CN1969836A - 诱导干细胞分化为神经干细胞的阿魏酸及其钠盐的试剂和药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及作为诱导胚胎干细胞分化为神经干细胞的阿魏酸及其钠盐的试剂和药物用途。阿魏酸(ferulic acid)，3－(4－hydroxyl－3－methoxyphenyl)－2－propenoic acid，分子式C₁₀H₁₀O₄，相对分子量194.18。阿魏酸的钠盐阿魏酸钠(sodium ferulate)较稳定。阿魏酸及其钠盐，已经作为药物在临床上用于治疗脑血栓形成、冠心病、脉管炎，预防缺血性心脑血管疾病，急性肾功能衰竭等疾患。实验研究发现，阿魏酸及其钠盐阿魏酸钠诱导小鼠胚胎干细胞、人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞，促进小鼠妊娠末期谷氨酸单钠灌胃导致的发育中胎脑损伤的修复。神经干细胞移植合用阿魏酸钠促进脊髓和脑损伤的修复。神经干细胞移植合用阿魏酸钠实验治疗动物帕金森病效果显著。

Description

诱导干细胞分化为神经干细胞的阿魏酸及其钠盐的试剂和 药物用途

发明背景

阿魏酸及其钠盐

阿魏酸，化学名3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoicacid，分子式C₁₀H₁₀O₄，相对分子量194.18，结构式如图1。阿魏酸苯环上的羟基是功能基，可清除自由基，抑制氧化反应和自由基反应。

阿魏酸的理化性质：顺式为黄色油状物，反式为斜方针状结晶(水)，熔点174℃。溶于热水、乙醇及醋酸乙酯，易溶于乙醚，微溶于石油醚及苯。阿魏酸的钠盐较稳定。

阿魏酸的制备：1)从植物，如阿魏、川芎、石松、木贼、稻根等的细胞壁中提取；2)从阿魏酸与一些小分子物质的结合物中获得，如从γ-谷维素的硷性水解产物分离；3)通过组织培养获得，如对糖甜菜、玉米进行细胞悬浮培养，即能获得水溶性的阿魏酸葡萄糖，阿魏酸蔗糖酯等；4)阿魏酸的化学合成多以香兰醛和丙二酸为原料，以无水吡啶为溶剂，哌啶作催化剂，通过缩合反应获得。

作为一种中药活血化瘀的有效成分，中国学者已对阿魏酸的药理作用进行了广泛深入的研究，归纳起来如下。

1)抗氧化  阿魏酸不仅能猝灭自由基，而且能调节人体生理机理，抑制产生自由基产生的酶，促进请除自由基酶的产生，增强其活性。

2)对心肌缺血的保护作用  阿魏酸能增加冠脉流量，保护缺血心肌。由于对α-受体有阻断作用，因而能抑制主动脉平滑肌收缩，对抗甲氯胺、肾上腺素的升压作用。

3)抗血小板聚集作用  大鼠口服阿魏酸钠600mg/kg后2h，以胶原诱导的血小板聚集性及血小板TXA样物质活性均受显著抑制，抑制率为46％及47％。

4)降血脂、抗动脉粥样硬化作用  抑制肝脏合成胆固醇，与生物膜磷脂结合保护膜脂质，清除、拮抗自由基对组织的损伤。

5)抗病毒、抗菌作用  阿魏酸对感冒病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)和艾滋病病毒都有显著抑制作用；阿魏酸抑制细菌的N-乙酰转移酶，对多种细菌，如志贺氏痢疾杆菌、肺炎杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等有较强的抑制作用。

6)抗突变和防癌作用  偶氮甲烷(AOM)人工诱发F334鼠产生结肠癌，加喂500mg/kg阿魏酸的鼠病灶数下降27％。阿魏酸及其衍生物还能抑制结肠癌、直肠癌和舌癌。阿魏酸的抗癌活性可能与它的抗氧化、清除自由基以及激活谷胱苷肽转硫酶、醌还原酶的活性有关。

7)抗过敏、抗早孕、抗痉挛作用。

8)增强肾血流量、显示具有肾髓质扩血管性前列腺素样作用。

9)活化淋巴细胞、促进淋巴细胞增殖。

毒理学  大鼠灌胃给药600mg/kg，每天一次，连续给药3个月，血液学和血液化学指标检测结果均属正常，主要脏器病理学组织学检查未发现药物引起的病理变化。药代动力学  静脉给药，血浆蛋白结合率为20.6％，大鼠分布半衰期(t1/2α)为3分钟，消除半衰期(t1/2β)为(11.46±3.2)分钟，分布迅速，可通过血-脑脊液屏障，主要经肾脏排泄，体内不易蓄积。

阿魏酸在临床上已经用于治疗脑血栓形成、冠心病、脉管炎，偏头痛、预防缺血性脑血管病、急性肾功能衰竭等。在食品工业中，阿魏酸也已作为防腐保鲜剂、食品交联剂、运动食品添加剂被广泛使用。胚胎干细胞及其诱导分化

人类胚胎干细胞分离成功以前，对小鼠胚胎干细胞进行的大量研究表明，小鼠胚胎干细胞在体外不仅可以诱导分化为神经干细胞，而且可以富集得到较纯净的神经干细胞。神经干细胞可以进一步成熟分化为多巴胺能神经元、运动神经元、五羟色胺神经元、GABA神经元，以及少突胶质细胞和星形胶质细胞等。动物实验表明，将体外分化得到的多巴胺能神经元植入Parkinson’s病模型大鼠可以减轻其症状；来自小鼠胚胎干细胞的少突胶质细胞和星形胶质细胞可以使髓鞘脱失的大鼠脊髓髓鞘再生；从小鼠胚胎干细胞分化来的神经干细胞植入跌落损伤脊髓9天的大鼠脊髓，植入的细胞进一步分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞；与对照组相比，治疗组的小鼠可以有限地使用其后肢。如果人类胚胎干细胞与小鼠胚胎干细胞一样，在体外可以分化为多巴胺能神经元、少突胶质细胞等，并能发挥相应的功能，这将为神经系统的再生、修复，以及多种疾病的治疗提供宝贵的细胞来源。80年代人们开始尝试胚胎脑组织细胞移植，用细胞移植的方法治疗神经退行性疾病(如Parkinson’s病，老年性痴呆等，能使大多数病人的症状得到改善。这些结果证实了移植的神经干细胞的存活能力，以及移植治疗的可行性。

神经干细胞及其诱导分化

在成年动物中枢神经系统内的大多数神经细胞是终末分化细胞，其存在贯穿于机体生命的全程，当其死亡则不可代替。然而，有证据表明，在成年动物的脑室区，嗅觉系统和海马有一小部分神经元继续新生。在成年动物的海马，新生的神经元起源于齿状回的颗粒细胞层下区的干细胞。这些干细胞的子代出生后一月内分化为颗粒细胞层的神经元，啮齿类终生具有这种神经细胞再生能力。

体外的研究结果表明，从成年小鼠脑室后和前脑分离出来的神经干细胞，当其受到上皮生长因子(EGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激时，在体外有神经发生能力。碱性成纤维细胞因子对不同脑区分离出来的脑细胞都是一种强丝裂原。碱性成纤维细胞因子可让分离培养的脑海马细胞多次传代长达1年，并诱使其中一些细胞表达神经元表型。定向诱导人类干细胞分化为神经细胞是目前的研究热点。

神经干细胞的定向移动

神经干细胞的移动对于中枢神经系统的发育和大多数脊椎动物(包括哺乳类)成熟中枢神经系统的持续神经发生都是一个必须的过程。无论是小鼠还是人，神经干细胞都有远距离精确定向移动到中枢神经系统损伤部位的能力。这可能是机体局限和修复损伤的适应性反应。神经干细胞移动的信号必然来自损伤部位。

发明概要

本发明涉及作为诱导胚胎干细胞分化为神经干细胞的阿魏酸及其钠盐的试剂和药物用途。

下面列举实验研究的结果，作为阿魏酸及其钠盐可用于诱导胚胎干细胞分化为神经干细胞的试剂和药物的证据。

1.阿魏酸钠体外定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经元样细胞材料和方法

1)药物：阿魏酸钠

2)小鼠胚胎干细胞的分离和培养

取妊娠6天(E6)ICR小鼠，断髓牺牲，放入75％酒精中浸泡消毒1min。超净工作台上打开腹腔，取出子宫，置于盛有D-Hank液的培养皿中。一一取出胚胎，放入盛有D-Hanks液的青霉素瓶中。再用D-Hanks液冲洗3次，眼科剪剪成小碎块(1mm³左右)。加入0.25％胰蛋白酶(刚刚覆盖组织即可)，37℃水平摇床消化15min。15分钟后用含10％小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。吸取消化液，通过250目不锈钢筛网过滤到青霉素瓶中。然后将滤液移入离心管，1000r/min，5min离心。弃上清，台盼蓝染色法计数活细胞数。用DMEM/F12调节为2～5×10⁵个/ml的细胞密度接种，加入含10％血清的DMEM/F12培养基6～7ml，移入50ml培养瓶中培养。24h后，改用不含血清的DMEM/F12培养基培养，3-4天换液一次。

3)小鼠胚胎干细胞的诱导分化

不含血清的DMEM/F12培养基培养的小鼠胚胎干细胞中，加入阿魏酸钠，使其终浓度为10μM，观察细胞形态的变化、照相记录，并进行神经干细胞的鉴定。

4)小鼠神经干细胞的鉴定

以免疫组化方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。

结果

1).光镜下观察

加入阿魏酸钠诱导6h后，部分细胞形态开始改变，胞质向核收缩，呈典型的核周体形态，胞体周围伸出较长的突起(轴突)，突起末端出现一级和二级分支，类似神经元，随着时间的推移，转变为神经元形态的干细胞逐渐增加，部分细胞拉成网状(图2)。超过24h后，小部分细胞脱落，呈现悬浮状态。空白对照组细胞形态未见任何变化。

2).免疫组化鉴定

免疫组化染色显示，实验组中神经元样细胞的胞体及部分突起NSE、NF-M、nestin染色为阳性，呈棕黄色，GFAP染色呈阴性。当阿魏酸钠诱导浓度为10μM时，阳性细胞率为36.82％。

2.阿魏酸钠体外定向诱导人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞材料

1)药物：阿魏酸钠

2)骨髓：成人健康骨髓

3)试剂：Ficoll-paque淋巴细胞分离液，胎牛血清(GIBCO公司)，L-DMEM培养基(GIBCO公司)，碱性成纤维生长因子(bFGF，R&D公司)，小鼠抗人巢蛋白(nestin)单抗(Maxim公司)、小鼠抗人神经元特异性烯醇酶(NSE)单抗、小鼠抗人神经丝蛋白(NF-M)单抗和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单抗(美国Zymed)，Envision二步法试剂盒(DAKO公司)。

方法

1).骨髓间质干细胞的培养和扩增

无菌条件下采集正常人骨髓10～20ml，肝素抗凝，与等体积PBS混匀，轻轻滴加到密度1.077g/ml等量Ficoll-paque分离液上。2500r/min离心25min，收集单个核细胞层，用PBS洗涤两次，1500r/min离心10min。细胞重悬于含10％胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液，以2.0×10⁶/ml密度接种于25cm²塑料培养瓶，置37℃、5％CO²饱和湿度的细胞培养箱培养。48h后更换培养液，弃去未贴壁细胞，3～4天换液1次。贴壁细胞接近80％～90％融合后，用0.25％胰蛋白酶-1mmol EDTA消化0.5～1min，1000r/min离心10min，弃上清，加入L-DMEM培养液，重悬细胞，按1∶3比例传代培养。

2)定向诱导骨髓间质干细胞向神经元分化

bFGF预诱导-阿魏酸钠诱导组(实验组)：传代培养的骨髓间质干细胞按0.5×10⁶/ml接种于事先放置有消毒盖玻片的6孔板内制备细胞爬片。当细胞达到60％～70％融合时，弃培养液，加入含bFGF(10μg/L)的L-DMEM培养液(含20％的FCS)预诱导24h后，更换培养液，PBS洗涤2次，再分别加入不同浓度阿魏酸钠对骨髓间质干细胞进行诱导分化，并在阿魏酸钠10μM条件下，观察同一浓度阿魏酸钠不同时间对骨髓间质干细胞诱导分化的影响。分组：空白对照组，不加任何诱导剂；硫代甘油对照组，用含1mmol/L的硫代甘油的L-DMEM预诱导，再加入含5mmol/L的硫代甘油的L-DMEM诱导；bFGF对照组，单用bFGF预诱导；阿魏酸钠对照组，不用bFGF预诱导，直接加入10μM阿魏酸钠的无血清L-DMEM；bFGF-阿魏酸钠组(实验组)，如上。每组包括12个细胞爬片。免疫组化鉴定。

3)免疫组化鉴定

为确定骨髓间质干细胞是否分化为神经元样细胞，采用神经元标志物NSE、NF-M、nestin、GFAP进行鉴定。诱导细胞用40g/L多聚甲醛固定15min，洗涤后加入过氧化物酶阻断剂，非免疫性动物羊血清封闭，分别加入nestin(1∶50稀释)、NSE(1∶50稀释)、NF-M(1∶100稀释)和GFAP(1∶50稀释)单抗4℃孵育过夜，PBS洗涤后加入Envision孵育30min，TBS洗涤，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固。各组细胞免疫组化染色后光镜下随机读取10个非重叠视野(×100)，计算nestin、NSE、NF-M和GFAP阳性细胞占总细胞数的比例。

结果

1)光镜下观察骨髓间质干细胞的形态变化

骨髓间质干细胞在含bFGF的DMEM预诱导液中处理24h，细胞形态无明显变化。加入阿魏酸钠诱导液3h后，部分骨髓间质干细胞形态开始改变，胞质向核收缩，呈典型的核周体形态，胞体周围伸出较长的突起(轴突)，突起末端出现一级和二级分支，类似神经元，随着时间的推移，转变为神经元形态的骨髓间质干细胞逐渐增加，部分细胞拉成网状。空白对照组细胞形态未见任何变化；硫代甘油对照组诱导5h后，多数细胞呈较典型的神经元样细胞形态，但部分细胞脱落。单用bFGF对照组中仅有少量神经元样细胞出现。单用阿魏酸钠对照组在加入阿魏酸钠诱导液6h后部分骨髓间质干细胞形态开始改变，胞质向核收缩，呈典型的核周体形态，胞体周围伸出较长的突起(轴突)，突起末端出现一级和二级分支，类似神经元，。

2)免疫组化鉴定

免疫组化染色显示，实验组中神经元样细胞的胞体及部分突起NSE、NF-M、nestin染色为阳性，呈棕黄色，GFAP染色呈阴性。

3)不同浓度阿魏酸钠对NSE、NF-M、nestin、GFAP阳性率的影响

NSE染色阳性细胞呈棕黄色，实验组在不同浓度阿魏酸钠(1～20μM)作用下，NSE阳性细胞占总细胞数的比例随着浓度的增加而增加，当阿魏酸钠浓度为10μM时，NSE阳性细胞率＞50％。空白对照组细胞形态未见任何变化；硫代甘油对照组有大量神经元样细胞(NSE和NF-M阳性细胞率＞50％)；单用bFGF对照组有部分神经元样细胞(NSE和NF-M阳性细胞率＜13％)；单用阿魏酸钠对照组有较大量神经元样细胞(NSE和NF2M阳性细胞率＞30％)。

4)阿魏酸钠作用时间与NSE阳性细胞率关系

实验组和硫代甘油对照组随着时间的推移，NSE阳性细胞率增加，且胞浆棕黄颜色加深，10μM阿魏酸钠作用12h NSE阳性细胞率最高，之后NSE阳性细胞数目基本不变。

3.阿魏酸钠对小鼠妊娠末期谷氨酸单钠(MSG)灌胃导致的发育中胎脑损伤的修复作用

材料和方法

取8周龄ICR小鼠40只，2雌1雄随机配对同箱饲养。交配成功后分笼饲养。待母鼠妊娠晚期，胎鼠中枢神经系统基本发育分化完全，即妊娠17-21日，一次性灌胃给予母鼠MSG(3.0g/kg体重)，对照组一次性灌胃同体积生理盐水。所产仔鼠进行下述实验。实验组从生后10日起腹腔注射阿魏酸钠溶液(60mg/kg体重)，每天1次，共计30日，对照组腹腔注射同体积生理盐水。末次注射后24h从每组随机取4只小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(0.06mg/kg体重)麻醉，用10％福尔马林溶液作心脏灌流牺牲小鼠。断头取脑，置相同浓度福尔马林溶液中固定1周。石蜡包埋，作10μm连续切片，每100μm取1片。焦油紫染色，光镜检查。各组剩下的小鼠于末次注射阿魏酸钠溶液后的第1日、第31日、第61日和第91日分别进行4次行为学检查，检查小鼠的学习记忆能力，自主活动，爬绳能力等。

结果

行为检查结果显示，药物(阿魏酸钠)对照组与正常对照组小鼠的学习记忆、爬绳能力和自主活动无明显差别。MSG组小鼠的学习记忆、爬绳能力，前3次检查，较之对照组都显著降低，差异非常显著(P＜0.01)，第4次(即第91日)检查有一定提高，但差异仍显著(P＜0.05)。与之相反，MSG小鼠的自主活动前3次检查都明显增加，差异非常显著(P＜0.01)，第4次(即91日)检查则接近正常(P＞0.05)。4次行为检查结果都显示，实验组(MSG+阿魏酸钠)小鼠的各种行为学检查与正常对照组小鼠无明显差别(P＞0.05)。形态学检查结果显示，药物(阿魏酸钠)对照组小鼠海马区神经细胞形态与正常对照组无明显差别，MSG组小鼠海马区神经细胞则明显变性、坏死，而MSG+阿魏酸钠处理的实验组小鼠海马区细胞形态与正常对照组和药物(阿魏酸钠)对照组小鼠的接近，无明显差别(图3)。

4.神经干细胞移植合用阿魏酸钠修复脊髓损伤

材料和方法

1)大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定

取孕16-18日的SD大鼠，断髓牺牲，放入75％酒精中浸泡消毒1min。超净工作台上打开腹腔，取出子宫，一一取出胎鼠，剪开头皮，去除颅骨，剥离硬膜，分离胎鼠大脑半球，取大脑皮质及皮质下脑室旁脑组织，将其放入盘中。加入PBS，用眼科剪剪成约1mm3组织小块，用微量加样器反复轻柔吹打。通过250目不锈钢筛网过滤，加PBS，光镜下观察，制成单细胞悬液。台盼蓝染色法计数活细胞数。培养，传代，5-7日传代一次。对培养细胞行nestin、NSE、GFAP免疫组化鉴定。

2)脊髓损伤的动物模型

成年SD大鼠48只，雌雄不拘，随机平均分为3组：损伤组(A组，假手术对照组)、神经干细胞移植组(B组)及神经干细胞移植合用阿魏酸钠组(C组)。用体积分数3％戊巴比妥钠麻醉，背正中纵形切口，显露并切除T_10-12棘突和椎板，充分暴露脊髓将其横断并剪去0.3-0.5cm，制作大鼠后肢瘫痪动物模型，但不损伤A组动物脊髓。

3)神经干细胞移植及合用阿魏酸钠

B、C组动物在损伤后3d进行神经干细胞移植。之前将培养传代的神经干细胞经台盼蓝染色，活细胞计数后，选取生长良好的培养细胞(活细胞达95％以上)，500r/min离心10min，取细胞团块，加生理盐水制成1×10²/ml细胞悬液。沿原切口部位暴露脊髓损伤灶，作局部多点注射。C组动物在神经干细胞移植后次日起腹腔注射阿魏酸钠溶液(60mg/kg体重)，每天1次，共计30日。A、B组腹腔注射同体积生理盐水。

4)观察指标

①各组动物按双后肢功能恢复情况进行等级评分。双后肢完全瘫痪为0分；重度瘫痪(肌张力存在)为1分；中度瘫痪仍可行走者为2分；正常为3分。

②脊髓移植区的组织形态学变化：细胞移植30日后，取出移植区脊髓，作切片以常规苏木素·伊红染色，观察比较各组间的组织学变化。

结果

1)大鼠胚胎神经干细胞培养  原始神经干细胞为圆球状，体积较人类神经干细胞略大，活细胞比例大于95％。培养2-3日后，细胞分裂形成多个细胞组成的细胞团，悬浮生长。之后细胞团逐渐增大，少量细胞贴壁生长，并出现突起，相互交织成网状。经液体微孔稀释法处理的单个细胞，仍然可见细胞分裂。Nestin免疫组化染色呈阳性。

2)神经干细胞移植及合用阿魏酸钠

①细胞移植后第6-8日，C组动物瘫痪的后肢肌力开始恢复，细胞移植后第8-10日B组动物瘫痪的后肢肌力开始恢复，被评为1分；第12-18日C组动物可爬行，第16-22日B组动物可爬行，评为2分；30日后，B组动物后肢活动活跃，已接近3分，C组动物后肢活动恢复正常，评为3分，；对照组瘫痪的肢体无任何恢复仍为0分。

②细胞移植30日后脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填，镜下有大量新生的细胞，表现为神经元和神经胶质细胞阳性染色(GFAP(+)、NSE(+)，C组动物脊髓移植区组织充填较B组动物的更充实；对照组肉眼见两断端间呈空腔状，镜下脊髓残端变性坏死明显。

5.神经干细胞移植合用阿魏酸钠修复脑损伤

材料和方法

1)大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定同上。

2)脑损伤的动物模型

SD大鼠24只，雌雄兼有。体积分数3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后头顶正中切开头皮，钻开顶骨，显露右侧大脑半球。用直径0.3cm的克氏针垂直向大鼠大脑右侧顶叶皮质刺入0.5cm左右，造成脑挫裂伤动物模型。动物随机平均分为4组：A组，对照组，单侧损伤，未作移植；B组，单侧损伤，未作移植，腹腔注射阿魏酸钠溶液；C组，单侧损伤，细胞移植；D组，单侧损伤，细胞移植并腹腔注射阿魏酸钠溶液。24h后进行神经干细胞移植(及合用阿魏酸钠)实验。

3)神经干细胞移植及合用阿魏酸钠

按上述分组要求进行：脑损伤部位的神经干细胞移植(6×10⁴神经干细胞，多点注射)，腹腔注射阿魏酸钠溶液(60mg/kg体重)，每日1次，共计45日。术后46日断髓牺牲动物，取脑标本，肉眼和显微镜下观察。

结果

C组(细胞移植)动物肉眼观损伤区脑组织基本平坦，仅见轻微灰褐色色素沉着，显微镜下可见大量新生的细胞和血管，而变性或坏死细胞则很少；D组(细胞移植及合用阿魏酸钠)动物肉眼观损伤区脑组织平坦，无色素沉着，显微镜下可见大量新生的细胞和血管。对照组动物损伤区局限性轻度凹陷，脑组织坏死，呈深灰褐色，其内有陈旧性凝血块，显微镜下则可见损伤区大量神经细胞变性、坏死，区域性融合呈空泡状，缺乏细胞增生迹象。

6.神经干细胞移植合用阿魏酸钠实验治疗动物帕金森病

材料和方法

1)试剂：1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP，)，是一种神经毒素，来源于人工合成毒品的中间产物。由于它的致幻作用，曾被作为毒品吸食，在对这些吸毒者的研究中偶然发现能引起类似帕金森病的症状。Langston(1983)报告该物质在人类可引起帕金森病综合征，Burns(1983)发现其在灵长类动物也可引起酷似人类帕金森病的表现。病理、生化研究证实MPTP在人和非人灵长类动物引起的帕金森病综合征同人类原发性帕金森病的表现也极其相似，表现为黑质致密部多巴安能神经元变性、死亡，黑质及纹状体酪氨酸羟化酶活性、多巴安及其代谢产物含量降低。MPTP造成的神经化学、动物行为和组织病理学改变都与人类的帕金森病症状类似，被公认是最好的帕金森病动物模型。

2)动物：10-12周龄，体重25～30g C57/BI褐小鼠。

3)小鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定：取孕15日的C57/BI褐小鼠，仿大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定方法进行。

4)帕金森病动物模型：C57/BI褐小鼠40只，雌雄不拘，腹腔内注射MPTP 20mg/kg，每2h一次，共4次。

5)小鼠脑室神经细胞移植法：用手抓住小鼠头部皮肤并将皮肤拉紧，在距头部中线2mm处与两侧耳根前部连线相交叉的点，用3/8英寸(长)27gauge的皮下针头垂直刺人，穿破颅骨进入脑室，缓慢注入细胞悬液。

6)分组：小鼠腹腔注射MPTP后随机平均分为4组：A组，对照组，注射MPTP后24h缓慢向小鼠侧脑室注射生理盐水10μl，每5日1次，共计2次，左右侧脑室各1次；B组，阿魏酸钠组，注射MPTP后24h缓慢向小鼠侧脑室注射生理盐水10μl，每5日1次，共计2次，左右侧脑室各1次，同时腹腔注射阿魏酸钠溶液(60mg/kg体重)，每日1次，共计30日；C组，细胞移植组，注射MPTP后24h缓慢向小鼠侧脑室注射神经干细胞悬液10μl(5×10³细胞)，每5日1次，共计2次，左右侧脑室各1次，；D组，细胞移植并合用阿魏酸钠组，注射MPTP后24h缓慢向小鼠侧脑室注射神经干细胞悬液10μl(5×10³细胞)，每5日1次，共计2次，左右侧脑室各1次，同时腹腔注射阿魏酸钠溶液(60mg/kg体重)，每日1次，共计30日。

7)病理组织学检查：末次注射后24h从每组随机取4只小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(0.06mg/kg体重)麻醉，用10％福尔马林溶液作心脏灌流牺牲小鼠。断头取脑，置相同浓度福尔马林溶液中固定1周。石蜡包埋，作10μm连续切片，每100μm取1片。焦油紫染色，光镜检查。

7)动物行为学改变的观察  观察检测小鼠肢体运动协调情况。

(1)爬杆试验：将一直径为25cm的软木小球固定于一根长50cm粗1cm的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录以下几个时间。①小鼠从小球上下来所需要的时间；②小鼠爬完杆子的上半部分所用的时间；③小鼠爬完杆子下半部分所用的时间。然后按以下标准记分：3s内完成上述某一动作的记3分；6s内完成的记2分；超过6s的记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析。

(2)悬挂实验：将受试小鼠悬挂于一水平电线上，如小鼠用两后爪抓住电线则记3分，如用一后爪抓住电线则记2分。如果小鼠两后爪均抓不住电线则记1分，最后计算得分情况，并作统计学分析。

(3)游泳实验：将受试小鼠放人一个20cm×30cm×20cm规格的水箱中，水温为22～25℃。评分标准如下：在受试时间(5min)内能连续不断游泳者记3.0分；大部分时间游泳仅偶尔漂浮者记2.5分；漂浮时间占整个受试时间50％以上者记2.0分；偶尔游泳者记1.5分；偶尔用后肢游动并漂浮在一边者记1.0分。最后计算得分情况，并作统计学分析。

结果

综合病理组织学检查和动物行为学改变观察结果，实验治疗帕金森病的效果从大到小依次为：细胞移植并合用阿魏酸钠组＞细胞移植组＞单用阿魏酸钠组。

7.神经干细胞移植合用阿魏酸钠的临床意义

利用自体和异体干细胞移植治疗神经系统损伤和疾病可提供一种有广阔应用前景的新治疗途径。目前应用最多、治疗效果最好的是脑组织神经干细胞移植治疗帕金森病。从患者受损脑组织中提取神经干细胞，体外培养、扩增后再植入损伤部位，患者可恢复部分认知功能。患者自体骨髓间质干细胞亦可作为干细胞来源。上文结果提示，干细胞移植的同时合用阿魏酸钠治疗效果更好。

人类胚胎干细胞的培养成功为长期困扰医学界的难题如帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、脑和神经损伤后修复等带来了解决的希望。选择的移植材料的最好来源，从其出现开始人们就寄予厚望，体外定向诱导人类胚胎干细胞分化为神经细胞是目前研究和开发的热点。拟胚体分化法及高细胞密度延长培养分化法均可诱导胚胎干细胞分化为神经细胞，上文结果提示，阿魏酸钠可作为诱导胚胎干细胞分化为神经干细胞和神经细胞的诱导剂。

移植转基因的干细胞还可治疗神经遗传性疾病，干细胞作为基因工程细胞具有自身固有的优势，阿魏酸钠可诱导干细胞分化为神经细胞，在结构上与宿主受损的脑组织相整合，同时还能在脑内迁移较远的距离。

肿瘤生长不可避免地导致颅内压增高及再灌注的血流量增多，同时受损细胞异常的离子流动以及兴奋性谷氨酸的释放也会造成相关的损害。化疗及放疗会杀伤少突胶质细胞、室管膜下区神经干细胞、以及海马齿状回前体细胞等，导致认知功能障碍。因此，对脑肿瘤理想的治疗是既能杀伤肿瘤细胞又能修复损伤的脑组织。在化疗及放疗的同时移植神经干细胞并合用阿魏酸钠，有可能改善临床治疗效果。

8.下列的配方举例说明本发明的制剂。

                       附图注释

附图1：A.阿魏酸；B.阿魏酸钠

附图2：阿魏酸钠体外定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经元样细胞A.小鼠胚胎干细胞(对照组，×50)；B.小鼠胚胎干细胞分化为神经元样细胞(阿魏酸钠10μM，12h，×50)

附图3：阿魏酸钠对小鼠妊娠末期谷氨酸单钠灌胃导致的发育中胎脑损伤的修复作用

A.对照，×200；B.谷氨酸单钠(3.0g/kg)，×200；C.谷氨酸单钠(3.0g/kg)+阿魏酸钠(60mg/kg/日，30日)，×200

实施例1：片剂，

NO

组分

用量

		mg/片	mg/片
				12345	阿魏酸钠乳糖USP玉米淀粉，食品级，呈10％的纯水浆状物玉米淀粉，食品级硬脂酸镁	5012230953	100123401307
合计  300			400

制造方法

在适当的混合机中混合第1项和第2项组分15分钟，第3组分与混合物粒化。如果需要，通过一个初筛研磨潮湿的颗粒，并使之干燥。如果需要，将干燥的颗粒过筛，并与第4项混合10-15分钟。加入第5项混合1-3分钟。在适当的压片机中将混合物压成适当的尺寸和重量。

实施例2：胶囊剂

NO	组分	用量
				1234	阿魏酸钠乳糖USP玉米淀粉，食品级硬脂酸镁NF	mg/粒50106404	mg/粒100120737

合计

200

300

制造方法

将第1、2和第3项在适当的混合机中混合10-15分钟，加入第4项混合1-3分钟。在适当的包囊机上将该混合物装入适当的胶囊中。

实施例3：注射液

1阿魏酸钠    100g

2葡萄糖      400g

3注射用水    加至10000ml

实施例4：粉剂

阿魏酸钠  纯度≥97％      10-1000mg包装

阿魏酸钠  纯度≥97.5％    10-1000mg包装

阿魏酸钠  纯度≥98％      5-500mg包装

阿魏酸钠  纯度≥98.5％    5-500mg包装

阿魏酸钠  纯度≥99％      1-100mg包装

阿魏酸钠  纯度≥99.5％    1-100mg包装

阿魏酸钠  纯度≥99.9％    1-100mg包装

Claims (1)

1.阿魏酸及其钠盐用于制备诱导胚胎干细胞分化为神经干细胞的试剂和药物用途。

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