CN110403928A - 一种丹酚酸a盐复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种丹酚酸A盐复合物，由二分子丹酚酸A和一个阳离子组成，化学结构如下式所示；本发明丹酚酸A盐复合物具有治疗抗心肌缺血、抗心肌缺血再灌注损伤、抑制血小板聚集药理活性，可应用于制备相关疗效的药物，本发明丹酚酸A盐复合物的制备方法简单易于生产，且相对于丹酚酸A更加稳定；

Description

一种丹酚酸A盐复合物及其制备方法和应用

(一)技术领域

本发明属于医学和药学技术领域，具体涉及一种丹酚酸A盐复合物及其制备方法，以及在制备治疗抗心肌缺血、抗心肌缺血再灌注损伤、抑制血小板聚集的药物中的应用。

(二)背景技术

丹酚酸A(Salvianic acid A)是由黎莲娘教授于1984年从丹参这一唇形科植物的干燥根和根茎中首次提取分离而获得的一种水溶性酚酸类化合物，具有多种药理活性，如抗炎、抗氧化及神经保护作用等(Li YJ,Duan CL,Liu JX.Salvianolic acid A promotesthe acceleration of neovascularization in the ischemic rat myocardium and thefunctions of endothelial progenitor cells[J].J Ethnopharmacol,2014,151:218-227.)。随着研究的进一步深入，学者们发现丹酚酸A不仅可以通过磷酸肌醇-3-激酶通路抑制血小板激活(Huang ZS,Zeng CL,Zhu LJ,ea tl.Salvianolic acid A inhibitsplatelet activation and arterial thrombosis via inhibition ofphosphoinositide 3-kinase[J].J Thromb Haemost,2010,8:1383-1393.)，还可以通过升高环磷酸鸟苷发挥抗血小板凝集作用(Fan HY,Fu FH,Yang MY,et al.Antiplatelet andantithrombotic activities of salvianolic acid A[J].Thromb Res,2010,126:e17-e22.)。

然而，丹酚酸A具有稳定性差、容易被氧化，以及将其制成各种剂型后难以保证其长期稳定等不足。有研究证明，在稳定性考察中(0至12月，(25±2)℃/(60±10)％)，丹酚酸A平均含量从93.5％下降至76.6％，总杂平均含量从4.3％上升至9.0％；高温高湿条件下(0至10天，(60±2)℃/(90±10)％)，丹酚酸A平均含量从93.2％下降至87.9％，总杂平均含量从4.5％上升至6.7％。

本发明公开了一种丹酚酸A盐复合物，其稳定性显著优于丹酚酸A。在稳定性考察中(0至12月，(25±2)℃/(60±10)％)，平均含量仅从99.8％下降至99.2％，总杂平均含量也仅从0.34％上升至0.39％。；高温高湿条件下(0至10天，(60±2)℃/(90±10)％)，丹酚酸A盐复合物平均含量从99.9％下降至99.4％，总杂平均含量也仅从0.32上升至0.36％。研究结果显示无论是含量变化还是杂质控制，丹酚酸A盐复合物均更优。因此，将丹酚酸A制备成丹酚酸A盐复合物比丹酚酸A稳定。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种具有治疗抗心肌缺血、抗心肌缺血再灌注损伤、抑制血小板聚集药理活性的丹酚酸A盐复合物，其制备方法简单易于生产，且相对于丹酚酸A更加稳定。

本发明的技术方案如下：

一种丹酚酸A盐复合物，由二分子丹酚酸A和一个阳离子组成，化学结构如下式所示：

式中，X表示阳离子，所述阳离子例如为：Na⁺、K⁺或NH₄ ⁺，优选Na⁺。

本发明所述丹酚酸A盐复合物的制备方法为：

取丹酚酸A溶解于水中，再用碱性物质的水溶液调节pH值为1.2～5.5(优选3.2～4.2)，收集析出物，即为所述的丹酚酸A盐复合物；

所述丹酚酸A与水的料液质量比为1：0.25～4，优选1：0.67～1.5；

所述碱性物质的水溶液的浓度为1％～50％，优选4％～11％；

所述的碱性物质例如：氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠、氢氧化钾、碳酸氢钾、碳酸钾、柠檬酸钾、酒石酸钾、碳酸氢铵、碳酸铵或氨，优选氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠；

所述收集所得的析出物用水清洗、干燥后，即可直接用于制剂或与人体可接受的药用辅料一起用于制剂；

所述丹酚酸A由原料丹参经水或乙醇水溶液提取、大孔树脂柱层析分离、聚酰胺层析柱分离制备而得，其制备方法例如可参考：中国专利CN101361728B公开的方法；

具体的，所述丹酚酸A的制备方法为：

(1)将原料丹参按料液质量比1：6～12与水或体积分数10％～90％的乙醇水溶液混合，在70～100℃下提取1～3h，过滤收集滤液，滤渣复提1～3次，合并各次所得滤液，得到丹参提取液；

(2)取步骤(1)所得丹参提取液，浓缩(通常浓缩至原料丹参质量的2～4倍)，调节pH至3.5～6.0(常规操作，用无机酸的水溶液进行调节，所述的无机酸例如盐酸、硫酸、硝酸等)，升温至110～130℃加热1～6h，之后冷却至室温(20～30℃)，过滤，滤液进行大孔树脂柱层析分离，先用水、体积分数10％～30％乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积分数30％～70％乙醇水溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的洗脱液，浓缩(至无醇味)后继续进行聚酰胺层析柱分离，先用水、体积分数20％～50％乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积分数50％～95％乙醇水溶液洗脱，收集含有丹酚酸A的洗脱液，浓缩(至无醇味)后调pH值至2～5(常规操作，用碱性物质的水溶液进行调节，所述的碱性物质如上述所定义)，经有机溶剂萃取，萃取液经浓缩，干燥，即得所述的丹酚酸A；

所述的原料丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，可在市面上常规商购获得；

所述的大孔树脂为HPD-100、HPD-100A、HPD-300、HPD-400、HPD-400A、HPD-450、D101、1300-I、1400或AB-8；

所述用于萃取的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、正丁醇或异丙醇；

制得的丹酚酸A纯度为50％～100％，可直接用于后续丹酚酸A盐复合物的制备。

本发明所述丹酚酸A盐复合物可用于制备治疗抗心肌缺血、抗心肌缺血再灌注损伤、抑制血小板聚集的药物，并可通过静脉滴注、口服、舌下含服等方式给药。

本发明所述丹酚酸A盐复合物的红外光谱下主要吸收特征峰位置(cm^-1)与丹酚酸A对照品(括号内显示)基本一致，其中：①3398±2(3382±2)为分子结构中羟基的O-H伸缩振动峰，1282±2(1285±2)、1259±2(1257±2)、1196±2(1191±2)和1114±2(1113±2)中较强的吸收峰为分子结构中与羟基相连的C-O伸缩振动峰(与羧基中C＝O对称伸缩振动峰重叠)；②1686±2(1687±2)处较强的吸收峰为分子结构中羧基的C＝O不对称伸缩振动峰；③1602±2(1603±2)、1519±2(1522±2)和1466±2(1445±2)处较强吸收峰为分子结构中苯环双键的C＝C伸缩振动峰，971±2(971±2)为分子结构中三取代苯环C-H面外弯曲振动峰，810±2(809±2)为分子结构中四取代苯环C-H面外弯曲振动峰。

本发明所述丹酚酸A盐复合物的粉末X射线衍射结果中出现了较明显的衍射峰，证明其呈现明显的多晶型态。

本发明所述丹酚酸A盐复合物的差示扫描量热结果中存在因峰型转变时交替出现的放热与吸热峰，证明其呈现明显的多晶型态。

本发明所述丹酚酸A盐复合物的热重分析与水分含量分析结果显示其结构中不含结晶水，但含有一定比例吸附水，其含量与储存条件和环境有关。

本发明所述丹酚酸A盐复合物中吸附水的含量一般不超过20％。

本发明所述丹酚酸A盐复合物的圆二色光谱结果显示其在200nm处显示一个正的科顿效应，确认其分子结构具有手性。

本发明所述丹酚酸A盐复合物的圆二色光谱结果显示其手性结构为R型。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种丹酚酸A盐复合物，相对于丹酚酸A更加稳定，并且具有治疗抗心肌缺血、抗心肌缺血再灌注损伤、抑制血小板聚集的药理活性。

(四)附图说明

图1：丹酚酸A钠复合物红外光谱图。

图2：丹酚酸A对照品红外光谱图。

图3：丹酚酸A钠复合物PXRD谱图。

图4：丹酚酸A钠复合物DSC谱图。

图5：丹酚酸A钠复合物TGA谱图。

图6：丹酚酸A钠复合物¹H-NMR谱图。

图7：丹酚酸A钠复合物¹³C-NMR谱图。

(五)具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

本发明所述丹酚酸A盐复合物的制备方法可参考CN 106748733A中公开的方法，下面以丹酚酸A钠复合物的制备为例进行说明：

取丹酚酸A 1250g溶解于1010mL水中，加5％氢氧化钠溶液调节pH至3.6，过滤，并收集析出物，减压干燥即得丹酚酸A钠复合物767g，纯度99.90％。

其他丹酚酸A盐复合物可按同样方法进行制备。

实施例2

精密称定实施例1中制备得到的丹酚酸A钠复合物适量溶于5％葡萄糖注射液中，并逐级稀释得到不同浓度的药液；取狗静脉血，抗凝后800r/min离心10min分离得到PRP，2000r/min离心10min分离得到PPP，分别按每份300μL分配于比色管中，确认PRP和PPP合适可用后，分别加入10μL药液，混匀后使药液终浓度分别为1.41、0.85、0.51、0.31、0.18、0.11、0.07和0.04mg/mL，对照组加入10μL 5％葡萄糖注射液；于仪器内预热5min后，按Born比浊法检测加入10μL ADP后5min内血小板的最大聚集率(A_max)，并按公式1计算聚集抑制率。

表1丹酚酸A钠复合物抗ADP诱导的体外血小板聚集实验结果

由表1可知，当丹酚酸A钠复合物终浓度为1.41、0.85、0.51、0.31、0.18、0.11、0.07和0.04mg/mL时，均可显著抑制ADP诱导的血小板聚集，且聚集抑制率与丹酚酸A钠复合物浓度之间呈现良好的浓度-效应关系，表明丹酚酸A钠复合物具有显著的抗血小板凝集作用。

实施例3

精密称定实施例1中制备得到的丹酚酸A钠复合物适量，以蒸馏水溶解后用Krebs-Henseleit试液分别稀释得到不同浓度梯度的药液；取健康Wistar大鼠，麻醉处死后迅速取出胸主动脉条上段，均匀切成3～4mm的血管环，悬挂至离体灌流装置中，套入上下平行的两个不锈钢钩，经张力传感器，由Pclab-UE生物信号采集系统记录张力变化，以K-H液平衡2h后，加入40mmol/L的KCl收缩血管环2次，直至收缩稳定；以40mmol/L KCl或0.8μmol/L盐酸去氧肾上腺素预收缩血管环9min时加入浓度为0.002％的抗坏血酸，20min时按照累计给药法每6min一次加入不同浓度的丹酚酸A钠复合物，观察其对收缩血管环的张力作用，对照组以K-H试液等量加入。

表2丹酚酸A钠复合物对KCl预收缩血管环的舒张作用

表3丹酚酸A钠复合物对去氧肾上腺素预收缩血管环的舒张作用

由表2和表3结果可知，与对照组相比，当终浓度在0.16～5.00mg/mL和0.04～1.25mg/mL时，丹酚酸A钠复合物均可显著性舒张分别由KCl和去氧肾上腺素预收缩的大鼠胸主动脉环，并且舒张效果呈现浓度依赖性；此外，两组的半数有效浓度分别为1.59mg/mL和0.26mg/mL。

实施例4

精密称定实施例1中制备得到的丹酚酸A钠复合物适量，用5％葡萄糖注射液分别配制成3.2、1.6、0.8和0.4mg/mL的药液(实验组)，并设浓度为8mg/mL的注射用丹参多酚酸盐组、0.4mg/mL的注射用盐酸地尔硫卓组和模型组(5％葡萄糖注射液)；取健康雄性SD大鼠并随机分为7组，麻醉后固定，气管插管并接入呼吸机，手术暴露心脏，尾静脉给予相应组别的药液，10min后以心脏表面左冠状静脉为标志结扎左冠状动脉前降支，造成结扎部位以下心肌缺血，缺血30min后，松开结扎线再灌注3h，处死大鼠后解剖取心脏，以冰生理盐水洗净后分离左心室并冷冻10min，切片后1％以TTC于37℃染色10min，数码相机拍照，并将坏死区(灰白色)和非坏死区(暗红色)分别称重，按公式2计算坏死区占左心室重量的百分比，即梗死范围。

表4丹酚酸A钠复合物对结扎/再通大鼠左冠状动脉前降支所致心肌缺血/再灌注损伤心肌梗死范围(％)的影响

由表4可知，尾静脉给予丹酚酸A钠复合物后，各实验组大鼠心肌梗死范围均有所减小，各实验组与模型组间均存在显著性差异，各实验组之间亦存在良好的量效关系；与阳性药相比，丹酚酸A钠复合物抗心肌缺血作用较注射用盐酸地尔硫卓稍差，但优于注射用丹参多酚酸盐。

实施例5

精密称定实施例1中制备得到的丹酚酸A钠复合物适量，用5％葡萄糖注射液分别配制成3.2、1.6和0.8mg/mL的药液(实验组)，并设浓度为8mg/mL的注射用丹参多酚酸盐组、模型组(5％葡萄糖注射液)和空白对照组(5％葡萄糖注射液)；取健康雄性SD大鼠并随机分为6组，除空白对照组和模型组按5.0mL/kg给予5％葡萄糖注射液外，其余各组按既定给药剂量给予相应药液，各组均预先尾静脉注射给药5天；第5天药后0.5h，除空白对照组外，其他各组大鼠予以2次皮下注射0.1％肾上腺素，第一次0.09mL/100g，第二次0.08mL/100g，两次间隔时间为4h，第1次注射后2h将大鼠浸入冰水中冷浴5min，处置后禁食不禁水，造模次日早上再给药1次，药后0.5h(相当于造模后18h)以0.5mL/100g剂量腹腔注射20％乌拉坦麻醉，切开腹中线，暴露腹主动脉，用10mL一次性使用无菌注射器取血，其中3.0mL立即置于有肝素钠抗凝的试管内震荡，用普利生血液流变仪测全血粘度、2000r/min离心分离血浆后测定血浆粘度，取约0.2mL血EDTA-2K抗凝用全自动血球分析仪检测红细胞压积。

表5丹酚酸A钠复合物对气滞血瘀大鼠血液流变性的影响(一)

表6丹酚酸A钠复合物对气滞血瘀大鼠血液流变性的影响(二)

表7丹酚酸A钠复合物对气滞血瘀大鼠血液流变性的影响(三)

由表5、表6及表7可知，经肾上腺素加冰浴造模后，模型组的全血粘度、血浆粘度及全血还原低切、中切、高切粘度与正常对照组均有非常显著性差异；丹酚酸A钠复合物高、中、低剂量组和注射用丹参多酚酸盐组均能显著降低造模大鼠的全血低切、中切、高切粘度、血浆粘度及全血还原低切、中切、高切粘度，与模型组比较有显著性差异；并且随着丹酚酸A钠复合物剂量的增加，有降低红细胞聚集指数、刚性指数和电泳指数的趋势；另外，丹酚酸A钠复合物各剂量组均有优于注射用丹参多酚酸盐组的趋势，但无统计学差异。

实施例6

精密称定实施例1中制备得到的丹酚酸A钠复合物适量，用5％葡萄糖氯化钠注射液配制成药液，注射用丹参多酚酸盐以5％葡萄糖氯化钠注射液配制；取健康Beagle犬并随机分为高、中、低剂量组、阳性对照组和空白对照5组，其中高、中、低剂量组分别给予8mg/kg、4mg/kg和2mg/kg药液，阳性对照组给予20mg/kg注射用丹参多酚酸盐溶液，空白对照组给予等量5％葡萄糖氯化钠注射液，各组试药均为临用前配制；各组犬麻醉后手术，连接安置相应的检测及取样装置，用于记录心率(HR)、动脉血压(MAP)、冠脉流量(CBF)、心输出量(CO)以及心肌耗氧量(MVO₂)等指标；术后待所有观察指标稳定15min后记录给药前值，然后开始股静脉滴注给药60min，以开始给药为起始点0min，于给药后5、10、15、30、45、6、90和120min进行记录，测量上述观察指标，并于给药前0min、给药后15、30、60和120min抽取股动脉、冠状静脉窦血，用血气－电解质分析仪测定血氧含量，并计算心肌耗氧量(MVO₂)；其中涉及的公式如下：

心肌耗氧量(MVO₂)＝心肌血流量(MBF)×[动脉血氧含量(CaO₂-冠状窦血氧含量(CvO₂)]公式4

表8丹酚酸A钠复合物对Beagle犬心率(HR)的影响

表9丹酚酸A钠复合物对Beagle犬平均动脉血压(MAP)的影响

表10丹酚酸A钠复合物对Beagle犬冠脉流量(CBF)的影响

表11丹酚酸A钠复合物对Beagle犬心输出量(CO)的影响

表12丹酚酸A钠复合物对Beagle犬心肌耗氧量(MVO₂)的影响

由表8和表9可知，空白对照组静脉滴注给予5％葡萄糖氯化钠注射液100ml，麻醉犬的心率、无明显变化；给予高、中、低剂量的丹酚酸A钠复合物和注射用丹参多酚酸盐后，与空白对照组比较，麻醉犬心率及也无明显改变。另外，空白对照组静脉滴注给予5％葡萄糖氯化钠注射液，麻醉犬的平均动脉血压(MAP)无明显变化；给予高、中、低剂量丹酚酸A钠复合物和注射用丹参多酚酸盐后，对麻醉犬的平均动脉压(MAP)均无明显影响。

由表10可知，空白对照组静脉滴注给予5％葡萄糖氯化钠注射液，麻醉犬的冠脉流量(CBF)有逐渐下降的趋势；而静脉滴注给予高、中、低剂量丹酚酸A钠复合物和注射用丹参多酚酸盐后，可有效升高麻醉犬的冠脉流量(CBF)。同时，与空白对照组比较，高、中、低剂量组分别在给药5min、10min、30min后呈显著性差异，高剂量组在给药90min时作用最强，麻醉犬的冠脉流量(CBF)升高了53.9％，其它各试验组随给药后时间延长作用增加，在给药120min后，高、中、低剂量组麻醉犬的冠脉流量(CBF)分别提高了48.2％、42.1％、35.6％，；阳性对照组亦随给药时间的延长作用增强，给药120min后麻醉犬的冠脉流量(CBF)提高了44.8％。此外，丹酚酸A钠复合物其作用效果随剂量的提高和给药时间的延长而作用增加，其综合效果，与阳性对照组比较，高剂量丹酚酸A钠复合物的作用强于阳性对照，中剂量的丹酚酸A钠复合物的作用相当于阳性对照组，即注射用丹参多酚酸盐。

由表11可知，空白对照组麻醉犬心输出量(CO)呈缓慢下降趋势，但给药前后比较无明显差异；而给予高、中、低剂量丹酚酸A钠复合物和注射用丹参多酚酸盐后，麻醉犬的心输出量(CO)明显提高，与空白对照组比较，各试验组在给45min后均呈显著性差异；对心输出量(CO)作用方面，各剂量组略弱于阳性对照组。

由表12可知，与给予5％葡萄糖氯化钠注射液前比较，空白对照组麻醉犬的心肌耗氧量(MVO₂)明显提高，而静脉滴注给予高、中、低剂量丹酚酸A钠复合物和注射用丹参多酚酸盐后，可有效抑制麻醉犬的心肌耗氧量(MVO₂)上升，且与空白对照组比，各剂量组均呈显著性差异。此外，各给药组在给药15-60min的心肌耗氧量(MVO₂)有明显下降，在给药60min后的时间段才出现上升，其幅度明显低于空白对照组，丹酚酸A钠复合物的作用效果与剂量有一定的依赖关系，高剂量组的作用效果优于中、低剂量组；与阳性对照组比，在给药0-60min时间段，高、中剂量的作用略强于阳性对照组，在给药60min后的各时间段，高、中、低剂量的作用均强于阳性对照组，且随给药时间的延长，高、中、低剂量抑制麻醉犬心肌耗氧量(MVO₂)上升的作用与阳性对照组差异逐渐增大。

Claims (8)

1.一种丹酚酸A盐复合物，由二分子丹酚酸A和一个阳离子组成，化学结构如下式所示：

式中，X表示阳离子。

2.如权利要求1所述的丹酚酸A盐复合物，其特征在于，所述阳离子为：Na⁺、K⁺或NH₄ ⁺。

3.如权利要求1所述的丹酚酸A盐复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：

取丹酚酸A溶解于水中，再用碱性物质的水溶液调节pH值为1.2～5.5，收集析出物，即为所述的丹酚酸A盐复合物。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述丹酚酸A与水的料液质量比为1：0.25～4。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碱性物质的水溶液的浓度为1％～50％。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的碱性物质为：氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠、氢氧化钾、碳酸氢钾、碳酸钾、柠檬酸钾、酒石酸钾、碳酸氢铵、碳酸铵或氨。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述丹酚酸A由原料丹参经水或乙醇水溶液提取、大孔树脂柱层析分离、聚酰胺层析柱分离制备而得。

8.如权利要求1所述的丹酚酸A盐复合物在制备治疗抗心肌缺血、抗心肌缺血再灌注损伤、抑制血小板聚集的药物中的应用。