CN111617234B - 外源性重组蛋白Reelin在制备治疗脑出血药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种外源性重组蛋白Reelin在制备治疗脑出血药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明公开了脑出血后纹状体、皮质组织中细胞焦亡的时程变化过程；脑出血后焦亡在纹状体、皮质组织不同细胞类型中分布情况；证明Reelin改善了脑出血后纹状体、皮质及海马组织水肿；证明Reelin能减轻脑出血后纹状体和皮质神经元焦亡的发生；本发明为利用Reelin作为治疗脑出血的一种新型药物提供了依据。

Description

外源性重组蛋白Reelin在制备治疗脑出血药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种外源性重组蛋白Reelin在制备治疗脑出血药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
脑出血是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血。虽然脑出血的发生率在脑卒中比率相对较低，但是，脑出血能够导致极高的致死率和致残率。作为一个严重的公共卫生问题，在临床治疗方面取得的进展却寥寥可数，也没有药物治疗被临床批准有效地增加生存率或改善幸存者的生活质量，病人预后结果仍旧不理想，致残率及致死率仍旧处于较高水平的状态。因此，当务之急必须充分的了解脑出血的病理变化并寻求有效的治疗方法。
细胞焦亡又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应，作为机体一种重要的免疫反应，在拮抗感染和内源性危险信号中发挥重要作用，广泛参与肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展。因此，揭示细胞焦亡发生发展过程及分子机制对寻找脑出血药物治疗方法具有重要意义。目前研究主要研究涉及的机制主要集中在胶质细胞中焦亡的发生，并未有神经元焦亡在脑出血后的报道。
Reelin是一种大型的分泌型细胞外基质糖蛋白，由3641个氨基酸残基组成。在神经发育早期以及成熟后的大脑中都有重要作用。Reelin作为分泌型糖蛋白，通过与其受体的相互作用，使细胞质衔接蛋白磷酸化，进而开启下游信号通路，早期主要与皮层形成、神经细胞迁移过程相关，后期起到调节突触功能的作用。目前已经发现Reelin与多种肿瘤和精神疾病有关。但Reelin作为外源性药物在脑出血中的作用至今未有报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明分析细胞焦亡在脑出血中不同脑区分布及时间变化，探究Reelin是否可以作为一种神经保护剂，能否抑制脑出血后焦亡的发生并且恢复脑出血所致的不同脑区水肿情况。
本发明的第一个目的是提供外源性重组蛋白Reelin在制备治疗脑出血药物中的应用。
进一步地，所述的治疗脑出血药物为减轻脑出血后神经元焦亡的药物。
进一步地，所述的治疗脑出血药物为改善脑出血后纹状体组织水肿的药物。
进一步地，所述的治疗脑出血药物为改善脑出血后脑皮质组织水肿的药物。
进一步地，所述的治疗脑出血药物为改善脑出血后脑海马组织水肿的药物。
进一步地，所述的治疗脑出血药物剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微胶囊制剂或注射剂。
进一步地，所述的治疗脑出血药物采用侧脑室给药。
进一步地，所述的侧脑室给药的剂量为50～150ng/ml。
进一步地，所述的重组蛋白Reelin由3641个氨基酸残基组成。
本发明的有益效果：
本发明公开了脑出血后纹状体、皮质组织中细胞焦亡的时程变化过程；脑出血后焦亡在纹状体、皮质组织不同细胞类型中分布情况；证明Reelin改善了脑出血后纹状体、皮质及海马组织水肿；证明Reelin能减轻脑出血后纹状体和皮质神经元焦亡的发生；本发明为利用Reelin作为治疗脑出血的一种新型药物提供了依据。
附图说明
图1发现脑出血后脑纹状体、脑皮质焦亡相关蛋白表达时间变化；
图2发现脑出血后焦亡在脑纹状体、脑皮质不同细胞类型中分布；
图3证明Reelin改善了脑出血后纹状体、脑皮质及海马组织水肿；
图4证明Reelin能减轻脑出血后神经元焦亡的发生。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：脑出血模型的建立
(1)将24只体重20-25g的ICR小鼠随机分为8组(n＝3只/组)，即：单纯对照组(Sham组)、出血后1h、6h、12h、1d、2d、3d、7d组。建模步骤如下：使用4％水合氯醛进行腹腔注射麻醉小鼠。通过眼睑反应、皮肤捏夹或脚趾反射观测小鼠麻醉深度。随后去除小鼠头部毛发，75％酒精消毒数次，提起头皮沿中线剪开约2cm，剥开骨膜，用立体定位仪固定小鼠头部。选择前囟前1.0mm，中线左侧2.0mm处，球钻颅骨钻孔至脑膜，微量注射器垂直刺入3.5mm，0.5μl胶原酶IV在5min内匀速注射，并留针5min，缓慢退针。将小鼠颅部消毒，缝合头皮。开始进行计时，在所对应的时间进行实验。Sham组不予特殊处理。
小鼠饲养条件均相同。
(2)将40只体重20-25g的ICR小鼠随机分为4组(n＝10只/组)，即：单纯对照组(Sham组)、Reelin组、ICH组、ICH+Reelin组。建模步骤如下：Sham组不予特殊处理。Reelin组侧脑室给药，药物浓度100ng/ml。ICH组和ICH+Reelin组建模方式同上，其中ICH+Reelin组建出血模型前30min侧脑室给药，药物浓度同Reelin组。建模24小时后进行实验。小鼠饲养条件均相同。
实施例2：脑出血后不同脑区焦亡相关蛋白表达的时间变化
根据小鼠脑出血建模后不同时间点(1h、6h、12h、1d、2d、3d、7d)和Sham组建立脑出血模型后1d将小鼠麻醉，分别分离小鼠损伤侧纹状体和皮质，将分离提取的脑组织加入到细胞裂解液中进行超声细胞破碎仪低温匀浆裂解，低温离心20min后提取上清液，测量蛋白浓度，每孔上样等量60ug蛋白样品利用SDS-PAGE凝胶电泳分离各蛋白，随后，将分离胶上的蛋白转到PVDF膜上60min，将转有蛋白的PVDF膜先后使用BSA封闭2h及4℃下孵育在BSA稀释的抗体中12-14h，PBST多次洗膜，蛋白条带在辣根过氧化物酶链接的二抗中室温孵育2h，最后，应用ECL化学发光系统(Kodak)检测扫描蛋白条带和使用Sigma Scan Pro 5分析蛋白条带的灰度值。结果如图1所示，图1A：在纹状体中，随着出血后时间的增加，焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、caspase-1及GSDMD呈上升趋势，并且在1-2d达到高峰，随后逐渐下降，在7d基本恢复至正常水平。图1B：在大脑皮质中，焦亡相关蛋白随着出血后时间的增加呈上升状态，在1d达到高峰，7d基本恢复至正常水平。
结果表明：(1)在不同时间点脑出血模型中，分离脑组织损伤侧不同部位(纹状体、皮质)检测焦亡相关蛋白指标。在纹状体中，随着出血后时间的增加，焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、caspase-1及GSDMD呈上升趋势，并且在1-2d达到高峰，随后逐渐下降，在7d基本恢复至正常水平。在大脑皮质中，焦亡相关蛋白随着出血后时间的增加呈上升状态，在1d达到高峰，7d基本恢复至正常水平。
实施例3：脑出血后焦亡在不同的细胞类型中发生及分布
脑出血后第1天对损伤侧的纹状体和皮质进行双免疫荧光染色，观察分析焦亡相关蛋白ASC与神经元细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞之间的关系。小鼠脑出血模型建立后1d麻醉小鼠，4％多聚甲醛内固定取脑组织，立刻进行外固定1d，随后蔗糖梯度脱水(20％、30％、40％)。脑组织在蔗糖溶液中沉入底部后，开始大脑组织冠状冰冻切片，每张切片厚10μm，间隔200μm连续切片50张。冰冻切片室温放置30min，再4％多聚甲醛固定30min，PBST溶液清洗数次，每次五分钟。之后依次先后进行BSA溶液封闭2h，一抗4℃孵育12-14h、PBST清洗数次、辣根过氧化物酶链接的二抗中室温孵育2h以及DAPI染色2min。最后，在体视学显微镜200×镜下摄片。结果如图2所示：脑出血后第1天对损伤侧的纹状体和皮质进行双免疫荧光染色，观察分析焦亡相关蛋白ASC与神经元细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞之间的关系，通过检测发现ASC与神经细胞标志物(NeuN、GFAP和Ibal)共定位，由此得出，脑出血后神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞均可发生以焦亡为特征的细胞死亡。其中神经元标记物NeuN与焦亡相关蛋白ASC的共定位数量较多，提示神经元发生焦亡的比例较高。
实施例4：Reelin改善了脑出血不同脑区脑水肿
小鼠脑出血模型建立后1d麻醉小鼠立刻处死，剖开颅骨，无菌条件下取出完整的大脑组织，滤纸吸干，在出血损伤侧以进针口为原点，前后各约2mm做冠状切开。将其脑组织分离纹状体和皮质，再取海马，得到三部分：皮质、纹状体及海马组织。快速将各组织分别置于电子精密天秤上称得并记录脑湿重；之后将称重后的脑于100℃的烘箱内，24h后取出，称得干重。脑组织含水量(％)的计算方法为：[(wet weight–dry weight)/wet weight]×100％。结果如图3所示：脑出血后1d测量损伤侧不同部位小鼠脑组织含水量。与sham组相比，ICH组各部位脑组织含水量显著升高(纹状体：P＜0.0001，皮质：P＜0.05)。与ICH组相比，ICH+Reelin组能减轻脑含水量。其中纹状体和皮质部位表现更为显著。
实施例5：Reelin能减轻脑出血后由神经元焦亡的发生
通过免疫荧光实验(如实施例3所示)对脑出血后1d不同分组(sham、Reelin、ICH、ICH+Reelin)进行检测，结果如图4A、图4B所示，发现无论是纹状体还是大脑皮质，焦亡相关蛋白ASC与神经元共定位，说明脑出血后1d神经元细胞发生焦亡。同时，在预处理Reelin显著地减少了大脑皮质(图4C)和纹状体(图4D)ASC阳性的神经元数量，说明Reelin对脑出血后神经元损伤具有抗焦亡的作用。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (8)

1.外源性重组蛋白Reelin在制备治疗脑出血药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗脑出血药物为减轻脑出血后神经元焦亡的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗脑出血药物为改善脑出血后纹状体组织水肿的药物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗脑出血药物为改善脑出血后脑皮质组织水肿的药物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗脑出血药物为改善脑出血后脑海马组织水肿的药物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗脑出血药物剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、口服制剂或微胶囊制剂。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗脑出血药物采用侧脑室给药。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的侧脑室给药的剂量为50～150ng/mL。
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氨基酸残基数量为3641的Reelin;ncbi;《NCBI》;20200603;全文 *
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重组人Reelin蛋白;abcam;《abcam》;20200603;全文 *

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