CN117838803A

CN117838803A - 天麻来源纳米胞外囊泡在制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用

Info

Publication number: CN117838803A
Application number: CN202410145026.9A
Authority: CN
Inventors: 张安可; 陈岩; 刘益波; 袁玲; 陈挺; 张建民
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2024-02-01
Filing date: 2024-02-01
Publication date: 2024-04-09

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了天麻来源纳米胞外囊泡在制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。本发明天麻来源纳米胞外囊泡由天麻经水提取分离得到，成分天然，无毒副作用，具有良好的生物相容性和安全性，因此具有广阔的应用前景。本发明利用天麻来源纳米胞外囊泡进行体内外实验，发现其具有抑制蛛网膜下腔出血诱导的小胶质细胞激活、抑制小胶质细胞向M1表型转化、促进小胶质细胞向M2表型转化的活性，具有显著的治疗SAH的效果，可用于制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中。

Description

天麻来源纳米胞外囊泡在制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及天麻来源纳米胞外囊泡在制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。

背景技术

脑内环境的复杂性，神经退行性疾病的治疗一直是个临床难题，其主要原因在于组织难以再生和持续性的神经炎症等。蛛网膜下腔出血(SAH)是一种与脑出血相关的破坏性脑血管疾病，患者死亡率和发病率高。在最近的研究中发现，早期伴随蛛网膜下腔出血出现的急性炎症引起的脑损伤可能是导致SAH患者预后不良的主要原因。在SAH过程中，由于蛛网膜下腔出血导致的血栓形成，血液内容物释放，引起的缺血性和炎症性反应是引发急性炎症的主要原因。然而，目前在西医临床上针对急性炎症和早期脑损伤的治疗策略仍然是缺少的。尽管多年来中枢神经系统被认为是免疫豁免器官，但现在人们普遍认为免疫系统和神经系统之间存在相互联系。此外，越来越多的数据表明，在大脑中，炎症细胞参与了损伤后的组织重塑。小胶质细胞是大脑的常驻巨噬细胞，在中枢神经系统中作为常驻免疫和吞噬细胞发挥着重要的作用。Ekdahl和他的同事报道了大鼠在2小时MCAO后的16周内，激活的小胶质细胞数量增加。小胶质细胞在缺血激活后可转化为吞噬细胞，并释放多种物质，其中许多物质具有细胞毒性和/或细胞保护作用。小胶质细胞可能通过产生神经营养分子如脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胰岛素样生长因子I(insulin-like growth factor I，IGF-I)和其他几种生长因子来发挥神经保护作用。大量证据表明，激活的小胶质细胞在SAH过程中可能释放一些促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，以及其他潜在的细胞毒性分子，包括NO、ROS和前列腺素。SAH引起的兴奋性毒性和氧化应激激活小胶质细胞和星形胶质细胞，这些细胞通过分泌细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)反应。这些炎症介质导致内皮细胞粘附分子的上调，使血源性炎症细胞(主要是中性粒细胞)浸润缺血脑区。中性粒细胞本身也分泌细胞因子，导致进一步激活胶质细胞。这些过程都会导致神经元细胞死亡，增强对缺血脑的损伤。病理状态下，小胶质细胞迅速激活并伴随转录适应性功能变化。激活的小胶质细胞具有M1型和M2型两种表型。当暴露于内毒素(如LPS)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)、6-羟基多巴胺(6-OHDA)、α-突触核蛋白和脑损伤等刺激，小胶质细胞M1表型被活化，分泌大量的促炎细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等介导对神经元细胞的损伤；而神经元的受损或死亡反过来又会进一步激活M1型小胶质细胞，形成恶性循环加剧PD的病理过程。与此同时，小胶质细胞受到刺激时，细胞内酶如氧化酶、环氧合酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等被不同程度地激活，释放大量的炎症介质如ROS、NO等，引起神经元损伤甚至死亡。因此，M1型小胶质细胞被认为是脑内炎症反应的主要发动和参与者。M2型小胶质细胞又分为M2a、M2b和M2c三种亚型，目前普遍认为M2型小胶质细胞对神经元细胞起保护作用，并分泌抗炎因子(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)以及神经营养因子(BDNF、GDNF)等，发挥抑制免疫炎症反应和促进组织修复等作用。尽管M1型和M2型小胶质细胞有不同的生物学功能，但在损伤环境下，它们分别表达特有的细胞标志物共同对机体发挥作用。其中，选择性地激活组织中M2表型的小胶质细胞可有效的参与急性脑损伤的修复。此外，大量的证据阐明了其在SAH后早期炎症反应中的重要作用。也有报道M2小胶质细胞可以促进血肿清除、神经元存活和减轻脑损伤。因此，针对性的激活M2小胶质细胞的药物成为预防SAH早期脑损伤的新型治疗策略。

外泌体是由细胞分泌的直径30-150nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构，存在于细胞培养上清液、血清、血浆等生物体液中，含有核酸、蛋白、脂质等多种内含物，参与细胞间的分子传递、机体免疫应答、细胞迁移、分化等多种生物学功能。近年来，有研究表明植物也可以产生外泌体并具有抗炎、调节肠道菌群、参与脂代谢等多种生物学功能。

天麻具有镇静、抗惊厥、降血压、抗心肌缺血、抗心律失常、抗炎、抗衰老、抗氧化、抗辐射、扩血管、抗凝血、抗血栓的作用，在中药针对神经损伤的中医临床中被大量应用，然而由于血脑屏障的存在，目前针对天麻与SAH和相关的神经损伤的药物作用机制目前并不能满足相关的机制说明。

因此，深入的研究天麻和SAH的作用机制，开发新的天麻有效成分制剂将为SAH临床治疗和药物应用提供新的理论基础与研究思路。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于天麻来源纳米胞外囊泡在制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。

本发明的天麻来源纳米胞外囊泡具有抑制蛛网膜下腔出血诱导的小胶质细胞激活、抑制小胶质细胞向M1表型转化、促进小胶质细胞向M2表型转化的活性，具有显著的治疗SAH的效果，可用于制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中。

本发明的目的通过下述方案实现：

天麻来源纳米胞外囊泡(Rhizoma Gastrodiae Extracellular Vesicle，RGEV)在制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。

进一步的，天麻来源纳米胞外囊泡在制备预防蛛网膜下腔出血药物中的应用。

进一步的，天麻来源纳米胞外囊泡在制备治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。

本发明中，所述天麻来源纳米胞外囊泡的直径为50-250nm。

进一步的，所述药物相同或不同的分别包括治疗有效量的天麻来源纳米胞外囊泡。

进一步的，所述的药物相同或不同的分别可采用常规方法制成各种药用剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、酒剂、酊剂、滴剂等口服给药的剂型及注射液等口服以外的给药剂型，如针剂等。

进一步的，所述的药物相同或不同的分别还可含有一种或以上药学上可接受的载体或辅料。

进一步的，所述的载体或辅料可包括稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂、防腐剂等。

本发明还提供上述天麻来源纳米胞外囊泡在制备促进小胶质细胞向M2表型转化的产品中的应用。

本发明还提供上述天麻来源纳米胞外囊泡在制备抑制小胶质细胞向M1表型转化的产品中的应用。

本发明还提供上述天麻来源纳米胞外囊泡在制备抑制蛛网膜下腔出血诱导的小胶质细胞激活的产品中的应用。

进一步的，所述产品可以为药物。

本发明中，所述天麻来源纳米胞外囊泡由天麻分离得到。

本发明天麻来源纳米胞外囊泡由天麻经水提取分离得到，成分天然，无毒副作用，具有良好的生物相容性和安全性，因此具有广阔的应用前景。

本发明利用天麻来源纳米胞外囊泡进行体内外实验，发现其具有抑制蛛网膜下腔出血诱导的小胶质细胞激活、抑制小胶质细胞向M1表型转化、促进小胶质细胞向M2表型转化的活性，具有显著的治疗SAH的效果，可用于制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为RGEV的提取分离示意图。

图2为RGEV的透射电镜图。

图3为RGEV的粒径图。

图4为RGEV的蛋白定量曲线图。

图5为RGEV的凝胶图。

图6为小胶质细胞BV2对RGEV的摄取图。

图7-图8为REGV对LPS作用下BV2细胞炎症因子分泌和M1，M2表型的影响图。

其中，图中数据＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001。

图9为RGEV的体内分布荧光图。

图10为RGEV对SAH模型大鼠的的脑损伤修复图。

图11为RGEV对SAH模型大鼠的脑组织IL-1beta表达的影响和巨噬细胞的变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。

一实施方式，天麻来源纳米胞外囊泡(Rhizoma Gastrodiae ExtracellularVesicle，RGEV)在制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。

一实施方式，天麻来源纳米胞外囊泡在制备预防蛛网膜下腔出血药物中的应用。

一实施方式，天麻来源纳米胞外囊泡在制备治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。

一实施例中，所述天麻来源纳米胞外囊泡的直径为50-250nm。

一实施方式，上述天麻来源纳米胞外囊泡在制备促进小胶质细胞向M2表型转化的产品中的应用。

一实施方式，上述天麻来源纳米胞外囊泡在制备抑制小胶质细胞向M1表型转化的产品中的应用。

一实施方式，上述天麻来源纳米胞外囊泡在制备抑制蛛网膜下腔出血诱导的小胶质细胞激活的产品中的应用。

一实施例中，所述产品可以为药物。

一实施方式，所述药物相同或不同的分别包括治疗有效量的天麻来源纳米胞外囊泡。

本发明的药物或药物组合物的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

所述的治疗有效量，是指可对人和/或动物产生治疗效果且可被人和/或动物所接受的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素，包括但不限于：治疗对象的特征因素(如治疗对象的身高、体重、性别、年龄和用药史等)、罹患疾病的严重程度。

在本发明的具体实施方案中，所述的治疗有效量是指对SAH患者能够产生预防和/或治疗效果且能够被患者所接受的量。

在本发明的具体实施方案中，所述药物或药物组合物的给药方式包括但不限于：口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。

在本发明的具体实施方案中，可以任何口服可接受的剂型，包括但不限于胶囊剂、片剂、水性混悬剂或溶液剂。

在本发明的具体实施方案中，供口服施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。

在本发明的具体实施方案中，供口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。

在本发明的具体实施方案中，药物或药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。所述药学上可接受的载体或辅料可以包含惰性成分，其不会不适当地抑制化合物的生物活性。药学上可接受的载体或辅料应当是生物相容性的，例如在施用于受试者时无毒性、无炎症性、无免疫原性或无其它不期望的反应或副作用。可以使用标准的药物制剂技术。

药学上可接受的载体或辅料包括但不限于稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂、防腐剂等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。

其中，稀释剂包括但不限于乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水。

粘合剂包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。

表面活性剂包括但不限于聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇。

致湿剂包括但不限于甘油、淀粉。

吸附载体包括但不限于淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土。

润滑剂包括但不限于硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁。

填充剂包括但不限于甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠。

崩解剂包括但不限于交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖。

在本发明的具体实施方案中，药物或药物组合物还包括其他预防和/治疗SAH的药物，即所述天麻来源纳米胞外囊泡可联合其它可用于预防和/治疗SAH的化合物一起用药。

一实施方式，所述天麻来源纳米胞外囊泡通过常规分离方法由天麻分离得到。

一实施例中，所述天麻来源纳米胞外囊泡通过对天麻通过粉碎或破壁加提取剂进行提取分离得到。

一实施例中，分离得到的沉淀即为天麻来源纳米胞外囊泡。

一实施例中，所述提取剂为常规使用的水或加入磷酸盐等缓冲液的水溶液。

一实施例中，所述分离的方法为高速离心分离。

一实施例中，所述高速离心的速度为100000g或以上。

一实施例中，所述高速分离的时间为10-100min。

一实施例中，所述高速离心的时间为60-100min。

一实施例中，高速离心所得沉淀可用PBS等缓冲液重悬从而得到天麻来源纳米胞外囊泡悬浮液。可进行一次或以上的高速离心，以获得进一步纯化的天麻来源纳米胞外囊泡。

一实施例中，高速离心前对进行预离心除去杂质沉淀。

一实施例中，所述预离心的速度为10000g或以下。通过预离心可将分非目标物质分离除去，减少杂质对于后续离心分离的影响。

一实施例中，所述预离心的时间为10-60min。可进行一次或以上的预离心。

一实施例中，至少进行一次离心速度为8000-10000g的预离心。

一实施例中，所述预离心前进行过滤，如使用纱布把不溶性沉渣过滤。

一实施例中，所述天麻来源纳米胞外囊泡悬浮液使用前使用过滤器过滤以获得无菌的天麻来源纳米胞外囊泡悬浮液。

一实施例中，所述的过滤器为0.22μm的过滤器。

一实施例中，所述天麻来源纳米胞外囊泡，由天麻经提取分离得到，提取流程示意图见图1，具体包括以下步骤方法制备得到：将天麻破碎或粉碎后，加入水中浸泡，分离得到上清液，对上清液在离心力10000g或以下进行预离心，取上清液，弃去沉淀；预离心后的上清液再在离心力100000g或以上进行高速离心，离心时间可为10-100min，所得沉淀即为天麻来源纳米胞外囊泡。

一实施例中，所述天麻使用前先清洗干净。

一实施例中，所述浸泡的时间可为6-24h。

一实施例总，所述浸泡的过程中可进行搅拌。

一实施例中，所述分离得到上清液可通过过滤分离得到，如使用纱布把不溶性沉渣过滤。

一实施例中，可进行一次或以上的预离心；如可在500-1000g、1500-2500g、8000-10000g下分别离心10-60min，分别取上清液，弃去沉淀。

一实施例中，至少进行一次离心速度为8000-10000g的预离心。

一实施例中，高速离心所得沉淀可用PBS等缓冲液重悬从而得到天麻来源纳米胞外囊泡悬浮液。

一实施例中，可进行多次高速离心，如将高速离心所得沉淀用无菌PBS重悬后再次进行高速离心。

一实施例中，所述的过滤器为0.22μm的过滤器。

一实施例中，利用透射电镜对RGEV进行形态学鉴定，利用纳米颗粒跟踪分析仪测定悬浮液中RGEV的粒径大小。结果见图2和图3，由图可见，RGEV呈类圆形或椭圆形的囊泡，如托盘状，直径分布在50-250nm之间。

一实施例中，利用BCA检测试剂盒(Thermo科学公司)对RGEV的蛋白浓度进行定量测定，测定562nm波长的吸光度，测定悬浮液中蛋白浓度为7.89μg/μL。结果见图4。

一实施例中，对RGEV悬浮液的蛋白通过考马斯蓝染色进行鉴定。结果见图5。

实施例1：小胶质细胞BV2对RGEV的摄取鉴定

(1)PKH26/PKH27-RGEV的孵育：将10mg PKH26/PKH27与10¹⁰个颗粒数的RGEV共孵育，37℃避光孵育30min，使得RGEV与PKH26/PKH27充分结合；

(2)去除游离的PKH26/PKH27：以上混合液进行再次高速离心，离心力130000g，离心70min，弃上清、取沉淀，以1mL PBS重悬，获得PKH26/PKH27-RGEV；

(3)细胞孵育：将生长旺盛的BV2接种于6孔板，待细胞融合度长至50-60％，加入10μLPKH26/PKH27-RGEV，37℃避光孵育6h；

(4)DAPI核染色：用PBS洗2-3次，每孔加入2mL基础1640培养基，并加入10μL的1mg/mL的DAPI，放入培养箱孵育30-40min；

(5)上机检测：荧光显微镜(舜宇)，取不同倍数拍摄，结果如图6。由图可见，PKH26/PKH27-RGEV可以被BV2细胞摄取并在胞内发出红/绿色荧光，而PBS对照组没有观察到荧光，该结果证实PKH26/PKH27-RGEV可被BV2细胞摄取进入胞内。

实施例2：RGEV对LPS作用下BV2细胞炎症因子分泌和M1，M2表型的影响

(1)实验分组：NC组，LPS组，Gastrodin(天麻素)组，LPS+Gastrodin组，RGEV组，LPS+RGEV组。BV2细胞购于中国科学院上海细胞库。

(2)模型建立：将生长状态良好的BV2细胞，使用胰酶消化，并用完全培养基终止消化。1200转，5min，离心去除上清。加入适量的培养基，对细胞沉淀进行重悬，取适量细胞悬液使用细胞计数仪进行计数，制备2×10⁵个/mL的细胞悬液；按照2mL/孔将细胞悬液铺设至孔板中，将铺好的6孔板置于培养箱中正常培养；加入终浓度为100μg/mL的内毒素(LPS)刺激BV2细胞进行BV2的表型诱导转化形成BV2炎症损伤模型。

(3)实验步骤：在LPS诱导BV2细胞12h后，各组加入对应的试剂，LPS+天麻素组，加入终浓度为30μmol/L的天麻素，并继续培养24h；LPS+RGEV组，加入RGEV，以RGEV的蛋白浓度进行定量，其中终浓度为100μg/mL，继续培养24h；培养完成后，消化收取细胞；

(3)结果检测：取1×10⁶细胞进行流式染色检测M1型和M2型巨噬细胞。使用FcRblock4℃孵育5-10min，加入M1型巨噬细胞流式抗体CD86表面染色，4℃孵育30min。PBS洗涤细胞2-3次，加入细胞固定液(Fixation Buffer，500μL，420801，BioLegend)室温避光固定30min。150g离心5min弃掉固定液，加入2mL用ddH₂O 10倍稀释后的10×IntracellularStaining Permeabilization Wash Buffer(421002，BioLegend)重悬细胞，150g离心5min弃上清，重复步骤2-3次。100μL 1×Intracellular Staining Permeabilization WashBuffer重悬细胞，加入M2型巨噬细胞流式抗体CD206，室温避光孵育30min。孵育完毕后，2mL1×Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer洗涤细胞2-3次，加入500μLcell staining buffer重悬细胞，上机。FlowJo软件分析最后的流式结果。结果见图7和图8。

由图可见，流式细胞技术检测BV2细胞M1和M2表型的变化，可得出LPS可以激活BV2的M1表型转化，M1细胞比例相对NC组出现明显增加，两者之间有显著统计学差异；单纯的天麻素和RGEV刺激可以减少M1的分化，两组对比NC组有统计学差异；单纯的天麻素和RGEV刺激可以激活M2的分化，两组对比NC组有统计学差异；LPS诱导的BV2向M1表型的分化，可受到天麻素和RGEV的抑制，并增加M2表型的分化，同时RGEV比天麻素效果更好，两组具有显著统计学差异；在细胞炎症水平上，LPS可以诱导激活BV2细胞的炎症因子IL-1b，IL-6，TNF-a的分泌，具有显著统计学差异；天麻素和RGEV对炎症因子无明显调控作用，对比NC组无明显统计学差异；天麻素和RGEV可抑制LPS诱导的炎症因子分泌增加，且RGEV对比天麻素效果更好，具有显著统计学差异。

实施例3：天麻来源纳米胞外囊泡(RGEV)的体内循环分布情况

(1)实验对象：8周龄大雄性SD大鼠；

(2)实验分组：①PBS灌胃；②DIL-RGEV腹腔注射(剂量：100μg/只)，每组3只；

(3)DIL荧光探针的孵育：将10mg DIL/PKH26/PKH27与10¹⁰个颗粒数的RGEV共孵育，37℃避光孵育30min，使得RGEV与DIL/PKH26/PKH27充分结合；以PBS做为对照与DIL孵育作为阴性对照

(4)去除游离的DIL/PKH26/PKH27：以上混合液进行再次高速离心，离心力130000g，离心70min，弃上清、取沉淀，以1mL PBS重悬，获得DIL/PKH26/PKH27-RGEV；

(5)实验步骤：小鼠禁食、禁水8h，按照实验分组，提前6h给予小鼠腹腔注射配置好的DIL标纪的RGEV，6h后，解剖取脑子，在活体成像仪上观察拍照，随后将脑子制作成石蜡切片，在荧光显微镜下观察拍照，结果见图9。

(6)结果分析：由图可见，DIL-RGEV经腹腔注射后，可穿过血脑屏障，并在脑部呈现富集，在大鼠脑部的活体成像中，可以看到荧光在大鼠的脑部富集，见图9A；进一步的对大鼠的脑组织进行解剖进行体外的二次成像，可明显看到鼠的脑部有荧光分部，说明DIL-RGEV在脑部富集，并被脑组织摄取进入细胞内部，见图9B。

实施例4：RGEV对SAH模型大鼠的脑损伤修复的情况

(1)实验对象：8周龄大雄性SD大鼠

(2)实验分组：①NC组；②SAH手术模型组；③Gastrodin+SAH手术模型组；④RGEV+SAH手术模型组，每组3只；

(3)实验步骤：大鼠称重后以10％水合氯醛按0.4g/kg腹腔麻醉，麻醉成功后剃除颅顶部毛发，取俯卧位，将动物头部固定于脑立体定位仪上，保持颅顶水平位置。手术区常规消毒，沿颅顶正中矢状线切开长约2cm皮肤，钝性分离肌肉及骨膜，双氧水消毒及止血，在距前囱正中线前6mm、中线旁开2-3cm处，用5mL注射器针头钻孔，手术显微镜下用4号针头小心将脑膜挑破，见清亮脑脊液流出时，在矢状面将导管向前倾斜30°插入，直至尖端达前颅窝底，深度距大脑表面约1.0cm。骨孔用骨蜡密封住。连接注射器轻柔抽吸，见清亮脑脊液流出后，证实进入蛛网膜下腔。局部消毒后剪除长约2cm鼠尾，快速接取鼠尾动脉血300μL，用微量注射注入蛛网膜下腔，注射时间为20s。拔出导管，医用生物胶封闭骨孔，逐层缝合皮肤，放入保暖箱内。大鼠麻醉苏醒后放回饲养箱饲养并观察。给药组动物，提前24h进行给药，天麻素组大鼠用量按照人体用量6倍计算，约30mg/kg；RGEV组大鼠用量按照外泌体BCA定量的结果按照蛋白浓度30mg/kg进行给药；每8h腹腔给药一次；蛛网膜下出血，48h后处死大鼠，进行取材，并行伊文氏蓝染色，对比各组脑子的出血情况；结果见图10；

(4)实验结果：由图可见，SAH手术模型组，可见整个大鼠脑部已经着上蓝色，可得出SAH模型成功建模，同时模型组的出血较为严重；天麻素组可见出血控制在造模孔周围，同时出血在造模孔周边出现深染，在造模孔侧有接近2/3出现了出血染色；RGEV的出血控制效果最佳，仅在造模孔周围出现了染色，说明RGEV提前给药可有效的控制造模后的出血损伤，加快造模后的出血吸收。

实施例5：RGEV对SAH模型大鼠的脑组织IL-1beta表达的影响和巨噬细胞的变化(使用CD11B进行标纪)

(1)实验对象：各组大鼠脑组织

(2)实验分组：①NC组；②SAH手术模型组；③Gastrodin+SAH手术模型组；④RGEV+SAH；

(3)实验步骤：

3.1组织取材

3.1.1使用水合氯醛麻醉处死大鼠；

3.1.2快速解剖大鼠并取出脑组织；将部份组织使用组织剪剪开PBS洗净冻至-80℃留作WB使用，一部份泡至10％中性福尔马林固定，固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的10倍以上。

3.1.3固定时间一般小组织4-6h，大组织一般要求切开固定24h以上。

3.1.4取材切面要平整，厚度应该为2-3mm，如蜡块太厚脱水。

3.1.5对于有特殊要求的组织，取材时要保证对目的组织的完整保留。

3.2组织脱水

使用自动脱水机将固定的组织进行脱水处理

自动脱水机温度设置为60℃

纯水1h

70％乙醇1h

85％乙醇1h

95％乙醇1h×2次

无水乙醇1h×2次

TO 45min×2次

石蜡 1h×2次

石蜡 2h

3.3蜡块包埋

脱水完成的组织需要进一步进行蜡块包埋。步骤如下：

3.3.1所用镊子要放在包埋机里加热，不能用冷镊子，否则组织会粘在镊子上。

3.3.2迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放在框底的正中间并轻轻压平，以保证石蜡内无气泡。

3.3.3包埋时石蜡的温度不能过高，包埋机温度调到60℃左右，因为温度过高会使组织变得僵硬，组织变僵硬以后会发生卷曲收缩变形，这时会影响切片，染色和结果判读。组织从脱水缸中取出来以后，要浸泡在包埋机加热的石蜡里面，这样组织本身与包埋石蜡的温度是一致的，如果两者温度不一致可能导致组织与周围石蜡脱裂，从而达不到包埋的效果。

3.3.4包埋时应该选取切面平整并且有病变的一面放在下面，如组织放不平可以用镊子轻轻将组织压平整。

3.3.5相同类型的组织如果要包埋于同一个蜡块中，要注意把组织放平，并且方向要保持一致，以利于切片。

3.4免疫组化

3.4.1切片、摊片、烤片及脱蜡步骤与HE染色相同，同上，需注意摊片的载玻片要用防脱玻片，因为免疫组化步骤繁琐，需用防脱玻片防止组织脱落。

3.4.2抗原修复：脱蜡结束后，将切片置于蒸馏水中，2min×2次，然后置于PBS中，2min×3次。最后将切片浸没于装有柠檬酸盐缓冲液即修复液的高压锅中，待高压锅中的修复液沸腾后，盖好盖子待高压连续喷气3min，然后将高压锅拿到地上，待其自然冷却。

3.4.3阻断内源性过氧化物酶活性：待修复液自然冷却后，取出玻片架，放入PBS中，2min×3次。然后放入提前预热的3％过氧化氢甲醇溶液孵育7分钟。

3.4.4封闭：孵育结束取出载玻片，放入PBS溶液中，5min×3次。擦干载玻片组织周围水分，滴加适量10％BSA溶液将组织完全覆盖，放置37℃烘箱中，封闭1小时。

3.4.5孵育一抗：封闭结束后，用IHC笔圈出组织：拿出1张玻片，甩干组织周围的液体，再用纸巾擦干玻片背面的液体，然后用IHC笔圈出组织范围，注意不要碰到组织，画的圈比组织稍微大一些。然后PBS洗，2min×3次，尽量将组织周围的封闭液吸掉，配制一抗，整个过程在冰上进行，先计算抗体和抗体稀释液用量，每个标本约50μL，在EP管里加抗体稀释液，抗体取出后放掌上离心机里离心，然后用移液器加抗体，涡旋仪混匀即可。加一抗，约50μL，加的时候不要超过画圈范围，尽量加在组织上使整个液体面呈凸起状。阴性对照同时加约50ulPBS，然后放4℃冰箱过夜。

3.4.6孵育二抗：第二天，取出玻片观察一抗在位情况，用双蒸水清洗玻片1次，阴性对照玻片和滴加抗体的玻片分开清洗。用PBS洗，2min×3次，滴加二抗：拿出1张玻片，甩干组织周围的液体，把画圈以外的液体擦干，再用纸巾擦干玻片背面的液体，把玻片放在湿盒里，滴加二抗，每个标本约50μL，加的时候不要超过画圈范围，尽量使加在组织上的整个液体面呈凸起状。然后37℃孵育20min。

3.4.7DAB显色：取出二抗孵育结束后的湿盒，观察二抗在位情况，双蒸水清洗1次，阴性对照玻片和滴加抗体的玻片分开清洗。再用PBS洗，2min×3次。将洗涤好的切片组织周围水分尽量擦干，滴加DAB显色液，每个标本约50μL，加的时候不要超过画圈范围，尽量加在组织上。光镜下控制显色时间，发现组织中有棕黄色沉积时用自来水冲洗，终止显色反应。

3.4.8复染：终止染色后用双蒸水洗1min，然后用苏木素溶液染色，具体染色时间视染色情况而定，染色结束后自来水冲洗，然后用1％盐酸酒精分化2s，再用自来水冲洗3s，放PBS中浸泡5min返蓝。

3.4.9脱水：与上述HE染色中的脱水步骤相同，此处不再赘述。

3.4.10封片：脱水结束将切片置于通风橱内自然晾干，并用中性树胶进行封片。

3.4.11拍照与统计：在光学显微镜下观察切片组织形态及阳性表达情况，运用Image Pro Plus软件对染色结果进行分析统计。

结果判读标准：方法一：免疫组织化学染色结果要考虑两个方面：1、阳性染色的强度。阳性染色是指细胞浆、细胞核或细胞膜显示棕黄色沉积物信号。阳性染色的强度分值为0-4分：无棕黄色沉积为阴性0分；棕黄色沉积颜色淡弱1分；棕黄色沉积颜色中等2分；棕黄色沉积颜色深强阳性3分。2、阳性染色细胞的比例。阳性染色细胞的比例分值为0-4分：＜5％为0分；5％-25％为1分；26％-50％为2分；51％-75％为3分；＞75％为4分。阳性染色的强度与阳性染色细胞的比例的乘积称为染色指数指，分值为0-12。染色指数用于数据的分析，认为0-3分是不表达，4-7分是低表达，8-12分是高表达。当染色不均匀时的评分：每个评分都是独立的，结果是综合的。比如说，一张切片包含了24％的细胞高等强度染色(1*3＝3分)，另外74％的细胞是弱强度的染色(3*1＝1分)，最后得到的结果是3+1＝4，低表达。

(4)实验结果见图11：IL-1beta的组化结果可得出，造模组中的IL-1beta出现显著性表达升高，脑组织的染色呈现多点化与深染；天麻素给药组的IL-1beta表达对比模型对照组有所下调，RGEV的IL-1beta表达对比手术模型和天麻素组显著下调，然而对比NC仍有所升高，这也与脑组织的大体解剖结构反馈出来的结果相同；CD11B是巨噬细胞的广泛表达位点，也常用于巨噬细胞的标纪，在组化结果可明显得出，正常脑组织中巨噬细胞富集较少，而SAH后脑组织中的巨噬细胞出现显著升高和富集；提前给以天麻素和RGEV的脑组织可下降CD11B巨噬细胞的招募和富集，且RGEV的抑制巨噬细胞富集的效果显著优于天麻素。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.天麻来源纳米胞外囊泡在制备预防和/或治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。

2.天麻来源纳米胞外囊泡在制备预防蛛网膜下腔出血药物中的应用。

3.天麻来源纳米胞外囊泡在制备治疗蛛网膜下腔出血药物中的应用。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述天麻来源纳米胞外囊泡的直径为50-250nm。

5.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述药物包括治疗有效量的天麻来源纳米胞外囊泡。

6.天麻来源纳米胞外囊泡在制备促进小胶质细胞向M2表型转化的产品中的应用。

7.天麻来源纳米胞外囊泡在制备抑制小胶质细胞向M1表型转化的产品中的应用。

8.天麻来源纳米胞外囊泡在制备抑制蛛网膜下腔出血诱导的小胶质细胞激活的产品中的应用。

9.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于所述产品为药物。

10.根据权利要求1-9任一项所述的应用，其特征在于所述天麻来源纳米胞外囊泡由天麻分离得到。