CN100999470B - 一种丹参丹酚酸a及制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从中药丹参中提取丹参丹酚酸A的方法、质量控制方法及其药物组合物，以及利用本发明方法得到的丹参丹酚酸A及其制剂在制备预防心脑血管疾病、肝损伤、肝纤维化、肺纤维化等药物中的应用。利用本发明工艺得到的丹参丹酚酸A由于质量可控，药效作用明显，疗效显著，性能稳定，毒性小，安全可靠。

Description

一种丹参丹酚酸A及制剂

技术领域

本发明涉及一种新的从中药丹参中提取分离得用于治疗心脑血管疾病、肝损伤、肝纤维化、肺纤维化的丹参丹酚酸A、其制备方法、高效液相测定方法，以及含有丹参丹酚酸A的药物组合物，属于医药技术领域。 

技术背景 

丹参是最常用的药材之一，用于治疗心绞痛、高血压、冠心病和中风等心脑血管疾病。但一般用的都是从丹参中提取的粗提物或直接用丹参饮片。近二十多年，丹参的主要活性成分丹酚酸类化合物陆续被发现。体外实验结果显示，丹酚酸类化合物除了用于治疗心脑血管疾病，还可治疗多种疾病，如肝病、肾病、消化溃疡、肿瘤等。丹参总酚酸中以丹酚酸B含量最高，因此，人们开发的重点集中于丹酚酸B，而含量较低而活性较强的丹酚酸A(salvianolic acid A)被人们忽略。 

丹酚酸A结构如下： 

杜冠华(基础医学与临床，2000，20(5)：10-14)等人对丹酚酸A的活性进行了大量研究，发现丹酚酸A对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用，对小鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤有保护作用，对樟柳碱或东莨菪碱引起的小鼠记忆获得障碍具有明显的改善作用，对大鼠半乳糖性白内障形成或有抑制作用，因此在心脑血管方向有有良好的疗效。胡义扬(中药药理学报，1997，18(5)：478-480)等人报道了丹酚酸A对肝损伤和肝纤维化的保护作用。 

中国专利CN1513848A，2002年公开了采用水温浸、离心、超滤、调酸、有机溶剂萃取再经反相柱层析制备丹酚酸A的方法，使用反相硅胶纯化，对被纯化样品要求高，反相硅胶的成本太高，在工业大生产上有一定的局限性。中国专利CN1397276A，2003年公开了水或醇提、树脂层析，再经硅胶柱层析的纯化方法，由于丹酚酸A在药材中含量低，甚至没有，丹酚酸A产率低，实际上并不能从根本上解决丹酚酸A的工业生产问题。 

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种从中药丹参中获得丹参丹酚酸A的制备方法，丹参丹酚酸A的含量大于等于92％，小于100％，其中含有2个杂质。该制备方法中发明了将丹参中水溶性成份丹酚酸转化为丹参丹酚酸A的转化工艺，发明了获得高纯度丹参丹酚酸A的分离纯化工艺，本方法重复性良好，简便易行，适合工业化生产。本发明的第二个目的在于提供丹参丹酚酸A的全面系统质量控制方法，采用高效液相色谱法测定，客观精确定量丹参丹酚酸A的含量，并且控制其中杂质的含量，达到全面控制丹参丹酚酸A的质量。本发明的第三个目的在于提供丹参丹酚酸A作为药物活性成分的药物组合物，及其药用剂量。 

本发明丹参丹酚酸A的制备方法，其技术方案为： 

(1)丹参用水或乙醇提取得到水提取液或醇提取液。 

(2)将步骤(1)的提取液，调PH值至3.5～9.0，30～130℃温度，加热1～6小时。 

(3)加热后对提取液进行过滤，滤液经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离，用水洗脱后，用洗脱剂洗脱，收集含有丹参丹酚酸A部分。 

(4)将洗脱液用硅胶或葡聚糖凝胶LH-20或聚酰胺层析柱纯化，用洗脱剂洗脱，收集含有丹参丹酚酸A部分。 

(5)将洗脱液调PH值至2～5，经有机溶剂萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩干燥，得本发明丹参丹酚酸A。或将洗脱液，直接浓缩，冷冻干燥，得本发明丹参丹酚酸A。 

其中步骤(1)中，在水或乙醇水溶液作为提取溶剂时，温浸温度为50～99℃，重复提取二到三次，采用乙醇水溶液作为提取溶剂，此时乙醇浓度为10％～95％。提取的方法可以采用回流法、温浸法、渗漉法、超声提取法。 

其中步骤(2)中，对于(1)的醇提取液需要经过常压或减压浓缩至无醇味后，再进行加热转化  该步骤中，所述步骤[1]的提取液也可以用市场上购买的丹酚酸B或丹参酚酸或它们的混合物制成的水溶液作为原料。该步骤的目的是将丹参中其他酚酸类化合物转化为丹酚酸A，以此来提高丹酚酸A的产率。加热转化优选条件为两种：一种条件为调PH值至7.5～9.0，30～80℃温度，加热1～6小时；另一种条件为调PH值至3.5～6.0，110～130℃温度，表压0.05MPa～0.17MPa压强，加热1～6小时。另外也可采用微波加热方式。 

步骤(3)中，所述大孔树脂层析柱分离，先用水洗脱，除去杂质；再用10～30％稀乙醇洗脱，除去杂质；改用30～70％浓度的乙醇洗脱，收集含有丹酚酸A部分洗脱液，洗脱液浓缩至无有机溶剂。所用的大孔树脂可以为HPD-100、100A、300、400、400A、450或D101、1300-I、1400、AB-8。 

步骤(4)中，所述葡聚糖LH-20或聚酰胺柱纯化，先用水洗脱，除去杂质；再用20～50％稀乙醇洗脱，除去杂质；改用用50～95％浓度的乙醇洗脱，收集含有丹酚酸A部分洗脱液，洗脱液浓缩至无有机溶剂。所述硅胶柱层析纯化，采用氯仿-甲醇-甲酸(5∶1∶0.1)为洗脱溶剂，收集含有丹酚酸A部分，直接减压浓缩干燥或减压浓缩后冷冻干燥。 

步骤(3)及(4)中所述的分离纯化过程中，通过薄层层析或高效液相色谱检测方法，检测洗脱液中丹酚酸A的含量，收集含有丹酚酸A的洗脱液。薄层层析可以为硅胶薄膜层析，也可以为聚酰胺薄膜层析，可采用氯仿-甲醇-甲酸(5∶1∶0.1)展开体系。步骤(3)、(4)可以调换先后顺序。 

步骤(5)中优选PH值范围为3～5。有机溶剂可以用乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丙醇。 

本发明丹参丹酚酸A的高效液相测定方法包括如下： 

照高效液相色谱法(《中国药典》2005版一部附录V)测定。 

色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长286nm；理论板数按丹酚酸A计应不低于60000；以乙腈-0.2％醋酸水溶液`为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行90分钟。 

0-15分钟时，乙腈的比例由10％升至20％，0.2％醋酸水溶液的比例由90％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％醋酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％醋酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.2％醋酸水溶液的比例由50％降至20％；72-77分钟时，乙腈的比例80％，0.2％醋酸水溶液的比例20％；77-80分钟时，乙腈的比例由80％降至10％，0.2％醋酸水溶液的比例由20％升至90％；80-90分钟时，保持乙腈-0.2％醋酸水溶液以10∶90的比例进行洗脱。 

丹参丹酚酸A对照品溶液的配制：精密称取丹酚酸A对照品10mg到50ml容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度。 

供试品溶液的配制：精密称取样品10mg到50ml容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度。 

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录90分 钟的色谱图，即得。 

丹参丹酚酸A中丹酚酸A含量大于等于92％，小于100％，其中含有2个杂质。以丹参丹酚酸A为参照物，其保留时间为1，两个杂质的相对保留时间分别为0.71、1.36。以丹参丹酚酸A为对照，采用主成分自身对照法，相对保留时间为0.71的杂质，其含量为0.1～2％，相对保留时间为1.36的杂质，其含量为0.1～6％，总杂质含量小于8％。 

样品中丹参丹酚酸A含量采用按外标法以峰面积计算，样品中杂质含量以丹参丹酚酸A为参照物，采用主成分自身对照法计算。 

采用本发明的制备方法获得的丹参丹酚酸A十三批样品(具体方案见实施例)，经高效液相色谱检测方法测定，结果见下表1。 

表1、丹参丹酚酸A样品测定结果 

经过多批次的工艺验证结果统计可知，经过本发明方法所得到的丹参丹酚酸A，丹酚酸A含量大于等于92％，小于100％，其中含有2个杂质。以丹参丹酚酸A为参照物，其保留时间为1，两个杂质的相对保留时间分别为0.71、1.36。以丹参丹酚酸A为对照，采用主成分自身对照法，相对保留时间为0.71的杂质，其含量为0.1～2％，相对保留时间为1.36的杂质，其含量为0.1～6％，总杂质含量小于8％。 

本发明还提供含有丹参丹酚酸A的药物组合物，该组合物含有生理上有效量的丹参丹酚酸A和药学上可接受的辅料，该组合物可以是任何一种可供服用的药物制剂形式。 

本发明还包括用本发明的丹参丹酚酸A或其的药物组合物在制备治疗和/或预防心脑血管疾病、肝损伤、肝纤维化、肺纤维化药物中的应用。 

本发明所述的丹参丹酚酸A在用于用于上述任一用途时，其使用剂量范围为1～1000mg，优选剂量范围为5～500mg，进一步优选剂量为10～200mg。 

本发明的药物组合物可制成适合服用的制剂形式选自：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含液、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液注射剂、粉针剂。 

本发明的药物组合物制剂以传统方式服用，包括口服和注射以保持药物的活性。 

本发明的药物制剂在制成制剂时可以加入与生理上可接受的载体(辅料)。所述生理上可接受的载体选自以下物质：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、羟基乙酸、蛋氨酸、维生素C、依地酸二钠、依地酸钙钠、一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、葡甲胺、有机碱、氯化钠、氯化钾、乳糖、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、淀粉、蔗糖、甜菊糖、甘露糖醇、硅衍生物、羟丙纤维素、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、纤维素及衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠、表面活性剂、聚乙二醇6000、环湖精、β-环湖精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬质酸镁、滑石粉。 

本发明的制剂，如果是口服，含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、润湿剂、防腐剂、助溶剂。 

适当的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其他类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁、滑石粉。适宜的药物可接受的润湿剂包括十二烷基硫酸钠。 

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性成分分布在整个使用大量填充剂的制剂中。 

口服液体制剂的形式例如可以是水性性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酊剂，或者可以是一种在使用前可用水或其他适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇-油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油酯的油性酯、丙二醇或 乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨醇。 

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将丹参丹酚酸A溶解。溶液的制备通常是通过将药物溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶，密封。辅料主要包括抗氧剂、PH调节剂(无机碱、有机碱、氨基酸)。另外渗透压调节剂、金属螯合剂也可以包括在内。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。 

用基本相同的方式制备胃肠外悬浮液，除了是将活性化合物悬浮在载体而不是将其溶解，而且在将其悬浮在无菌载体之前，用环氧乙烷对其进行消毒。表面活性剂或润湿剂可包括在此制剂中，以利于提取物的均匀分布。 

本发明与现有技术相比，具有明显的优点： 

(1)丹参药材或丹参酚酸提取物中丹酚酸A的含量很低，丹参药材中丹酚酸A的含量低于万分子五。传统提取、分离纯化工艺难于获得大量的有效成份丹参丹酚酸A。本发明创新性地发明了将丹参中水溶性成份丹酚酸转化为丹参丹酚酸A的转化工艺，经转化后丹参中丹酚酸基本被转化成丹参丹酚酸A，使获得单一有效成份——高纯度丹参丹酚酸A成为可能。本方法重复性好，特异性好，转化率高，简便易行，适合工业化生产。 

(2)本发明采用非极性或弱极性大孔树脂分离，首先用水和低浓度乙醇溶剂洗脱除杂质。再采用适当浓度的溶剂洗脱丹参丹酚酸A，使丹参丹酚酸A与杂质达到有效分离，使丹参丹酚酸A含量得到提高，转移率较高。与传统丹参酚酸提取物大孔树脂分离纯化工艺比较，选择性特异性更高，转移率更好，节约了丹参药材，降低了生产成本。 

(3)本发明采用硅胶或葡聚糖凝胶或聚酰胺树脂纯化，首先用水和低浓度乙醇溶剂洗脱除杂质。再采用适当浓度的溶剂洗脱丹参丹酚酸A，使丹参丹酚酸A与杂质达到较好分离，丹参丹酚酸A含量得到进一步提高，转移率较高。本发明创新性地发明了获得单一有效成份丹参丹酚酸A含量在90％以上的纯化工艺。 

(4)为了减少浓缩过程中丹参丹酚酸A含量的下降，采用有机溶剂萃取进一步纯化，最终制得了高纯度的丹酚酸A，也可以采用冷冻干燥防止丹酚酸A含量降低。丹酚酸A含量达到92％以上，其中含有两个杂质。且质量稳定、工艺成熟、可规模化生产。 

(5)质量控制方法，与传统中药提取物质量控制方法比较，丹参丹酚酸A采用高效液相色谱法测定，客观准确定量丹参丹酚酸A的含量，并且全面定量其中杂质的含量，质量稳定均一，达到全面控制丹参丹酚酸A的质量。与传统有效成份质量控制方法比较，丹参丹酚酸A的质量控制方法不仅客观精确定量丹参丹酚酸A的含量，也全面定量控制其中杂质的含量， 能够全面系统控制丹参丹酚酸A的质量。 

(6)丹参丹酚酸A是丹参丹酚酸中药理活性最强的药物活性成份之一，经药效筛选，优选了丹参丹酚酸A的药用剂量，丹参丹酚酸A的有效剂量为1-1000mg，优选剂量为5-500mg，进一步优选剂量为10-200mg。 

下面通过丹参丹酚酸A(以下简称丹酚酸A)的实验例来进一步说明本发明的有益结果。 

实验例

实验例1：丹酚酸A对离体大鼠胸主动脉环的舒血管作用 

1.实验方法 

取体重为250-300g Wistar大鼠，雌雄兼用，麻醉处死，剪开胸腔，迅速取出胸主动脉条上段，置于4℃的Krebs-Henseleit(K-H)液中，去除血块和血管周围结缔组织。血管被均匀切成3mm-4mm长的血管环，迅速悬挂至离体灌流装置中，套入上下平行的两个不锈钢钩，经张力传感器，由Pclab-UE生物信号采集系统记录张力变化。整个血管环置于20ml恒温(37℃)通气(95％O₂+5％CO₂)的K-H液中，调节主动脉环张力至2g，实验中，每隔15min换一次新鲜的Krebs液，平衡2h后，加入KCl 40mmol/L收缩血管环2次，直到收缩稳定。 

收缩张力小于1g的血管被抛弃。 

再用KCl(40mmol/L)或去氧肾上腺素(phenylephrine，PE)(0.8μmol/L)预收缩血管环。 

以40mmol/LKCl预收缩血管环20min后，按照累计给药法每6min l次加入不同浓度的丹酚酸A(丹酚酸A终浓度分别为：0.16、0.31、0.62、1.25、2.50、5.00mg/ml)，观察其对收缩血管环的张力作用；对照组以K-H代替药物等容加入。以KCl40mmol/L诱发最大收缩幅度为基准，以加入不同浓度的药物后的血管舒张幅度与KCl诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管舒张程度(血管舒张百分率)，并作血管舒张反应的量-效曲线。计算不同浓度的药物致血管张力变化的百分率，并求出药物的半效有效浓度EC₅₀。 

以0.8μmol/L PE预收缩血管环20min后，按照累计给药法每6min l次加入不同浓度的丹酚酸A(丹酚酸A终浓度分别为：0.04、0.08、0.16、0.31、0.62、1.25mg/ml)、丹酚酸B(丹酚酸B的终浓度为0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00mg/ml)和注射用丹参多酚酸盐(终浓度为0.16、0.31、0.62、1.25、2.50、5.00mg/ml)，分别观察各药对收缩血管环的张力作用；对照组以K-H代替药物等容加入。以PE0.8μmol/L诱发最大收缩幅度为基准，以加入不同浓度的药物后的血管舒张幅度与PE诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管舒张程度(血管舒张百分率)，并作血管舒张反应的量-效曲线。计算不同浓度的药物致血管张力变化的百分率，并分别求出不同药物的半效有效浓度EC₅₀。 

2.试验结果 

2.1丹酚酸A对KCl预收缩血管环的影响 

试验结果表明，丹酚酸A在浓度为0.16～5.00mg/ml时呈剂量依赖性舒张40mmol/L KCl 预收缩的大鼠主动脉环，与模型对照组比较，有显著性差异(P＜0.05或P＜0.001)。丹酚酸A的半数有效浓度为1.59mg/ml。结果详见表2。 

表2丹酚酸A对KCl预收缩血管环的舒张作用( 

) 

与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 

2.2丹酚酸A、丹酚酸B和注射用丹参多酚酸盐对PF所致离体胸主动脉环收缩功能的影响 

试验结果表明，丹酚酸A、丹酚酸B和注射用丹参多酚酸盐均呈浓度依赖性舒张0.8μmol/L PE预收缩的大鼠主动脉环。丹酚酸A浓度在0.08～1.25mg/ml、丹酚酸B浓度在0.62～10.00mg/ml、丹参多酚酸盐浓度0.31～5.00mg/ml时，各组与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05，0.01或0.001)。丹酚酸A显著性舒张大鼠胸主动脉环(P＜0.001)，半数有效浓度为0.26mg/ml；丹酚酸B半数有效浓度为2.85mg/ml；丹参多酚酸盐显著性舒张大鼠胸主动脉环(P＜0.001)，半数有效浓度为1.44mg/ml。 

且在同等浓度下，丹酚酸A的舒张作用明显强于注射用丹参多酚酸盐和丹酚酸B，结果详见表3。 

表3不同药物对PE预收缩血管环的舒张作用( ) 

与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 

与注射用丹参多酚酸盐组相比，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01，^▲▲▲P＜0.001 

与丹酚酸A相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001 

实验例2：丹酚酸A对麻醉大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 

1.试验方法 

取健康SD大鼠108只，体重240-260g，随机分为9组：空白对照组、假手术组、模型组、注射用丹参多酚酸盐对照组、盐酸地尔硫卓注射液对照组、注射用丹酚酸A剂量1组(16mg/kg)、注射用丹酚酸A剂量2组(8mg/kg)，注射用丹酚酸A剂量3组(4mg/kg)及注射用丹酚酸A剂量4组(2mg/kg)。置于相同环境预饲养2天，自由饮食。预饲养结束后，进行试验，动物称重，20％乌拉坦按0.6ml/100g腹腔注射，待麻醉满意后，仰卧固定于鼠板上，气管插管，接呼吸机，按10～12ml潮气量，70次/分的频率给予呼气，持续正压呼吸，吸∶呼比为1∶1。根据呼吸频率及深度调整呼吸参数。随后接心电图机，测正常心电图。剪去胸前手术区毛，碘酒消毒，剪开皮肤、皮下组织、胸前肌肉及筋膜3～4cm，用18#血管钳沿第三肋间钝性分离肋间肌3cm长，打开胸腔及心包膜，记录心电图，撑开3、4肋骨，用左手四指托住大鼠右侧胸腔，助手用眼科镊将胸腺向上推，在左心耳与肺动脉圆锥之间找到结扎标志血管左冠状静脉，在左心耳下方2mm处用无创小圆针带6-0丝线穿线，进针深度为1～1.5mm，宽2～3mm，穿线后记录心电图，经尾静脉给予相应药液，给药10min后记录心电图，并用一带凹槽的小塑料管垫在结扎部位，两端线头在其上结扎。结扎后即刻记录心电图，以左室前壁呈紫绀或II导联S-T段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5h以上为结扎成功标志(S-T段无改变者淘汰)。结扎后10min再次记录心电图，结扎30min后剪开结扎线，实现再灌注，并记录再灌注即刻心电图，清除胸腔内积血后逐层缝合胸壁，撤呼吸机，动物恢复自主呼吸，气管切口不做处理。再灌即刻、10min、20min、40min、1h、2h、3h分别记录心电图。再灌3小时，经腹主动脉取血，4000rpm离心10min取血清，采用全自动生化分析仪检测LDH、CK及CK-MB活性，并采用相应试剂盒检测血清SOD、MDA(以上指标具体检测步骤详见说明书)，解剖取心脏，冰生理盐水洗去残血，剪去心房及右心室，立即放入冰箱中冷冻。将心脏在冰箱中冷冻10min后，自心尖向心底平行房室沟方向将左室切成相等厚度的5片，放入1％TTC染液中，37℃染色10min，未坏死区为暗红色，坏死区呈灰白色。数码相机拍照。将坏死区和非坏死区分别称重，计算坏死区占左心室重量的百分比，即梗死范围。 

检测指标分别为，心肌梗死范围，LDH、CK及CK-MB活性，血清SOD活性、MDA含量。 

2.试验结果 

2.1丹酚酸A对结扎/再通大鼠左冠状动脉前降支所致心肌缺血/再灌注损伤心肌梗死范围(％)的影响 

试验结果表明，尾静脉给予注射用丹酚酸A后，各剂量组大鼠心肌梗死范围均有所减小，其中剂量1、2、3组与模型组间存在显著性差异(P＜0.001)，剂量4组有减小心肌梗死范围的趋势，且各剂量组之间存在良好的量效关系。与阳性药相比，注射用丹酚酸A抗心肌缺血作用较盐酸地尔硫卓注射液差，有优于注射用丹参多酚酸盐的趋势。结果详见表4。 

表4注射用丹酚酸A对结扎/再通大鼠左冠状动脉前降支所致心肌缺血/再灌注损伤心肌梗死范围(％)的影响( 

) 

与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 

与注射用丹参多酚酸盐组相比，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01，^▲▲▲P＜0.001 

与盐酸地尔硫卓注射液组相比，^△P＜0.05，^△△P＜0.01，^△△△P＜0.001 

2.2注射用丹酚酸A对结扎/再通大鼠左冠状动脉前降支所致大鼠心肌缺血/再灌注模型心肌酶的影响 

试验结果表明，与正常组和假手术组相比，模型组心肌酶各指标活性均有显著升高(P＜0.001)。注射用丹酚酸A剂量1、2、3可降低大鼠血清中LDH活性，与模型组有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，剂量4有降低血清中LDH的趋势，但无统计学差异(P＞0.05)；剂量1、2、3可明显降低血清中CK活性，与模型组相比有显著性差异(P＜0.05，P＜0.001)，剂量4有降低血清中CK的趋势；各剂量组均能显著降低血清中CK-MB活性，与模型组有显著性差异(P＜0.01，P＜0.001)；各剂量组间存在量效关系。盐酸地尔硫卓注射液对三个酶学指标均有较好的降低作用，疗效与注射用丹酚酸A相当，注射用丹参多酚酸盐有降低血清中LDH的趋势并能显著降低血清中CK及CK-MB活性(P＜0.05，P＜0.001)，但总体上效果不如注射用丹酚酸A。结果详见表5。 

表5注射用丹酚酸A对结扎/再通大鼠左冠状动脉前降支所致大鼠心肌缺血/再灌注模型心肌酶的影响( 

) 

与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 

与注射用丹参多酚酸盐组相比，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01，^▲▲▲P＜0.001 

与盐酸地尔硫卓注射液组相比，^△P＜0.05，^△△P＜0.01，^△△△P＜0.001 

2.3注射用丹酚酸A对结扎/再通大鼠左冠状动脉前降支所致大鼠心肌缺血/再灌注模型血清中SOD活性、MDA含量的影响 

试验结果表明，与正常组和假手术组相比，模型组MDA含量显著增加(P＜0.001)，SOD活性显著下降(P＜0.05)。注射用丹酚酸A各剂量组、注射用丹参多酚酸盐及盐酸地尔硫卓注射液均可显著降低模型大鼠血清中MDA含量(P＜0.05，P＜0.001)，并能减轻血清中SOD活性下降的程度，其中注射用丹酚酸A剂量组1、2及盐酸地尔硫卓注射液组与模型组具统计学差异(P＜0.05)。注射用丹酚酸A各组间存在良好的剂量-效应关系。从作用趋势上看，注射用丹酚酸A与盐酸地尔硫卓注射液效果相当，有优于注射用丹参多酚酸盐的趋势。结果详见表6。 

表6注射用丹酚酸A对结扎/再通大鼠左冠状动脉前降支所致大鼠心肌缺血/再灌注模型血清中SOD活性、MDA含量的影响 

与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 

与注射用丹参多酚酸盐组相比，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01，^▲▲▲P＜0.001 

与盐酸地尔硫卓注射液组相比，^△P＜0.05，^△△P＜0.01，^△△△P＜0.001 

本试验结论，结扎大鼠左冠状动脉前降支后，结扎部位以下心肌紫绀，心电图显示S-T段升高，并渐与QRS波融合，波形增宽、增高、心律失常，波幅随着时间延长可逐渐变小等，TTC染色可见结扎位置以下大面积缺血灶，心肌酶包括LDH、CK、CK-MB活性明显升高，SOD活性降低，MDA含量增加。尾静脉给予相应药物后，各给药组及阳性对照组大鼠均可不同程度抵抗心肌缺血再灌注损伤，表现为梗死范围减小、血清心肌酶活性降低、SOD活性降低得到改善及MDA含量减少。以盐酸地尔硫卓注射液效果最好，其次分别为注射用丹酚酸A剂量1、2、3，注射用丹参多酚酸盐及注射用丹酚酸A剂量4。供试药各剂量组间存在一定量效关系。与阳性药相比，从趋势上讲，注射用丹酚酸A抗心肌缺血作用与盐酸地尔硫卓注射液相近，总体上优于注射用丹参多酚酸盐。 

实验例3：丹酚酸A对大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤保护作用的研究 

1.试验方法 

动物随机分为7组，每组12只分别为：假手术组(葡萄糖注射液)、模型对照组(葡萄糖注射液)、注射用尼莫地平组(0.18mg/kg)、丹酚酸A(10mg/kg)低剂量组、丹酚酸A(20mg/kg)中剂量组、丹酚酸A(40mg/kg)高剂量、丹酚酸B(40mg/kg)对照组。 

各剂量组连续静脉注射给药3天，第4天药后20分钟用改良线栓法制成大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。大鼠麻醉后，将其仰卧固定。分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA与CCA，用动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与ICA分叉处作一切口，插入一端加热成光滑球形并涂了0.1％多聚赖氨酸的尼龙线(直径为0.25mm，距球端18mm处作标记，插入前沾肝素溶液)，插入深度为18mm，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处，尼龙线外留约1cm，缝合皮肤。2小时后轻轻提拉所留线头至略有阻力，实现大脑中动脉再灌注，造模完成。在缺血2h和再灌注1h内用电热毯维持大鼠的体温，体温维持在肛温36.5～37.5℃。假手术只结扎CCA与ECA。 

动物入选标准，按Longa五级评分法，取神经功能行为评分为1、2、3、4分的动物，(0分：无神经缺损症状；1分：对侧前肢不能完全伸直；2分：向对侧旋转；3分：向对侧倾倒；4分：不能自己行走或昏迷)。 

脑梗塞范围测定，模型大鼠再灌注24h，行为学评分后，断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在-20℃冰箱冷冻10min，在冰盘上冠状切成6片，迅速将脑片置于TTC染 液中，37℃避光温孵1h，取出后置于10％甲醛液中避光保存24h。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占全脑重量百分比作为脑梗塞范围。 

脑含水量测定：TTC染色称重后，将大脑置于120℃真空干燥器内烘干12h称干重。脑含水量＝(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100％。 

2.试验结果 

2.1丹酚酸A对大鼠造模后缺血2h再灌注24h神经功能行为学的影响 

试验结果表明，假手术组大鼠没有神经功能行为学症状，而模型组及各给药组大鼠则有不同程度的神经行为学表现。各给药组均较模型组轻。且丹酚酸A各组优于丹参酚酸B组，与阳性对照组尼莫地平相当。结果详见表7。 

表7各组大鼠造模后缺血2h再灌注24h神经功能行为学评分结果 

与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 

2.2丹酚酸A对缺血再灌大鼠脑梗死范围及脑水含量的影响 

试验结果表明，模型组大鼠脑肌梗死范围和脑水含量与假手术组比较均有非常显著性差异。丹酚酸A各剂量组、丹酚酸B组及尼莫地平组均能显著降低大鼠的脑肌梗死范围和脑水含量，与模型组比较有显著性差异。且丹酚酸A各组优于丹参酚酸B组，与阳性对照组尼莫地平相当。结果详见表8。 

表8丹酚酸A对大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤大鼠脑梗塞范围及脑水含量的影响( 

) 

与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 

结论：丹酚酸A对大鼠脑缺血再灌注损伤有显著保护作用，其作用效果与尼莫地平相当。 

实验例4：丹酚酸A对CCl₁致大鼠肝纤维化的影响 

1.试验方法 

选择雄性健康Wistar大鼠60只，体重180-200g，将大鼠均随机分正常组、模型组、秋水仙碱组(0.17mg/kg)、丹酚酸A(10mg/kg)低剂量组、丹酚酸A(30mg/kg)中剂量组、丹酚酸A(90mg/kg)高剂量组6组，除正常对照组外，其余各组大鼠首次于皮下注射CCl₁5ml/kg，以后每周2次背部皮下注射40％CCl4橄榄油3ml/kg，共6周。在试验期间除正常组外，第1~2周各组均给予20％猪油加0.5％胆固醇的玉米粉饲料，第3~6周饲以普通饲料。各给药组在造模开始时即同时灌胃给予相应剂量的药液，给药体积1ml/100g，给药时间共6周。各组用药周期完成后，乙醚麻醉下剖腹，经下腔门静脉采血，分别检测血清ALT、AST、Alb，并取一部分肝组织制成肝匀浆，用于检测羟脯氨酸(Hyp)含量。另取肝组织作HE染色用于组织病理学观察。 

2.试验结果 

2.1丹酚酸A对肝纤维化模型大鼠血清生化指标的影响 

试验结果表明，造模6周后，模型组大鼠血清ALT、AST均显著升高，Alb显著降低，与正常对照组比较有显著性差异。各给药组ALT、AST的升高程度均小于模型组，且丹酚酸A各剂量组与秋水仙碱组比较，降低程度高于秋水仙碱组。各给药组Alb与正常组比较均有所降低，但无显著性差异，其中丹酚酸A中、高剂量组的降低程度小于模型组，与模型组比较，有显著性差异。结果详见表9。 

表9丹酚酸A对肝纤维化模型大鼠血清生化指标的影响( 

) 

与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01 

2.2丹酚酸A对肝纤维化模型大鼠肝组织中Hyp的影响 

试验结果表明，造模6周后，模型组大鼠肝组织中Hyp显著升高，与正常对照组比较有 显著性差异。各给药组Hyp的升高程度均小于模型组，且丹酚酸A各剂量组与秋水仙碱组比较，降低程度高于秋水仙碱组。其中丹酚酸A各剂量组之间随着剂量的增加效果逐渐增强。结果详见表10。 

表10丹酚酸A对肝纤维化模型大鼠肝组织中Hyp的影响( 

) 

与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01 

2.3丹酚酸A对肝纤维化模型大鼠肝组织病理的影响 

各试验组病理检查结果如下，空白对照组：各只大鼠肝组织结构完整，无肝细胞脂肪变性、坏死，无炎细胞浸润及纤维组织增生。模型组：肝组织病理损害严重，肝细胞明显肿胀、变性，其中多为脂肪变性，部分呈气球样变，肝小叶周围明显坏死，部分形成假小叶。各给药组可见少量纤维组织增生，仅个别被分隔成假小叶，以肝细胞脂肪变性、坏死为主，各组大鼠纤维化程度与模型组比较均较轻。结果详见表11。 

表11丹酚酸A对肝纤维化模型大鼠肝组织病理的影响 

结论，丹酚酸A能显著降低肝损伤模型大鼠血清中ALT、AST含量，升高Alb含量，降低肝组织中Hyp含量，抑制CCl₄致大鼠肝病理的改变，表明丹酚酸A对CCl₄致大鼠肝损伤有一定的保护作用。 

实验例5：丹酚酸A对小鼠肺纤维化模型的影响 

1.试验方法 

动物：8-12周龄、雄性、昆明种小鼠，体重18-22g。试剂：注射用博莱霉素A5，天津 河北制药厂，醋酸泼尼松片：仙居制药有限公司生产，用时研成粉末，以蒸馏水溶解配成50％的混悬液。PBS液，自己配制。采用博莱霉素A5复制动物弥漫性肺间质纤维化模型。将小鼠用乙醚麻醉后仰卧于实验台上，固定头部及四肢，切开颈部皮肤，由气管一次性注入博莱霉素A5溶液0.05ml(含药0.1mg，5mg/kg)。注药完毕后缝合皮肤，将小鼠直立、旋转，尽量使药液在肺内均匀分布。手术过程严格无菌操作。空白对照组以同样方法注入等量生理盐水代替博莱霉素A5，动物清醒后随意进食。小鼠造模24小时后随机分为6组，分别为空白对照组、模型组、醋酸泼尼松组(6.5mg/kg)、丹酚酸A高(108mg/kg)、中(36mg/kg)、低(12mg/kg)剂量组、每组10只。每日下午16:00给药。空白对照组灌胃给予蒸馏水0.2ml/10g，每日一次；模型组造模后同空白对照组给予蒸馏水；阳性对照组，造模后灌胃给予醋酸泼尼松，6.5mg/kg、0.2ml/10g，每日一次；三个给药剂量组，造模后按0.2ml/10g灌胃给予各相应剂量的药液。以上各组，连续给药28天。 

2.指标检测与方法 

2.1肺指数 

于试验第28天末次给药后2小时，取各剂量组小鼠各6只，称体重后颈椎脱臼法处死动物，在解剖台上，以无菌操作取肺，电子天平称小鼠肺重，计算肺系数。肺系数＝肺重(mg)/体重(g) 

2.2肺组织形态学定量观察(HE染色) 

取肺称重后，自气管向左肺注射中性福尔马林液5ml，胸膜平展后结扎气管，将左肺浸于中性福尔马林液内固定48小时，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，常规切片4μm，HE染色，在图形分析系统下定量观察。 

2.2.1观察每高倍视野(HE×400)炎性细胞数(淋巴细胞、单核细胞、浆细胞数)，每张切片观察5个视野取平均值。 

2.2.2观察平均肺泡间隔宽度(μm)，在图像分析仪上分别测取每张切片肺泡壁宽度和肺泡腔宽度，每张切片观察5个视野取平均值。用平均肺泡壁宽度/平均肺泡腔宽度的比值来表示平均肺泡间隔宽度。 

3.试验结果 

3.1丹酚酸A对肺纤维化模型小鼠肺系数的影响 

试验结果表明，注射博莱霉素后一个月，模型组肺系数明显增加，经丹酚酸A各剂量组及醋酸泼尼松对照组治疗后均能明显减小肺系数，各治疗组与模型组比较，有显著性差异。丹酚酸A各剂量组随着剂量的增加，有效果逐渐增强的趋势，且在趋势上好于醋酸泼尼松组，结果详见表12。 

表12丹酚酸A对肺纤维化模型小鼠肺系数的影响( 

) 

与模型组比较**P＜0.01 

3.2丹酚酸A对肺纤维化肺组织形态学(HE染色)定量结果的影响 

试验结果表明，肺组织大体观察可见，空白对照组肺表面光滑，呈粉红色，且弹性较好；模型组呈暗红色，表面凸凹不平，且弹性较差。各给药组均较模型组轻。光镜下观察，空白对照组肺组织结构清晰，肺泡上皮细胞结构完整。模型组，肺泡间隔较宽，肺纤维细胞及基质增生，有较多的炎细胞浸润，且肺泡腔有囊状改变。各给药组可见肺泡结构基本正常，未见纤维化改变，有散在得炎细胞浸润。 

3.2.1丹酚酸A对小鼠肺间隔中炎细胞数的影响 

观察结果显示，空白对照组肺泡间隔未见单核细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润。模型组肺泡间隔有较多的单核细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润。丹酚酸A各剂量组及醋酸泼尼松对照组肺泡间隔单核细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润较轻，与模型组比较均显著小于模型组。丹酚酸A各剂量组有随着剂量的增加，有效果逐渐增强的趋势，且在趋势上好于醋酸泼尼松组，结果详见表13。 

表13丹酚酸A对肺纤维化小鼠肺间隔中炎细胞数的影响( 

) 

与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01 

3.2.2丹酚酸A对小鼠平均肺泡间隔宽度的影响 

观察结果显示，模型组小鼠平均肺泡间隔宽度明显大于空白对照组，其他各给药组的小鼠平均肺泡间隔宽度明显低于模型组。且丹酚酸A各剂量组有随着剂量的增加，有效果逐渐增强的趋势，且在趋势上好于醋酸泼尼松组。结果详见表14。 

表14丹酚酸A对肺纤维化小鼠平均肺泡间隔宽度的影响( 

) 

与模型组相比*P＜0.05 

3.2.3丹酚酸A对小鼠肺组织中TGF-β面积总和的影响 

试验结果表明，模型组小鼠肺组织中TGF-β表达面积总和明显多于空白对照组；各给药治疗组小鼠肺组织中TGF-β表达面积总和与空白对照组比较，无显著性差异，与模型组比较明显小于模型组；与醋酸泼尼松组比较，各组均有优于醋酸泼尼松的趋势，但各组之间无统计学差异，结果详见表15。 

表15丹酚酸A对小鼠肺组织中TGF-β面积总和的影响( 

) 

与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01 

结论，丹酚酸A对博莱霉素致小鼠肺纤维化有一定的保护作用 

实验例6：丹参丹酚酸A的毒性试验研究 

丹酚酸A的小鼠单次静脉给药急性毒性试验结果表明，其LD₅₀约为500mg/kg，折合成人用等效剂量约为3.3g/人。 

丹酚酸A大鼠腹腔给药3个月长期毒性试验结果表明，当给药剂量为50mg/kg时，未见明显毒副反应，折合成人用等效剂量约为500mg/人；丹酚酸A犬静脉给药3个月长期毒性试验结果表明，当给药剂量为25mg/kg时，未见明显毒副反应，折合成人用等效剂量约为780mg/人。 

实验例7：丹参丹酚酸A的高效液相测定方法 

色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长286nm；理论板数按丹酚酸A计应不低于60000；以乙腈-0.2％醋酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行90分钟。 

0-15分钟时，乙腈的比例由10％升至20％，0.2％醋酸水溶液的比例由90％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％醋酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％醋酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时， 乙腈的比例由50％升至80％，0.2％醋酸水溶液的比例由50％降至20％；72-77分钟时，乙腈的比例80％，0.2％醋酸水溶液的比例20％；77-80分钟时，乙腈的比例由80％降至10％，0.2％醋酸水溶液的比例由20％升至90％；80-90分钟时，保持乙腈-0.2％醋酸水溶液以10∶90的比例进行洗脱。 

丹参丹酚酸A对照品溶液的配制：精密称取丹酚酸A对照品10mg到50ml容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度。 

供试品溶液的配制：精密称取样品10mg到50ml容量瓶中加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度。 

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录分钟的色谱图，即得。 

方法的验证： 

专属性：通过高温，高湿，强光，酸，氧化等破坏途径所产生的杂质均对测定无干扰。 

线性与范围：经测定，丹酚酸A进样量在0.20～4.09μg之间，以峰面积对进样量(μg)回归，回归方程为：A＝2.909×10⁶X-1.166×10⁵，R²＝0.9999，峰面积与进样量呈良好的线性关系。 

精密度：测得供试品溶液中，丹酚酸A日内精密度的RSD为0.3％，日间精密度的RSD为0.3％，重复性的RSD为0.7％。 

准确度：测得丹A原料中丹酚酸A的平均回收率为99.5％，RSD为0.5％。 

附图说明

图1为丹参丹酚酸A结构确证图(¹HNMR、¹³CNMR) 

图2为丹参丹酚酸A对照品、样品1、2色谱图 

图3为丹参丹酚酸A样品3、4、5色谱图 

图4为丹参丹酚酸A样品6、7、8色谱图 

图5为丹参丹酚酸A样品9、10、11色谱图 

图6为为丹参丹酚酸A样品12、13色谱图 

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。 

实施例一：丹参丹酚酸A的制备方法，其工艺步骤为： 

1、丹参药材粗粉100kg，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次1.0小时，滤过； 

2、合并滤液浓缩至药材∶药液(1∶4)，浓缩液调PH值至6.0，置于反应罐中110℃，表压0.05MPa，反应6小时；

表压0.05MPa，反应6小时； 

3、反应液过滤，滤液过AB-8型(南开大学化工厂生产)大孔吸附树脂柱(药材∶树脂量为1∶2)，先用水洗至糖检测反应为阴性，改用10％乙醇洗脱至FeCl₃反应为阴性，再用30％乙醇洗脱，用高效液相追踪检测，收集含有丹酚酸A洗脱液，减压浓缩至无有机溶剂； 

4、浓缩液过滤，滤液上聚酰胺层析柱(台州市路桥四甲生化塑料厂生产，药材∶树脂量为1∶2)，先用水洗至糖检测反应为阴性，改用20％乙醇洗脱至FeCl₃反应为阴性，再用50％乙醇洗脱，用高效液相追踪检测，收集含有丹酚酸A洗脱液，减压浓缩至无有机溶剂； 

5、调PH值，乙酸乙酯萃取：将样品液，调节PH值至2.0，用药液1.5倍量体积的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相；减压浓缩萃取液至浸膏状，真空干燥，得淡黄色粉末，即为丹参丹酚酸A(药材∶树脂或凝胶为药材重∶树脂或凝胶体积，以下同)。 

经测定，丹酚酸A含量为96.58，丹酚酸A保留时间45.39分钟，杂质1保留时间32.15分钟，杂质1相对保留时间0.708，杂质1含量1.98；杂质2保留时间61.78分钟，杂质2相对保留时间1.361，杂质2含量0.74。 

实施例二：与实施例一基本相同，所不同的是步骤3中，大孔树脂型号改为HPD-100(沧州宝恩化工有限公司生产)；步骤4改为，浓缩液过滤，滤液上聚酰胺层析柱(药材∶树脂量为1∶2)，先用水洗至糖检测反应为阴性，改用40％乙醇洗脱至FeCl₃反应为阴性，再用80％乙醇洗脱，用高效液相追踪检测，收集含有丹酚酸A洗脱液，减压浓缩至无有机溶剂；步骤5中PH值调至5。 

经测定，丹酚酸A含量为97.97，丹酚酸A保留时间45.44分钟，杂质1保留时间32.14分钟，杂质1相对保留时间0.707，杂质1含量0.57；杂质2保留时间61.78分钟，杂质2相对保留时间1.360，杂质2含量0.94。 

实施例三：与实施例一基本相同，所不同的是步骤3中大孔树脂改为HPD-300(沧州宝恩化工有限公司生产)；步骤4改为，浓缩液过滤，滤液上聚酰胺层析柱(药材∶树脂量为1∶2)，先用水洗至糖检测反应为阴性，改用50％乙醇洗脱至洗脱液中出现丹酚酸A，再用95％乙醇洗脱，用高效液相追踪检测，收集含有丹酚酸A洗脱液，减压浓缩至无有机溶剂。 

经测定，丹酚酸A含量为97.87，丹酚酸A保留时间45.594分钟，杂质1保留时间32.27分钟，杂质1相对保留时间0.708，杂质1含量0.71；杂质2保留时间61.89分钟，杂质2相对保留时间1.358，杂质2含量1.05。 

实施例四：与实施例一基本相同，所不同的是步骤3中大孔树脂改为HPD-400(沧州宝恩化工有限公司生产)；步骤4改为，浓缩液过滤，滤液上葡聚糖凝胶LH-20(上海医药工业研究院生产，药材∶凝胶量为1∶4)，先用水洗至糖检测反应为阴性，改用20％乙醇洗脱至洗脱液中出现丹酚酸A，再用50％乙醇洗脱，用高效液相追踪检测，收集含有丹酚酸A洗脱液，减压浓缩至无有机溶剂。 

经测定，丹酚酸A含量为93.52，丹酚酸A保留时间46.03分钟，杂质1保留时间32.65分钟，杂质1相对保留时间0.709，杂质1含量1.23；杂质2保留时间61.78分钟，杂质2相对保留时间1.357，杂质2相对1.29。 

实施例五：与实施例四基本相同，所不同的是步骤3中大孔树脂改为HPD-100A(沧州宝恩化工有限公司生产)；步骤4改为，浓缩液过滤，滤液上葡聚糖凝胶LH-20(药材∶凝胶量为1∶4)，先用水洗至糖检测反应为阴性，改用40％乙醇洗脱至洗脱液中FeCl₃反应为阴性，再用80％乙醇洗脱，用高效液相追踪检测，收集含有丹酚酸A洗脱液，减压浓缩至无有机溶剂。 

经测定，丹酚酸A含量为93.60，丹酚酸A保留时间45.67分钟，杂质1保留时间32.39分钟，杂质1相对保留时间0.709，杂质1相对1.22；杂质2保留时间61.96分钟，杂质2相对保留时间1.357，杂质2含量1.17。 

实施例六：与实施例四基本相同，所不同的是步骤3中大孔树脂改为HPD-400A(沧州宝恩化工有限公司生产)；步骤4改为，浓缩液过滤，滤液上葡聚糖凝胶LH-20(药材∶凝胶量为1∶4)，先用水洗至糖检测反应为阴性，改用50％乙醇洗脱至洗脱液中出现丹酚酸A，再用95％乙醇洗脱，用高效液相追踪检测，收集含有丹酚酸A洗脱液，减压浓缩至无有机溶剂。 

经测定，丹酚酸A含量为94.53，丹酚酸A保留时间45.75分钟，杂质1保留时间32.37分钟，杂质1相对保留时间0.708，杂质1含量0.17；杂质2保留时间62.00分钟，杂质2相对保留时间1.355，杂质2含量0.99。 

实施例七：与实施例六基本相同，所不同的是步骤3中大孔树脂改为D101(天津农药厂生产)；步骤4改为浓缩液加入1kg硅胶(青岛海浪硅胶干燥剂厂生产)，搅拌，挥干；把拌样硅胶加到已装好的50kg干硅胶柱上，以氯仿-甲醇-甲酸(5∶1∶0.1)为洗脱剂，用硅胶薄层检测追踪，收集丹酚酸A部分，减压浓缩至无有机溶剂；步骤5改为冷冻干燥。 

经测定，丹酚酸A含量为93.35，丹酚酸A保留时间45.82分钟，杂质1保留时间32.51分钟，杂质1相对保留时间0.710，杂质1含量1.40；杂质2保留时间62.33分钟，杂质2相对保留时间1.360，杂质2含量2.46。 

实施例八：与实施例三基本相同，所不同的是所不同的是步骤3中大孔树脂改为1300-I(扬州制药厂生产)。 

经测定，丹酚酸A含量为97.33，丹酚酸A保留时间45.48分钟，杂质1保留时间32.28分钟，杂质1相对保留时间0.710，杂质1含量0.33；杂质2保留时间61.72分钟，杂质2相对保留时间1.357，杂质2含量4.56。 

实施例九：与实施例二基本相同，所不同的是步骤2改为合并滤液浓缩至药材∶药液(1∶4)，浓缩液调PH值至4.5，置于反应罐中120℃，表压0.10Mpa，反应3小时；步骤3中大孔树脂改为1400(扬州制药厂生产)；步骤5中调节PH值至3.4。 

经测定，丹酚酸A含量为97.48，丹酚酸A保留时间45.34分钟，杂质1保留时间32.16分钟，杂质1相对保留时间0.709，杂质1含量0.23；杂质2保留时间61.55分钟，杂质2相对保留时间1.358，杂质2含量0.11。 

实施例十：与实施例八基本相同，所不同的是步骤2改为浓缩液调PH值至3.5，置于反应罐中130℃，表压0.17Mpa，反应1小时。 

经测定，丹酚酸A含量为97.41，丹酚酸A保留时间45.34分钟，杂质1保留时间32.16分钟，杂质1相对保留时间0.709，杂质1含量0.24；杂质2保留时间61.55分钟，杂质2相对保留时间1.358，杂质2含量0.46。 

实施例十一：与实施例八基本相同，所不同的是采用丹酚酸B提取物反应，步骤1、2改为丹酚酸B提取物1000g配成1∶10的水溶液，调解水溶液PH值至9.0，30℃，反应6小时；步骤5中调节PH值至5.0；柱层析中大孔树脂、聚酰胺体积均为100L。 

经测定，丹酚酸A含量为95.01，丹酚酸A保留时间46.19分钟，杂质1保留时间32.76分钟，杂质1相对保留时间0.709，杂质1含量0.7；杂质2保留时间62.82分钟，杂质2相对保留时间1.360，杂质2含量2.03。 

实施例十二：与实施例九基本相同，所不同的是步骤1改为：丹参药材粗粉100kg，加8倍量水80℃温浸3次，每次1.0小时，滤过；步骤2改为：合并滤液浓缩至药材∶药液(1∶4)，浓缩液调PH值至8.0，60℃，反应5小时。 

经测定，丹酚酸A含量为94.53，丹酚酸A保留时间45.46分钟，杂质1保留时间32.25分钟，杂质1相对保留时间0.709，杂质1含量1.18；杂质2保留时间61.83分钟，杂质2相对保留时间1.360，杂质2含量3.27。 

实施例十三：与实施例十二基本相同，所不同的是步骤2改为提取液不浓缩直接调PH值至7.5，80℃，反应3小时；步骤3中大孔树脂改为HPD-450(沧州宝恩化工有限公司生产)。 

经测定，丹酚酸A含量为94.53，丹酚酸A保留时间46.38分钟，杂质1保留时间32.9分钟，杂质1相对保留时间0.709，杂质1含量1.18；杂质2保留时间63.09分钟，杂质2 相对保留时间1.360，杂质2含量5.67。 

实施例十四：丹参丹酚酸A粉针剂处方 

丹参丹酚酸A  5.0g 

甘露醇       10.0g 

依地酸钙钠   0.4g 

L-半胱氨酸   适量 

注射用水     1000ml 

上述组分混匀后，采用粉针剂常规制备方法，冷冻干燥，即可制得1000支。 

实施例十五：丹参丹酚酸A粉针剂处方 

丹参丹酚酸A    20.0g 

维生素C        4.0g 

甘露醇         80.0g 

依地酸钙钠     0.4g 

碳酸氢钠       适量 

注射用水       2000ml 

上述组分混匀后，采用粉针剂常规制备方法，冷冻干燥，即可制得1000支。 

实施例十六：丹参丹酚酸A粉针剂处方 

丹参丹酚酸A    40.0g 

维生素C        7.5g 

甘露醇         150.0g 

碳酸氢钠       适量 

注射用水       2000ml 

上述组分混匀后，采用粉针剂常规制备方法，冷冻干燥，即可制得1000支。 

实施例十七：丹参丹酚酸A粉针剂处方 

丹参丹酚酸A    100.0g 

亚硫酸氢钠     15.0g 

甘露醇         150.0g 

葡甲胺         适量 

注射用水       2000ml 

上述组分混匀后，采用粉针剂常规制备方法，冷冻干燥，即可制得1000支。 

实施例十八：丹参丹酚酸A粉针剂处方 

丹参丹酚酸A    200.0g 

维生素C        25.0g     

甘露醇         250.0g 

碳酸氢钠       适量 

注射用水       2000ml 

上述组分混匀后，采用粉针剂常规制备方法，冷冻干燥，即可制得1000支。 

实施例十九：丹参丹酚酸A水针剂处方 

丹参丹酚酸A    5.0g 

维生素C        1.0g 

氯化钠         5.0g 

L-精氨酸       适量 

注射用水       2000ml 

上述组分混匀后，采用水针剂常规制备方法，即可制得1000支。 

实施例二十：丹参丹酚酸A水针剂处方 

丹参丹酚酸A    20.0g 

维生素C        5.0g 

氯化钠         20.0g 

碳酸氢钠       适量 

注射用水       2000ml 

上述组分混匀后，采用水针剂常规制备方法，即可制得1000支。 

实施例二十一：丹参丹酚酸A水针剂处方 

丹参丹酚酸A  40.0g 

维生素C      10.0g 

氯化钠       40.0g 

碳酸氢钠     适量 

注射用水     2000ml 

上述组分混匀后，采用水针剂常规制备方法，即可制得1000支。 

实施例二十二：丹参丹酚酸A水针剂处方 

丹参丹酚酸A    100.0g 

维生素C     20.0g 

氯化钠      40.0g 

依地酸二钠  1.0g 

碳酸氢钠    适量 

注射用水    5000ml 

上述组分混匀后，采用水针剂常规制备方法，即可制得1000支。 

实施例二十三：丹参丹酚酸A水针剂处方 

丹参丹酚酸A    200.0g 

维生素C        40.0g 

葡萄糖         420.0g 

烟酰胺         适量 

注射用水       10000ml 

上述组分混匀后，采用水针剂常规制备方法，即可制得1000支。 

实施例二十四：丹参丹酚酸A输液处方 

丹参丹酚酸A    40.0g 

维生素C        20.0g 

氯化钠         85.0g 

碳酸氢钠       适量 

注射用水       100000ml 

上述组分混匀后，采用输液常规制备方法，即可制得1000瓶。 

实施例二十五：丹参丹酚酸A片剂处方 

丹参丹酚酸A    10.0g 

乳糖           60.0g 

羟丙纤维素     8.0g 

硬脂酸镁       0.5g 

无水乙醇       适量 

共制成         1000片 

取丹参丹酚酸A与乳糖、羟丙纤维素混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片。 

实施例二十六：丹参丹酚酸A片剂处方 

丹参丹酚酸A  50.0g 

乳糖         180.0g 

羟丙纤维素   6.0g 

硬脂酸镁     3.0g 

无水乙醇     适量 

共制成       1000片 

取丹参丹酚酸A与乳糖、羟丙纤维素混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片。 

实施例二十七：丹参丹酚酸A片剂处方 

丹参丹酚酸A    100.0g 

微晶纤维素     40.0g 

滑石粉         2.0g 

硬脂酸镁       2.0g 

无水乙醇溶液   适量 

共制成         1000片 

取丹参丹酚酸A与微晶纤维素混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入滑石粉、硬脂酸镁，混匀，压片。 

实施例二十八：丹参丹酚酸A片剂处方 

丹参丹酚酸A    250.0g 

乳糖           40.0g 

羟丙纤维素     10.0g 

硬脂酸镁       5.0g 

无水乙醇       适量 

共制成         1000片 

取丹参丹酚酸A与乳糖、羟丙纤维素混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片。 

实施例二十九：丹参丹酚酸A片剂处方 

丹参丹酚酸A     500.0g 

羟丙纤维素      50.0g 

硬脂酸镁        20.0g 

无水乙醇    适量 

共制成      1000片 

取丹参丹酚酸A与羟丙纤维素混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片。 

实施例三十：丹参丹酚酸A片剂处方 

丹参丹酚酸A     1000.0g 

羧甲基淀粉钠    70.0g 

滑石粉          15.0g 

硬脂酸镁        5.0g 

无水乙醇        适量 

共制成          1000片 

取丹参丹酚酸A与羧甲基淀粉钠混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入滑石粉、硬脂酸镁，混匀，压片。 

实施例三十一：丹参丹酚酸A胶囊处方 

丹参丹酚酸A    10.0g 

乳糖           70.0g 

羟丙纤维素     1.5g 

硬脂酸镁       0.5g 

无水乙醇       适量 

共制成         1000粒 

取丹参丹酚酸A与乳糖、羟丙纤维素混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，装入胶囊。 

实施例三十二：丹参丹酚酸A胶囊处方 

丹参丹酚酸A    50.0g 

乳糖           20.0g 

羟丙纤维素     6.0g 

硬脂酸镁       3.0g 

无水乙醇       适量 

共制成         1000粒 

取丹参丹酚酸A与乳糖、羟丙纤维素混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选 颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，装入胶囊。 

实施例三十三：丹参丹酚酸A胶囊处方 

丹参丹酚酸A     100.0g 

微晶纤维素钠    40.0g 

滑石粉          2.0g 

硬脂酸镁        3.0g 

无水乙醇        适量 

共制成          1000粒 

取丹参丹酚酸A与微晶纤维素钠混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入滑石粉、硬脂酸镁，混匀，装入胶囊。 

实施例三十四：丹参丹酚酸A胶囊处方 

丹参丹酚酸A   250.0g 

羟丙纤维素    10.0g 

硬脂酸镁      5.0g 

无水乙醇      适量 

共制成        1000粒 

取丹参丹酚酸A、羟丙纤维素混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，装入胶囊。 

实施例三十五：丹参丹酚酸A胶囊处方 

丹参丹酚酸A 500.0g 

羟丙纤维素  20.0g 

硬脂酸镁    20.0g 

无水乙醇    适量 

共制成      1000粒 

取丹参丹酚酸A与羟丙基纤维素混合均匀，加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，装入胶囊。 

实施例三十六：丹参丹酚酸A颗粒剂处方 

丹参丹酚酸A  100.0g 

硬脂酸镁     10.0g 

滑石粉       10.0g 

无水乙醇    适量 

共制成      1000袋 

取丹参丹酚酸A加无水乙醇溶液制成软材，过18目筛选颗粒，60℃干燥40分钟，整粒，加入滑石粉、硬脂酸镁，混匀，装袋。 

实施例三十七：丹参丹酚酸A口服液处方 

丹参丹酚酸A         200.0g 

维生素C             40.0g 

甜菊糖              10.0g 

蔗糖                200.0g 

对羟基苯甲酸乙酯    5.0g 

碳酸氢钠            适量 

注射用水            10000ml 

上述组分混匀后，采用口服液常规制备方法，分装1000支。 

实施例三十八：丹参丹酚酸A滴丸处方 

丹参丹酚酸A     50.0g 

聚乙二醇6000    250.0g 

共制成          1000粒 

取丹参丹酚酸A与聚乙二醇6000混合，融溶，滴入低温二甲基硅油中，选丸，除去二甲基硅油，即得。 

实施例三十九：丹参丹酚酸A的高效液相测定方法 

照高效液相色谱法(《中国药典》2005版一部附录V)测定。 

色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长286nm；理论板数按丹酚酸A计应不低于60000；以乙腈-0.2％醋酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行90分钟。 

0-15分钟时，乙腈的比例由10％升至20％，0.2％醋酸水溶液的比例由90％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％醋酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％醋酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.2％醋酸水溶液的比例由50％降至20％；72-77分钟时，乙腈的比例80％，0.2％醋酸水溶液的比例20％；77-80分钟时，乙腈的比例由80％降至10％，0.2％醋酸水溶液的比例由20％升至90％；80-90分钟时，保持乙腈-0.2％醋酸水溶液以10∶90的 比例进行洗脱。 

丹参丹酚酸A对照品溶液的配制：精密称取丹酚酸A对照品10mg到50ml容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度。 

供试品溶液的配制：精密称取样品10mg到50ml容量瓶中加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度。 

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录分钟的色谱图，即得。 

丹参丹酚酸A，丹酚酸A含量大于等于92％，小于100％，其中含有2个杂质。以丹参丹酚酸A为参照物，其保留时间为1，两个杂质的相对保留时间分别为0.71、1.36。以丹参丹酚酸A为对照，采用主成分自身对照法，相对保留时间为0.71的杂质，其含量为0.1～2％，相对保留时间为1.36的杂质，其含量为0.1～6％，总杂质含量小于8％。 

高效液相图谱见附图2-6。 

本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。 

Claims (6)

1.一种丹参丹酚酸A，其特征在于：采用高效液相色谱法测定，丹参丹酚酸A的含量大于等于92％且小于100％，其中含有2个杂质；采用高效液相色谱法测定，记录时间为90分钟，以丹参丹酚酸A为参照物，其保留时间为1，2个杂质的相对保留时间分别为0.71、1.36；以丹参丹酚酸A为对照，相对保留时间为0.71的杂质，其含量为0.1～2％，相对保留时间为1.36的杂质含量为0.1～6％，总杂质含量小于8％；其中高效液相色谱法为：

照高效液相色谱法《中国药典》2005版一部附录V测定；

色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长286nm；理论板数按丹酚酸A计不低于60000；以乙腈-0.2％醋酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行90分钟；

0-15分钟时，乙腈的比例由10％升至20％，0.2％醋酸水溶液的比例由90％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％醋酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％醋酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.2％醋酸水溶液的比例由50％降至20％；72-77分钟时，乙腈的比例80％，0.2％醋酸水溶液的比例20％；77-80分钟时，乙腈的比例由80％降至10％，0.2％醋酸水溶液的比例由20％升至90％；80-90分钟时，保持乙腈-0.2％醋酸水溶液以10∶90的比例进行洗脱；

对照品溶液的配制：精密称取丹酚酸A对照品10mg到50ml容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；

供试品溶液的配制：精密称取样品10mg到50ml容量瓶中，加甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，即得；

其制备方法为：

丹参用水或乙醇溶液提取得到水提取液或醇提取液，醇提液浓缩乙醇至尽；调pH值至7.5-9.0、30-80℃温度、加热1-6小时或调pH值至3.5-6.0、110-130℃温度、表压0.05MPa-0.17MPa压强，加热1-6小时；溶液进行过滤，滤液经非极性或弱极性大孔树脂柱层析分离，用水洗脱后，用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液回收洗脱剂至尽；浓缩液用硅胶或葡聚糖凝胶LH-20或聚酰胺层析柱分离，用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液回收洗脱剂至尽；浓缩液液调pH值至2-5，经有机溶剂萃取，分离有机溶剂相，得含药溶液，浓缩，干燥，得丹参丹酚酸A；

其中所述大孔树脂柱为HPD-100、HPD-100A、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、D101、1300-I、1400或AB-8；

其中所述大孔树脂柱层析分离，先用水、10～30％稀乙醇洗脱，除去杂质，再用30～70％浓度的乙醇洗脱，收集含有丹酚酸A部分，洗脱液浓缩至无醇味；

其中所述硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇-甲酸5∶1∶0.1为洗脱溶剂，收集含有丹酚酸A部分；

其中所述葡聚糖凝胶LH-20或聚酰胺层析柱分离，先用水、20～50％乙醇溶液洗脱除杂，再用50～95％乙醇溶液洗脱，收集含有丹酚酸A部分，洗脱液浓缩至无醇味；

其中所述的大孔树脂或聚酰胺柱层析分离的过程中，通过薄层层析或高效液相色谱检测方法，检测洗脱液中丹酚酸A的含量，收集含有丹酚酸A的洗脱液；

所述的有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丙醇。

2.根据权利要求1所述的丹参丹酚酸A作为药物活性成分的药物组合物。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其选自：片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂、注射液或粉针剂。

4.根据权利要求2所述的药物组合物，其中丹参丹酚酸A的剂量范围为1～1000mg。

5.根据权利要求2中所述的药物组合物，其中丹参丹酚酸A的剂量范围为5～500mg。

6.根据权利要求2中所述的药物组合物，其特征在于丹参丹酚酸A的剂量范围为10～200mg。

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