心脏，分离左心室，吸去多余水分后称左心室湿重。在结扎线以下，横切成相等厚度的5片，放入1％TTC染液中，37℃恒温染色10min，未梗塞区被染成红色，梗塞区不被染色呈灰白色，梗塞区称重，计算梗塞区重占左心室重的百分比，即心肌梗塞范围。

表34.丹酚酸A冻干粉针对大鼠心肌缺血-再灌不同时间心肌梗死范围的影响

(n＝6)

注：与假手术组比较：#P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.0

模型组大鼠心肌缺血1.5h，再灌注6h后心肌梗死严重，且在恢复灌注48h内，梗死范围逐步增大，心肌损伤加剧。与模型组比较，不同剂量丹酚酸A冻干粉针能明显缩小心肌梗死范围(P＜0.01)，减轻心肌缺血再灌损伤，且心肌梗死范围并不随缺血再灌时间延长而扩大；各剂量组之间存在一定剂效关系，且优于同剂量丹酚酸A单体化合物。提示丹酚酸A冻干粉针能缩小实验性心肌缺血再灌注大鼠的心肌梗死范围，减轻心肌损伤程度，对心肌缺血-再灌注损伤具有较好的防治作用。

实验例22：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血-再灌注损伤SD大鼠自由基代谢的影响

造模及给药方法同实验例21。在恢复再灌注24h后，动物麻醉，取心脏，剪去心房，保留心室，冰生理盐水冲洗，吸干表面水分，称重，制成组织匀浆，离心(3000rpm，10min)，取上清液，依照试剂盒说明书操作，检测组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性。

表35.丹酚酸A冻干粉针对大鼠组织中自由基代谢相关酶活的影响(n＝10)

注：与假手术组比较：#P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

实验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠在心肌缺血-再灌注24h，心肌组织SOD、GSH-Px、CAT酶活显著下降，MDA、XOD酶活显著升高(P＜0.01)，提示大鼠心肌缺血-再灌注后，过氧化产物堆积严重，心肌清除过氧化产物能力显著下降，缺血再灌引起大量氧自由基产生导致心肌损伤加重。各药物组与模型组比较，心肌组织SOD、GSH-Px、CAT酶活不同程度升高，MDA、XOD酶活不同程度降低(P＜0.05或P＜0.01)，丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组效果最明显。提示丹酚酸A能增强心肌清除自由基能力，抑制氧自由基产生，增强大鼠心肌抗氧化能力，抑制心肌缺血-再灌注损伤。

实验例23：丹酚酸A冻干粉针对犬心肌缺血-再灌注损伤心肌缺血程度的影响

健康犬，(17.5±2.5)kg，随即分为6组：分别为模型组、注射用盐酸地尔硫卓组(0.5mg/kg)、丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量组(6、3、1.5mg/kg)、丹酚酸A单体化合物组(3mg/kg)。戊巴比妥钠30mg/kg静脉注射麻醉，固定，气管插管接呼吸机，分离左侧颈总动脉，插管经压力换能器与多道生理记录仪相连记录血压，分离右侧颈外静脉，沿左侧第4肋间开胸，做心包床。分离主动脉弓，放置电磁流量计探头，测量心输出量。开胸后插管至右心室，记录中心静脉压。分离冠状动脉左前降支中段，引线备结扎用，缝置16导联心外膜电极连接心电放大器，记录心外膜心电图。心尖插管，连接压力换能器，测量心室内压。记录各项指标稳定后，采用两步结扎法结扎冠脉左前降支。首次结扎前2min，给予2.5mg/kg利多卡因预防心律失常。于完全结扎后稳定15min，股静脉恒速推注给药，给药体积1ml/kg，10min注射完毕。模型组和假手术组给予等容量的生理盐水。缺血3h后，解开线栓，实现再灌注。分别在结扎前，结扎15min(即给药前)，30，60，120，180min、再灌30min、再灌60min记录心外膜心电图ST段的变化，血氧。以各时刻各标测点的ST段升高离的总mV数(∑-ST)表示心肌缺血程。

表36.丹酚酸A冻干粉针对犬心肌缺血-再灌注损伤心肌缺血程度(∑-ST)的影响

(mV，n＝6)

注：与假手术组比较：#P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

实验结果显示，结扎犬冠状动脉后5min开始，各组犬心外膜电图ST段抬高总数(∑-ST)明显升高；模型组犬至结扎后15min已升高到一个相对稳定的水平，且在实现再灌注后，虽然∑-ST较缺血期间下降，但与假手术组比较仍极显著增高(P＜0.001)，提示犬心肌依然处于缺血状态。各药物组在结扎前及结扎后的15min内(即给药前)，备组∑-ST与模型组比较没有差异性(P＞0.05)；而在结扎后30min始(即给药后15min)，各药物组∑-ST开始下降，缺血程度减轻，但除丹酚酸A冻干粉针高剂量组与模型组比较有明显差异外(P＜0.05)，其它药物组下降没有统计学意义；但至结扎后60min到结扎后180min期间(即给药后45min到药后165min期间)，各药物组∑-ST仍持续下降，且与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)；恢复再灌注后，各药物组∑-ST与模型组比较亦显著降低。丹酚酸A冻干粉针各剂量组之间存在一定量效关系，丹酚酸A冻干粉针中剂量组∑-ST下降幅度与0.5mg/kg注射用盐酸地尔硫卓组相当，且有稍有的趋势。丹酚酸A冻干粉针比同剂量丹酚酸A单体化合物组的∑-ST下降更明显。提示丹酚酸A冻干粉针能减轻实验缺血-再灌注犬的心肌缺血程度，且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物。提示其能保护心肌缺血损伤，对缺血性心脏病具有良好的治疗作用。

实验例24：丹酚酸A冻干粉针对犬心肌缺血-再灌注损伤心肌缺血范围的影响

造模、分组给药同实验例23所述。记录各组动物各时间段的心外膜心电图ST段的变化，以各时刻ST段升高≥2mV的标测点总数(N-ST)表示心肌缺血范围。

表37.丹酚酸A冻干粉针对犬心肌缺血-再灌注损伤心肌缺血范围(N-ST)的影响

(n＝6)

注：与假手术组比较：#P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

实验结果显示，结扎犬冠状动脉后，各组犬心外膜电图N-ST明显增加；模型组犬至结扎后15min，N-ST已增高到一个相对稳定的水平，缺血范围基本稳定，且在实现再灌注后，虽然N-ST较结扎期间减少，但仍极显著高于假手术组(P＜0.001)。各药物组在结扎前及结扎后的15min内(即给药前)，各组N-ST与模型组比较没有差异性；而在结扎后30min始(即给药后15min)，各药物组N-ST开始有减少的趋势，但除丹酚酸A冻干粉针高剂量组减少率与模型组比较有明显差异外(P＜0.05)，其它药物组并无统计学差异；但至结扎后60min到结扎后180min期间(即给药后45min到药后165min期间)，各药物组N-ST仍持续降低，且与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)；恢复再灌注后，各药物组N-ST与模型组比较亦显著降低。丹酚酸A冻干粉针各剂量组之间存在一定量效关系，丹酚酸A冻干粉针中剂量组N-ST减少率与0.5mg/kg注射用盐酸地尔硫卓组相当，丹酚酸A冻干粉针比同剂量丹酚酸A单体化合物组的N-ST减少明显。提示丹酚酸A冻干粉针能减少实验缺血-再灌注犬的心肌缺血范围，且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物。提示其能保护心肌缺血损伤，对缺血性心脏病具有良好的治疗作用。

实验例25：丹酚酸A冻干粉针对犬心肌缺血-再灌注损伤心肌梗死范围的影响

造模、分组给药同实验例23所述。各组犬缺血180min，再灌注60min后，取心脏，生理盐水冲洗，称量全心重。剪去大血管和心房，称心室重，自心尖至结扎点平均切成五片，0.5％硝基四氮唑蓝(N-TB)染液中染色，15min，梗死区不着色，非梗死区染成暗蓝色。分离梗死区及非梗死区并称重，以梗死心肌占全心重、梗死心肌占心室重的百分比计算梗死范围。

表38.丹酚酸A冻干粉针对犬心肌缺血-再灌注损伤心肌梗死范围的影响

(n＝6)

注：与假手术组比较：#P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

实验结果显示，模型组犬心肌缺血-再灌注后，心肌梗死较重。丹酚酸A冻干粉针、注射用盐酸地尔硫卓、丹酚酸A单体化合物均能显著减少实验犬心肌梗死范围，且以丹酚酸A冻干粉针高剂量组犬心肌梗死比值最小，丹酚酸A冻干粉针中剂量组心肌梗死范围小于同剂量丹酚酸A单体化合物组。与模型组比较，丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组能极显著减少梗死心肌占脏及心室的比重(P＜0.01)，丹酚酸A冻干粉针低剂量犬心肌梗死区占心脏及心室的比重亦明显降低(P＜0.05)，提示丹酚酸A冻干粉针能剂量依赖性地缩小实验犬心肌梗死范围，能保护心肌缺血-再灌注损伤，用于治疗缺血性心脏病。且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物。

实验例26：丹酚酸A冻干粉针对急性心肌缺血犬冠脉血流量的影响

造模、分组、给药时间及剂量同实验例23所述方法。动物开胸后，分离冠状动脉左旋支，放置电磁流量计探头，测定结扎前、结扎后缺血期240min内不同时间段心脏冠脉血流量(CBF)。实验结束后处死动物，以三分之一心脏重量作为左旋支引流区，计算每100g心肌的血流量：MBF＝(CBF/心脏重量)×100×3。

表39.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血-再灌注损伤犬冠脉血流量的影响

(n＝6)

注：给药后血流量增幅跟模型组增幅比较：*P＜0.05，**P＜0.01

实验结果显示，假手术组犬各时间段冠脉血流量没有明显变化；由模型组犬各时间段冠脉血流量与结扎前比较、以及各组犬给药前的冠脉流量与结扎前比较结果可知，结扎犬冠状动脉形成心肌缺血后，冠脉血流量有短时间代偿性增加，增加幅度在10％左右；丹酚酸A冻干粉针各剂量、注射用盐酸地尔硫卓、丹酚酸A单体化合物治疗组犬各给药后各时间段冠脉流量与给药前比较有不同程度的增加，各药物组在给药后15min(即结扎30min)，冠脉流量增幅在13％～24％之间，除丹酚酸A高剂量组增幅具有明显差异外，其他各药物组增加并不明显；而给药后45min至给药后225min(即结扎60min至240min)，各药物治疗组冠脉流量与给药前比较，增加了25.3％～52.6％之间；以丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组、注射用盐酸地尔硫卓组最为显著，增幅分别为52.6％、40.2％、36.7％。丹酚酸A冻干粉针中剂量组增幅高于同剂量丹酚酸A单体化合物组。提示丹酚酸A冻干粉针能促进侧枝循环开放，增加心肌缺血时的冠脉血流量，从而对抗心肌缺血，保护心肌缺血损伤，提示其在防治缺血性心脏病方面有一定的用途。

实验例27：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬心脏功能及血流动力学的影响

造模、分组给药按实验例23所述方法；主动脉根部放置电磁流量计探头，测量心输出量(CO)；心尖插管至左心室，连接压力换能器，测量左室压、左室内压最大收缩与舒张变化速率(±dp/dt_max)；记录心电图(ECG)；冠脉结扎手术后稳定15min给药；多道生理仪记录、测量并计算犬缺血240min内不同时间各主要指标的变化：CO、左室舒张末压(LVEDP)、±dp/dt_max、左室做功(LVW)、总外周阻力(TPR)。

表40.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬CO的影响(L/min，n＝6)

注：与自身缺血前比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

表41.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬LVEDP的影响(mmHg，n＝6)

注：与自身缺血前比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

表42.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬+dp/dt_max的影响(mmHg/s，n＝6)

注：与自身缺血前比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

表43.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬-dp/dt_max的影响(mmHg/s，n＝6)

注：与自身缺血前比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

表44.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬左室做功(LVW)的影响(n＝6)

注：与自身缺血前比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

表45.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬总外周阻力(TPR)的影响(n＝6)

注：与自身缺血前比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

实验结果显示，结扎冠脉缺血30min后，犬心输出显(CO)与缺血前比较显著下降、LVEDP显著升高、±dp/dt_max显著下降、左室做功(LVW)减少、总外周阻力(TPR)显著增大(P＜0.05或P＜0.01)，说明犬冠脉结扎后，心肌功能受损明显，心肌收缩和舒张功能下降，心输出量不足，心脏泵血功能降低，血氧供给不足，心肌缺血缺氧受损致心功能下降。与模型组比较：高剂量丹酚酸A冻干粉针给药后15min(即缺血30min)能显著抑制LVEDP升高、抑制±dp/dt_max下降、抑制犬LVW减少、降低TPR，给药后45min(即缺血60min后)能显著抑制CO下降；中剂量丹酚酸A冻干粉针给药后15min(缺血30min后)能升高犬±dp/dt_max、使TPR下降，给药后45min(即缺血60min后)能显著抑制犬LVW减少、降低LVEDP，增加给药后105min(即缺血120min)犬CO，其作用效果与注射用盐酸地尔硫卓相当；丹酚酸A冻干粉针低剂量组给药后105min能明显抑制犬CO下降，给药后45min能降低犬TPR、升高±dp/dt_max及增加LVW，且在给药后105min后(即缺血120min)能明显降低犬LVEDP，且有优于同剂量丹酚酸A单体化合物的趋势。结果提示丹酚酸A冻干粉针给药后，能改善心肌缺血犬血流动力学指标，增强实验犬的心肌收缩力、改善心肌舒缩功能，降低外周阻力，抑制心输出量减少、提高心脏的泵血功能，改善心肌血液供应，改善心肌缺血状态及心功能，发挥抗心肌缺血作用。

实验例28：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬心肌酶的影响

造模、分组给药同实验例23所述方法。冠脉结扎术后稳定15min后给药，分别在结扎后240min(即缺血后4h)从股静脉取血，检测血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)。

表46.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬心肌酶的影响(U/L，n＝6)

注：与模型组比较，*P＜0.01，**P＜0.00

血清中CK、LDH、AST、CK-MB为临床上常用的作为缺氧缺血性心肌损害的相关检测心肌酶学指标，可反映心肌损伤程度。其中CK-MB为心肌特异性酶，在心肌损伤中最敏感。实验结果显示，与假手术组比较，心肌缺血模型组犬血清中CK、LDH、AST、CK-MB显著升高，说明结扎冠脉缺血后，犬心肌线粒体破坏，心肌细胞损伤，心肌酶被释放出来致血清中心肌酶活升高。丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组比较，能不同程度地降低犬心肌缺血4h后血清中CK、LDH、AST、CK-MB活性(P＜0.01或P＜0.001)，且呈剂量依赖性；中剂量丹酚酸A冻干粉针组比同剂量丹酚酸A单体化合物组效果更显著。实验结果提示丹酚酸A冻干粉针能能稳定心肌细胞膜，减少心肌缺血损伤时心肌酶的溢出，对缺血心肌具有明显保护作用。

实验例29：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬脂肪酸代谢和氧自由基代谢的影响

造模、分组给药同实验例23所述方法。冠脉结扎术后稳定15min后给药，分别在结扎后240min(即缺血后4h)从股静脉取血，检测血清中游离脂肪酸(FFA)、过氧化脂质(LPO)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。

表47.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬脂肪酸代谢和氧自由基代谢的影响

(n＝6)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

心肌缺血时会引起一系列心肌代谢出现不同程度的紊乱，从而导致心功能不全。心肌缺血损伤最主要原因是由于心肌缺血后造成能量供给障碍而使心肌损伤甚至坏死。游离脂肪酸是正常心脏供能的主要底物。而心肌在缺血情况下，由于脂肪酸氧化供能比葡萄糖代谢供能要消耗更多的氧，心肌缺血期游离脂肪酸水平以及氧化率升高会抑制葡萄糖的氧化，增加细胞中乳酸的聚集，因此会使心脏做功的效率降低，对心肌产生不利的影响。实验结果显示，与假手术组比较，模型组犬在缺血4h后，血清中游离脂肪酸(FFA)、过氧化脂质(LPO)显著升高(P＜0.01)，提示心肌缺血后心肌脂肪酸代谢出现障碍，将会抑制葡萄糖氧化主要酶的活性，从而增加心肌耗氧量，扩大心肌梗塞范围。而丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组比较，能显著降低心肌缺血犬血清中FFA、LPO含量(P＜0.05或P＜0.01)，且呈剂量依赖关系。提示丹酚酸A冻干粉针能显著抑制血清中FFA水平升高，改善心肌脂肪酸代谢，降低乳酸的堆积，增加单位氧耗的产能量，降低心肌耗氧量，从而改善心功能，抑制心肌梗塞范围，保护心肌缺血损伤。

与假手术组比较，模型组犬心肌缺血4h后血清中MDA含量显著升高，SOD、GSH-Px活性显著下降(P＜0.01)，提示犬心肌缺血后，氧自由基生成明显增加，体内清除氧自由基的酶活显著降低，而氧自由基会通过一系列氧化反应影响细胞的正常结构和功能，加剧心肌缺血损伤程度。丹酚酸A冻干粉针各剂量组与模型组比较，能显著降低心肌缺血犬血清中MDA的含量，同时使血清中SOD、GSH-Px活性明显增强(P＜0.05或P＜0.01)，且呈一定的剂效关系；提示丹酚酸A冻干粉针能通过某种机制抑制脂质过氧化过程，减少氧自由基生成，同时又能提高内源性抗氧化酶活性而减轻氧自由基对心肌的损伤，提高缺血心肌的抗氧化能力而发挥抗心肌缺血作用。且效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物。

实验例30：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬心肌耗氧量的影响

制备犬心肌缺血模型：造模、分组、给药剂量及时间同实验例23所述方法。经颈外静脉插管至冠状静脉窦，于颈动脉插管，用血氧测定仪分别在结扎冠脉前及缺血后15、30、60、120、240min测定各动物的冠状静脉、动脉的血氧含量，计算心肌耗氧量和氧利用率。心肌耗氧量＝(颈动脉血氧量-冠状静脉窦血氧量)×CBF；心肌氧利用率＝(颈动脉血氧量-冠状静脉窦血氧量)/颈动脉血氧量×100％。

表48.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬心肌耗氧量的影响(ml/min)(n＝6)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

表49.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬心肌氧利用率的影响(％)(n＝6)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

氧代谢失调，供氧与需氧的不平衡是心肌缺血的主要原因。实验结果显示，模型组犬在结扎冠脉致心肌缺血后，心肌耗氧量及氧利用率与缺血前比较并无显著变化，但结合本说明中前述有关心肌缺血左室做功的实验可知，心肌缺血后，左室做动减少，而心肌耗氧量及氧利用率并无变化，因此，单位做功的耗氧量增加，心脏做功效率显著降低。与模型组比较，不同剂量的丹酚酸A冻干粉针能不同程度地减少心肌耗氧量以及氧利用率，其中丹酚酸A冻干粉针高、中剂量组缺血120min(即给药后105min)氧利用率较给药前分别降低了近20％、16％。结合本说明中有关丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬冠脉流量及心室做功等心功能指标的实验结果，提示丹酚酸A冻干粉针能降低心肌耗氧量及氧利用率，改善心肌氧的供需平衡，改善心室功能，发挥保护缺血心肌的作用，防治心肌缺血。

实验例31：丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬血液流变学的影响

制备犬心肌缺血模型：造模、分组、给药剂量及时间同实验例23所述方法。分别在缺血240min后抽血，进行全血粘度、血浆粘度、血浆纤维蛋白原含量、红细胞压积、血小板粘附率等血液流变学指标的测定。

表50.丹酚酸A冻干粉针对心肌缺血犬全血粘度、血浆粘度的影响(n＝6)

注：与模型组比较，*P＜0.05

与假手术组比较，结扎冠脉致心肌缺血犬的全血粘度、血浆粘度明显升高，血浆纤维蛋白原含量明显上升，红细胞压积及血小板粘附率明显增加(P＜0.05)；与模型组比较，实验中不同剂量丹酚酸A冻干粉针能使心肌缺血犬血液粘度、血浆粘度、红细胞压积及血小板粘附率不同程度地降低，明显降低血浆中纤维蛋自含量；各剂量组之间呈一定剂效趋势；提示丹酚酸A冻干粉针能降低血粘度，抑制血小板粘附聚集，预防血管内血栓形成，改善心肌缺血犬血液流变学，改善微循环，能用于防治缺血性心脏病。

实验例32：丹酚酸A冻干粉针对大鼠体内血栓形成的影响

SD大鼠，(280±20)g，随机分6组：生理盐水组对照组、丹酚酸A冻干粉针高、中、低剂量(20、10、5mg/kg)组，阿司匹林组(10mg/kg)、丹酚酸A单体化合物组(10mg/kg)。各组每天尾静脉注射给药1次(对照组给予等容积生理盐水)，连续7d，末次给药后1h，戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定，手术分离出右颈总动脉及左颈外静脉，用三段聚乙烯管连接。在聚乙烯管中段放入一根长5cm已称重手术丝线。以肝素生理盐水溶液(5u/mL)充满聚乙烯管。管的一端插入左颈外静脉，另一端与右颈总动脉相连。打开动脉夹，血液由右颈动脉流经聚乙烯管返回左颈静脉。开放血流15min后中断血流，迅速取出丝线，滤纸吸去浮在表面的血液，称重，总重减线重即得血栓湿重；然后置60℃烘箱内恒温干燥至恒重，冷却后称重，即为血栓干重。

表51.丹酚酸A冻干粉针对大鼠体内血栓形成的影响(n＝6)

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

与生理盐水组比较，60、30、15mg/kg丹酚酸A冻干粉针能显著减轻大鼠血栓湿、干重(P＜0.0)5或P＜0.01)，对血栓形成具有明显的抑制作用；各剂量组之间呈一定的量效关系，且抑制效果优于同剂量丹酚酸A单体化合物。提示丹酚酸A冻干粉针具有抑制大鼠体内血栓形成的作用，提示其可用于防治血栓所致的缺血性心脏病。

Claims (21)

1.丹酚酸A冻干粉针的制备方法，所述丹酚酸A冻干粉针用于制备预防和治疗缺血性心脏病药物，所述丹酚酸A冻干粉针包括含丹酚酸A主份原料，填充剂和抗氧剂；其中所述冻干粉针的各成份按下列重量配比制成：含丹酚酸A主份原料10g～80g，填充剂10g～80g，抗氧剂为制成总量的0.01％～0.2％，其中所述填充剂为甘露醇、葡萄糖、乳糖中的任意一种或几种，所述抗氧剂选自维生素C、硫脲、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠中的任意一种或几种，其中所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量大于93％，小于100％，还包括4个其他成分：紫草酸0.1％～2％，迷迭香酸0.1％～2％，丹酚酸B0.1％～2％，丹酚酸C0.1％～2％，

所述丹酚酸A冻干粉针采用如下制备方法获得：

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径1mm～5mm颗粒，每次加3～15倍量、45～95℃水温浸提取，同时以10～50转/分速度搅拌，或加3～15倍量水煎煮提取，共提取1～3次，每次提取1～4小时；提取液减压浓缩至相对密度在60℃测定为1.0～1.25，加入乙醇使含醇量在50％～85％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；或者

取丹参药材，切成饮片或粉碎成直径1mm～5mm颗粒，每次加3～15倍量30％～60％乙醇回流提取，每次提取1～4小时，共提取1～3次；减压回收乙醇并浓缩至无醇味，得丹参提取液；

上述丹参提取液加水稀释至每1ml含丹酚酸B1～30mg，水溶液用碱调pH至3.5～6.5，加入与丹酚酸B摩尔百分比0.1～3％氯化锌作为催化剂，在100～140℃温度加热转化1～6小时；

转化液调pH值至2.5～4.5，静置、离心，上清液减压浓缩至每1ml含丹酚酸A1～10mg，经HPD-100大孔树脂柱层析分离，丹酚酸A上样量与大孔吸附树脂比为1∶35～1∶70，树脂柱径高比为1∶4～1∶30，分别用1～8倍柱体积水、1～10倍柱体积10％～40％乙醇洗脱，除去杂质，再用2～10倍柱体积20％～60％乙醇洗脱，HPLC检测，收集含有丹酚酸A的20％～60％乙醇洗脱部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味；

水溶液浓缩至每1ml含1-10mg丹酚酸A的溶液，通过聚酰胺层析柱分离，丹酚酸A上样量与聚酰胺比为1∶5～1∶25，树脂柱径高比为1∶4～1∶25，分别用1～10倍柱体积水、5～20倍柱体积20％～60％乙醇溶液洗脱除杂，再用4～15倍柱体积40％～90％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的40％～90％乙醇溶液部分，减压回收乙醇并浓缩至无醇味水溶液；

水溶液浓缩，调酸pH至2.0～4.0，用水溶液1-8倍量的叔丁基甲基醚，分2～6次萃取，分离有机层，减压回收叔丁基甲基醚，制成每1ml含丹酚酸A1g～10g的萃取液，加入1～3倍量硅胶，搅拌，挥干；

把搅拌样硅胶加到已装好的5～20倍量干硅胶柱上，硅胶柱径高比为1∶4～1∶25，以正戊烷-叔丁基甲基醚为洗脱剂，梯度洗脱，分别用体积比为4∶6的正戊烷-叔丁基甲基醚洗脱6～30倍柱体积，体积比为6∶4的正戊烷-叔丁基甲基醚洗脱6～30倍柱体积，减压回收洗脱剂，回收有机溶剂后的丹酚酸A加5～20倍量水溶解，微波真空干燥，得所述含丹酚酸A主份原料，

取含丹酚酸A主份原料10g～80g加注射用水1500～2800ml搅拌使溶解，用碱调pH值4.0～5.0，再加入所述填充剂使其溶解，再加入所述抗氧剂，搅拌使溶解混匀，再加入活性炭0.5～2g搅拌吸附，滤过除去活性炭，加注射用水灌装成瓶，送入冻干机再进行冷冻干燥，

其中所述冷冻干燥包括如下步骤：

A、冷冻：以20℃～30℃/h速度降温至-40℃～-45℃，保温冷冻10～16小时；

B、升华：抽真空至0.3mbar以下，在10～14小时内将冻结的丹酚酸A制剂温度上升到-23℃～-27℃，维持-23℃～-27℃真空干燥6～8小时；

C、干燥：继续升温，以0.5℃～1.0℃/min均匀升温至40℃～45℃，维持40℃～45℃干燥2～5小时后，将样品温度降至室温，加盖，即得丹酚酸A冻干粉针。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述填充剂用量为20mg～40mg/2ml～3ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于微波真空干燥温度：20-100℃，回差温度1-5℃，真空度-0.07MPa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分钟。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于微波真空干燥温度：50-85℃，回差温度2-4℃，真空度-0.07MPa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分钟。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于微波真空干燥温度：55-80℃，回差温度2-3℃，真空度-0.07MPa以上，微波功率25-60KW，干燥120-140分钟。

6.根据权利要求1的制备方法，其中所述的用于预防和治疗缺血性心脏病的病症包括以下一种或几种：冠心病、心肌缺血性卒中、急性冠状动脉综合症、冠状动脉狭窄、心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化。

7.根据权利要求1或6的制备方法，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善缺血心脏血流动力学的用途。

8.根据权利要求7的制备方法，其中所述丹酚酸A冻干粉针用于改善缺血性心脏心功能的用途。

9.根据权利要求7的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于增加缺血性心脏的冠脉血流量的用途。

10.根据权利要求1或6的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于减少缺血性心脏心肌梗死范围的用途。

11.根据权利要求10的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于缩小心肌缺血范围的用途。

12.根据权利要求10的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于减轻心肌缺血程度的用途。

13.根据权利要求10的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于保护心肌细胞膜结构调节心肌酶活性的用途。

14.根据权利要求10的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于抑制缺血心肌组织炎症反应的用途。

15.根据权利要求10的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于保护心肌线粒体损伤的用途。

16.根据权利要求1或6的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于改善心肌代谢的用途。

17.根据权利要求16的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于改善心肌代谢的用途包括用于改善以下心肌代谢的一种或几种：心肌氧自由基代谢、脂肪酸代谢、能量代谢。

18.根据权利要求1或6的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于降低心肌耗氧量的用途。

19.根据权利要求1或6的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于改善血液流变学的用途。

20.根据权利要求1或6的制备方法，其中所述的丹酚酸A冻干粉针用于抑制血栓形成的用途。

21.根据权利要求6的制备方法，其中所述的用于预防和治疗缺血性心脏病的病症包括以下一种或几种：心绞痛、缺血性心肌病、心肌梗死。