EA021833B1

EA021833B1 - Композиции полимера мирцена

Info

Publication number: EA021833B1
Application number: EA201190170A
Authority: EA
Inventors: Задик Хазан; Шимон Амселем
Original assignee: Редженера Фарма Лтд.
Priority date: 2009-03-04
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2015-09-30
Also published as: CN102413834B; PL2403512T3; EP2403512A2; WO2010100651A3; BRPI1013222A2; CN102413834A; DK2403512T3; IL248056A0; AU2010220057A1; EP3578191A1; WO2010100651A4; AU2010220057B2; BRPI1013222B1; US20120039992A1; US20170252387A1; US20190255132A1; AU2010220057C1; WO2010100651A2; IL214923A0; EA201492273A1

Abstract

Изобретение относится к композициям и составам, содержащим полимер мирцена. В частности, изобретение относится к композициям, содержащим выделенную фракцию полимера мирцена в гидрофобном носителе, и к составам, сохраняющим биологическую активность активного полимера.

Description

Изобретение относится к композициям, выделенным из мастиковой смолы, и терапевтическим применениям указанных композиций. В частности, изобретение относится к композициям, содержащим выделенную фракцию полимера мирцена, и составам, сохраняющим биологическую активность активного полимера.

Уровень техники

Поиски новых лекарственных субстанций, полученных из растений и растительных продуктов, для различных терапевтических применений велись, начиная с античности, и продолжаются до настоящего времени. Одним из таких источников является мастика, также известная как мастиковая смола или смола мастикового дерева, которая представляет собой древесную смолу, полученную в виде выделений из ΡίχΙαοία ΙοηΙίχαιιχ Ь., входящего в семейство АпасагЛасеае. В античном Средиземноморье мастику применяли при желудочно-кишечных расстройствах, таких как гастралгия, диспепсия и пептическая язва. Было показано, что пероральное введение мастики пациентам-людям, страдающим язвой двенадцатиперстной кишки, и подопытным крысам с индуцированными язвами желудка и двенадцатиперстной кишки, имеет терапевтический эффект (А1-НаЬЬа1 е1 а1. (1984) СБп Ехр РЬагтасор Ρΐινχίο 11(5):541-4; δηίά е1 а1. (1986) 1. Е1ЬпорЬагтасо1 15(3):271-8). Хотя сообщалось, что мастика обладает ίη νίίτο бактерицидным действием на НеБсоЬайег ру1оп - этиологический агент, вызывающий язвенную болезнь (Магопе еί а1. (2001) 1. СЬетоШет 13:611-614), в других сообщениях было указано, что мастика не проявляет антибактериальной активности при введении пациентам-людям, зараженным Н. ру1оп (ВеЬЬ еί а1. (2003) 1. АЩшпсгоЬ СЬетоШет 52:522-23) или экспериментально инфицированным мышам (ЬоидЬ1ш еί а1. (2003) 1. АпОтютоЬ СЬетоШет 51:367-371).

В патенте Греции № ОК. 1003541 описано противомикробное и противогрибковое действие хиосского мастикового масла, экстрагированного из листьев, ветвей и плодов ΡίχΙ;κί;·ι 1еп(1хсих \чг С1па.

В патенте Греции № ОК 1003868 описано применение продукта, полученного из ΡίχΕι^-ι ΚπΙίχαιχ \'аг. СЫа, в качестве антиоксиданта, в качестве вещества, вызывающего заживление ран, и в качестве цитостатического агента.

В опубликованной заявке на патент США № 2005/0238740 описано, что некоторые фракции, экстрагированные из мастиковой смолы, проявляют антимикробную и антипролиферативную активность. Согласно указанному описанию первый экстракт (названный суммарной фракцией или цельным экстрактом) содержит все соединения мастиковой смолы, кроме полимерной смолы; второй экстракт представляет собой кислую фракцию, содержащую все тритерпеновые кислоты из суммарной фракции; и третий экстракт представляет собой нейтральную фракцию, содержащую все остальные терпены из суммарной фракции. Дополнительно описано эфирное масло, полученное путем перегонки, которое содержит монотерпены, включая β-мирцен. В указанной заявке описаны фармацевтические составы, содержащие любую из указанных выше суммарной, кислой или нейтральной фракций, возможно, в сочетании с эфирным маслом или синтетическими эквивалентами эфирного масла или содержащие выделенные компоненты или их синтетические эквиваленты, а также применение указанных соединений в способах лечения микробных инфекций, включая Н. ру1оп. РгорюшЬайетшт, ^рЬу1ососсш, Ρχеиάοтοηаχ, и гиперпролиферации клеток.

Ρа^аχсЬοχ еί а1. (2007), где в число авторов входили некоторые из авторов указанной выше заявки на патент, было предложено получение суммарного экстракта мастики, не содержащего полимера (ТМЕАР), полученного путем экстрагирования полярным растворителем сырой мастики и удаления из полученного экстракта нерастворимого полимера поли-β-мирцена, и кислой и нейтральной фракций, выделенных из ТМЕАР (Ρа^аχсЬοχ еί а1. (2007) АпОппсгоЬ АдепЬ СЬетоШет 51(2):551-559). Согласно указанному документу введение ТМЕАР мышам, зараженным Н. ру1оп, в течение 3 месяцев приводило к 30-кратному уменьшению бактериальной колонизации, по большей части приписываемому конкретному соединению, выделенному в чистом виде из кислой фракции. Авторы указывают, что ТМЕАР получали, поскольку предполагали, что высокое процентное содержание поли-в-мирцена в препаратах сырой мастики, применявшихся в предшествующих исследованиях, препятствует возможной активности ш νί\Ό при пероральном введении. Далее авторы сообщают, что удаление поли-в-мирцена может обеспечить получение компонента с улучшенной терапевтической активностью в отношении Н. ру1отЕ

В заявке на патент ЕР №1520585 описано применение продукта, полученного из растения рода Ρ^χйаа, для производства лекарственного средства для лечения или предотвращения рака. Согласно указанной заявке эфирные масла, полученные перегонкой из листьев, веток, плодов, орехов и цветов различных видов Ρ^χίас^а, содержат широкий ряд мономерных терпеновых соединений в различных соотношениях, в том числе и β-мирцен. Далее в указанной заявке описаны эфирные масла, проявляющие противоопухолевую активность в отношении линий клеток определенных типов опухолей, таких как аденокарциномы кишечника и яичников, и то, что борнилацетат представлял собой единственное соединение, у которого была обнаружена противораковая активность.

В публикации международной заявки на патент АО 2005/112967 описано выделение из мастики противоракового соединения, имеющего антипролиферативное действие, которое было обнаружено в

- 1 021833 растворимой фракции, полученной путем суспендирования мастики в растворителе, выбранном из некислотного алифатического углеводорода, водного раствора, содержащего по меньшей мере 25% водорастворимого некислотного алифатического углеводорода, или их комбинаций, и удаления нерастворимой фракции. Далее в указанной заявке описан способ лечения раковых клеток, включающий введение фармацевтически эффективного количества фракции мастиковой смолы, ингибирующей рост раковых клеток. Согласно указанной заявке противораковое соединение эффективно в отношении различных типов раковых клеток, включая раковые клетки кишечника человека.

Уап бет Вегд е! а1. (1998) описывают выделение и очистку полимерной фракции мастики при помощи экстракции и эксклюзионной хроматографии (Уап бег Вегд е! а1. (1998) ТеЦаНебгоп Ьей 3:2645-2648). Согласно указанному описанию полимер имеет широкое молекулярно-массовое распределение, т.е. от 20000 до 100000 Да, состоит из мономерных звеньев с молекулярной массой 136 Да и имеет структуру 1,4-поли-в-мирцена, содержащего цис- и транс-конфигурации в соотношении 3:1. Авторы утверждают, что их описание является первым сообщением об обнаруженном в природе полимере монотерпена.

Ватта е1 а1. (2007) описывают экстракцию и анализ методом газовой хроматографии эфирного масла, полученного из Р. 1епЬ8СИ8 Ь. (Ватта е! а1. (2007) I. Адпс Рооб СЬет 55(17):7093-7098). Согласно указанному описанию всего было идентифицировано 45 соединений, включая β-мирцен в качестве одного из главных компонентов.

Магпег е! а1. (1991) описывают идентификацию различных тритерпеноидов из мастиковой смолы Р. 1епЬ8СИ8 (Магпег е! а1. (1991) РЬуЮсЬепщЦу. 30, 3709-3712).

В патенте США № 5506406 описано мастиковое масло, полученное путем растворения мастики в масле или жире и помещенное в мягкую капсулу, которая, возможно, дополнительно содержит амфипатическое вещество, такое как хитин или хитозан. Согласно указанному описанию капсула эффективна для устранения и ингибирования Η. ру1оп и для уменьшения запаха кала.

В патенте США № 5637290 описан продукт для гигиены полости рта, содержащий комбинацию зубной пасты и ингредиента, выбранного из природной мастики, экстрагированного мастикового масла и синтетических агентов мастикового масла. Также описано применение мастик для включения в лосьон для загара, продукты для волос и косметические средства.

В патенте США № 6623728 описаны композиции косметической эмульсии для ухода за кожей, содержащие примерно от 0,001 мас.% примерно до 10 мас.% солюбилизированной мастиковой смолы; летучий смешиваемый с водой растворитель и косметически приемлемую несущую среду. Согласно указанному описанию эмульсия предпочтительно представляет собой эмульсию типа масло-в-воде, а предпочтительные растворители включают этанол, метанол, пропанол, изопропиловый спирт и смеси указанных соединений. Согласно указанному описанию, те же типы растворителей применяют для получения солюбилизированной мастиковой смолы.

В патенте США № 6811769 описана композиция для перорального введения, содержащая масляный экстракт мастики, такой как экстракт, полученный с применением оливкового масла или пальмового масла; и противовоспалительное средство, такое как глицирризиновая кислота. Согласно указанному описанию композиция обладает антибактериальным действием по отношению к бактериям, связанным с заболеваниями периодонта и по отношению к бактериям, связанным с кариесом.

В патенте США № 7294651 описано применение изопреноидных соединений, в том числе терпеновых соединений, для ингибирования выработки экзобелков грамположительных бактерий, таких как токсин синдрома токсического шока-1, выделяемый 8. аигеи8. Согласно указанному описанию подходящие терпены могут быть циклическими или ациклическими, насыщенными или ненасыщенными и также включают политерпены. Также описано применение указанных соединений для получения композиций, которые можно включить в состав водных растворов, таких как вагинальные моющие составы.

В патенте США № 4564718 описано получение полимеров, содержащих на концах цепи функциональные группы, называемых жидкие каучуки, которые имеют температуру стеклования существенно ниже комнатной температуры, путем полимеризации терпена или кислородсодержащего производного терпена, содержащего двойную связь или сопряженную двойную связь, способную к полимеризации, при помощи инициатора, обеспечивающего выбранные концевые функциональные группы. Согласно указанному описанию полимеры предпочтительно имеют молекулярную массу от 500 до 20000, и для получения указанных полимеров предпочтительны ациклические монотерпены, в том числе β-мирцен. В указанном патенте описано получение полимера мирцена молекулярной массой примерно 2000 и примерно 4000. Дополнительно в указанном патенте описано, что полимеры согласно указанному изобретению могут дополнительно взаимодействовать с другими реагентами с образованием эластомеров, герметиков или клеев, или их можно применять в качестве агентов, упрочняющих каучуки. Дополнительно описано получение из мирцена полимирцена с гидроксильными концевыми группами и применение указанного соединения для получения полиуретанового эластомера.

В статье Ыееттагк е! а1. 1. Ро1утег 8с( 26, 71-77 (1988) описан синтез полимирцена, имеющего наблюдаемую молекулярную массу 87000 и расчетную молекулярную массу 46000.

В патенте США № 4374957 описан клейкий термопластический эластомерный линейный трехблоч- 2 021833 ный полимер, соответствующий формуле А-В-А, где А представляет собой неэластичный линейный гомополимерный блок моновинильного ароматического углеводорода, имеющий среднюю молекулярную массу от 10000 до 60000 и температуру стеклования выше 70°С, а В представляет собой эластомерный гомополимерный блок мирцена, имеющий среднюю молекулярную массу от 50000 до 200000 и температуру стеклования ниже примерно -40°С.

В патенте США № 5759569 описаны биоразлагаемые, способные подвергаться компостированию изделия, по меньшей мере, частично содержащие определенные транс-полимеры, причем указанные полимеры имеют среднемассовую молекулярную массу по меньшей мере примерно 20000 и получены путем полимеризации мономерного компонента, содержащего (1) примерно от 70 до 100 мол.% 1,3-диенов, в том числе β-мирцена; и (2) примерно до 30 мол.% других совместимых сомономеров. Согласно указанному описанию указанные изделия включают, в том числе, упаковочные материалы: одноразовые впитывающие изделия (например, подгузники, гигиенические салфетки); предметы одежды, такие как защитная спецодежда, операционные салфетки, операционные халаты, операционные простыни; тканые, вязаные и нетканые материалы; хирургические губки, аппликаторы тампонов, одноразовые шприцы и контейнеры.

В патентах США №№ 7232872 и 7214750 описан процесс полимеризации, включающий приведение в контакт одного или нескольких мономеров, в том числе мирцена, одной или нескольких кислот Льюиса, одного или нескольких инициаторов и разбавителя, содержащего один или несколько фторированных углеводородов, в реакторе.

В заявке на патент США № 2007/0179260 и в патенте США № 7417103 описаны полимеры на основе 3,4-изопрена с высокой региорегулярностью и способ получения указанных полимеров. Согласно указанным описаниям среднечисленная молекулярная масса полимера составляет от 5000 до 6000000, и полимер может также содержать звенья 1,4-изопренов, таких как мирцен. Согласно указанному описанию полимер подходит для применения в качестве пластического материала благодаря его механической и термической стойкости.

Известный уровень техники не содержит каких-либо идей или предположений, касающихся применения выделенной фракции полимера мирцена, ни полученной из мастики, ни синтезированной химически, в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции или для терапевтического применения. Известный уровень техники не описывает или не предполагает наличия преимуществ при применении выделенной фракции полимера мирцена, - ни полученной из мастики, ни синтезированной химически, - в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции или для терапевтического применения.

Краткое описание изобретения

Согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие полимерные формы монотерпенового соединения, известного как мирцен, проявляющие ряд благоприятных биологических активностей, которые можно использовать для терапевтических применений. В частности, в настоящем изобретении описаны композиции, содержащие выделенные фракции полимера мирцена, включая синтезированные химически и полученные из растительных источников, таких как мастиковая смола, имеющие активность в области нейропротекции, регенерации тканей и восстановлении тканей и ран.

Композиции согласно настоящему изобретению можно получить путем экстракции растворителями определенного растительного материала, такого как мастиковая смола, таким образом, чтобы получить выделенные фракции, растворимые как в полярных, так и в неполярных растворителях, и освобожденные от различных мономерных терпеновых соединений, влияющих на желаемую биологическую активность.

Идеи настоящего изобретения были проиллюстрированы примерами экстрактов мастиковой смолы, полученных при помощи двухстадийной методики экстракции, таким образом, чтобы получить фракцию, растворимую как в полярном, так и в неполярном растворителе, при этом материал мастиковой смолы, растворимый в полярном растворителе, но оставшийся нерастворимым в неполярном растворителе, удаляли. Также настоящее изобретение было проиллюстрировано как полимером мирцена, выделенным из природного источника, т.е. мастикой древесной смолы, так и химически синтезированным полимером мирцена, имеющим молекулярную массу в том же диапазоне, и химическую структуру, соответствующую химической структуре полимера, выделенного из мастики.

Кроме того, идеи настоящего изобретения особенно неожиданны и удивительны на фоне описанного применения фракций экстракта мастиковой смолы, из которых был удален полимер мирцена. Более того, в известном уровне техники утверждают, что полимерные фракции, полученные из мастики, не подходят для терапевтического применения и что присутствие полимера мирцена в терапевтических композициях действительно подавляет благоприятное биологическое действие и биодоступность активных соединений. В известном уровне техники описано, что активные соединения мастиковой смолы соответствуют различным низкомолекулярным молекулам терпенового типа, в том числе мономеру мирцена. Однако авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили в противоположность известным из уровня техники взглядам, что мономер мирцена, низшие олигомерные формы мирцена и некоторые другие низкомолекулярные терпены препятствуют и блокируют активность полимера мирцена в отно- 3 021833 шении индуцирования дифференцировки клеток.

Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией или механизмом действия, отметим, что активность полимера мирцена в отношении индуцирования дифференцировки нервных клеток, как описано в настоящем изобретении, делает настоящее изобретение полезным для образования новых межнейронных связей и преодоления нарушения межнейронного взаимодействия в головном мозге и нервной ткани, пораженных патологиями, связанными с нарушением образования синапсов. Указанная патология лежит в основе многих патологий нервной системы, включая, например, болезнь Альцгеймера. Дополнительно настоящее изобретение подходит для стимуляции заживления ран и омоложения широкого ряда клеток и тканей.

В настоящем описании полимер мирцена включает полимерные формы мирцена, имеющие степень полимеризации по меньшей мере 6. Полимер мирцена включает, без ограничения, полимер β-мирцена (поли-в-мирцен), полимер α-мирцена (поли-а-мирцен), гомополимеры и гетерополимеры указанных соединений (также известные как сополимеры), содержащие субъединицы мирцена. Также включены геометрические изомеры, оптические изомеры и диастереомеры полимерных соединений мирцена.

Следует однозначно понимать, что в объем настоящего изобретения не включен мирцен в мономерной форме, такой как β-мирцен и α-мирцен, в качестве активных ингредиентов фракций и композиций согласно настоящему изобретению.

В настоящем описании β-мирцен относится к 7-метил-3-метилен-1,6-октадиену, а α-мирцен относится к структурному изомеру указанного соединения 2-метил-6-метилен-1,7-октадиену.

Далее следует понимать, что биологическая активность фракций и композиций согласно настоящему изобретению ингибируется в присутствии определенных мономерных и низших олигомерных форм различных терпенов.

Согласно первому из аспектов настоящего изобретения предложена композиция, содержащая эффективное количество выделенной фракции мастиковой смолы, причем указанная фракция характеризуется растворимостью по меньшей мере в одном полярном органическом растворителе и по меньшей мере в одном неполярном органическом растворителе и, по существу, не содержит соединений, растворимых в указанном полярном органическом растворителе, но не растворимых в указанном неполярном органическом растворителе.

Согласно конкретному варианту реализации композицию получают при помощи процесса, включающего стадии:

(a) обработки мастиковой смолы полярным органическим растворителем;

(b) выделения фракции, растворимой в указанном полярном органическом растворителе;

(c) возможно, удаления указанного органического растворителя;

(ά) обработки растворимой фракции, полученной на стадии (Ь) или (с), неполярным органическим растворителем;

(е) выделения фракции, растворимой в указанном неполярном органическом растворителе; и (ί) возможно, удаления указанного неполярного органического растворителя, причем стадии (ά)-(ί) могут предшествовать стадиям (а)-(с).

Согласно конкретным вариантам реализации стадии (а)-(с) осуществляют перед стадиями (ά)-(ί) или стадии (ά)-(ί) осуществляют перед стадиями (а)-(с). Согласно конкретным вариантам реализации стадии (а)-(с) и/или стадии (ά)-(ί) повторяют в виде множества циклов.

Согласно конкретному варианту реализации стадии (с) и/или (ί) включают удаление растворителя при помощи средств, выбранных из группы, состоящей из ротационного выпаривания, применения высокого вакуума и комбинации указанных средств. Согласно конкретному варианту реализации процесс дополнительно включает фракционирование по размеру растворимой фракции, полученной в указанном процессе.

Полярные органические растворители, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, можно выбирать из спирта, простого эфира, сложного эфира, амида, альдегида, кетона, нитрила и комбинаций указанных соединений.

Конкретные примеры подходящих полярных органических растворителей включают метанол, этанол, пропанол, изопропанол, 1-бутанол, 2-бутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, 1-пентанол, 2-пентанол, 3-пентанол, неопентанол, 3-метил-1-бутанол, 2-метил-1-бутанол, 3-метил-2-бутанол, 2-метил-2-бутанол, этиленгликоль, этиленгликоля монометиловый эфир, диэтиловый эфир, метилэтиловый эфир, этилпропиловый эфир, метилпропиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, тетрагадрофуран, дигидрофуран, фуран, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, метилацетат, этилацетат, пропилацетат, ацетальдегид, метилформиат, этилформиат, этилпропионат, метилпропионат, дихлорметан, хлороформ, диметилформамид, ацетамид, диметилацетамид, Ν-метилпирролидон, ацетон, этилметилкетон, диэтилкетон, ацетонитрил, пропионитрил и комбинации указанных соединений.

Согласно конкретным вариантам реализации полярный органический растворитель представляет собой этанол.

Неполярные растворители, подходящие для применения в настоящем изобретении, можно выби- 4 021833 рать из ациклических или циклических насыщенных или ненасыщенных алифатических углеводородов и ароматических углеводородов, каждый из которых может содержать в качестве заместителей один или несколько атомов галогенов, и комбинаций указанных соединений. Согласно конкретному варианту реализации неполярный органический растворитель выбран из С5-С10 алканов, С5-С10 циклоалканов, С6С14 ароматических углеводородов и С7-С14 перфторалканов и комбинаций указанных соединений.

Согласно конкретным вариантам реализации неполярный органический растворитель выбран из пентанов, гексанов, гептанов, октанов, нонанов, деканов, циклопентана, циклогексана, циклогептана, бензола, толуола, ксилола, изомеров и смесей указанных соединений.

Согласно конкретным вариантам реализации С5-С10 алкан выбран из группы, состоящей из пентана, гексана, гептана, октана, нонана, декана, циклогексана, изомеров и смесей указанных соединений.

Согласно конкретным вариантам реализации неполярный органический растворитель представляет собой гексан.

Согласно конкретному варианту реализации полярный органический растворитель содержит этанол, а неполярный органический растворитель содержит гексан.

Согласно конкретным вариантам реализации композиция, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и нерастворимых в неполярном органическом растворителе. Согласно конкретному варианту реализации терпеновые соединения представляют собой мономерные терпеновые соединения. Согласно конкретному варианту реализации терпеновые соединения выбраны из β-мирцена, α-мирцена, цис-а-омицена, дигидромирцена, лимонена, анинена, β-пинена и комбинаций указанных соединений.

Согласно конкретному варианту реализации композиция содержит примерно от 0,01 примерно до 25 мас.% выделенной фракции мастиковой смолы от общей массы композиции. Согласно конкретному варианту реализации композиция содержит примерно от 0,01 примерно до 12 мас.% выделенной фракции мастиковой смолы от общей массы композиции.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция мастиковой смолы содержит полимер мирцена.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество выделенной фракции полимера мирцена и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно конкретному варианту реализации композиция содержит примерно от 0,01 примерно до 12 мас.% полимера мирцена от общей массы композиции.

Согласно конкретным вариантам реализации полимер мирцена выбран из группы, состоящей из полимера β-мирцена (поли-в-мирцен), полимера α-мирцена (поли-а-мирцен), сополимеров мирцена и комбинаций указанных соединений. Согласно конкретным вариантам реализации поли-в-мирцен выбран из группы, состоящей из 1,4-поли-в-мирцена, 3,4-поли-в-мирцена, 1,2-поли-в-мирцена и комбинации указанных соединений. Согласно конкретным вариантам реализации полимер мирцена содержит изомер мирцена, выбранный из группы, состоящей из цис-изомера, транс-изомера и комбинации указанных соединений. Согласно конкретным вариантам реализации 1,4-поли-в-мирцен выбран из группы, состоящей из цис-1,4-поли-в-мирцена, транс-1,4-поли-в-мирцена и комбинации указанных соединений. Согласно конкретным вариантам реализации полимер мирцена содержит цис-1,4-поли-в-мирцен. Согласно конкретным вариантам реализации полимер мирцена имеет циклическую структуру. Согласно конкретным вариантам реализации полимер мирцена имеет разветвленную структуру.

Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет степень полимеризации в диапазоне по меньшей мере примерно от 6 примерно до 1800. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет примерно по меньшей мере 10. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет примерно по меньшей мере 15. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет примерно по меньшей мере 25. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет примерно по меньшей мере 35. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации находится в диапазоне примерно от 6 примерно до 30. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации находится в диапазоне примерно от 30 примерно до 500, например в диапазоне примерно от 33 примерно до 150.

Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.

Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу по меньшей мере примерно 800. Согласно конкретному варианту реализации среднечисленная молекулярная масса составляет по меньшей мере примерно 1000. Согласно конкретному варианту реализации среднечисленная молекулярная масса составляет по меньшей мере примерно 2000. Согласно конкретному варианту реализации среднечисленная молекулярная масса составляет по меньшей мере примерно 3000. Согласно конкретному варианту реализации среднечисленная молекулярная масса составляет по меньшей мере примерно 5000. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу в диапазоне по меньшей мере примерно от 800 примерно до 100000. Согласно конкретным вариантам реализации среднечисленная молекулярная масса находится

- 5 021833 в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из по меньшей мере примерно от 800 примерно до 80000; по меньшей мере примерно от 800 примерно до 50000; по меньшей мере примерно от 800 примерно до 20000; по меньшей мере примерно от 800 примерно до 10000; по меньшей мере примерно от 800 примерно до 5000; по меньшей мере примерно от 1000 по меньшей мере примерно до 50000; по меньшей мере примерно от 1000 примерно до 10000; по меньшей мере примерно от 1000 примерно до 5000; примерно от 5000 примерно до 10000; примерно от 10000 примерно до 15000; примерно от 5000 примерно до 20000; примерно от 15000 примерно до 30000; примерно от 25000 примерно до 40000; примерно от 35000 примерно до 50000; примерно от 45000 примерно до 60000; примерно от 55000 примерно до 70000; примерно от 65000 примерно до 80000; примерно от 75000 примерно до 90000; примерно от 85000 примерно до 100000 и любых комбинаций и поддиапазонов указанных диапазонов. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу в диапазоне примерно от 5000 примерно до 20000.

Следует понимать, что композиция может содержать различающиеся по молекулярной массе фракции полимера мирцена, например, в диапазоне по меньшей мере примерно от 800 примерно до 100000 или различные комбинации указанных фракций. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет коэффициент полидисперсности менее 5.

Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена представляет собой продукт химического синтеза. Согласно конкретному варианту реализации химический синтез включает применение мономера мирцена в качестве субстрата. Согласно конкретному варианту реализации субстрат представляет собой β-мирцен. Согласно конкретному варианту реализации субстрат β-мирцен получен из растения.

Согласно конкретному варианту реализации продукт химического синтеза содержит цис-1,4-полиβ-мирцен. Согласно конкретному варианту реализации химический синтез представляет собой реакцию анионной полимеризации. Согласно конкретному варианту реализации химический синтез дополнительно включает растворение полимера мирцена, полученного в результате указанного синтеза, в гидрофобном носителе, таком как по меньшей мере одно растительное масло.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена получена из природного источника. Природные источники включают растения, относящиеся к семейству ЛпасагбС асеае. Согласно конкретному варианту реализации мастиковая смола получена из растения, относящегося к семейству ЛпасатФасеае. Подходящие растения включают растения, отноящиеся к роду, выбранному из группы, состоящей из РШааа. Рти8, Рюеа, Лппрегщ. ЛЫез, Ьапх, ЛпбггПпит, Во8\уе1Па, Сбти8 и Супита. Согласно конкретному варианту реализации вид Р|81ас1а выбран из группы, состоящей из Р. 1епЙ8си8, Р. абапйса, Р. ра1е8Йпа, Р. заройае, Р. 1егеЬт1Ъи8, Р. уета и Р. Ыедетта. Согласно конкретному варианту реализации вид Р|81ас1а представляет собой Р|81ас1а 1епЙ8си8 Ь. Согласно конкретному варианту реализации природный источник представляет собой растительный материал, выбранный из группы, состоящей из смолы, листьев, веток, цветов, семян, почек, коры, орехов и корней. Согласно конкретному варианту реализации природный источник представляет собой растение, относящееся к роду, выбранному из группы, состоящей из Остит, Ьаига8 и Ьауепби1а.

Согласно конкретному варианту реализации выделенную фракцию полимера мирцена получают при помощи процесса, включающего стадии:

(a) осуществления контакта растительного материала по меньшей мере с одним полярным органическим растворителем;

(б) обработки растворимой фракции, полученной на стадии (Ь) или (с), неполярным органическим растворителем;

(е) выделения фракции, растворимой в указанном неполярном органическом растворителе; и (ί) возможно, удаления указанного неполярного органического растворителя, причем стадии (6)-(ί) могут предшествовать стадиям (а)-(с), причем стадии (а)-(с) и стадии (6)-(ί), каждые независимо, выполняют в виде ряда циклов; получая, таким образом, выделенную фракцию полимера мирцена.

Согласно конкретным вариантам реализации выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере примерно 80 мас.%. Выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере примерно 85 мас.%. Выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере примерно 90, или по меньшей мере примерно 93, или по меньшей мере примерно 95, или по меньшей мере примерно 97, или по меньшей мере примерно 98, или по меньшей мере примерно 99 мас.%.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере 80% и полимер мирцена имеет степень полимеризации по меньшей мере 6.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена имеет степень

- 6 021833 чистоты по меньшей мере 90% и полимер мирцена имеет степень полимеризации по меньшей мере 10.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит смесь цис-1,4-поли-в-мирцена и транс-1,4-поли-в-мирцена, причем указанная смесь содержит по меньшей мере 50 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой по меньшей мере 800, или по меньшей мере 1000, или по меньшей мере 5000, или по меньшей мере 10000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 80 мас.% цис-1,4поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 800 примерно до 5000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 1000 примерно до 10000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 5000 примерно до 20000.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 10000 примерно до 20000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 20000 примерно до 30000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 30000 примерно до 50000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 50000 примерно до 80000.

Согласно конкретным вариантам реализации композиция содержит менее примерно 10 мас.% и более предпочтительно менее примерно 5 мас.% терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и нерастворимых в неполярном органическом растворителе. Согласно конкретным вариантам реализации композиция, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и нерастворимых в неполярном органическом растворителе. Согласно конкретным вариантам реализации композиция содержит менее примерно 10 мас.% и более предпочтительно менее примерно 5 мас.% мономерных терпеновых соединений. Согласно конкретным вариантам реализации композиция, по существу, не содержит мономеров мирцена.

Как указано в настоящем изобретении, терпеновые соединения включают мономерные и олигомерные формы терпеновых соединений, включая соединения, различным образом относимые к монотерпенам, дитерпенам, сесквитерненам, тритерпенам и тетратерпенам, включая соответствующие кислотные, альдегидные и спиртовые формы. Согласно конкретному варианту реализации композиция содержит менее примерно 10 мас.% и более предпочтительно менее примерно 5 мас.% терпенового соединения, выбранного из группы, состоящей из β-мирцена, α-мирцена, цис-а-оцимена, дигидромирцена, лимонена, α-пинена, β-пинена и комбинаций указанных соединений.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена получена из растения, и композиция, по существу, не содержит мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее примерно 6. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена получена из растения, и композиция, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых по меньшей мере в одном полярном органическом растворителе и не растворимых по меньшей мере в одном неполярном органическом растворителе.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена представляет собой продукт химическою синтеза и композиция, по существу, не содержит мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее примерно 6. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена представляет собой продукт химического синтеза и композиция, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и нерастворимых в неполярном органическом растворителе.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая синтетический полимер мирцена, причем указанный полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу в диапазоне по меньшей мере примерно от 800 примерно до 50000, причем выделенная фракция полимера мирцена имеет степень чистоты по меньшей мере 80%.

Согласно конкретному варианту реализации фармацевтически приемлемый носитель содержит гидрофобный носитель. Согласно конкретному варианту реализации гидрофобный носитель содержит по меньшей мере одно масло. Согласно конкретному варианту реализации масло выбирают из группы, состоящей из растительного масла, минерального масла и комбинаций указанных масел. Согласно конкретному варианту реализации растительное масло выбирают из группы, состоящей из миндального

- 7 021833 масла, масла канолы, кокосового масла, кукурузного масла, хлопкового масла, масла виноградной косточки, оливкового масла, арахисового масла, шафранового масла, кунжутного масла, соевого масла и комбинации указанных масел. Согласно конкретному варианту реализации минеральное масло представляет собой светлое минеральное масло. Согласно конкретному варианту реализации гидрофобный носитель содержит по меньшей мере один воск. Согласно конкретному варианту реализации гидрофобный носитель содержит комбинацию по меньшей мере одного масла и по меньшей мере одного воска.

Согласно различным вариантам реализации композиция согласно настоящему изобретению находится в форме, подходящей для введения посредством пути, выбранного из группы, состоящей из перорального, топического, парентерального и трансдермального путей введения.

Согласно конкретным вариантам реализации композиция находится в форме, подходящей для введения посредством инъекции. Согласно различным вариантам реализации композиция представляет собой парентеральный состав для введения посредством пути, выбранного из группы, состоящей из внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутрикожного, внутрибрюшинного, внутриартериального, внутримозгового, интрацеребровентрикулярного, внутрикостного и интратекального путей введения. Согласно различным вариантам реализации композиция представляет собой топический состав для введения посредством пути, выбранного из группы, состоящей из дермального, вагинального, ректального, ингаляционного, интраназального, окулярного, аурикулярного и трансбуккального путей введения.

Согласно конкретным вариантам реализации композиция находится в форме, подходящей для косметического или дерматологического введения.

Согласно конкретным вариантам реализации композиция находится в форме, выбранной из группы, состоящей из капсулы, таблетки, липосомы, суппозитория, суспензии, мази, крема, лосьона, раствора, эмульсии, пленки, цемента, порошка, клея, аэрозоля и спрея. Согласно конкретному варианту реализации капсула выбрана из группы, состоящей из твердой желатиновой капсулы и мягкой желатиновой капсулы. Согласно конкретному варианту реализации эмульсия представляет собой наноэмульсию или микроэмульсию.

Согласно конкретным вариантам реализации состав содержит по меньшей мере одно из следующих: комплекс включения, наноэмульсию, микроэмульсию, порошок, липидный рафт, липидную микрочастицу, дендример и липосому. Согласно конкретному варианту реализации комплекс включения содержит по меньшей мере один циклодекстрин. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере один циклодекстрин содержит гидроксипропил-в-циклодекстрин. Согласно конкретному варианту реализации наноэмульсия содержит капельки со средним размером частиц менее 800 нм. Согласно конкретному варианту реализации капельки имеют средний размер менее 500 нм. Согласно конкретному варианту реализации капельки имеют средний размер менее 200 нм. Согласно конкретному варианту реализации порошок представляет собой порошок, высушенный распылением. Согласно конкретному варианту реализации липосома содержит многослойную липосому. Согласно конкретному варианту реализации микроэмульсия содержит неионогенное поверхностно-активное вещество. Согласно конкретному варианту реализации неионогенное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полигидроксилированных касторовых масел, сложных эфиров полиоксиэтиленированного сорбитана и жирных кислот (полисорбаты), полоксамера, производного витамина Е, алкиловых эфиров полиоксиэтилена, полиоксиэтиленстеаратов, насыщенных полигликолизированных глицеридов или комбинаций указанных соединений.

Согласно конкретному варианту реализации композиция помещена на изделие в виде покрытия. Согласно конкретному варианту реализации изделие включает сосуд, причем композиция помещена в сосуд. Согласно конкретному варианту реализации изделие выбирают из группы, состоящей из изделия из ткани, подгузника, повязки на рану, медицинского устройства, иглы или множества игл, микроиглы или множества микроигл, устройства для инъекций или распылителя спрея. Согласно конкретному варианту реализации изделие включает множество микроигл. Согласно конкретным вариантам реализации медицинское устройство выбирают из группы, состоящей из протеза, искусственного органа или компонента искусственного органа, клапана, катетера, трубки, стента, искусственной мембраны, ритмоводителя, сенсора, эндоскопа, устройства для получения изображения, насоса, проволоки и имплантата. Согласно конкретному варианту реализации имплантат выбирают из группы, состоящей из сердечного имплантата, кохлеарного имплантата, имплантата роговицы, черепного имплантата, зубного имплантата, челюстно-лицевого имплантата, имплантата органа, ортопедического имплантата, сосудистого имплантата, внутрисуставного имплантата и грудного имплантата.

Согласно конкретному варианту реализации композиция подходит для введения при помощи средств, выбранных из группы, состоящей из электропорации, воздействия ультразвуком, радиочастотного воздействия, распыления под давлением и комбинаций указанных средств.

Согласно конкретному варианту реализации композиция предназначена для лечения нарушения неврологической функции. Согласно конкретному варианту реализации нарушение неврологической функции включает снижение функции, выбранной из группы, состоящей из когнитивной функции, сенсорной функции, двигательной функции и комбинаций указанных функций. Согласно конкретным вариантам реализации нарушение неврологической функции связано с заболеванием или состоянием, вклю- 8 021833 чая, например, нарушение неврологической функции, связанное с заболеванием или состоянием, включая, например, травму, сосудистую деменцию, старческую деменцию, болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз (АБС), рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, инсульт, шизофрению, биполярное расстройство, депрессию, ожирение, анорексию, кахексию, инфекцию и иммунологическое нарушение. Согласно конкретному варианту реализации нарушение неврологической функции вызвано воздействием лекарственного средства, такого как анестетик.

Согласно конкретному варианту реализации композиция предназначена для лечения заболевания кожи или волосистой части головы, выбранного из группы, состоящей из алопеции, экземы, псориаза, себорейного кератоза и себореи. Заболевания кожи и волосистой части головы включают заболевания придатков кожи, волосистой части головы и волос, включая, например, ногти и волосяные фолликулы. Согласно конкретному варианту реализации заболевание кожи представляет собой повреждение кожи, включая, например, трофическую язву, пролежневую язву, язву диабетической стопы, ожог, ампутационную рану, пролежень, рану после донорства расщепленного кожного лоскута, рану после донорства кожного лоскута, участок имплантации медицинского приспособления, укушенную рану, обморожение, колотую рану, осколочную рану, дермабразию, контузию, инфекцию, рану и хирургическую рану.

Согласно конкретному варианту реализации композиция предназначена для индуцирования или стимуляции восстановления тканей. В настоящем описании восстановление тканей включает индуцирование и стимуляцию регенерации тканей, включая нервные ткани.

Согласно конкретному варианту реализации композиция предназначена для индуцирования или стимуляции восстановления тканей после повреждения или поражения. Согласно конкретному варианту реализации повреждение или поражение выбраны из группы, состоящей из инфаркта миокарда, легочной эмболии, церебрального инфаркта, окклюзионного поражения периферических артерий, грыжи, инфаркта селезенки, венозной язвы, аксотомии, отслойки сетчатки, инфекции и хирургического вмешательства.

Следует однозначно понимать, что объем настоящего изобретения охватывает более короткие и более длинные формы полимеров мирцена, включая синтетические и полусинтетические формы, включая сополимеры мирцена, и производные, содержащие в качестве заместителей различные функциональные группы и конъюгированные с различными добавочными молекулами, известные в данной области техники, при условии, что указанные варианты и модификации сохраняют терапевтические свойства полимера мирцена в отношении способов согласно настоящему изобретению.

Другие задачи, особенности и преимущества настоящего изобретения станут ясны из последующего описания и чертежей.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана эксклюзионная хроматография экстракта мастиковой смолы с использованием детекторов δΕΌΕΧ и ФДМ (с фотодиодной матрицей).

На фиг. 2 показаны низкомолекулярная (фиг. 2А) и высокомолекулярная (фиг. 2В) фракции экстракта мастиковой смолы, полученные при помощи препаративной эксклюзионной хроматографии.

На фиг. 3 показан спектр ¹Н-ЯМР высокомолекулярной фракции, полученной при помощи препаративной эксклюзионной хроматографии экстракта мастиковой смолы.

На фиг. 4 показан спектр ¹³С-ЯМР высокомолекулярной фракции, полученной при помощи препаративной эксклюзионной хроматографии экстракта мастиковой смолы.

На фиг. 5 показана аналитическая эксклюзионная хроматография высокомолекулярного (фиг. 5А) и низкомолекулярного (фиг. 5В) продуктов, полученных в процессе химического синтеза полимера мирцена.

На фиг. 6 показан спектр ¹Н-ЯМР синтезированного 1,4-поли-в-мирцена.

На фиг. 7 показан спектр ¹³С-ЯМР синтезированного 1,4-поли-в-мирцена.

На фиг. 8 показано действие КРН-1 на клетки АКРЕ-19. На фиг. 8А - контрольные культуры, обработанные масляной несущей средой; на фиг. 8В - исследуемые культуры через 48 ч после введения КРН-1 (0,1%; 1 мг/мл) и инкубирования; на фиг. 8С - исследуемые культуры через 48-72 ч после введения КРН-1 (0,25%; 2,5 мг/мл) и инкубирования; на фиг. 8Ό - исследуемые культуры через 72 ч после введения КРН-1 (0,25%; 2,5 мг/мл) и инкубирования.

На фиг. 9 показан иммунофлуоресцентный анализ дифференцированных клеток АКРЕ-19 до (левая сторона) и через 72 ч (правая) инкубирования в присутствии КРН-1, показана экспрессия β-3-тубулина (ТиВВЗ), активно регулируемого связанного с цитоскелетом белка (Агс/Аг§3.1) и нейронального пентраксина-ΙΙ (МРТХ2) после воздействия.

На фиг. 10 показано действие КРН-1 на пролиферацию клеток АКРЕ-19, наблюдаемую при помощи теста, оценивающего суммарное содержание белка.

На фиг. 11 показаны клетки АКРЕ-19 на различных стадиях дифференцировки. На фиг. 11А - стадия дифференцировки 3; на фиг. 11В - стадия дифференцировки 4; на фиг. 11С - стадия дифференцировки 5.

На фиг. 12 показано действие КРН-1 на клетки меланомы человека. На фиг. 12А - контрольные клетки, обработанные масляной несущей средой; на фиг. 12В - клетки, получавшие воздействие КРН-1

- 9 021833 (5 мкл) через 48 ч инкубирования, на фиг. 12С - клетки, получавшие воздействие КРй-1 (2 мкл) через 48 ч инкубирования; на фиг. 12Ό - клетки, получавшие воздействие КРй-1 (5 мкл) через 72 ч инкубирования.

На фиг. 13 показано действие химически синтезированного полимера мирцена на клетки КРй-1. На фиг. 13А - дифференцировка, индуцированная фракцией 18.1; на фиг. 13В - дифференцировка, индуцированная фракцией 18.2.

На фиг. 14 показана регенерация шерсти у старого самца собаки породы золотистый ретривер, пораженного кожным заболеванием, связанным с алопецией, после лечения КРй-1. На фиг. 14А - до лечения; на фиг. 14В - после 2 недель лечения.

На фиг. 15 показано действие КРй-1 на заживление умышленных ран у мышей в эксперименте, показанное как размер раны (мм²) в различные моменты времени после нанесения раны мышам, получавшим лечение КРй-1 путем п/к инъекции (группа А, серые столбики), топически (группа В, черные столбики), и мышам, получавшим только несущую среду (группа С, пустые столбики).

На фиг. 16 показано действие КРй-1 на восстановление после мозговой гипоперфузии в модели сосудистой деменции на крысах по оценке в тесте на водяном лабиринте Морриса.

Восстановление животных, получавших КРй-1 (группа А; столбики с перекрестной штриховкой), животных, получавших несущую среду (группа В; столбики с горизонтальной штриховкой), и контрольных животных, получавших плацебо (закрашенные столбики), исследовали на частоту обнаружения платформы (фиг. 16А); время, проведенное в области платформы (фиг. 16В); латентность обнаружения платформы (фиг. 16С); частоту нахождения в зоне 1 (фиг. 16Ό); время, проведенное в светлой части (фиг. 16Е); латентность обнаружения платформы (фиг. 16Р) и скорость (фиг. 160).

На фиг. 17 показано действие КРй-1 на набор массы.

На фиг. 17А показан набор массы у животных после мозговой гипоперфузии в модели сосудистой деменции на крысах. Животные в группе В (получавшие КРй-1; обозначены треугольниками) восстанавливали массу значительно быстрее, чем животные в группе А (получавшие несущую среду; обозначены квадратами).

На фиг. 17В показан набор массы у мышей с ожирением (оЬ/оЬ) после лечения КРй-1, или путем подкожного введения (группа А; обозначены ромбами), или путем топического введения (группа В; обозначены квадратами), или получавших только несущую среду (группа С; обозначены треугольниками). Мыши в группах В и С набрали 10,2 и 9,1% соответственно. Скорость набора массы во всех группах, выраженная как тангенс угла наклона, была сходной (р=0,07 (А от В), 0,08 (А от С) и 0,43 (В от С)).

На фиг. 18 показано действие КРй-1 на восстановление после инсульта, вызванного временной окклюзией средней мозговой артерии (ОСМА) в модели на крысах.

На фиг. 18А показана нервно-мышечная оценка (Иеигоксоге) в различные моменты времени, указанные в днях (й), после ОСМА у крыс, получавших КРй-1 (группа А) или несущую среду (группа В). Значительные отличия наблюдались только в группе А, от дня 8 до дня 14 и от дня 8 до дня 28.

На фиг. 18В показаны результаты шагового теста в различные моменты времени после ОСМА у крыс, получавших КРй-1 (группа А; черные столбики) или несущую среду (группа В; пустые столбики). Значительные различия между двумя группами наблюдались только на 28 день.

На фиг. 18С показаны результаты теста на удаление пластыря в различные моменты времени, указанные в днях (й), после ОСМА у крыс, получавших КРй-1 (группа А) или несущую среду (группа В). Значительные отличия наблюдались только в группе А между днем 2 и другими днями.

На фиг. 19 показано среднее число выживших ганглиозных клеток сетчатки (РОС) после аксотомии зрительного нерва у крыс, получавших КРй-1, и контрольных крыс.

На фиг. 20 показан вестерн-блоттинг анализ экспрессирования 8ЕМА3 (фиг. 20А) и каспазы-3 (фиг. 20В) в отслоившейся сетчатке (ОС) и неповрежденной сетчатке (контроль) животных, получавших КРй-1 или несущую среду после отслоения сетчатки.

Подробное описание изобретения

Автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил, что выделенные фракции мастиковой смолы обладают активностью по облегчению нарушения неврологической функции, излечению заболеваний и ран кожи и волосистой части головы, и стимуляции восстановления тканей. Известно, что указанные фракции содержат полимер мирцена. Кроме того, также было неожиданно обнаружено, что очищенные фракции полимера мирцена проявляют те же биологические активности, которые наблюдались для выделенных фракций мастиковой смолы. Вышеуказанные биологические активности полимера мирцена были продемонстрированы как для полимера мирцена, полученного из растительного источника, так и для химически синтезированного полимера мирцена. Кроме того, диапазон молекулярной массы полимера и степень чистоты препарата являются важными факторами, влияющими на биологическую активность полимера мирцена. Кроме того, обнаружение указанных фактов оказалось весьма неожиданным с учетом того, что в известном уровне техники считалось, что полимерная фракция, полученная из мастики, не имеет терапевтической полезности и фактически подавляет некоторые биологические действия, приписываемые препаратам сырой мастики и экстрактам мастики.

В настоящем изобретении впервые описано, что в отношении различных действий по стимулированию и индуцированию регенерации клеток выделенную фракцию мастиковой смолы согласно настояще- 10 021833 му описанию можно применять в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях для ряда терапевтических показаний.

Композиции согласно настоящему изобретению можно выгодно применять в способах лечения нарушения неврологической функции и состояний кожи и волосистой части головы. При контакте с клетками как человека, так и других субъектов композиция индуцирует дифференцировку клеток в широком спектре тканей, категорий клеток и линий дифференцировки клеток, включая кожу, эндотелий, слизистые мембраны, кости, сухожилия и хрящ. Кроме того, действие фармацевтической композиции на дифференцировку клеток можно использовать для стимуляции внедрения ίη νίνο медицинских устройств, имплантатов и трансплантатов органов.

Определения.

В настоящем описании термины мастика, мастиковая смола, камедь мастикового дерева и мастиковая камедь применяют взаимозаменяемо для указания на смолу дерева (также известную как живица), полученную в виде выделений дерева, относящегося к семейству АпасатШаееае. Деревья рода ΡίδΙααία. прежде всего РМааа 1епЙ8си8 Ь., и особенно культурный сорт Р. 1епЙ8си8 Ь. ον. СЫа (выращиваемый на греческом острове Хиос) известны своим высоким урожаем мастики. Другие разновидности включают Р. 1еп118си8 Ь. уаг. етагдтаШ Епд1. и Р. 1еп1т8си8 Ь. уаг. 1аПГоПа Со88. Дополнительные виды РМааа включают, например, Р. аИапйса, Р. раЫШпа, Р. заройае, Р. 1егеЪшШи8, Р. уега и Р. нИедегпта.

В настоящем описании термин полимер относится к соединению или смеси соединений, содержащих повторяющиеся звенья (также называемые мономерами) одинаковой химической структуры, причем мономеры соединены между собой ковалентными связями. Примером мономера, который может образовывать полимер, является терпен, например монотерпен, такой как мирцен. Полимеры могут иметь различные степени полимеризации и таким образом включать полимерные формы с различной длиной цепи. Полимеры включают гомополимеры и гетерополимеры (также известные как сополимеры) и могут иметь различные изомерные и диастереомерные конфигурации.

В настоящем описании термины полимер мирцена и полимирцен взаимозаменяемо относятся к полимеру, образованному мономерами мирцена. Полимер мирцена включает полимерные формы, имеющие различные степени полимеризации, и предпочтительно полимеры мирцена, имеющие степень полимеризации по меньшей мере 6. Настоящее изобретение включает без ограничения полимер β-мирцена (поли-в-мирцен), полимер α-мирцена (поли-а-мирцен), гомополимеры указанных соединений, гетерополимеры (также известные как сополимеры), содержащие мономеры мирцена, непосредственно или опосредованно связанные ковалентно с гетерологичными мономерами, транс- и цис-изомеры указанных соединений, Ό- и Ь-энантиомеры указанных соединений или комбинации указанных соединений. Полимер мирцена может быть получен из природного источника, в частности из мастики, или может представлять собой продукт реакции химического синтеза.

В настоящем описании термин выделенная фракция мастиковой смолы относится к фракции, полученной после экстракции мастиковой смолы при помощи по меньшей мере одного полярного или неполярного органического растворителя, или комбинации указанных растворителей. Выделенная фракция согласно настоящему изобретению в общем случае растворима в полярном или неполярном органическом растворителе или одновременно в обоих типах растворителей.

В настоящем описании термин выделенная фракция полимера мирцена относится к препарату полимера мирцена, имеющего заданную молекулярную массу или молекулярную массу в заданном диапазоне, который отделен от остальных химических компонентов, присутствующих в источнике, из которого выделен полимер мирцена, в частности химической реакционной смеси или растительном экстракте.

В настоящем описании термин степень чистоты относится к содержанию определенного химического соединения в препарате, выраженному в процентах по массе определенного химического соединения по отношению к остальным химическим соединениям в препарате.

В настоящем описании гомополимер относится к полимеру, полученному из одного типа мономера. Например, полимер мирцена представляет собой гомополимер, если он получен только из мономеров мирцена, например β-мирцена. Гомополимер также может представлять собой смесь полимеров, полученных из одного и того же мономера, но имеющих различную степень полимеризации, т.е. длину цепи. Соответственно полимер мирцена может включать ряд соединений с различной длиной цепи и соответственно с различной молекулярной массой. Кроме того, гомополимер может содержать мономеры, имеющие различные изомерные конфигурации, например β-мирцен и а-мирцен.

В настоящем описании гетерополимер и сополимер относятся к полимеру, полученному более чем из одного типа мономера. Так, например, сополимер мирцена получен из мономеров мирцена в дополнение к гетерологичному типу мономера, не являющегося мирценом. Сополимеры включают чередующиеся сополимеры, периодические сополимеры, случайные сополимеры, блок-сополимеры и статистические сополимеры, известные в данной области техники.

В настоящем описании степень сополимеризации относится к числу мономеров или мономерных звеньев, ковалентно соединенных между собой с образованием полимера, например к числу мономеров мирцена в полимерном соединении мирцена.

- 11 021833

В настоящем описании среднемассовая молекулярная масса относится к средней молекулярной массе полимера, имеющего молекулы с различными длинами цепи, выраженной уравнением

где N1 представляет собой число молекул с молекулярной массой Μι. Среднемассовую молекулярную массу можно определить, например, по светорассеянию, рассеянию нейтронов на малых углах, рассеянию рентгеновских лучей или скорости осаждения.

В настоящем описании среднечисленная молекулярная масса относится к средней молекулярной массе полимера, имеющего молекулы с различными длинами цени, выраженной уравнением

где Νΐ представляет собой число молекул с молекулярной массой Μ_ί.

Среднечисленную молекулярную массу можно определить, например, при помощи гельпроникающей хроматографии (также известной как эксклюзионная хроматография) или вискозиметрии.

Термины коэффициент полидисперсности и молекулярное распределение в настоящем описании взаимозаменяемо относятся к отношению среднемассовой молекулярной массы к среднечисленной молекулярной массе.

В настоящем описании терпеновые соединения относятся к углеводородам, содержащим изопрен, и родственным кислородсодержащим соединениям, таким как спирты, альдегиды или кетоны (терпеноиды). Звено изопрена (СН2=С(СН₃)-СН=СН₂) представляет собой основную структурную единицу таких соединений. Терпеновые углеводороды в целом имеют молекулярную формулу (С₅Н₈)_П и включают монотерпены, сесквитерпены, дитерпены, тритерпены и тетратерпены соответственно, содержащие 2, 3, 4, 6 и 8 изопреновых звеньев. Терпены можно дополнительно разделить на ациклические или циклические.

Примеры монотерпенов включают мирцен, лимонен и пинен, которые соответственно представляют собой примеры ациклических, моноциклических и бициклических монотерпенов. Примеры сесквитерпенов включают неролидол и фарнезол. Примеры дитерпенов включают кафестол и фитол. Примерами тритерпена и тератерпена являются сквален и каротин соответственно.

В настоящем описании по существу, не содержит обозначает препарат или фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, в общем случае, содержащие менее 3% указанного вещества, предпочтительно менее 1% и наиболее предпочтительно менее 0,5%.

В настоящем описании терапевтически эффективное количество относится к такому количеству фармацевтического ингредиента, которое, по существу, индуцирует, стимулирует или приводит к желаемому терапевтическому действию.

В настоящем описании фармацевтически приемлемый носитель относится к разбавителю или несущей среде, применяемым для улучшения доставки и/или фармакокинетических свойств фармацевтического ингредиента, в состав с которым они входят, но сами по себе не оказывают терапевтического действия и не индуцируют или не вызывают какого-либо нежелательного или неблагоприятного действия или побочной реакции у субъекта.

В настоящем описании фармацевтически приемлемый гидрофобный носитель относится к гидрофобному неполярному разбавителю или несущей среде, в которых растворен или суспендирован полимер мирцена.

В настоящем описании дифференцировка клеток относится к процессу, в котором менее специализированная клетка превращается в более специализированную клетку. Дифференцировка клеток может быть установлена на основании изменений любой из ряда характеристик клетки, включая, без ограничения, размер, форму, внешний вид органелл, мембранный потенциал, метаболическую активность и восприимчивость к сигналам. Конкретная степень может быть приписана типу клеток для описания степени дифференцировки.

В настоящем описании нарушение неврологической функции относится к отклонению или снижению по меньшей мере одной из сенсорной, когнитивной или двигательной функции, по сравнению с предшествующим значением функции или активности и/или по сравнению с индивидуумами без нарушений, соответствующими принятым критериям.

Указанные в настоящем описании числовые значения следует понимать как указанное значение ±

10%.

Выделенные фракции мастиковой смолы и полимера мирцена.

В настоящем изобретении применяют выделенные фракции, содержащие полимер мирцена. Фракция может быть из растительного источника, в частности мастиковой смолы, или может быть продуктом химического синтеза. Полимер мирцена для применения в настоящем изобретении представляет собой полимерное соединение или смесь полимеров с различными молекулярными массами, образованных звеньями мирцена. Подходящие растительные источники полимера мирцена включают растения, отно- 12 021833 сящиеся к семейству ЛпасагШасеае или к другому семейству растений. Виды растений, из которых можно получить композиции согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, виды, относящиеся к родам РМааа, Ршик, Рюеа, Лкйрегик, А1ыек, Ьапх, Осппит, Ьаигик и ЬауепДи1а. Подходящие виды РМааа включают, без ограничения, Р. 1еп1ксик, Р. айапйса, Р. ра1еккпа, Р. кароПае, Р. 1егеЬтШик, Р. уега и Р. иНедегпта. Полимер мирцена можно получить из любой части растения, включая, например, смолу, листья, ветки, ягоды и семена.

Выделенную фракцию полимера мирцена легко можно получить из мастиковой смолы, хотя можно применять и другие части и продукты растения. Различные способы получения и характеризации выделенной фракции, содержащей полимер мирцена, из мастиковой смолы приведены в качестве примеров в примерах 1 и 2 настоящего изобретения. Коммерческие препараты мастики поставляет, например, Ше СЬюк Сит МакЬс Сго^егк АккоааЬоп или С. ВаММп & Со., и.К.

Как вариант, полимер мирцена может быть получен химически как синтетический эквивалент существующего в природе полимера, такого как цис-1,4-поли-в-мирцен, или может представлять собой не существующий в природе полимер мирцена, такой как полимер α-мирцена. Настоящее изобретение не ограничивает процесс, при помощи которого можно получить полимер мирцена, природный, синтетический или полусинтетический.

Предполагают, что полимер мирцена может представлять собой продукт синтеза, полученный при помощи химического процесса с использованием в качестве субстрата мономерной формы монотерпенового мирцена. Субстрат мономера мирцена может быть выделен из растения или может быть химическим или ферментативным путем получен из предшественника терпена, как это известно в данной области техники. Например, мономер β-мирцена, выделенный из растительного источника, можно впоследствии подвергнуть полимеризации с образованием полимера β-мирцена при помощи химического процесса. Если субстрат мирцена получен из природного источника, полученный продукт может упоминаться как полусинтетический продукт. Химические процессы полимеризации β-мирцена описаны, например, в патентах США №№ 4564718; 5759569; 7232872 и 7214750 и в статьях №\утагк е! а1. (1988) I. Ро1утег 8ск 26, 71-77 (1988) и Са\уке е! а1. (1986) 1оигиа1 о£ АррЬеД Ро1утег §аепсе, Уо1. 31, 1963-1975.

В подходящем процессе химического синтеза применяют реакцию анионной полимеризации, например реакцию, включающую применение по меньшей мере одного алканового или циклоалканового растворителя и по меньшей мере одного алкилщелочного металла. Например, алкилщелочной металл может представлять собой бутиллитий, а алкановый растворитель может представлять собой гексан, или циклоалкановый растворитель может представлять собой циклогексан. Алкановый растворитель и инициатор алкилщелочной металл могут присутствовать в реакционной смеси в соотношении по меньшей мере 20:1. Реакцию анионной полимеризации можно останавливать при помощи таких соединений, как вода, спирт, молекулярный кислород и диоксид углерода.

Процесс синтеза 1,4-поли-β-мирцена согласно настоящему описанию (пример 3) особенно подходит для обеспечения различных биологических активностей полимера, таких как стимуляция дифференцировки клеток. Известно, что мономер β-мирцена обнаружен в различных растениях, включая деревья родов Ршик, Рюеа, кипрегик, АЫек и Ьапх и цветы родов АпОггЬпшт, Вок^еШа, Скгик и Супига.

Выделенную фракцию полимера мирцена можно получить в виде очищенного продукта реакции химического синтеза, как описано в примере 3 настоящего изобретения. Химически синтезированный полимер мирцена можно отделить от непрореагировавшего субстрата и других реагентов, проанализировать и дополнительно фракционировать согласно молекулярной массе при помощи известных в данной области техники способов анализа и разделения. Указанные способы включают способы, разделяющие молекулы исходя из их размера, заряда или гидрофобности, включая, например, эксклюзионную хроматографию (8ЕС), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), газожидкостную хроматографию (ГЖХ) и комбинации указанных способов.

Способы анализа для определения точной химической структуры полученного полимера включают ядерный магнитный резонанс (например, ¹Н ЯМР и ¹³С ЯМР), вискозиметрию, различные массспектрометрические способы (например, ΜΑΕΌΙ-ΤΟΡ), комбинированные способы, такие как жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС), методики светорассеяния, такие, например, как рассеивание лазерного излучения с кратными углами (МАЬЬ§), анализ на общее содержание углерода, спектрофотометрия в УФ и видимом диапазоне, ИК и Фурье-ИК спектрофотометрия и другие способы, известные в данной области техники. Те же способы и подходы можно применять для очистки и характеризации полимеров мирцена, выделенных из растений, как показано в примере 2 настоящего описания.

Согласно особенно предпочтительному варианту реализации фракция полимера мирцена, являющегося продуктом химического синтеза, по существу, не должна содержать мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее 5. Также предпочтительно, чтобы выделенный продукт, по существу, не содержал мономерных терпеновых соединений, растворимых в полярных органических растворителях.

Аналогичные способы можно применять для получения выделенных фракций мастиковой смолы и выделенных фракций полимера мирцена, если полимер мирцена получен из растительного источника,

- 13 021833 например, такого как мастиковая смола. Для общего описания собранный растительный материал, например мастиковую смолу, объединяют в подходящем сосуде с подходящим растворителем, обычно с полярным растворителем. Подходящие полярные растворители включают, например, спирты, простые эфиры, сложные эфиры, амиды, альдегиды, кетоны, нитрилы и комбинации указанных соединений. Конкретными примерами полярных органических растворителей являются метанол, этанол, пропанол, изопропанол, 1-бутанол, 2-бутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, 1-пентанол, 2-пентанол, 3-пентанол, неопентанол, 3-метил-1-бутанол, 2-метил-1-бутанол, 3-метил-2-бутанол, 2-метил-2-бутанол, этиленгликоль, этиленгликоля монометиловый эфир, диэтиловый эфир, метилэтиловый эфир, этилпропиловый эфир, метилпропиловый эфир, 1,2-диметоксиэтан, тетрагидрофуран, дигидрофуран, фуран, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, метилацетат, этилацетат, пропилацетат, ацетальдегид, метилформиат, этилформиат, этилпропионат, метилпропионат, дихлорметан, хлороформ, диметилформамид, ацетамид, диметилацетамид, Ν-метилпирролидон, ацетон, этилметилкетон, диэтилкетон, ацетонитрил, пропионитрил и комбинации указанных соединений.

Мастиковую смолу и растворитель предпочтительно объединяют так, чтобы растворитель присутствовал в большом избытке, например 10:1 или 20:1. Смесь можно периодически или постоянно перемешивать в течение промежутка времени от нескольких минут до нескольких часов. Растворитель можно декантировать без какой-либо обработки или, возможно, смесь можно сначала подвергнуть центрифугированию на низкой скорости, например от 100 до 2000 об/мин, как известно в данной области техники. Нерастворимый материал отделяют от экстракта и добавляют к нерастворимому материалу свежую аликвоту растворителя, таким образом повторяют процесс экстракции и растворения в виде ряда циклов для получения настолько большого количества компонентов, растворимых в полярном растворителе, насколько это возможно. После последней стадии растворения экстракты, содержащие материал, растворимый в полярном растворителе, объединяют и вымаривают полярный растворитель (например, при помощи ротационного испарения, известного в данной области техники), с образованием материала, растворимого в полярном растворителе, также называемого черновым или экстрактом первой стадии.

Материал экстракта первой стадии объединяют с неполярным органическим растворителем и проводят экстракцию путем встряхивания в течение 1 ч. Подходящие неполярные растворители включают ациклические и циклические насыщенные или ненасыщенные алифатические углеводороды или ароматические углеводороды, например С5-С10 алканы, С5-С10 циклоалканы, С6-С14 ароматические углеводороды, и комбинации указанных соединений. Каждый из указанных выше углеводородов может содержать в качестве заместителей один или несколько атомов галогенов, например С7-С14 перфторалканы. Конкретными примерами неполярных органических растворителей являются пентаны, гексаны, гептаны, октаны, нонаны, деканы, циклопентан, циклогексан, циклогептан, бензол, толуол, ксилол, изомеры и смеси указанных соединений.

Материалы, оставшиеся нерастворенными или выпавшие в осадок в присутствии неполярного растворителя, отделяют и отбрасывают. Затем получают фракцию, растворимую в неполярном растворителе, путем выпаривания неполярного растворителя (например, путем ротационного выпаривания). Полученная фракция, которую можно называть очищенной или экстрактом второй стадии, соответствует выделенной фракции мастиковой смолы, характеризующейся тем, что она растворима как в полярном растворителе, так и в неполярном растворителе, в то время как материалы, растворимые в полярном растворителе, но нерастворимые в неполярном растворителе, были удалены. Указанная особенность отличает выделенные фракции согласно настоящему изобретению от экстрактов мастиковой смолы известного уровня техники, поскольку последние в общем случае содержат широкий спектр соединений, растворимых только в полярных растворителях. Согласно идеям настоящего изобретения такие соединения влияют на благотворное биологическое действие выделенных фракций согласно настоящему изобретению.

Экстракт второй стадии можно дополнительно высушить, например, в высоком вакууме (например, <0,01 мбар в течение нескольких дней) для удаления остатков растворителя и другого летучего материала, взвесить и объединить с подходящим неполярным органическим растворителем или другим носителем для обеспечения растворения. В примерах 1 и 2 настоящего изобретения описаны такие выделенные фракции, содержащие полимер мирцена. Полученные фракции, содержащие полимер мирцена, можно применять непосредственно или дополнительно очищать, характеризовать и/или фракционировать при помощи перечисленных выше средств, известных в данной области техники.

Согласно конкретным вариантам реализации выделенные фракции согласно настоящему изобретению получают при помощи процесса, включающего стадии:

(c) возможно, удаления указанного полярного органического растворителя;

(ά) обработки растворимой фракции, полученной на стадии (Ь) или (с), неполярным органическим растворителем, (е) выделения фракции, растворимой в указанном неполярном органическом растворителе; и (ί) возможно, удаления указанного неполярного органического растворителя, причем стадии (ά)-(ί) могут предшествовать стадиям (а)-(с).

- 14 021833

Процесс может дополнительно включать фракционирование растворимой фракции, полученной после стадии (с) или стадии (£), например, при помощи эксклюзионной хроматографии или другого известного в данной области техники способа.

Процесс может дополнительно включать удаление растворителя после любой из стадий (с) или (ί) или обеих указанных стадий. Удаление растворителя можно осуществить при помощи любых известных в данной области средств, например ротационного испарения, применения высокого вакуума и комбинации указанных средств. Согласно конкретному варианту реализации стадии (а)-(с) выполняют перед стадиями (6)-(ί) или наоборот. Согласно конкретному варианту реализации полярный органический растворитель содержит этанол, а неполярный органический растворитель содержит гексан. Как легко поймет опытный специалист в данной области техники, стадии (а)-(с) и стадии (6)-(ί) можно, каждые независимо, осуществлять в виде ряда циклов для оптимизации процесса экстракции и степени очистки продукта.

Для получения композиции для терапевтического применения можно применять подходящие носители, такие как гидрофобные носители, включая фармацевтически приемлемые масла, возможно, в комбинации с восками согласно настоящему описанию.

Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации композиции, содержащие фракции, выделенные из мастиковой смолы, согласно настоящему описанию должны содержать менее примерно 20 мас.% мономерных и олигомерных терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и, по существу, нерастворимых в неполярном органическом растворителе, причем вышеуказанные растворители относятся к растворителям, использованным при получении фракции. Более предпочтительно выделенные фракции содержат менее примерно 5 мас.% таких терпеновых соединений. Еще более предпочтительно выделенные фракции, по существу, не содержат таких терпеновых соединений. Ингибирующее действие фракций, содержащих такие низкомолекулярные соединения, на биологическую активность полимера мирцена показано в качестве примера в примере 8 настоящего описания.

Согласно другому конкретному варианту реализации выделенная фракция, содержащая полимер мирцена, получена из растения и, по существу, не содержит мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее 6. Согласно другому конкретному варианту реализации выделенная фракция, содержащая полимер мирцена, получена из растения и, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и, по существу, нерастворимых в неполярном органическом растворителе.

Следует понимать, что полимер мирцена может иметь не единственную молекулярную массу, но напротив, распределение молекулярных масс, представляющее совокупность молекул полимера мирцена с различной длиной цепи, т.е. степенью полимеризации.

Не существует конкретного верхнего предела молекулярной массы или степени полимеризации полимера мирцена. Согласно одному в настоящее время предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения степень полимеризации составляет по меньшей мере примерно 6. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет по меньшей мере примерно 10. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет по меньшей мере примерно 25. Согласно конкретному варианту реализации степень полимеризации составляет по меньшей мере примерно 35. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет степень полимеризации в диапазоне по меньшей мере примерно от 6 примерно до 1800. Подходящие типичные диапазоны включают примерно от 30 примерно до 500 или примерно от 35 примерно до 150. Среднечисленная молекулярная масса полимера мирцена предпочтительно составляет по меньшей мере примерно 800. Более предпочтительно среднечисленная молекулярная масса составляет по меньшей мере примерно 1000, как, например, по меньшей мере 2000 или по меньшей мере 3000, и еще более предпочтительно среднечисленная молекулярная масса составляет по меньшей мере примерно 5000. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу в диапазоне примерно от 5000 примерно до 20000. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу в диапазоне по меньшей мере примерно от 800 примерно до 100000. Согласно конкретным вариантам реализации среднечисленная молекулярная масса находится в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из по меньшей мере от примерно 800 до примерно 5000; по меньшей мере от примерно 800 до примерно 15000; от примерно 5000 до примерно 15000; от примерно 5000 до примерно 20000; от примерно 15000 до примерно 30000; от примерно 25000 до примерно 40000; от примерно 35000 до примерно 50000; от примерно 45000 до примерно 60000; от примерно 55000 до примерно 70000; от примерно 65000 до примерно 80000; от примерно 75000 до примерно 90000; от примерно 85000 до примерно 100000 и комбинаций указанных диапазонов. Согласно конкретному варианту реализации среднечисленная молекулярная масса составляет по меньшей мере примерно 5000. Следует понимать, что композиция может содержать фракции полимера мирцена с различной молекулярной массой, например, в диапазоне по меньшей мере примерно от 5000 до примерно 20000, а также в диапазоне от примерно 25000 до примерно 40000. Согласно конкретному варианту реализации полимер мирцена имеет молекулярное распределение менее 5.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция состоит, по существу, из полимера мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 5000 до примерно 20000.

- 15 021833

Молекулярная масса полимерного продукта может быть выражена рядом способов, известных в данной области техники, например среднечисленная молекулярная масса или среднемассовая молекулярная масса. Молекулярную массу можно определить при помощи ряда средств, таких как светорассеяние, рассеяние лазерного излучения с кратными углами (МЛЬЬ§), малоугловое нейтронное рассеяние, рентгеновское рассеяние, скорость седиментации, вискозиметрия (уравнение Марка-Хувинка), массспектрометрия (например, ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ) и гельпроникающая хроматография.

Полимер мирцена может существовать в виде различных геометрических изомеров, полученных в результате расположения заместителей относительно двойной углерод-углеродной связи. Такие изомеры обозначают как цис- или транс-конфигурацию (также называемые соответственно Ζ- или Е-конфигурацией), причем цис- (или Ζ) обозначает заместители с одной и той же стороны двойной углеродуглеродной связи, а транс- (или Е) обозначает заместители с противоположных сторон двойной углеродуглеродной связи. Различные геометрические изомеры и смеси указанных изомеров включены в объем настоящего изобретения.

Продукт полимера мирцена может содержать один или несколько асимметрических атомов углерода и может благодаря этому проявлять оптическую изомерию и/или диастереомерию. Все стереоизомеры и диастереомеры включены в объем настоящего изобретения как в виде отдельного изомера, так и в виде смеси стереохимических изомерных форм. Различные стереоизомеры и диастереомеры можно разделить при помощи обычных методик, например хроматографии или дробной кристаллизации. Как вариант, выбранные оптические изомеры можно получить путем взаимодействия соответствующих оптически активных исходных материалов в условиях, не вызывающих рацемизации или эпимеризации, или путем получения производных, например, с участием гомохиральной кислоты с последующим разделением диастереомерных производных обычными способами.

Подходящие формы полимера мирцена включают полимер β-мирцена (поли-в-мирцен), включая

1.4- поли-в-мирцен, 3,4-поли-в-мирцен, 1,2-поли-в-мирцен, цис-1,4-поли-в-мирцен, транс-1,4-поли-вмирцен, полимер α-мирцена (поли-а-мирцен) или комбинации указанных соединений. Выделение и характеризация 1,4-поли-в-мирцена из мастики описаны, например, в Уап йег Вегд с1 а1. (1998) ТейаЬейгоп Ьей 3:2645-2648.

Согласно конкретным вариантам реализации полимер мирцена имеет линейную структуру, разветвленную структуру или циклическую структуру.

Выделенная фракция полимера мирцена согласно настоящему изобретению имеет степень чистоты по меньшей мере 90%, такую как по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%. Как понятно в данной области техники, желательная степень чистоты настолько высокая, насколько это возможно, в том числе, чтобы гарантировать соответствие требованиям органов регулирования здравоохранения. Однако следует понимать, что фракция полимера мирцена может содержать молекулы полимера с различными молекулярными массами, такими как в пределах узкого или широкого диапазона, без снижения определенной степени чистоты. Кроме того, выделенная фракция полимера мирцена может содержать различные описанные выше структурные изомеры полимера мирцена без снижения определенной степени чистоты. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит смесь цис-1,4-поли-в-мирцена и транс-1,4-поли-в-мирцена, причем указанная смесь содержит по меньшей мере 80 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-вмирцена со среднечисленной молекулярной массой по меньшей мере 800. Среднечисленная молекулярная масса может составлять по меньшей мере 1000. Средняя молекулярная масса может составлять по меньшей мере 2000. Среднечисленная молекулярная масса может составлять по меньшей мере 3000. Среднечисленная молекулярная масса может составлять по меньшей мере 5000. Среднечисленная молекулярная масса может составлять по меньшей мере 10000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 800 примерно до 5000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 1000 примерно до 10000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 10000 примерно до 20000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 5000 примерно до 20000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена состоит, по существу, из цис1.4- поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 5000 примерно до 20000.

- 16 021833 чистоты по меньшей мере 90% и полимер мирцена имеет степень полимеризации по меньшей мере 10.

Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 20000 примерно до 30000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 30000 примерно до 50000. Согласно конкретному варианту реализации выделенная фракция полимера мирцена содержит по меньшей мере 90 мас.% цис-1,4-поли-вмирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне примерно от 50000 примерно до 80000.

Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации выделенная фракция полимера мирцена, по существу, очищена от терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и, по существу, нерастворимых в неполярном органическом растворителе. В частности, композиция должна содержать менее примерно 10 мас.%, более предпочтительно менее примерно 5 мас.% и наиболее предпочтительно менее примерно 3 мас.% терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и, по существу, нерастворимых в неполярном органическом растворителе. Согласно конкретным вариантам реализации композиция, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых в полярном органическом растворителе и, по существу, нерастворимых в неполярном органическом растворителе. Согласно конкретным вариантам реализации композиция содержит менее примерно 10 мас.%, более предпочтительно менее примерно 5 мас.% и наиболее предпочтительно менее примерно 3 мас.% мономерных терпеновых соединений. Согласно конкретному варианту реализации композиция, по существу, не содержит мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее примерно 5. Согласно конкретному варианту реализации композиция содержит менее примерно 10 мас.%, более предпочтительно менее примерно 5 мас.% и наиболее предпочтительно менее примерно 3 мас.% терпеновых соединений, выбранных из группы, состоящей из β-мирцена, амирцена, цис-а-оцимена, дигидромирцена, лимонена, α-пинена, β-пинена и комбинаций указанных соединений.

Фармацевтические композиции.

Композиция для применения согласно настоящему изобретению содержит терапевтически эффективное количество выделенной фракции полимера и фармацевтически приемлемый гидрофобный носитель.

Подходящий гидрофобный носитель содержит по меньшей мере одно масло, такое как, например, минеральное масло, растительное масло или комбинация указанных масел.

Термин минеральное масло относится к прозрачной бесцветной жидкости практически без запаха и вкуса, полученной при перегонке нефти. Указанную жидкость можно также называть белое масло, белое минеральное масло, жидкий вазелин, жидкий парафин или жидкое парафиновое масло. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения минеральное масло представляет собой светлое минеральное масло, коммерчески доступный продукт, который можно получить или в виде продукта ΝΡ (Национальный Формуляр) или в виде продукта качества И8Р (Фармакопея США). Для настоящего изобретения минеральное масло предпочтительно не содержит ароматических или ненасыщенных соединений.

Подходящие растительные масла включают, без ограничения, миндальное масло, масло канолы, кокосовое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло виноградной косточки, оливковое масло, арахисовое масло, шафрановое масло, кунжутное масло, соевое масло или комбинации указанных масел. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения минеральное масло представляет собой светлое минеральное масло.

Фармацевтически приемлемый носитель может как вариант или дополнительно содержать походящий заменитель масла. Заменители масла включают алканы, содержащие по меньшей мере 10 атомов углерода (например, изогексадекан), сложные эфиры бензоата, алифатические сложные эфиры, некомедоногенные сложные эфиры, летучие кремнийорганические соединения (например, циклометикон) и летучие заместители кремнийорганических соединений. Примеры сложных эфиров бензоата включают С₁₂С₁₅ алкилбензоат, изостеарилбензоат, 2-этилгексилбензоат, дипропиленгликольбензоат, октилдодецилбензоат, стеарилбензоат и бегенилбензоат. Примеры алифатических сложных эфиров включают С₁₂С₁₅ алкилоктаноат и диоктилмалеат. Примеры некомедоногенных сложных эфиров включают изононилизононаноат, изодецилизононаноат, диизостеарил димер дилинолеат, арахидилпропионат и изотридецилизононаноат. Примеры летучих заменителей кремнийорганических соединений включают изогексилдеканоат, октилизононаноат, изононилоктаноат и диэтиленгликольдиоктаноат.

Циклометикон представляет собой парообразующее кремнийорганическое соединение, которое можно включить в носитель для содействия изготовлению композиции, поддающейся введению при помощи дозатора спрея. Кроме того, благодаря своему парообразующему свойству, циклометикон может помогать сохранять и удерживать состав на поверхности, на которую он нанесен, например, на области раны.

Гидрофобный носитель может дополнительно содержать по меньшей мере один воск. Воски вклю- 17 021833 чают, например, пчелиный воск, растительные воски, воски сахарного тростника, минеральные воски и синтетические воски. Растительные воски включают, например, карнаубский воск, канделильский воск, воск урикури и воск жожоба. Минеральные воски включают, например, парафиновый воск, горный воск, микрокристаллический воск и озокериты. Синтетические воски включают, например, полиэтиленовые воски.

Фармацевтическую композицию можно изготовить в виде рецептуры любой из ряда формы, как, например, капсулы (включая мягкую желатиновую капсулу), таблетки, липосомы, суппозитории, суспензии, мази, растворы, эмульсии или микроэмульсии, пленки, цемент, порошки, клеи, аэрозоли, спреи и гели.

Для получения фармацевтической композиции полимер мирцена можно подходящим образом включить в рецептуру комплексов включения, наноэмульсий, микроэмульсий, порошков и липосом. Согласно конкретному варианту реализации комплекс включения содержит по меньшей мере один циклодекстрин. Согласно конкретному варианту реализации циклодекстрины содержат гидроксипропил-βциклодекстрин. Согласно конкретному варианту реализации наноэмульсия содержит капельки со средним размером частиц менее 800 нм. Согласно конкретному варианту реализации капельки имеют средний размер частиц менее 500 нм. Согласно конкретному варианту реализации капельки имеют средний размер частиц менее 200 нм. Согласно конкретному варианту реализации порошки представляют собой порошки, высушенные распылением. Согласно конкретному варианту реализации липосомы содержат многослойные липосомы. Согласно конкретному варианту реализации микроэмульсия содержит неионогенное поверхностно-активное вещество. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, полигидроксилированные касторовые масла, сложные эфиры полиоксиэтиленированного сорбитана и жирных кислот (полисорбаты), полоксамер, производное витамина Е, алкиловые эфиры полиоксиэтилена, полиоксиэтиленстеараты, насыщенные полигликолизированные глицериды или комбинации указанных соединений.

Различные составы полимера мирцена и препараты, содержащие указанные составы, описаны в примерах 17-21 настоящего изобретения. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить при помощи любых средств, подходящих для указанной задачи. Например, введение возможно посредством перорального, парентерального, топического или трансдермального путей. Парентеральное введение включает внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный, внутрибрюшинный, внутриартериальный, внутриматочный, внутриуретральный, внутрисердечный, внутримозговой, интрацеребровентрикулярный, внутрипочечный, внутрипеченочный, внутрисухожильный, внутрикостный и интратекальный пути введения. Топическое введение включает нанесение посредством путей, выбранных из дермального, вагинального, ректального, ингаляционного, интраназального, окулярного, аурикулярного и трансбуккального. Введение может дополнительно включать методику или средства, такие как электропорация или воздействие ультразвукового излучения, способствующие введению, например, трансдермально. Другие методики, которые можно применять, включают, например, радиочастотное воздействие или применение распыления под давлением.

Вводимая дозировка будет зависеть от возраста, состояния здоровья и массы субъекта, применения одновременного лечения, при его наличии, частоты лечения и природы желательного действия. Количество полимера мирцена согласно настоящему изобретению в любой дозированной форме включает терапевтически эффективное количество, которое может зависеть от субъекта реципиента, пути и частоты введения.

В общем, количество полимера мирцена или выделенной фракция мастиковой смолы, присутствующее в фармацевтической композиции, может обычно находиться в диапазоне примерно от 0,01% примерно до 25%, как, например, примерно от 0,01 примерно до 12 мас.% от общей массы композиции. Для топического применения процентное содержание полимера мирцена или выделенной фракции мастиковой смолы в композиции может находиться в диапазоне примерно от 0,05 примерно до 2,5%. Для введения посредством инъекции процентное содержание полимера мирцена или выделенной фракции мастиковой смолы в композиции удобно может находиться в диапазоне примерно от 0,1 примерно до 7%. Для перорального введения процентное содержание полимера мирцена или выделенной фракции мастиковой смолы в композиции может находиться в диапазоне примерно от 0,005 примерно до 7%.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно производить способом, который сам по себе известен любому опытному специалисту в данной области техники, например, при помощи обычных процессов смешивания, гранулирования, дражирования, заключения в мягкие капсулы, растворения, экстрагирования или лиофилизации. Согласно предпочтительным вариантам реализации составы являются неводными и/или не содержат полярных растворителей в непосредственном контакте с активным ингредиентом полимера мирцена с тем, чтобы избежать потери биологической активности активного ингредиента. Так, фармацевтические композиции для перорального применения можно получить путем смешивания активных соединений с твердыми или полутвердыми формообразующими агентами и подходящими консервантами и/или антиокислителями. Возможно, полученную смесь можно размолоть и переработать. Полученную смесь гранул можно применять после добавления подходящих вспомогательных веществ, при необходимости, для изготовления таблеток, мягких капсул или ядер дра- 18 021833 же.

Подходящие формообразующие агенты включают, в частности, наполнители, такие как сахариды, например лактоза или сахароза, маннит или сорбит; препараты целлюлозы и/или фосфата кальция, например трикальцийфосфат или гидрофосфат кальция; а также связующие вещества, такие как крахмальная паста, с использованием, например, кукурузного крахмала, пшеничного крахмала, рисового крахмала, картофельного крахмала, желатина, трагаканта, метилцеллюлозы, гидрокспропилметилцеллюлозы, натрия карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидона. При желании можно добавить дезинтегрирующие агенты, такие как вышеуказанные крахмалы, а также карбоксиметилкрахмал, сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту либо соли альгиновой кислоты, такие как альгинат натрия. Вспомогательными являются агенты, регулирующие сыпучесть, и смазывающие вещества, например двуокись кремния, тальк, стеариновую кислоту или соли стеариновой кислоты, такие как стеарат магния или стеарат кальция, и/или полиэтиленгликоль. Ядра драже снабжают подходящими покрытиями, которые, при желании, устойчивы к желудочному соку, для чего можно применять концентрированные растворы сахаридов, которые, возможно, могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лака и походящие органические растворители или смеси растворителей. Для получения покрытий, устойчивых к желудочному соку, применяют растворы подходящих препаратов целлюлозы, таких как фталат ацетилцеллюлозы или фталат гидроксипропилметилцеллюлозы. Красящие вещества или пигменты можно вводить в покрытия для таблеток или драже, например, дли идентификации или с целью указания на комбинации доз активных соединений.

Другие фармацевтические композиции для перорального применения включают твердые составные капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие герметичные капсулы, изготовленные из желатина с пластификатором, таким как глицерин или сорбит. Составные капсулы могут содержать активные соединения в форме гранул, которые могут быть смешаны с наполнителями, такими как лактоза; связующими, такими как крахмалы; и/или смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, возможно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения предпочтительно растворяют или суспендируют в подходящих жидкостях, таких как жирные масла или жидкий парафин. Дополнительно могут быть добавлены стабилизаторы.

Другие фармацевтические композиции для перорального применения включают пленку, выполненную с возможностью прилипания к слизистой оболочке полости рта, как описано, например, в патентах США №№ 4713243; 5948430; 6177096: 6284264; 6592887 и 6709671.

Фармацевтические композиции в форме суппозиториев состоят из комбинации активного соединения (соединений) с основой суппозитория. Подходящие основы суппозиториев включают, например, природные или синтетические триглицериды, полиэтиленгликоли или парафиновые углеводороды.

Составы для парентерального введения включают суспензии и дисперсии микрочастиц активных соединений в зависимости от обстоятельств. Согласно конкретному варианту реализации можно вводить масляные суспензии путем инъекций. Подходящие липофильные растворители или несущие среды включают жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, например этилолеат, триглицериды, полиэтиленгликоль-400, Кремофор или циклодекстрины. Суспензии для инъекций могут содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, включая, например, натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Возможно, суспензия может также содержать стабилизаторы.

Фармацевтические композиции можно также приготовить с использованием липосом, содержащих активные ингредиенты. Как известно в данной области техники, липосомы, в общем, получают из фосфолипидов или других липидных веществ. Липосомы образованы моно- или мульти-ламеллярными гидратированными жидкими кристаллами, диспергированными в водной несущей среде. Можно применять любой нетоксичный, физиологически приемлемый и метаболизируемый липид, способный к образованию липосом. В общем, предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидилхолины (лецитины) как природные, так и синтетические. Способы создания липосом известны в данной области техники, например способы, описанные в Ргексой, Ей., Ме1йойк ίη Се11 Вю1оду, Уо1ите XIV, Асайешю Ргекк, №\ν Уогк, Ν.Υ. (1976) и в патенте США № 7048943.

Составы для топического введения включают мази. Походящие носители включают растительные или минеральные масла, вазелин, жиры или масла с разветвленной цепью, животные жиры и воски. Предпочтительными носителями являются носители, в которых растворим активный ингредиент. Также можно включить стабилизаторы, увлажнители и антиокислители, а также при желании агенты, придающие цвет или запах. Составы мазей можно приготовить, например, путем смешивания раствора активного ингредиента в растительном масле с теплым мягким парафином и оставляя полученную смесь остыть.

Фармацевтическая композиция может содержать микроэмульсию или эмульсию типа масло-в-воде для облегчения для указанного состава перорального, парентерального или топического применения. Такие эмульсии/микроэмульсии, в общем, содержат липиды, поверхностно-активные вещества, возможно, увлажнители и воду. Подходящие липиды включают липиды, в общем известные как подходящие для создания эмульсий/микроэмульсий типа масло-в-воде, например сложные эфиры глицеридов и жирных кислот. Подходящие поверхностно-активные вещества включают поверхностно-активные вещества, в

- 19 021833 общем, известные как подходящие для создания эмульсий/микроэмульсий типа масло-в-воде, в которых в качестве масляного компонента эмульсии применяют липиды. Предпочтительными могут быть неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как, например, этоксилированное касторовое масло, фосфолипиды и блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида. Подходящие увлажнители в случае их применения включают, например, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Составы фармацевтических композиций можно приготовить в виде геля, такого как гидрогель, образованного гельобразующим полимером, таким как каррагинан, ксантановая камедь, камедь карайи, гуммиарабик, камедь рожкового дерева, гуаровая камедь. Гидрогель можно комбинировать с эмульсией типа масло-в-воде, содержащей активный ингредиент.

Состав фармацевтической композиции можно приготовить в виде цемента, такого как цементы, содержащие полиметилметакрилат (ПММА) или фосфат кальция, применяемые в ортопедической хирургии.

Состав фармацевтической композиции можно приготовить в виде порошка, в частности как порошки, применяемые для трансдермального применения с использованием радиочастотного воздействия, описанные, например, в патентах США №№ 6074688 и 6319541 и в ЮО 2006/003659.

Состав фармацевтической композиции можно приготовить в виде клея, такого как клеи, содержащие октоцианоакрилат, применяемые для закрытия ран.

Согласно конкретному варианту реализации фармацевтическая композиция, по существу, не содержит мономерных и низкомолекулярных терпеновых соединений, включая, например, соединения, относимые к монотерпенам, дитерпенам, сесквитерпенам, тритерпенам, тетратерпенам. Примеры терпеновых соединений включают β-мирцен, α-мирцен, цис-а-оцимен, дигидромирцен, лимонен, а-пинен, βпинен, тирукаллол, бетулональ, мастикадиеноновая кислота, мастикадиеноловая кислота, изомастикадиеноновая кислота, изомастикадиеноловая кислота, олеаноловая кислота и олеаноновая кислота.

Терапевтические применения.

Согласно настоящему изобретению предложены терапевтические применения и способы лечения нарушения неврологической функции, лечения заболеваний кожи и волосистой части головы, индуцирования восстановления тканей и ран у субъекта, нуждающегося в указанном лечении. Способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенную фракцию мастиковой смолы или выделенную фракцию полимера мирцена согласно настоявшему описанию.

Стадия введения композиции может включать любой приемлемый путь, включая пероральный, топический, парентеральный и трансдермальный. Парентеральное введение включает внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный, внурибрюшинный, внутриартериальный, внутриматочный, внутриуретральный, внутрисердечный, внутримозговой, интрацеребровентрикулярный, внутрипочечный, внутрипеченочный, внутрисухожильный, внутрикостный и интратекальный пути введения. Топическое введение включает нанесение посредством путей, выбранных из дермального, вагинального, ректального, ингаляционного, интраназального, окулярного, аурикулярного и трансбуккального.

Согласно конкретным вариантам реализации стадия введения включает осуществление контакта клеток конкретного типа, конкретной линии дифференцировки или находящихся на конкретной стадии дифференцировки с композицией. Клетки могут принадлежать к любому из множества типов клеток, включая, в частности, нервные клетки, нейрональные клетки, клетки эндотелия, клетки эпителия и стволовые клетки указанных линий дифференцировки клеток. Далее, клетки могут принадлежать к любой линии дифференцировки клеток, например эктодермальной, мезодермальной, эндодермальной линиям дифференцировки или к стволовым клеткам указанных линий дифференцировки. Согласно различным вариантам реализации стадия осуществления контакта клеток проводится ίη νίνο, ех νίνο или ίη νίίτο.

Способ лечения нарушения неврологической функции согласно настоящему описанию имеет особые преимущества для субъектов, страдающих от нейродегенеративных состояний и заболеваний, включающих, в частности, травму, сосудистую деменцию, старческую деменцию, болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз (АБС), рассеянный склероз (РС), инсульт и болезнь Паркинсона. В других случаях способ можно выгодно применять у субъектов, страдающих нарушением неврологической функции, вызванной инфекцией (например, вирусной, бактериальной, грибковой, паразитической) или иммунологическим нарушением. Согласно конкретному варианту реализации нарушение неврологической функции вызвано воздействием лекарственного средства, такого как анестетик. Нарушение неврологической функции также может быть связано с состоянием, выбранным из группы, состоящей из шизофрении, биполярного расстройства, депрессии, ожирения, анорексии и кахексии.

Заболевания кожи и волосистой части головы включают все заболевания придатков кожи, волосистой части головы и волос, включая, например, ногти и волосяные фолликулы. Конкретные состояния, при которых можно получать пользу от настоящего изобретения, включают алопецию, экзему, псориаз, себорейный кератоз, себорею и повреждения кожи. Повреждения кожи включают, например, трофические язвы, пролежневые язвы, язвы диабетической стопы, ожоги, ампутационные раны, пролежни, раны после донорства расщепленного кожного лоскута, раны после донорства кожного лоскута, участки имплантации медицинского приспособления, укушенные раны, обморожения, колотые раны, осколочные

- 20 021833 раны, дермабразии, контузии, инфекции, раны и хирургические раны. Раны могут являться результатом инфекции; воздействия ионизирующего излучения; воздействия лазера или воздействия химического агента.

Изобретение может быть особенно эффективным для бесшрамового заживления ран.

Изобретение может быть особенно эффективным и экономически выгодным для лечения хронических незаживающих ран. Как известно среднему специалисту в данной области техники, эффективность конкретного лечения для стимуляции заживления ран можно оценить по различным критериям, включая скорость закрытия, измеряемую по изменению длины, ширины и глубины раны со временем, скорость эпителизации, образование грануляционной ткани и прочность ткани на разрыв.

Способы индуцирования или стимуляции регенерации тканей согласно настоящему описанию имеют особые преимущества для субъектов с повреждениями тканей, которые, например, могут быть связаны или являться результатом повреждения или поражения. Способы индуцирования или стимуляции регенерации тканей можно применять у субъектов, страдающих от повреждения или поражения, выбранного из группы, состоящей из инфаркта миокарда, легочной эмболии, церебрального инфаркта, окклюзионного поражения периферических артерий, грыжи, инфаркта селезенки, венозной язвы, аксотомии, отслойки сетчатки, раны (например, ожога, укуса, обморожения, колотой раны, осколочной раны, контузии, инфицированной раны или хирургической раны), инфекции и хирургического вмешательства.

Примеры способов согласно настоящему изобретению приведены в примерах настоящего описания. В примере 4 описано, что выделенная фракция полимера мирцена (полученная из мастики Р181ааа) индуцирует дифференцировку клеток пигментного эпителия сетчатки.

В примере 5 описано, что полимер мирцена сокращает восстановление после анестезии у экспериментальных животных.

В примере 6 описано, что та же фракция обладает активностью, индуцирующей дифференцировку линий опухолевых клеток меланомы и нейробластомы.

В примере 7 описано, что химически синтезированный полимер мирцена с молекулярной массой в различных диапазонах индуцирует дифференцировку клеток пигментного эпителия сетчатки.

В примере 8 описано, что низкомолекулярные соединения мастики, выделенные из полимера мирцена в процессе получения указанного полимера по причине растворимости указанных соединений только в полярном растворителе согласно настоящему изобретению, влияют, уменьшают и препятствуют дифференцировке клеток, вызванной активностью, проявляемой полимером мирцена.

В примерах 9-11 описано, что настоящее изобретение можно применять при лечении ран у субъектов, относящихся и не относящихся к млекопитающим.

В примере 12 описано, что композиция, содержащая полимер мирцена согласно настоящему изобретению оказывает облегчающее действие в модели сосудистой деменции на животных.

В примере 13 описано, что настоящее изобретение можно применять для стимуляции аппетита у субъектов, страдающих различными нарушениями, приводящими к потере аппетита или патологическому набору массы в результате ожирения.

В примере 14 описано, что композиции, содержащие полимер мирцена согласно настоящему изобретению, оказывают облегчающее действие в модели инсульта на животных.

В примере 15 описано, что композиции, содержащие полимер мирцена согласно настоящему изобретению, оказывают облегчающее действие в модели повреждения/травмы зрительного нерва на животных.

В примере 16 описано, что композиции, содержащие полимер мирцена согласно настоящему изобретению, оказывают облегчающее действие в модели отслойки сетчатки на животных и обеспечивают явление заживления ран без шрамов.

Стадию осуществления контакта клеток можно проводить ίη νίίτο или ех νίνο. В частности, клетки, или орган либо ткань, полученные из клеток, предназначенные для имплантации или трансплантации субъекту, можно обработать согласно настоящему изобретению. Например, клеточные эксплантаты или клетки, или ткани, выращенные и поддерживаемые в культуре, можно привести в контакт с композицией. Клетки могут происходить, например, от стволовых клеток аутологичного или гомологичного донора и могут быть предназначены для регенерации органа и/или имплантации реципиенту. В других случаях клетки происходят от гетерологичного донора и предназначены для имплантации или трансплантации реципиенту. Согласно конкретному варианту реализации клетки представляют собой клетки органа или ткани от гетерологичного донора, предназначенные для имплантации или трансплантации реципиенту. Согласно конкретному варианту реализации клетки представляют собой клетки, секретирующие растворимые факторы.

Способ можно осуществлять до или после имплантации медицинского устройства субъекту. Медицинские устройства включают, без ограничения, протез, искусственный орган или компонент искусственного органа, клапан, катетер, трубку, стент, искусственную мембрану, ритмоводитель, сенсор, эндоскоп, устройство для получения изображения, насос, проволоку и имплантат. Имплантаты включают, без ограничения, сердечный имплантат, кохлеарный имплантат, черепной имплантат, зубной имплантат, челюстно-лицевой имплантат, имплантат органа, ортопедический имплантат, сосудистый имплантат,

- 21 021833 внутрисуставной имплантат и имплантат груди.

Согласно конкретному варианту реализации медицинское устройство представляет собой имплантат органа, который может в некоторых случаях содержать аутологичные клетки субъекта.

Согласно конкретному варианту реализации стадия осуществления контакта включает средства, выбранные из группы, состоящей из электропорации, ультразвукового воздействия, радиочастотного воздействия, распыления под давлением и комбинации указанных средств.

Согласно конкретному варианту реализации стадия осуществления контакта включает установление контакта между тканевой жидкостью и композицией. Это может быть особенно выгодно для повреждений, окруженных тканевой жидкостью. Контакт между тканевой жидкостью и композицией можно осуществлять при помощи прокалывания и/или препарации кожи иглой, микроиглой или устройством, включающим множество игл или микроигл. Указанные иглы или микроиглы предпочтительно не полые и могут быть расположены во множестве, например, на гребне или щеткоподобном приспособлении.

Способ согласно настоящему изобретению подходит для применения у человека, прочих млекопитающих, рыб и птиц.

Изделия.

Способ согласно настоящему описанию может включать применение изделий, включающих композицию, содержащую полимер мирцена согласно настоящему изобретению.

Фармацевтическая композиция может находиться в виде покрытия изделия или может содержаться внутри сосуда, являющегося составной частью изделия. Фармацевтическая композиция выгодно присутствует в качестве покрытия на устройствах, вводимых в организм и предназначенных для встраивания в организм, например имплантат. Таким образом, фармацевтическая композиция может способствовать закрытию имплантата тканью благодаря активности полимера мирцена, индуцирующего дифференцировку клеток.

Фармацевтическая композиция может быть выгодно включена на поверхность или внутрь изделий, применяемых при лечении ран или восстановлении тканей, например повязку или бинт. Фармацевтическая композиция может таким образом стимулировать заживление раны благодаря активности полимера мирцена, индуцирующего дифференцировку клеток.

В других случаях фармацевтическая композиция может быть включена в устройство для доставки, такое как игла, устройство для инъекций или дозатор спрея, из которого композицию вводят в участок организма, нуждающийся в лечении, например в область раны.

Изделия включают, без ограничения, изделие из ткани, подгузник, повязку на рану, медицинское устройство, иглу, микроиглу, устройство для инъекций или распылитель спрея. Согласно конкретному варианту реализации изделие включает множество микроигл. Медицинские устройства и импланты такие, как описано выше в настоящем изобретении.

Следующие примеры представлены, чтобы более полно проиллюстрировать некоторые варианты реализации настоящего изобретения. Их, однако, не следует никоим образом рассматривать как ограничивающие широту объема изобретения. Опытный специалист в данной области техники легко может разработать множество вариантов и модификаций принципов, изложенных в настоящем описании, не выходя за рамки объема настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Получение выделенной фракции мастиковой смолы из растительных источников.

Способ 1. Мастиковую смолу (10 г) объединяли с абсолютным этанолом (200 мл) и оставляли полученную смесь стоять в течение ночи. Полученную смесь встряхивали, давали отстояться крупным нерастворимым частицам в течение 20 мин и переносили этанол в новую колбу. Остаток встряхивали со свежей порцией абсолютного этанола (150 мл) в течение 10 мин. Полученную этанольную фракцию объединяли с первой фракцией. Процедуру повторяли еще с одной порцией 150 мл абсолютного этанола, которую объединяли с первыми двумя фракциями этанола. Вслед за этим этанол удаляли в вакууме при помощи ротационного испарителя (температура водяной бани 30°С). К полученному остатку добавляли гексан (300 мл) и периодически встряхивали полученную смесь в течение 2 ч. После отстаивания в течение ночи в закрытой колбе для полного растворения растворимого материала и осаждения любого нерастворимого материала прозрачный раствор в гексане переносили в чистую предварительно взвешенную колбу и удаляли гексан при помощи ротационного испарителя. К полученной выделенной фракции немедленно добавляли выбранное количество масла и встряхивали полученную смесь до образования однородной смеси.

Способ 2. Мастиковую смолу (10 г) объединяли с абсолютным метанолом (300 мл) и оставляли полученную смесь стоять в течение ночи. Полученную смесь встряхивали, давали отстояться крупным нерастворимым частицам в течение 20 мин и переносили растворимую в метаноле фракцию в новую колбу. Остаток встряхивали со свежей порцией абсолютного метанола (200 мл) в течение 10 мин. Полученную растворимую в метаноле фракцию объединяли с первой растворимой в метаноле фракцией. Процедуру повторяли еще с одной порцией 200 мл абсолютного метанола, полученную растворимую в метаноле фракцию объединяли с первыми двумя растворимыми в метаноле фракциями. Вслед за этим метанол удаляли в вакууме при помощи ротационного испарителя (температура водяной бани 30°С). К получен- 22 021833 ному остатку добавляли гексан (300 мл) и периодически встряхивали полученную смесь в течение 2 ч. После отстаивания в течение ночи в закрытой колбе для полного растворения растворимого материала и осаждения любого нерастворимого материала прозрачный раствор в гексане переносили в чистую предварительно взвешенную колбу и удаляли гексан при помощи ротационного испарителя. К полученной выделенной фракции немедленно добавляли выбранное количество масла и встряхивали полученную смесь в закрытой колбе до образования однородной смеси.

Способ 3. Мастиковую смолу (5 г) измельчали пестиком в ступке и объединяли с гексаном (200 мл). Полученную смесь встряхивали каждые 30 мин на протяжении 8 ч и после этого оставляли стоять в течение ночи. Растворимую в гексане фракцию отделяли от нерастворимого материала и переносили в чистую колбу. Удаляли из растворимой в гексане фракции гексан при помощи ротационного испарителя. Затем полученный остаток выдерживали в системе с высоким вакуумом (<0,01 мбар) в течение по меньшей мере 24 ч для удаления дополнительных летучих материалов. Затем к полученному остатку добавляли абсолютный этанол (100 мл) и полученную смесь периодически встряхивали в течение 1 ч. Растворимую в этаноле фракцию переносили в чистую колбу и повторяли экстракцию с использованием еще двух порций по 100 мл абсолютного этанола. Растворимые в этаноле фракции объединяли и оставляли в течение ночи для осаждения любого нерастворимого материала. Прозрачный этанольный раствор переносили в чистую предварительно взвешенную колбу и удаляли этанол в вакууме. К полученному остатку немедленно добавляли выбранное количество масла и встряхивали полученную смесь до образования однородной смеси.

Способ 4. Листья, мягкие веточки, плоды и ягоды деревьев Ρ^χίас^а ^ίίχ^χ Ь., Р. абапБса или Р. ра^Бпа собирали, очищали и измельчали. Растворение в этаноле или в метаноле вначале проводили, по существу, как описано в способах 1 и 2, а последующие растворения проводили с использованием комбинации этанола или метанола с растительным маслом на протяжении ряда циклов.

Способ 5. Листья (30 г) Ρ^χίас^а ΚπΙίχ^ιχ Ь. собирали, очищали, нарезали ножом на мелкие кусочки и помещали в кухонный комбайн. Добавляли оливковое масло (10 мл) и измельчали. Извлекали всю смесь и помещали в стеклянный стакан. Добавляли 200 мл этанола (96%) и нагревали полученную смесь при 65°С в течение 20 мин. Всю смесь помещали в марлю и отжимали жидкость. Верхнюю этанольную фазу отбирали пипеткой и выбрасывали. Остаток этанола можно удалить из масляной фазы путем выпаривания.

Способ 6. Ягоды (25 г) Εηιιηιχ ^ΜΗχ (собранные в мае или июне) промывали этанолом (96%, 200 мл) в течение 30 с. Этанол и ягоды удаляли и к полученному остатку добавляли оливковое масло. Давали осесть любому нерастворимому материалу и отделяли прозрачный масляный раствор.

Способ 7. Для каждого препарата применяли приблизительно 10 г выделений смолы, собранной с деревьев Ρ^χίас^а ΚπΙίχαιχ Ь., Р. аБапПса или Р. ра^Бпа в области Зихрон-Яаков, Израиль. Смолу объединяли с 30 мл метанола в подходящем стеклянном сосуде и периодически интенсивно встряхивали в течение периода времени от 30 мин до 2 ч. Часть смолы растворялась, в то время как нерастворимый материал оседал на дно сосуда. Верхний слой жидкости декантировали, добавляли дополнительные аликвоты метанола, как описано выше, и повторяли процесс встряхивания и декантации. Оставшийся нерастворимый материал затем погружали в дистиллированную воду на время от 30 с до 1 мин, получая в результате молочно-белую жидкость с оставшимся нерастворимым материалом. После нескольких чередующихся быстрых циклов обработки водой и метанолом оставшийся нерастворимый материал высушивали на воздухе и взвешивали. Обычно из 10 г исходной смолы получали 1-3 г нерастворимого материала. Аналогичные результаты были получены при применении в качестве растворителя этанола вместо метанола. Растворение конечной фракции нерастворимого материала проводили немедленно после высушивания путем добавления растительного масла, обычно оливкового масла или масла виноградной косточки, в количестве, достаточном для получения раствора выбранной концентрации, обычно 1 или 10%.

Способ 8. Для каждого препарата применяли приблизительно 10 г или (ί) выделений смолы, собранной с коры деревьев Ρ^χίас^а ΚπΙίχαιχ Ь. или Р. ра^ша, растущих в области горы Кармель, Израиль, или (ίί) коммерчески полученной хиосской мастики (поставляемой, например, Ше СЬ^ Оит Маχί^с Огоуеге Аχχοс^аί^οη или О. Ва1бМп & Со.). Смолу измельчали в ступке, переносили в стеклянный стакан и добавляли 100 мл этанола (98%). После встряхивания в течение нескольких минут этанол декантировали, оставляя уменьшенную по причине удаления растворенного материала массу смолы. Добавляли дополнительное количество этанола и быстро повторяли стадии встряхивания, декантации и добавления растворителя в течение ряда циклов, причем каждый из циклов занимал от 5 до 30 мин. Нерастворимый материал, оставшийся после последнего цикла (обычно составлявший от 20 до 33 мас.% от коммерческого исходного материала или от 10 до 25 мас.% от исходного материала собранной смолы) растворяли в одном из следующих масел - оливковом масле, арахисовом масле, масле виноградной косточки, кунжутном масле, хлопковом масле или соевом масле, получая конечную концентрацию от 8 до 10 мас.%.

Способ 9. Измельченную мастику (~10 г) объединяли с 100 мл метанола. После встряхивания в течение нескольких минут метанол декантировали, оставляя уменьшенную по причине удаления растворенного материала массу нерастворимого белого материала. Добавляли дополнительное количество метанола и быстро повторяли стадии встряхивания, декантации и добавления растворителя в течение ряда

- 23 021833 циклов. Нерастворимый материал, оставшийся после последнего цикла (обычно составлявший от 20 до 30 мас.% от исходного материала) растворяли в оливковом масле. Процесс растворения обычно включал нагревание оливкового масла до 45°С и осторожное перемешивание в стакане.

Способ 10. Измельченную мастику (~10 г) объединяли с 25 мл соевого масла и 100 мл метанола в стеклянном стакане. Проводили перемешивание при помощи магнитной мешалки в течение 2 ч. Декантировали растворитель и добавляли свежий метанол с последующим перемешиванием в течение 1 ч. Растворитель декантировали с последующим выпариванием в вакууме для удаления оставшегося растворителя.

Способ 11. Измельченную мастику (~10 г) объединяли с 100 мл этанола (96%) в стеклянном стакане. Проводили перемешивание при помощи магнитной мешалки в течение 10 мин. Декантировали растворители и добавляли дополнительное количество этанола с последующим перемешиванием в течение 5 мин и декантацией растворителя. Стадии добавления растворителя, перемешивания и декантации повторяли 4 раза. Затем к нерастворимому белому материалу добавляли гексан (100 мл) с последующим периодическим встряхиванием до растворения материала. Небольшую пробу высушивали и взвешивали для определения концентрации. Основную часть гексанового раствора вносили в калиброванную колонку для эксклюзионной хроматографии и отбрасывали фракцию, имеющую молекулярную массу менее 1500. Фракцию с молекулярной массой выше 1500 смешивали с 20 г густой парафиновой мази. Смесь гомогенизировали путем повторного смешивания и удаляли гексан путем выпаривания в вакууме.

Указанную методику можно также осуществить путем смешивания парафинов и восков, имеющих увеличенную молекулярную массу для получения более твердого продукта.

Термин РРН-1 в настоящем описании относится к выделенной фракции, полученной, как описано в любом из вышеуказанных способов, с последующим растворением в подходящем масле, воске или комбинации указанных веществ.

РРН-1 применяли непосредственно для опытов с культурой клеток ίη νίίτο или для воздействия на подопытных животных, обычно в конечной концентрации в диапазоне от 0,025 до 5% в конкретном масле или смеси масел, как определено в настоящем описании. Кроме того, как показано в примере 2, определено, что основным компонентом РРН-1 является 1,4-поли-в-мирцен с молекулярной массой в диапазоне от 5000 до 20000.

Пример 2. Определение химических характеристик полимера мирцена, выделенного из растительных источников.

Обзор.

Мастиковую смолу из РМааа 1епп8си8 Ь. экстрагировали по способу 1 или 2 для получения выбранной фракции (называемой РРН-1), которую анализировали при помощи эксклюзионной хроматографии (§ЕС) для определения молекулярно-массового распределения. Химическую структуру РРН-1 анализировали при помощи ядерного магнитного резонанса (ЯМР) после препаративного фракционирования §ЕС.

Было обнаружено, что РРН-1 содержит легкую фракцию с молекулярной массой ниже 1000 и тяжелую полимерную фракцию с молекулярной массой в диапазоне от 5000 до 20000. По данным анализа ЯМР 'Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР преобладающее соединение в тяжелой фракции имеет структуру, соответствующую структуре 1,4-поли-в-мирцена.

Препаративное разделение проводили с использованием этилацетата и тетрагидрофурана (ТГФ) в качестве элюентов. В обоих случаях наблюдали, что тяжелая фракция полимера проявляет разнообразные выгодные биологические действия, включая индуцирование дифференцировки клеток, как описано в примерах 4 и 6. Напротив, легкая фракция показала токсичность в экспериментах на эффективность ίη νίίτο с использованием клеток пигментного эпителия сетчатки. Было обнаружено, что для сохранения активности полимерной фракции очень важно предохранить ее от окисления или реакций поперечной сшивки путем разбавления ее гидрофобным растворителем, предпочтительно маслом, возможно в комбинации с воском.

Способы.

Мастиковую смолу (10 г) объединяли с абсолютным этанолом (200 мл) и оставляли полученную смесь стоять в течение ночи. Полученную смесь встряхивали, давали отстояться крупным нерастворимым частицам в течение 20 мин и переносили этанол в новую колбу. Остаток встряхивали со свежей порцией абсолютного этанола (150 мл) в течение 10 мин. Полученную этанольную фракцию объединяли с первой фракцией. Процедуру повторяли еще с одной порцией 150 мл абсолютного этанола, которую объединяли с первыми двумя фракциями этанола. Вслед за этим этанол удаляли в вакууме при помощи ротационного испарителя (температура водяной бани 30°С). К полученному остатку добавляли гексан (300 мл) и периодически встряхивали полученную смесь в течение 2 ч. После отстаивания в течение ночи в закрытой колбе для полного осаждения любого нерастворимого материала прозрачный раствор в гексане переносили в чистую колбу и применяли для аналитического и препаративного разделения.

Макромолекулы разделяли при помощи эксклюзионной хроматографии (§ЕС) на основании их вытеснения из неподвижной фазы. В §ЕС соединения с наивысшей молекулярной массой полностью вы- 24 021833 тесняются из пор набивки и таким образом элюируются первыми. Молекулярные массы исследуемых полимерных соединений можно оценить при помощи 8ЕС исходя из сравнения со стандартной кривой, построенной для соединений с известной молекулярной массой, например полистирольных стандартов. Однако молекулярная масса полимера, определенная на основании такого сравнения, может быть подвержена допустимой погрешности метода по меньшей мере около 10-15%, поскольку взаимосвязь между гидродинамическим объемом и молекулярной массой не одинаковая для различных полимеров, благодаря чему можно провести только оценочное определение.

Для аналитической 8ЕС применяли колонку РЬде1 (7,5x300 мм 5 μ 10³ А) и калибровали по полистирольным стандартам с молекулярными массами 1000, 2000, 5000, 10000, 30000 и 70000. Все применяемые растворители (гексан, этилацетат, тетрагидрофуран (ТГФ), дихлорметан (ДХМ) и ацетон) имели аналитическое качество для жидкостной хроматографии. Было обнаружено, что для аналитических целей оптимальным является ТГФ. Применяли хроматографический прибор ТНеттоРЫптдап Т8Р, снабженный или детектором на диодной матрице, или детектором ЕЬЗО (испарительный детектор рассеяния света), применяли расход 1 мл/мин, рабочее время 15 мин и 100% ТГФ в качестве подвижной фазы.

Препаративную 8ЕС проводили при следующих условиях.

1. Условия для ТГФ:

колонка: РЬде1: 25x300 мм 5 μ 10³ А, подвижная фаза: гексан 60% /ТГФ 40% расход 11 мл/мин, разделение повторяли 12 раз по 1 мл экстракта в каждой и собирали две фракции: 1) содержащую высокие Μ\ν (молекулярные массы); 2) содержащую низкие Μ\ν.

2. Условия для ДХМ: колонка: РЬде1: 25x300 мм 5 μ А, подвижная фаза: гексан 70% /ДХМ 30% расход 11 мл/мин, разделение повторяли 12 раз по 1 мл экстракта в каждой и собирали две фракции: 1) содержащую высокие ΜΨ; 2) содержащую низкие М№.

Для каждого опыта препаративной 8ЕС колонку калибровали по полистирольным стандартам с молекулярными массами 1000, 2000, 5000, 10000, 30000 и 70000.

Фракции, собранные для двух указанных различных подвижных фаз, делили пополам, одну половину выпаривали досуха при помощи испарителя и добавляли 3 мл масла. Ко второй половине добавляли 3 мл масла и затем выпаривали органический растворитель. Полученные образцы анализировали на биологическую активность.

Материал с высокой Μν, элюированиый ТГФ, анализировали при помощи 'Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР на 300 и 75 МГц соответственно.

Результаты.

Аналитическая 8ЕС.

На фиг. 1 показана аналитическая хроматограмма 8ЕС, полученная с использованием детектора ФДМ (тонкая линия) и детектора ЕЕ®-8ЕЭЕХ (жирная линия). Фракцию, соответствующую молекулярной массе в диапазоне примерно от 60000 до 5000 (элюирование через 5-7 мин), детектировали только на детекторе ЕБ®. Оба детектора указывали на присутствие фракции с молекулярной массой в диапазоне <1000.

Препаративная 8ЕС.

На фиг. 2 показаны высокомолекулярная (фиг. 2В) и низкомолекулярная (фиг. 2А) фракции, полученные путем препаративной 8ЕС. Высокомолекулярная фракция была получена при помощи 8ЕС в ДХМ/гексане, тогда как низкомолекулярная фракция была получена при помощи 8ЕС в ТГФ/гексане. В табл. 1 обобщены данные о фракциях, полученных при помощи препаративной 8ЕС и различных систем растворителей.

- 25 021833

Таблица 1

Фракции, собранные из препаративных колонок с использованием различных элюентов способом выпаривания

№ Фракции	Диапазон молекулярной массы	Элюент / способ выпаривания
19-1	Тяжелая	ТГФ/гексан выпаривание с маслом
19-2	Легкая
19-3	Тяжелая	ТГФ/гексан выпаривание без масла
19-4	Легкая
19-5	Тяжелая	ДХМ/гексан выпаривание с маслом
19-6	Легкая
19-7	Тяжелая	ДХМ/гексан выпаривание без масла
19-8	Легкая

Анализ ЯМР.

На фиг. 3 показан спектр ¹Н-ЯМР, полученный для высокомолекулярного материала из препаративной 8ЕС в гексане 60%/ТГФ 40%. На фиг. 4 показан спектр ¹³С-ЯМР, полученный для высокомолекулярного материала из препаративной 8ЕС в гексане 50%/ТГФ 50%.

Анализ ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР показал, что 1,4-полимерный β-мирцен является основным компонентом высокомолекулярной фракции, полученной путем препаративной 8ЕС материала, нерастворимого в полярном растворителе (КРЬ-1) из мастики.

Пример 3. Химический синтез 1,4-полимерного β-мирцена.

Получали синтетические препараты 1,4-полимерного β-мирцена с различными молекулярными массами при помощи способов, в целом, основанных на методиках, описанных в №\тагк е! а1. (1988) I. Ро1ут 8с1. 26:71-77.

Способы.

Следующие реагенты помещали в 3-горлую колбу объемом 250 мл, снабженную холодильником: βмирцен, гексан и втор-бутиллитий в циклогексане, все в атмосфере азота, в количествах, показанных в табл. 2. Объем гексана, применяемого в каждой реакции, в общем случае по меньшей мере чем в 20-25 раз превышал объем инициатора бутиллития. Каждую реакционную смесь нагревали до 80°С и перемешивали примерно в течение 1 ч. Для оценки концентрации полимера отбирали небольшую аликвоту раствора (несколько мл) и выпаривали досуха.

Из некоторых реакционных смесей после реакции удаляли литий путем разбавления конечной смеси избытком гексана и двукратной промывки водой. Органическую фазу отделяли и высушивали над сульфатом натрия.

Для применения в тестах на биологическую активность и определения молекулярной массы готовили 10% раствор синтезированного полимера в оливковом масле путем добавления оливкового масла до конечной концентрации 10% (без гексана) и выпаривания растворителя гексана. Кажущуюся молекулярную массу определяли при помощи 8ЕС и рассчитывали на основании калибровочной кривой, полученной по полистирольными стандартам с молекулярными массами 2000, 5000, 10000, 30000 и 70000. Условия 8ЕС были следующие:

колонка: РЬ§е1: 7,5x300 мм 5 μ 10³ А°, подвижная фаза: 100% ТГФ, расход 1 мл/мин, детектор: ЕЬ8О.

Результаты.

Ожидаемые и вычисленные молекулярные массы полимерного β-мирцена, полученного в различных условиях реакции, представлены в табл. 2.

- 26 021833

Таблица 2

Количества реагентов и молекулярная масса продукта химически синтезированного полимера мирцена

Реакдия	втор- бутиллитий (мл)	втор- бутиллитий (моль)	β-мирден (моль)	Ожидаемая ММ	Расчетная ММ
1	3	0,00420	0,0735	2381	3816,05
2	2	0,00280	0,0735	3571	7007,32
3	1	0,00140	0,0735	7143	11400,54
4	0,5	0,00070	0,0735	14286	27153,13
5	0,25	0,00035	0,0735	28571	46034,97
6	4	0,00560	0,0735	1786	2845,24

Как показано в табл. 2, в различных условиях реакции получали полимер мирцена с раечетыми молекулярными массами в диапазоне примерно от 3000 до 46000. Продукты можно обозначить как относящиеся к диапазону высоко молекулярного полимера мирцена, т.е. от <20000 примерно до 50000, и низко молекулярного полимера мирцена, т.е. от <3000 до ~11000. Типичные аналитические профили 5ЕС для высоко и низко молекулярного полимера β-мирцена показаны на фиг. 5А и 5В соответственно.

Продукты реакции, промытые водой, показали практически идентичные результаты в аналитической 5ЕС.

На фиг. 6 показан типичный спектр Ή-ЯМР продукта полимеризации β-мирцена. На фиг. 7 показан типичный спектр ¹³С-ЯМР продукта полимеризации β-мирцена.

Анализ ²Н-ЯМР ¹³С-ЯМР показал, что продукт реакции полимеризации имеет структуру, соответствующую структуре 1,4-поли-β-мирцена.

Реакция синтеза, использованная для получения полимера β-мирцена, протекает по механизму анионной полимеризации (известной как реакция Михаэля).

Для успешного инициирования свободная энергия стадии инициирования должна быть благоприятной. Следовательно, необходимо подбирать мономер и инициатор соответствующей силы, чтобы первое присоединение являлось нисходящим. Типичной анионной реакцией является полимеризация стирола с использованием бутиллития, С₄Н₉Б1 в инертном растворителе, таком как н-гексан. При проведении в подходящих условиях не происходит обрыва реакции анионной полимеризации. Для прекращения развития обычно вводят такое соединение, как вода, спирт, молекулярный кислород или диоксид углерода, быстро реагирующее с карбанионами на концах цепей.

Анионная полимеризация дает очень узкое молекулярно-массовое распределение, поскольку отсутствуют процессы передачи цепи. Если растворитель особо чистый, цепи полимера остаются активными даже после расхода всего мономера.

Степень полимеризации выражают как где М - мономер и I - инициатор.

Как указано выше, бутиллитий является подходящим инициатором анионной полимеризации для изопренсодержащих молекул, таких как терпены. Поэтому его применяли в синтезе 1,4-полимирценов согласно настоящему изобретению.

Хотя вышеописанная методика в целом была описана в известном уровне техники (см., например, Ые^шагк е! а1. (1988) I. Ро1уш 5ст 26:71-77), важными модификациями, описанными в настоящем изобретении, были разработка высокого разбавления гексаном и конечная стадия замены растворителя на масло для получения очищенного полимера, сохраняющего свою биологическую активность с высокой эффективностью.

Пример 4. НРИ-1 индуцирует нейронально-подобную дифференцировку в культурах клеток пигментного эпителия сетчатки.

Обзор.

Настоящее изобретение направлено на индуцирование дифференцировки и созревания клеток и имеет прямое применение для регенерации функциональной ткани, в частности нейрональной ткани. Результаты наших экспериментов показали, что КРй-1 индуцирует дифференцировку клеток пигментного эпителия сетчатки, эпителиальной ткани нейронального происхождения в морфологические нейрональные клетки, производящие аксоны, дендриты и соединения между клетками, известные как синапсы. Морфологическая дифференцировка в клетках, обработанных ИРИ-1. сопровождается экспрессией бе ηονο нейрон-специфического дифференцировочного антигена β3 тубулина. Индуцирование дифферен- 27 021833 цировки нейрональных клеток строго предполагает, что КРк-1 вызывает дифференцировку нейрональных стволовых клеток в функциональные нейроны. Современные принципы патологии деменции и болезни Альцгеймера утверждают, что недостаточность включает неспособность нейронов образовывать функциональные синаптические соединения (см., например, Кгтига К., Окпо М. 1траитеп18 ш гето1е тетогу 81аЫНхабоп ргесебе Ырросатра1 8упарйс апб содтйуе Рабиге8 ш 5ΧΡΑΌ АИкенпег тои8е тобе1. БеигоЬю1 Όΐ8. 2008 Боу 5).

Соответственно эксперименты согласно настоящему описанию поддерживают применение выделенной фракции мастиковой смолы, описанной в примере 1, а также полимера мирцена в качестве активной молекулы КРк-1, в качестве терапевтического воздействия, вызывающего нейрорегенерацию при иейродегенеративных заболеваниях, таких как деменция и болезнь Альцгеймера.

Синтетический полимер мирцена также входит в объем настоящего изобретения и подходит для применения в способах терапии согласно настоящему изобретению.

Клетки пигментного эпителия сетчатки (КРЕ).

Исследования, нацеленные на изучение действия КРк-1 на различные линии клеток, взятые у человека, привели к применению клеток АКРЕ-19, линии доброкачественных клеток пигментного эпителия сетчатки человека.

Клетки пигментного эпителия сетчатки (КРЕ) представляют собой один слой шестиугольных пигментированных эпителиальных клеток нейронального происхождения, образующих внешний слой клеток в сетчатке глаза и прикрепленных к нижележащей сосудистой оболочке глаза. Функции КРЕ включают поддержку, питание и защиту нижележащих фоторецепторов нейроретины.

Клетки КРЕ участвуют в фагоцитозе внешнего сегмента клеток фоторецепторов, в цикле витамина А, в котором они осуществляют изомеризацию полностью-транс-ретинола в 11-цис-ретиналь и снабжают фоторецепторы И-глюкозой, аминокислотами и аскорбиновой кислотой.

Хотя 1п У1уо ПЭМ пигментированы, клетки АКРЕ-19 не образуют меланин и не пигментированы. В культуре клетки растут в виде веретенообразных и полигональных клеток.

Способы.

Клетки АКРЕ-19 (полученные из Американской типовой коллекции клеточных культур - Атепсап Туре Сиките СоПесиоп, АТСС) высевали на 96-луночные плоскодонные культуральные микропланшеты (Со81ат) в концентрации 2-5х10³ клеток на лунку (1-2,5х10⁴ клеток/мл) в среде для выращивания, содержащей ИМЕМ:Наш Р-12, 1:1, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 200 мМ глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки оставляли прикрепиться к поверхности планшетов в течение ночи перед воздействием КРк-1.

КРк-1 готовили, по существу, как описано в примере 1 способа 1, получая 10% раствор в носителе, состоящем из масла виноградной косточки, оливкового масла, хлопкового масла, Му§1ю1® 810 или Му§1ю1® 812. Препарат добавляли к культурам в объеме 0,5, 2, 5 и 20 мкл. Указанные объемы, введенные в общий объем сред образца, равный 200 мкл, соответствовали конечным концентрациям КРк-1 0,025, 0,1, 0,25 и 1% соответственно. Масляный носитель служил в качестве контроля по несущей среде и вносился в контрольные культуры в тех же объемах.

Культуры инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 72 ч. Затем среду удаляли, промывали культуры дважды фосфатным солевым буферным раствором (ФСБ), фиксировали абсолютным метанолом в течение 10 мин и окрашивали реагентами Нетасо1ог ® (Воектшдет Маппкет), окрашивающим клетки способом, аналогичным окраске по Гимзе, и допускающим применение в количественном определении выживаемости клеток (см. Ке18ап, Υ. А со1опте(пс тютоШет а88ау Рэг (Не диайкакоп оί суЮкте асйуку оп абкегеШ се118 ш к88ие сиките. ί. 1ттипо1. Ме(коб8 146, 155-161, 1992). Краситель вымывали 20% §И§ и определяли количественно на считывающем устройстве ЕЬ1§Л на длине волны 630 нм (оценивали образцы в трех повторениях). Для определения экспрессии β-3-тубулина клетки высевали на стерильные стеклянные покровные стекла, погруженные в 6-луночные микропланшеты в концентрации 10⁵ клеток/лунку в среде, состоящей из смеси 1: 1 минимальной поддерживающей среды по Дульбекко (ИМЕМ) и среды Нат Р12, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и пенициллином (100 ед./мл), стрептомицином (100 мкг/мл) и глутамином (2 мМ). Клетки оставляли прикрепиться к покровным стеклам в течение ночи, вводили в культуры 7% КРк-1 в оливковом масле (или только оливковое масло для контрольных препаратов) в объеме 25 мкл/мл среды и инкубировали при 37°С 5% СО₂ в течение 72 ч. Затем клетки промывали 2Х ФСБ и фиксировали 4% параформальдегидом. Для определения экспрессирования белка β-3-тубулина в клетках, покровные стекла окрашивали моноклональным первым антителом мыши, направленным на β-3-тубулин человека, с последующим вторичным меченым Р1ТС (флуоресцеин изотиоцианат) 1дС к белку мыши. Ядра клеток противоокрашивали при помощи ИАР1 (4',6-диамидино-2фенилиндол). Опытные и контрольные препараты исследовали при помощи кофокального микроскопа.

Результаты.

Неожиданно было обнаружено, что воздействие КРк-1 на клетки КРЕ АКРЕ-19 индуцирует резкие морфологические изменения, определенно являющиеся характеристиками нейродифференцировки. Морфологические изменения не наблюдались в контрольных культурах, обработанных только масляным

- 28 021833 носителем, и подобные результаты наблюдались в опытных культурах, обработанных КРЬ-1, вне зависимости от масла, применявшегося в качестве носителя активного соединения. Морфологические изменения также были связаны с приостановкой пролиферации клеток, дополнительно поддерживая вывод, что КРЬ-1 индуцирует нейродифференцировку.

Контрольные культуры, получавшие масло, демонстрировали типичные веретеновидные и полигональные формы роста, характерные для клеток КРЕ АКРЕ-19 (фиг. 8А). Через 48 ч инкубирования в культуре клетки, обработанные КРЬ-1 (0,1%; 1 мг/мл), изменили форму и развили толстые, густо окрашиваемые очень длинные единичные выросты, напоминающие аксоны нейрональных клеток (фиг. 8В). Через 48 ч инкубирования клетки, обработанные КРЬ-1 (0,25%; 2,5 мг/мл), показали большее число более тонких длинных выростов, напоминающих дендриты (фиг. 8С). Через 72 ч инкубирования с КРЬ-1 тонкие длинные выросты образовали соединения с подобными выростами соседних клеток, образовав сеть соединенных между собой клеток, потенциально способных обмениваться информацией между собой (фиг. 8Ό). Подобные сети обычно наблюдаются между нейронами в центральной нервной системе и способны передавать и обрабатывать информацию.

В то время как контрольные клетки пролиферировали на протяжении 72-часового периода инкубации, клетки, обработанные КРЬ-1, быстро прекращали пролиферацию, и плотность клеток оставалась разреженной, дополнительно поддерживая мнение о дифференцировке клеток.

При применении неактивных препаратов КРЬ-1, не индуцирующих дифференцировку, как описано выше, клетки АКРЕ-19 начинали производить большое количество гранул меланина, указанные культуры продолжали пролиферировать и плотность клеток возрастала до смыкания.

Воздействие КРЬ-1 (5% в хлопковом масле) на клетки АКРЕ-19 показало в результате экспрессию нейрональных маркеров и маркеров синаптогенеза β3 тубулина (ТиВВ3), дифференцировочного маркера нейронального типа, Агс/Аг§3.1, связанного с синаптической пластичностью; и нейронального пентраксина II (ΝΓΤΧ2), нейронального немедленно-раннего гена, действующего на возбуждающий синаптогенез. Иммунофлуоресцентный анализ дифференцированных клеток АКРЕ-19 показал, что через 72 ч инкубирования с КРЬ-1 клетки окрашиваются положительно на β3ΤϋΒ, Агс/Аг§3.1 и ΝΙ^ΤΓΧ2 (фиг. 9, правые изображения), в то время как до обработки не наблюдалось экспрессии или наблюдалась небольшая экспрессия указанных маркеров (фиг. 9, левые изображения).

Далее были получены данные, что воздействие КРЬ-1 на клетки АКРЕ-19 ведет к прекращению их репликации. Клетки обрабатывали КРЬ-1 в течение 72 ч и общее содержание белка (связанное с общим числом клеток, присутствующих в культуре) сравнивали с необработанными контрольными клетками АКРЕ-19. Как показано на фиг. 10, культуры, обработанные КРЬ-1, имели значительно более низкое содержание белка по сравнению с контрольными культурами, подтверждая, что пролиферация клеток была, по существу, остановлена.

Балльная система оценки эффективности КРЬ-1 для индуцирования дифференцировки клеток.

Исходя из приведенных выше результатов была разработана балльная система оценки эффективности КРЬ-1 для индуцирования дифференцировки в культуре клеток, с клетками, высеянными в концентрации 2х10³ на лунку. Баллы и соответствующие им описания приведены в табл. 3.

Таблица 3

Балл	Описание действия на дифференцировку
0	Действие отсутствует. Клетки пролиферируют, культуры становятся сомкнутыми, и клетки сохраняют свою типичную веретенообразную и полигональную морфологию.
1	Клетки производят пигментированную грануляцию, ио продолжают пролиферировать.
2	Менее 10 % клеток подвергаются морфологическим изменениям, давая удлиненные дендритоподобные выросты
3	Примерно 10 - 30 % клеток демонстрируют удлиненные выросты. Пролиферация клеток уменьшается по сравнешно с контрольными клетками.
4	Более 30 % клеток образуют удлиненные дендритоподобные вырост ы, образующие соединения между соседними клетками, а также толстые аксоноподобиые удлинения.
5	Вся культура клеток подвергается дифференцировке. Клетки остаются разреженными, и все клетки подвергаются морфологическим изменениям, которые завершаются образованием удлиненных дендритоподобных выростов, аксононодобных структур и межклеточных соединений.

Типичные примеры культур клеток с оценками 3, 4 к 5 представлены на фиг. 11А-11С соответственно.

Пример 5. КРЬ-1 сокращает период восстановления после анестезии.

Становится все более очевидно, что анестезия связана с повреждением нейронов, и необходимы безопасные и эффективные способы нейрозащиты в отношении указанного повреждения.

- 29 021833

Способы.

Мыши С57В1/6, по 8 в группе, получали инъекции КРй-1 посредством подкожного пути введения три раза в течение 7 дней (через день) по 0,05 мл 3% раствора в масле виноградной косточки в дозировке 30 мг/кг. Затем мышей подвергали воздействию сублетальной дозы (120 мг/кг) кетамина, вводимого мышам. Контрольная группа получала 0,05 мл масла виноградной косточки в качестве несущей среды.

Результаты.

После анестезии мыши, получавшие КРй-1, восстанавливались значительно быстрее, как показывала их полная подвижность, в то время как контрольные животные были еще неподвижны. Восстановление в контрольной группе, определяемое по возможности появления подвижности, занимало на 3 мин больше у контрольной группы по сравнению с группой, получавшей КРй-1. Полученные наблюдения показывают, что активный ингредиент полимер мирцена в КРй-1 сокращает период восстановления после анестезии и может применяться для нейропротекции в отношении побочных эффектов, связанных с анестезирующими лекарственными средствами.

Пример 6. КРй-1 индуцирует дифференцировку клеток с последующей гибелью клеток в линиях опухолевых клеток.

Изучали действие КРй-1 на две линии клеток меланомы и три линии клеток нейробластомы. Как линия клеток меланомы человека 5151, так и линия клеток меланомы мыши В16Р10 пролиферируют в культуре клеток недифференцируемым образом и не образуют меланин. Линии клеток нейробластомы человека Ьап-1, Ьап-5 и 8Υ5Υ пролиферируют в культуре в виде веретенообразных клеток и не проявляют дифференцировочной морфологии.

Способы.

Клетки высевали в концентрации 2х10³ клеток на лунку в 96-луночные плоскодонные микропланшеты (Сок!аг) и культивировали в 200 мкл среды ΌΜΕΜ (среды Дульбекко), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 200 мМ Ь-глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все реактивы от О1Ьсо-ВКЬ). После прикрепления в течение ночи к культуре клеток добавляли КРй-1 (из 10% раствора в масле виноградной косточки) для получения конечных концентраций 0,025, 0,1, 0,25 и 0,5%, и продолжали инкубирование в течение 48 и 72 ч. Несущую среду масло виноградной косточки применяли в качестве контроля. Через 72 ч клетки фиксировали метанолом и окрашивали реактивами Нетасо1ог® (Воейгшдег Маппйеш).

Результаты.

Было обнаружено, что воздействие КРй-1 на клетки меланомы индуцирует образование меланина через 24-48 ч, как показано на фиг. 12В и 12С, по сравнению с клетками, получавшими контроль на фиг. 12А. Дальнейшее воздействие КРй-1 вызывало прекращение репликации, как показывала уменьшающаяся плотность клеток, например, на фиг. 12Ό. Через 72 ч в культурах, инкубировавшихся с каждой из четырех концентраций КРй-1, наблюдалась гибель клеток.

После воздействия на линии клеток нейробластомы Ьап-1, Ьап-5 и 8Υ5Υ выделенной фракцией полимирцена (конечная концентрация 0,025%) клетки начали развивать дендритоподобные выросты и пролиферация клеток прекратилась. Более высокие концентрации КРй-1 вызывали гибель клеток во всей культуре. Таким образом, воздействие КРй-1 индуцировало морфологические нейроноподобные признаки дифференцировки с последующей гибелью клеток.

Выводы.

Полимер мирцена, активный компонент КРй-1, связан с индуцированием дифференцировки различных линий клеток, полученных из злокачественных опухолей меланомы и нейробластомы.

Блок на конечной стадии дифференцировки считают основным путем в сохранении пролиферации клеток при раке. Преодоление указанного блока уже доказало свою эффективность в качестве эффективного метода терапии некоторых видов рака (например, ретиноиды при лечении острого промиелоцитарного лейкоза) и в настоящее время известно как таргетная терапия. Таргетная терапия не убивает раковые клетки, но изменяет их поведение, в первую очередь, индуцируя дифференцировку. Соответственно можно уменьшить агрессивность многих видов рака.

Согласно настоящему описанию, обнаружено, что полимер мирцена, активный ингредиент КРй-1, преодолевает блок в дифференцировке опухолевых клеток, как показывает образование дендритов нейрональных клеток в линии клеток нейробластомы и индуцирование образования меланина в линии клеток меланомы. В обоих случаях описанные изменения связывают с прекращением пролиферации клеток и гибелью клеток.

Пример 7. Химически синтезированный полимер мирцена индуцирует дифференцировку клеток в культурах клеток пигментного эпителия сетчатки.

Опыты проводили для определения, индуцируют ли синтетические полимеры мирцена в двух различных диапазонах молекулярных масс нейродифференцировку в клетках АКРЕ-19.

Способы.

Клетки АКРЕ-19 высевали на плоскодонные 96-луночные культуральные микропланшеты (ВЮИЬ) в концентрациях 5х10³ клеток на лунку (2,5х10⁴ клеток/мл) в среде для выращивания, состоящей из

- 30 021833

ЭМЕМ:Нат Е-12, 1:1, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 200 мм глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки оставляли прикрепиться к поверхностям планшета в течение ночи перед воздействием фракций химически синтезированного полимера мирцена.

Выделенные фракции химически синтезированного полимера мирцена с различными молекулярными массами исследовали на активность в тесте на дифференцировку клеток КРЕ. Применяли описанную в примере 3 фракцию 18-1 (молекулярная масса в диапазоне примерно 50000 Да) и фракцию 18-2 (молекулярная масса в диапазоне примерно 20000 Да), для каждой фракции готовили КРИ-1 в концентрации 10% в оливковом масле. Каждый из препаратов добавляли к культурам клеток АКРЕ-19, применяя объемы 0,5, 2, 5 и 20 мкл, соответствующие конечным концентрациям 0,025, 0,1, 0,25 и 1% соответственно. Оливковое масло служило контролем по несущей среде и применялось в контрольных культурах в тех же объемах. Культуры инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 72 ч. Затем удаляли среду, промывали культуру дважды фосфатным солевым буферным раствором (ФСБ), фиксировали абсолютным метанолом в течение 10 мин и окрашивали реактивами Нетасо1ог ®.

Результаты.

Показано, что обе фракции 18-1 и 18-2 имеют активность при индуцировании нейродифференцировки в клетках АКРЕ-19 (фиг. 13 и табл. 4). Оптимальная активность наблюдалась для фракции 18-1 в концентрации 0,25% (как показано на фиг. 13А), в то время как концентрация 0,1% была отчасти эффективной, а концентрация 0,025% не имела эффекта (табл. 4). Эффект фракции 18-2 показан на фиг. 13В.

Таблица 4

Эффекты фракций 18-1 и 18-2 на дифференцировку клеток АКРЕ-19

Фракция	Объем (мкл)	Результаты
18-1	0,5	Высокая плотность клеток. Дифференцировки нет.
	2	Высокая плотность. Дифференцированные клетки.
	5 ²⁰	Более низкая плотность. Дифференцированные клетки. Длинные аксоны с межклеточными соединениями Гибель клеток
18-2	0,5	Низкая плотность. Несколько полностью дифференцированных клеток.
	2	Клетки дифференцированы, ио аксоны короче и менее
		распространены, чем для 18-1
	5-20	Гибель клеток
КРЪ-1	0,5	Дифференцированные клетки в группах. Длинные аксоны.
	2	Дифференцированные клетки с более низкой
		плотностью. Длинные аксоны.
	5-20	Гибель клеток
Масляная несущая среда	0,5-20	Очень высокая плотность клеток. Дифференцировки нет

Выводы.

Полученные результаты подкрепляют вывод, что КРИ-1 в составе выделенной фракции мастиковой смолы обладает активностью, индуцирующей дифференцировку иейрональных клеток.

Полученные результаты также подкрепляют вывод, что полимер мирцена, как выделенный из растительного источника, так и химически синтезированный, обладает активностью, индуцирующей дифференцировку нейрональных клеток.

Пример 8. Индуцирующее дифференцировку действие КРИ-1 блокируется фракцией, растворимой в полярном растворителе, присутствующей в мастиковой смоле.

Обзор.

Мастиковая смола и различные соединения, идентифицированные в ее составе, были связаны с множеством благоприятных биологических и терапевтических активностей. Различные описания в известном уровне техники показывают, что биологическая активность связана с фракцией, полученной путем экстрагирования мастики полярным растворителем и выделения материала, растворимого в полярном растворителе. Напротив, КРИ-1 представляет собой фракцию, которая была выделена из мастиковой смолы исходя из ее растворимости как в полярных органических растворителях и в неполярных органических растворителях, в то время как соединения, растворимые только в полярных органических растворителях, но не растворимые в неполярных органических растворителях, удаляли (последние в настоящем описании обозначены как фракция ЗР). Основным компонентом КРИ-1 является полимер мирцена, как показано в примере 2. Однако указанному соединению ранее не были приписаны благоприят- 31 021833 ные эффекты, но напротив, признавали его негативное влияние на пероральное введение и биодоступность активных соединений, присутствующих в мастиковой смоле. Фракция ЗР соответствует описанным в имеющемся уровне техники фракциям, которым приписывали наличие различных благоприятных биологических активностей. Задачей настоящего исследования было оценить действие ЗР на эффект дифференцировки клеток, оказываемый КРН-1. В настоящем изобретении описано, что соединения, присутствующие в ЗР, влияют и блокируют эффекты дифференцировки клеток, индуцируемые КРН-1.

Способы.

Мастиковую смолу обрабатывали для получения КРН-1, по существу, как описано в способе 1 примера 1, с использованием этанола в качестве полярного растворителя. Растворимую в этаноле фракцию декантировали с нерастворимого материала для получения фракции ЗР. Смеси КРН-1 и фракции ЗР в различных пропорциях готовили следующим образом:

Кроме того, цельную мастику, растворенную в масле (подогретом до 60°С), готовили для получения препарата ТС.

Результаты исследования, приведенные в табл. 5, показывают, что фракции, богатые КРН-1 (А0 и А1) эффективно индуцировали дифференцировку АКРЕ-19. Морфологические изменения, наблюдаемые в указанных культурах, были аналогичны изменениям, показанным на фиг. 8В и 8С. По мере увеличения пропорции фракции ЗР в смесях увеличивалась гибель клеток, при этом не наблюдалось дифференцировки клеток. Клетки в культуре, обработанной только ЗР, погибали во всех изученных дозах, а фракция ТС оказывала только незначительный эффект.

Полученные результаты показывают, что в сильную активность, индуцирующую нейродифференцировку, вносят вклад только полимеры в КРН-1, тогда как полярная фракция ЗР вызывает только гибель клеток.

Таблица 5

Эффекты смесей КРН-1 и ЗР на дифференцировку клеток

Фракция	Объем (мкл)	Результаты
АО	0,5	Высокая плотность клеток. Дифференцированные клетки.
	2	Более низкая плотность клеток. Дифференцированные клетки с
		длинными аксонами.
	5-20	Г ибель клеток.
А1	0,5	Высокая плотность клеток. Менее дифференцированные клетки, чем в АО.
	2	Дифференцировка.

- 32 021833

Фракция	Объем (мкл)	Результаты
	5	Низкая плотность клеток. Дифференцированные клетки с длинными аксонами
	20	Гибель клеток.
А2	0,5 2 20	Низкая плотность клеток. Дифференцировка. Частично дифференцированные клетки (только короткие дендриты), связанные с гибелью клеток. Гибель клеток.
АЗ	0,5	Единичная, частичная дифференцировка. Высокая плотность клеток (пролиферация клеток).
	2-20	Гибель клеток.
А4	0,5 2-20	Гибель клеток, токсичность. Гибель клеток.
А5	0,5-20	Гибель клеток.
КРЬ-1	2 5	Дифференцированные клетки с межклеточными соединениями и длинными аксонами. Дифференцировка и длинные аксоны.
	20	Гибель клеток.
8Р	0,5-20	Гибель клеток.
тс	0.5	Незначительные эффекты
	2	Гибель клеток.
Несущая среда	0,5-20	Высокая плотность

Пример 9. Заживление ран у собак.

Старый самец собаки породы золотистый ретривер имел открытую хроническую рану на ноге в течение более 6 месяцев. Поражение кожи было связано с алопецией (выпадением шерсти) и депигментацией шерсти в прилегающей области. Собака получала несколько циклов топического лечения КРй-1. После первого применения наблюдался временный отек с опуханием в течение 16-20 ч. Это сопровождалось образованием бе ηονο функциональной эпителиальной ткани (эпителизацией) и неоангиогенезом (новым образованием сети мелких сосудов) с нормальными границами тканей, благодаря быстрому и интенсивному образованию грануляционной ткани. Заживающая рана стягивалась внутрь к центру раны, позволяя предположить присутствие фибромиоцитов (мезодермального происхождения).

Рана полностью зажила примерно в течение 12 недель преимущественно с функциональной кожей и вновь выросшей шерстью. На фиг. 14 показана пораженная область до (фиг. 14А) и после (фиг. 14В) лечения КРй-1.

У другого пожилого самца собаки, страдающего алопецией, топическое лечение КРй-1 привело к новому росту шерсти до соединения с шерстью в прилегающей области.

У другой собаки наблюдалась опухоль челюсти (не индуцированная), части которой выдавались в ротовую полость. Выступающие части были иссечены хирургическим путем, тогда как части опухоли, внедренные в челюсть, удалить было невозможно. Опухоль была диагностирована как саркома. Состав, содержащий КРй-1 в масле виноградной косточки, наносили на пораженную область челюсти. Результатом лечения было практически полное излечение десен, закрывающих место хирургического вмешательства до такой степени, что шрама не осталось, и место хирургического вмешательства было больше неразличимо. Даже ожидаемый рецидив опухоли из частей, внедренных в челюсть, был предотвращен на длительный интервал в несколько недель. Лечение КРй-1 индуцировало необычайно быстрое заживление места хирургического вмешательства и полную регенерацию десен.

В обоих вышеописанных случаях заживление ран сопровождалось общим увеличением энергичности, психической ориентированности и физической активности собак, получавших лечение.

Полученные результаты поддерживают применение полимера мирцена, активного компонента КРй1, для лечения ран, регенерации волосяных фолликулов и обратного развития неврологической дегенерации.

Пример 10. Лечение ран у рыб.

Золотая рыбка так же, как и декоративный карп (обе рыбы из семейства карповых) подвержены язвам наружного покрова, вызываемым бактериями, в частности Аеиготопаз йубгорййа.

Золотых рыбок массой примерно 100 г каждая с выраженными бактериальными язвами разделяли на две группы в отдельных аквариумах, каждая группа состояла из четырех рыб. Каждый аквариум заполняли 100 л воды и обеспечивали аэрацию при помощи воздушного насоса. Группы распределяли случайным образом по массе и размеру ран (в диапазоне от 1-1,5 до 1-1,5 см). Каждая рыба получала внут- 33 021833 римышечную инъекцию через интактный внешний покров в месте, приблизительно на 5 мм отстоящем от язвы, по 20 мкл или только масла виноградной косточки (контрольная группа) или 1% раствора КРН-1 в масле виноградной косточки (опытная группа).

У рыб в опытной группе началось прогрессирующее улучшение через 4 цикла лечения КРН-1 и наступило выздоровление в течение месяца. Рыбы в указанной группе остались живы на протяжении 6 недель исследования. Указанные рыбы также продемонстрировали активное и чувствительное поведение, включая активное плавание, поиск и хватание пищи, помещаемой на поверхность воды, и быстрое испуганное бегство в ответ на постукивание по стенке аквариума.

Напротив, среди рыб в контрольной группе не наблюдалось улучшения состояния язв. Рыбы были сонными, демонстрировали малоподвижное поведение у дна аквариума и не реагировали на стимуляцию. Все рыбы в указанной группе погибли к концу указанных шести недель.

Различия между указанными двумя группами были значительными по обоим параметрам: выживаемость рыб и заживление ран.

Пример 11. Действие КРН-1 на заживление ран с использованием модели на мышах В6.УЬероЬ/О1аН5б.

Мышей В6.У-ЬероЬ/О1аН8б (оЬ/оЬ) (демонстрируют ожирение в возрасте 4 недель) применяли для оценки действия КРН-1 на заживление ран. Выполняли прокол кожи на всю толщину при помощи одноразового пробойника для биопсии (Ит-РипсН® Э^рохаЫе Вюрку РипсН, Ргепиег) в дистальной части спины каждой из мышей. Прокол имел эллиптическую форму. Средняя длина прокола по длинной оси находилась в диапазоне от 5,1 до 5,3 мм. Средняя длина прокола по короткой оси находилась в диапазоне от 4,8 до 5,1 мм. КРН-1 (5%) в оливковом масле вводили путем подкожной инъекции в два места, окружающих рану, на расстоянии 3-5 мм от края раны (группа А, п=6) или топически на рану (группа В, п=6). Несущую среду наносили на раны мышей топически (группа С, п=6). После этого применяли КРН1 (5%) 3 раза в неделю, всего 7 раз в течение 16 дней исследования, в дозе объемом 20 мкл (инъекция) или в дозе объемом 50 мкл (топическое введение).

На фиг. 15 показано, что на 11 день после нанесения раны размер раны (площадь раны) значительно уменьшился у мышей, получавших КРН-1 (группа А), по сравнению с мышами, получавшими только несущую среду (р=0,005) (группа С). Скорость заживления ран на протяжении периода со дня 0 по день 11 после нанесения раны была значительно быстрее у мышей, получавших КРН-1, по сравнению с мышами, получавшими только несущую среду (р=0,034).

Пример 12. Действие КРН-1 на обратное развитие нейродегенеративных эффектов хронической мозговой гипоперфузии (сосудистой деменции) в модели на крысах.

Сосудистая деменция (СД) представляет собой подтип деменции, находящийся в обществах западного типа на втором месте по распространенности после болезни Альцгеймера. СД вызывает множество нейропсихиатрических и физических проблем и представляет собой значительное экономическое бремя. Изображения головного мозга выявили заметные изменения в коре головного мозга и белом веществе, и полагают, что указанные поражения являются главной патологией когнитивных нарушений у пациентов с сосудистой деменцией (см., например, Рагкак е( а1., Ехребтеп1а1 сегеЬга1 НуроретГикюп шбисек \\Нйе та((ег 1И)игу апб тюгодНа1 асбуабоп ίη (Не га! Ьгат. Ас(а №игора(Но1. 2004, 108:57-64; 8(епке( е( а1., \У1и1е табег 1екюп киЫурек апб содтбуе бейсНк ш рабейк ^ИН тетогу йпрабтеп(. Оетеп( Сепа(г Содп Э|5огб. 2008, 26: 424-431).

Мозговые поражения можно экспериментально индуцировать в головном мозге крысы при помощи постоянной окклюзии обеих общих сонных артерий, что может оказать воздействие на когнитивную функцию. Указанная модель аналогична сосудистой деменции и методика эксперимента способна уменьшить кровоток в коре головного мозга и гиппокампе на 40-80% на протяжении нескольких месяцев, вызывая определенные расстройства научения. Поэтому указанную модель применяли для изучения влияния лечения КРН-1 на обратное развитие нарушений, вызванных поражениями сосудистой деменции.

Группу из 40 животных случайным образом распределяли по 3 группам, т.е. группа мнимого контроля без лечения, группа контроля по несущей среде и группа, получавшая КРН-1 (10-15 животных в группе). 10 мкл КРН-1 (5% в хлопковом масле) или несущей среды вводили подкожно 2 раза в неделю, причем первую дозу вводили через 14 дней после индуцирования сосудистой деменции.

Тест в водном лабиринте Морриса (ВЛМ) представляет собой тест, чувствительный к функции гиппокампа. Испытание в водном лабиринте проводят для оценки двух связанных с ОСА (общие сонные артерии) нарушений научения с использованием ранее описанного способа (\Уа(апаЬе е( а1., Сйок(а/о1 8боке. 2006;37(6): 1539-1545). В круглый резервуар диаметром 160 см, заполненный водой на глубину 20 см, помещают круглую прозрачную акриловую платформу, верхняя поверхность которой находится на 3 см ниже уровня воды. Крыс выпускают мордой к стене и регистрируют время спасения на платформе как латентность спасения. Испытания проводили за 3 дня до окклюзии ОСА и в дни 14, 35, 56, 84 и 112 после окклюзии ОСА. В дни испытаний проводили по 6 попыток прохождения испытаний в день с интервалом между попытками 2 мин. Животных помещали в резервуар в одном из шести исходных положений. В каждой попытке прохождения испытания регистрировали время и длину пути, необходимые для спасе- 34 021833 ния на скрытой платформе. Результаты шести попыток прохождения испытания усредняли, получая единственное репрезентативное значение, и указанные средние значения использовали для окончательного статистического анализа. Животным, нашедшим платформу, позволяли оставаться на платформе 30 с. Животных, не нашедших платформу в течение 90 с, осторожно направляли к платформе на 30 с в конце попытки.

Показатели животных, получавших КРН-1 (столбики с перекрестной штриховкой), животных, получавших несущую среду (пустые столбики) и животных в мнимом контроле (черные столбики) исследовали на частоту обнаружения платформы (фиг. 16А); время, проведенное в области платформы (фиг. 16В); латентность обнаружения платформы (фиг. 16С); частоту нахождения в зоне 1 (фиг. 16Ό); время, проведенное в светлой части (фиг. 16Е); латентность обнаружения платформы (фиг. 16Р) и скорость (фиг. 160). Все испытания показали значительно более высокие показатели в группе животных, получавших КРН-1, по сравнению по меньшей мере с одной контрольной группой.

Пример 13. Действие КРН-1 на патологическую регуляцию контроля массы (орексигенное действие и действие против ожирения).

Собаки с различными ранами, описанные в примере 9, также страдали потерей аппетита и не ели пищу, помещенную перед ними. После примерно 10 дней описанного лечения КРН-1 собаки постепенно восстановили интерес к пище и начали есть. В течение месяца собаки демонстрировали большой интерес к пище, и их аппетит был аналогичен аппетиту обычных здоровых собак.

Рыбы с язвами, описанные в примере 10, также страдали потерей аппетита. Контрольная группа продолжала игнорировать пищу, помещенную на воду, тогда как рыбы, получавшие КРН-1, реагировали охотно с быстрым движением в ответ на подачу пищи.

Крысы, описанные в примере 12, также страдали от потери массы после хронической мозговой гипоперфузии. Через 35 дней лечения (56 день исследования) крысы, получавшие КРН-1 согласно описанию, восстанавливали массу значительно быстрее, чем животные, получавшие несущую среду (фиг. 17А).

Мыши, описанные в примере 11, в целом страдали ожирением в результате мутации гена лептина. На фиг. 17В показано, что подкожное введение КРН-1 мышам (группа А; символы ромбы) вызвало значительное снижение набора массы по сравнению с животными, получавшими несущую среду (группа С; символы треугольники) или с животными, получавшими топическое введение КРН-1 (группа В; символы квадраты). Мыши в группе А набрали 4,9% в течение 11 дней. Набор массы тела показан по сравнению с исходной (0 день) массой тела. Набор массы тела в группе А значительно ниже, чем средний набор массы тела мышей в группе В (величина р = 0,02, Т-критерий, Ехсе1). Мыши в группе С были похожи (р = 0,08) на мышей в группе В и набирали массу тела, значительно отличаясь (величина р = 0,04) от мышей в группе А. Мыши групп В и С набрали 10,2 и 9,1% соответственно. Скорость набора массы тела во всех группах, выраженная как тангенс угла наклона, была близкой (р= 0,07 (А от В), 0,08 (А от С) и 0,43 (В от С)).

Описанные выше наблюдения подтверждают вывод, что КРН-1 является регулятором патологического нарушения массы и может служить орексигенным (стимулирующим аппетит) агентом или агентом против ожирения.

Пример 14. Действие КРН-1 в модели инсульта, вызванного временной окклюзией средней мозговой артерии (ОМСА) на крысах.

В исследовании для оценки способности КРН-1 предотвращать или обращать развитие неврологического расстройства, являющегося результатом ишемии, применяли модель инсульта на крысах, вызванного временной окклюзией средней мозговой артерии (ОМСА), КРН-1 (5% в хлопковом масле) вводили подкожно в количестве 10 мкл, и первое введение осуществляли через 3 ч после хирургической операции, а затем дважды в неделю до окончания исследования в день 28. Во время исследования тестировали неврологические, двигательные и соматосенсорные функции в комплексе поведенческих тестов.

На протяжении исследования не наблюдалось значимых различий между двумя группами в общем физиологическом состоянии, наборе массы тела или общих клинических симптомах.

Были заметны явные различия между группой, получавшей КРН-1, и группой контроля по несущей среде в восстановлении неврологической функции после инсульта в течение 28 дней после инсульта. В целом животные, получавшие КРН-1, демонстрировали ускоренное и улучшенное восстановление. Соматосенсорные функции были наиболее восприимчивы к лечению и показали значительный отклик уже на 8 день после инсульта (фиг. 18А и 18С). Оценка Ыеигоксоге показала, что значимые различия наблюдались только у крыс, получавших КРН-1 (группа А), между днем 8 и днем 14 и между днем 8 и днем 28 (фиг. 18А). Неврологическое восстановление, оцениваемое при помощи теста на удаление пластыря, было значимым только у крыс, получавших КРН-1 (группа А) между днем 2 и остальными днями (фиг. 18С). Улучшение двигательной функции, оцениваемое при помощи шагового теста, было значимым только у крыс, получавших КРН-1 (черные столбики), в день 28 (фиг. 18В).

- 35 021833

Пример 15. Действие КРЬ-1 на ганглиозные клетки сетчатки (ГКС).

Аксотомию зрительного нерва проводили на правом глазу крыс под глубоким наркозом (19 крыс в группе). Опытная группа получала подкожную инъекцию КРЬ-1 (5% в хлопковом масле) в заднюю область шеи; 0,025 мл/инъекция, а контрольная группа получала аналогичную инъекцию такого же объема несущей среды. Первую инъекцию вводили всем животным непосредственно после хирургического вмешательства. Последующие инъекции (те же дозировка и способ введения) вводили дважды в неделю, каждые 3 или 4 дня.

Через четырнадцать дней после аксотомии в зрительный нерв, подвергшийся аксотомии, вводили флуоресцентный катаболический нейроиндикатор (Όί-Α8ρ) для окрашивания выживших ганглиозных клеток сетчатки (ГКС), через 24 ч крыс умерщвляли в заполненной СО₂ камере и извлекали поврежденный правый глаз. Выделяли сетчатки, расправляли на предметном стекле и фиксировали заливочной средой на основе ксилола.

Цельные сетчатки изучали под флуоресцентным микроскопом. Окрашенные клетки подсчитывали вручную. Среднее число клеток ГКС в группе показано на фиг. 19, демонстрирующей значительно более высокое число клеток в опытной группе КРЬ-1.

Пример 16. Модель отслойки сетчатки (ОС).

Отслойку сетчатки (ОС) проводили на правом глазу у животных под глубоким наркозом (ксилазин 50 мг/кг и кетамин 35 мг/кг) с последующим расширением зрачков каплями тропикамид 0,5%. ОС индуцировали путем создания небольшого отверстия в сетчатке в области зубчатого края с последующей инъекцией под сетчатку 5 мкл солевого раствора при помощи шприца с иглой 300. При помощи указанной методики отслаивалась примерно половина площади сетчатки.

Крыс с ОС разделяли по двум экспериментальным группам, при этом опытная группа получала подкожную инъекцию в заднюю область шеи КРЬ-1 (5% в хлопковом масле; 0,025 мл/инъекция), а контрольная группа получала инъекцию такого же объема несущей среды. Первую инъекцию все животные получали непосредственно после хирургического вмешательства. Вторую инъекцию (те же доза и способ введения) вводили через 48 ч после хирургического вмешательства.

В день 3 и день 14 после ОС оперированных крыс умерщвляли в камере, заполненной СО₂. Извлекали поврежденный правый глаз и неповрежденный левый глаз. Выделяли сетчатки, замораживали в сухом льду и подвергали анализу методом вестерн-блоттинга или иммуногистохимическому анализу. Сетчатки левого глаза служили контролем в отсутствии операции.

Исследовали уровни экспрессии семафорина-3А (8ета3А), нейтрофилина-1 (ΝΓ1) и 0АР43, в качестве маркера апоптоза применяли касиазу-3 и исследовали морфологические изменения в клетках Мюллера и клетках микроглии.

8ета3А представляет собой ингибитор роста аксонов, который, как показано, участвует в гибели ганглиозных клеток сетчатки после повреждения зрительного нерва. Высокие уровни 8ета3А были отмечены в сетчатках после ОС по данным вестерн-блоттинг анализа (фиг. 20А). Лечение КРЬ-1 явно снизило уровни экспрессии 8ета3А как в контрольных неповрежденных сетчатках, так и в сетчатках с ОС (фиг. 20А). Образцы нормализовывали по экспрессии β-актина (нижняя полоса, фиг. 20А).

Иммуногистохимический анализ 20 мкм срезов сетчатки, инкубированных с антителом к 8ета3А и ядерным красителем 8у!ох В1ие, показал, что экспрессия 8ета3А была явно выше в отслоенных сетчатках по сравнению с контрольными. Экспрессия 8ета3А в основном наблюдалась вокруг ганглиозных клеток сетчатки. Аналогично результатам, полученным при вестерн-блоттинг анализе, экспрессия 8ета3А была снижена у животных с ОС, получавших КРЬ-1.

ΝΓ1 представляет собой функциональный рецептор 8ета3А. Клетки, положительные по ТЦКЕЬ, указывающие на процессы апоптоза, явно наблюдались через 24 ч после отслойки сетчатки и увеличивались через 7 дней.

Каспаза-3 активировалась в ответ на ОС. Однако повышение каспазы-3 было значительно ослаблено у животных с ОС, получавших КРЬ-1 (фиг. 20 В).

0АР43 представляет собой внутриклеточный белок, плотно соединенный с мембраной конусов роста. Он обычно экспрессируется в процессе синаптогенеза. В сетчатке 0АР43 экспрессирован в нейронах на ранней стадии эмбриогенеза, когда зрительный нерв еще удлиняется. В зрительном нерве крысы 0АР43 обнаружен как в аксонах, так и в телах клеток ГКС, но экспрессия исчезает в возрасте от 8 до 16 недель и обнаруживается вновь после ишемии или повреждении зрительного нерва.

Морфологические изменения в клетках Мюллера изучали путем окрашивания на глиофибриллярный кислый белок (ГФКБ). ГФКБ отмечает клетки Мюллера в сетчатке и обычно используется в качестве индикатора стресса. Метки ГФКБ в интактной контрольной сетчатке концентрировались в СГК (слой ганглиозный клеток). Иммуногистохимический анализ показал повышенные уровни ГФКБ в отслоенных сетчатках по сравнению с контрольными. Отслоенные сетчатки животных, получавших КРЬ-1, показали более высокие уровни ГФКБ.

Микроглиальная инвазия и активация считаются вредными или полезными для нейронов. Микроглиальная активация после острого повреждения ЦНС, в первую очередь, представляет собой реактивный и адаптивный ответ глиальных клеток, запускаемый поврежденными нейронами и предназначенный

- 36 021833 для облегчения первичного повреждения ткани и, как результат, содействия восстановлению и глиозу (глиальный шрам). Микроглия активируется в сетчатке обычно после повреждения, стимулируя и накапливая эндотелиальные клетки и фибробласты. Иммуногистохимический анализ срезов отслоенной и неповрежденной сетчаток, помеченных ΙΒ4 и окрашенных ядерным красителем Р1, показал присутствие активированных клеток микроглии только в отслоенных сетчатках. Однако в отслоенных сетчатках животных, получавших РРН-1, наблюдалась меньшая активация микроглии по сравнению с отслоенными сетчатками животных, получавших несущую среду.

Полученные результаты показали уменьшенное накопление активной микроглии в область вокруг поврежденного участка и поддержание бесшрамового механизма заживления ран.

Пример 17. Получение комплексов циклодекстрина с полимером мирцена.

Циклодекстрины, благодаря их способности образовывать комплексы включения со многими лекарственными средствами, могут существенно увеличивать растворимость в воде биофармацевтических препаратов, особенно относящихся к не растворимым в воде, как полимер мирцена. Циклодекстрины представляют собой растворимые в воде соединения, способные обратимо образовывать комплексы с плохо растворимыми в воде молекулами, с образованием растворимого молекулярного комплекса включения. Когда комплекс включения комбинации лекарственное средство - циклодекстрин разбавляют достаточно большим объемом воды или крови, он быстро диссоциирует, высвобождая изолированный фармакологически активный агент.

Комплексообразование полимера мирцена с β-НРСЭ (β-гидроксипропилциклодекстрин) будет проходить следующим образом:

a) растворение предварительно взвешенного полимера мирцена в минимальном количестве неполярного растворителя, такого как гексан, гептан и тому подобное;

b) добавление по каплям неполярного растворителя к порошку β-НРСЭ;

c) высушивание при 50-80°С до выпаривания неполярного растворителя; ά) смешивание с необходимым количеством воды;

е) растворение при ультразвуковом воздействии и нагревании; ί) фильтрование через фильтр 0,2-0,45 мкм.

Пример 18. Получение наноэмульсии полимера мирцена.

Составы жидких наноэмульсий типа масло-в-воде готовили по методике эмульгирования при высоком давлении всех липидных ингредиентов и активного компонента полимера мирцена, растворенного в липидной масляной фазе и эмульгированного в водной фазе, намереваясь достигнуть образования стабильных сферических равномерно распределенных содержащих лекарственное средство липидных нанокапелек. Уменьшение размера нанокапелек эмульсии существенно для получения состава лекарственного средства с высокой стабильностью. Предпочтительные капельки наноэмульсий имеют средний размер капелек менее 1 мкм (обычно в диапазоне 0,1-0,2 мкм) и равномерно диспергированы в водной фазе. Уникальность большого внутреннего гидрофобного масляного ядра капелек наноэмульсии обеспечивает высокую солюбилизационную емкость по отношению к нерастворимым в воде соединениям, таким как полимер мирцена.

1. Получение масляной фазы.

Масляная фаза состояла из 13% липоида Е-75, 0,026% α-ТФ-сукцината, пропилпарабена в качестве антиокислителя и 86,9% Μί§1γο1® 810. Полимер мирцена, полученный, как описано в примере 1, растворяли в масляной фазе. Компоненты смешивали при умеренном нагревании до получения полностью однородного солюбилизированного раствора.

2. Получение водной фазы.

Водная фаза состояла из 0,1% ЭДТА, 0,5% Твин-80, 2,3% глицерина, метилпарабена в качестве консерванта и 97,1% воды. рН доводили до 7,4 при помощи 1 N раствора ЫаОН.

3. Смешивание водной и масляной фазы.

Масляную фазу (3,7 г) нагревали и добавляли 70 мл водной фазы (предварительно нагретой). Смесь осторожно перемешивали в течение 10-15 мин при комнатной температуре.

4. Получение грубой эмульсии типа масло-в-воде.

Эмульсию типа масло-в-воде готовили при помощи дозатора среднего размера и гомогенизирующего устройства с большим усилием сдвига Ро1у1гоп® на 20000 об/мин в течение 5 мин.

5. Доведение эмульсии до субмикронного диапазона при помощи гомогенизатора высокого давления СаиНп®.

Размер капелек эмульсии, полученных после стадии 4, уменьшали до субмикронного (наноразмера), подвергая эмульсию гомогенизации с высоким усилием сдвига при помощи гомогенизатора высокого давления СаиНп® М1сто1аЬ 70 под давлением 800 бар. Всего необходимо было 5-6 циклов для получения капелек гомогенной наноэмульсии со средним размером частиц менее 200 нм. Размер частиц определяли при помощи фотонно-корреляционной спектроскопии (ФКС) с использованием анализатора размера частиц Ν4ΜΌ (СоиНет® Е1ес1гошс5, ИК). Процесс считали завершенным, когда большинство частиц (> 90%) были менее 200 нм.

- 37 021833

6. Стерильная фильтрация.

Фильтровали наноэмульсию в асептических условиях в стерильные флаконы с использованием стерильного фильтра 0,2 мкм РЕЗ и хранили при 40°С.

Пример 19. Получение высушенного распылением порошка полимера мирцена.

Обычный процесс получения продукта смеси полимер мирцена-липид представляет сбой непосредственное высушивание распылением состава, представляющего собой смесь дисперсии в неполярном растворителе, содержащем все липидные ингредиенты, и воды, содержащей гидрофильные компоненты, принимая во внимание рентабельность и соображения укрупнения масштаба. Выбранный способ высушивания распылением оптимизировали для получения мелкодисперсного сыпучего порошка. Полимер мирцена растворяли в липидной фазе, содержащей липидные ингредиенты лецитин, трикаприн (триглицерид каприновой кислоты), токоферола сукцинат, и подогревали (~40°С) в неполярном растворителе до получения хорошей дисперсии. Дисперсию пирогенного диоксида кремния (СаЪ-О-ЗП®) в воде (5%) готовили путем набухания порошка в очищенной воде. Полученную суспензию (предварительно нагретую до 40°С) затем медленно выливали в дисперсию липидов в неполярном растворителе и перемешивали полученную смесь при 40°С примерно в течение 1 ч до получения однородной дисперсии. Затем смесь высушивали распылением при помощи распылительной сушилки УатаЮ Рп1у15® СА32. Условия высушивания распылением были следующие: расход 7 мл/мин, температура на входе 130°С, температура на выходе 70°С, расход высушивающего воздуха 0,5 м³/мин. Предполагали получить однородный сухой порошок, содержащий смесь полимера мирцена-липида.

Предполагали, что состав смеси полимера мирцена-липида, полученный путем процесса непосредственного высушивания распылением, покажет хорошую диспергируемость в воде, благодаря чему подойдет для получения твердых дозированных лекарственных форм, таких как твердые желатиновые капсулы или таблетки для улучшенной пероральной доставки полимера мирцена с потенциально хорошей биодоступностью при пероральном приеме.

Пример 20. Получение липосомных препаратов, содержащих полимер мирцена.

Липиды, содержащие растворенные полимеры мирцена, растворяли в 100 мл дихлорметана в круглодонной колбе и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре до получения прозрачного бесцветного раствора. Растворитель выпаривали при помощи ротационного испарителя при 39°С. Сначала колбу вращали со скоростью 4,5 об/мин в течение 5 мин при атмосферном давлении, после этого 10-30 мин (до полного испарения растворителя) в слабом вакууме и, наконец, 15 мин в полном вакууме. По окончании процесса выпаривания будет получена однородная пленка липида. Пленку липида растворят в 15 мл изотонического буферного раствора. Липосомы получали энергичным встряхиванием в течение 10-30 мин на многошпиндельном шейкере до получения однородной молочной дисперсии многослойной липосомы (МСЛ) и исчезновения видимых остатков липидной пленки. Для получения сбалансированного и однородного липосомного препарата колбу дополнительно встряхивали при 37°С в течение 30-90 мин при 270 об/мин.

Пример 21. Получение микроэмульсий, содержащих полимер мирцена.

Некоторые поверхностно-активные вещества, обычно применяемые парентерально, можно применять для получения микроэмульсий типа вода-в-масле и масло-в-воде, подходящих для инъекционного, перорального и топического применения. Фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, подходящие для создания микроэмульсий, представляют собой неионогенные поверхностноактивные вещества, включая полиоксил-40-гидрогенизированное касторовое масло (продаваемое под торговым наименованием Кремофор КН40®, полиоксил-35-гидрогенизированное касторовое масло (продаваемое под торговым наименованием Кремофор® ЕЬ), сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот (полисорбаты), полоксамеры (Р1иготс8®), витамин Е-ТРСЗ 1000 (УЕ-ТРСЗ 1000), алкиловые эфиры полиоксиэтилена, Зо1и1о1® НЗ-15, Тада!® ТО, Ред1юо1 6-олеат, полиоксиэтилена стеараты или насыщенные полигликолизированные глицериды, все из которых коммерчески доступны. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают полиоксил-40-гидрогенизированное касторовое масло (Кремофор® КН40®), полиоксил-35-гидрогенизированное касторовое масло (Кремофор® ЕЬ), сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот (полисорбаты), полоксамеры (Р1иготс8®) и витамин Е-ТРСЗ 1000. Общее количество поверхностно-активного вещества, присутствующего в композиции, будет в общем случае составлять от 100 до 700 мг/г и предпочтительно примерно от 300 до 500 мг/г.

Получение микроэмульсий, содержащих полимер мирцена, можно осуществить путем растворения полимеров мирцена в подходящем количестве масла, такого как среднецепочечные триглицериды (Мтд1уо1) в подходящем флаконе. Затем флакон закрывают. Флакон помещают на водяную баню примерно при 50-60°С и осторожно встряхивают до полного растворения лекарственного материала. Затем флакон охлаждают до комнатной температуры, добавляют соответствующее количество поверхностноактивного вещества (такого как Кремофор® ЕЬ или УЕ-ТРСЗ) с последующим добавлением смеси монои диглицеридов жирных кислот, если таковые входят в рецептуру. Затем флакон закрывают и помещают на водяную баню примерно при 50-60°С. Флакон осторожно встряхивают до получения однородного

- 38 021833 прозрачного раствора. Полученный раствор можно поместить в капсулы из ГПМЦ и хранить при комнатной температуре до перорального приема. Как вариант, порошки замещенных полимеров (таких как ГПМЦ) можно вводить в раствор при соответствующем перемешивании (т.е. помешивании, встряхивании) для получения однородной суспензии полимера. Затем полученную композицию можно поместить в капсулы из мягкого желатина или твердого желатина и хранить при комнатной температуре до перорального приема. Как вариант, состав микроэмульсии можно применять топически или профильтровать через мембраны 0,2 мкм для парентерального введения.

Микроэмульсии, содержащие полимеры мирцена, обладают хорошей диспергируемостью в воде и самоэмульгируются при разбавлении водной средой с образованием маленьких наноразмерных мицелл с улучшенной биодоступностью.

Предшествующее описание конкретных вариантов реализации будет настолько полно раскрывать основную сущность настоящего изобретения, что любой может, применяя современные знания, легко изменить и/или приспособить описанные конкретные варианты реализации для различных применений, не проводя излишних экспериментов и не отступая от родового понятия, и, следовательно, указанные адаптации и модификации должны и предназначены входить в объем значений и диапазон эквивалентов описанных вариантов реализации. Следует понимать, что фразеология или терминология, применяемые в настоящем описании, предназначены для описания, но не для ограничения. Средства, материалы и стадии для осуществления различных описанных функций могут иметь ряд альтернативных форм, не выходящих за рамки настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенная фракция мастиковой смолы, характеризующаяся тем, что указанная фракция растворима по меньшей мере в одном полярном органическом растворителе, выбранном из спирта и простого эфира, и по меньшей мере в одном неполярном органическом растворителе, выбранном из ациклического или циклического насыщенного или ненасыщенного алифатического углеводорода или ароматического углеводорода либо их комбинаций, и, по существу, не содержит соединений, растворимых в указанном полярном органическом растворителе, но не растворимых в указанном неполярном органическом растворителе.
2. Выделенная фракция по п.1, отличающаяся тем, что по меньшей мере один полярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из метанола, этанола, пропанола, изопропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, втор-бутанола, трет-бутанола, 1пентанола, 2-пентанола, 3-пентанола, неопентанола, 3-метил-1-бутанола, 2-метил-1-бутанола, 3-метил-2бутанола, 2-метил-2-бутанола, этиленгликоля, этиленгликоля монометилового эфира, диэтилового эфира, метилэтилового эфира, этилпропилового эфира, метилпропилового эфира, 1,2-диметоксиэтана, тетрагидрофурана, дигидрофурана, фурана, пирана, дигидропирана, тетрагидропирана и их комбинаций, предпочтительно по меньшей мере один полярный органический растворитель представляет собой этанол; или неполярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из ациклических или циклических насыщенных или ненасыщенных алифатических углеводородов, ароматических углеводородов и их комбинаций, предпочтительно из группы, состоящей из С5-С10 алканов, С5-С10 циклоалканов, С6С14 ароматических углеводородов и комбинаций указанных соединений, где более предпочтительно указанный неполярный органический растворитель выбран из группы, состоящей из пентанов, гексанов, гептанов, октанов, нонанов, деканов, циклопентана, циклогексана, циклогептана, бензола, толуола, ксилола, изомеров и их смесей, наиболее предпочтительно неполярный органический растворитель представляет собой гексан; или полярный органический растворитель содержит этанол, а неполярный органический растворитель содержит гексан; или мастиковая смола получена из вида ΡίδΙαεία. выбранного из группы, состоящей из Р. 1епЙ8СИ8, Р. а11ап11еа. Р. ра1е81ша, Р. заройае, Р. 1егеЬш1йи8, Р. уега и Р. иНедегпта; или фракция, по существу, не содержит терпеновых соединений, растворимых в указанном полярном органическом растворителе, но не растворимых в указанном неполярном органическом растворителе, где предпочтительно указанные терпеновые соединения представляют собой мономерные терпеновые соединения.
3. Выделенная фракция по п.1, отличающаяся тем, что указанная фракция получена способом, включающим стадии:

(a) обработки мастиковой смолы полярным органическим растворителем;

(b) выделения фракции, растворимой в указанном полярном органическом растворителе;

(С) возможно, удаления органического растворителя;

(ά) обработки растворимой фракции, полученной на стадии (Ь) или (с), неполярным органическим растворителем;

(е) выделения фракции, растворимой в указанном неполярном органическом растворителе;

- 39 021833 (ί) возможно, удаления указанного неполярного органического растворителя, причем стадии (й)-(£) могут предшествовать стадиям (а)-(с), предпочтительно способ дополнительно включает стадию распределения по размеру фракции, полученной на стадии (с) или (ί), или где любая из стадий (с) или (ί) или обе указанные стадии включают удаление растворителя при помощи средств, выбранных из группы, состоящей из ротационного испарения, высокого вакуума и комбинации указанных средств, или способ дополнительно включает повторение стадий (а)-(с) и/или стадий (й)-(Г) в виде ряда циклов.
4. Выделенная фракция по п.1, содержащая полимер мирцена.
5. Выделенная фракция по п.4, отличающаяся тем, что указанный полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу по меньшей мере 1000, где предпочтительно среднечисленная молекулярная масса находится в диапазоне по меньшей мере от 1000 до 20000 или где среднечисленная молекулярная масса находится в диапазоне по меньшей мере от 5000 до 20000; или полимер мирцена выбран из группы, состоящей из полимера β-мирцена (поли-в-мирцена), полимера α-мирцена (поли-а-мирцена), сополимеров мирцена и их комбинаций, предпочтительно поли-βмирцен выбран из группы, состоящей из цис-1,4-поли-в-мирцена, транс-1,4-поли-в-мирцена, 3,4-поли-вмирцена, 1,2-поли-в-мирцена и их комбинаций, наиболее предпочтительно содержит смесь цис-1,4-полиβ-мирцена и транс-1,4-поли-в-мирцена, причем указанная смесь содержит по меньшей мере 75 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена, предпочтительно по меньшей мере 75 мас.% цис-1,4-поли-в-мирцена со среднечисленной молекулярной массой в диапазоне от 1000 до 20000; или полимер мирцена содержит цис-1,4-поли-в-мирцен, предпочтительно содержит по меньшей мере 90% цис-1,4-поли-в-мирцена; или полимер мирцена представляет собой продукт химического синтеза или получен из растительного источника; или полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу по меньшей мере 800 и степень чистоты по меньшей мере 80%, предпочтительно степень чистоты по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно степень чистоты по меньшей мере 95%, предпочтительно полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу по меньшей мере 1000 и степень чистоты по меньшей мере 90%; или фракция содержит менее 5% мономеров мирцена и олигомерных форм мирцена со степенью полимеризации менее 6.
6. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания кожи или волосистой части головы, повреждения тканей или лечения раны, содержащая выделенную фракцию по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
7. Композиция по п.6, содержащая от 0,01 до 25 мас.% выделенной фракции мастиковой смолы от общей массы композиции.
8. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что содержит от 0,01 до 25 мас.% полимера мирцена от общей массы композиции.
9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу по меньшей мере 800 и степень чистоты по меньшей мере 80%, предпочтительно степень чистоты по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно степень чистоты по меньшей мере 95%; или полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу по меньшей мере 1000, предпочтительно по меньшей мере 5000, наиболее предпочтительно полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу от 5000 до 20000; или полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу по меньшей мере 1000 и степень чистоты по меньшей мере 90%; или полимер мирцена представляет собой продукт химического синтеза или получен из растительного источника; или полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу в диапазоне по меньшей мере от 1000 до 50000, предпочтительно по меньшей мере от 1000 до 10000; по меньшей мере от 1000 до 20000; от 5000 до 10000; от 5000 до 20000; от 10000 до 15000; от 15000 до 30000; от 25000 до 40000; от 35000 до 50000.
10. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что носитель представляет собой гидрофобный носитель, выбранный из группы, состоящей по меньшей мере из одного масла, по меньшей мере одного воска и их комбинаций, предпочтительно по меньшей мере одно масло выбрано из группы, состоящей из миндального масла, масла канолы, кокосового масла, кукурузного масла, хлопкового масла, масла виноградной косточки, оливкового масла, арахисового масла, шафранового масла, кунжутного масла, соевого масла и их комбинации; или композиция содержит по меньшей мере одно из следующих: комплекс включения, наноэмульсию, микроэмульсию, липидную микрочастицу и дендример, где предпочтительно комплекс включения со- 40 021833 держит по меньшей мере один циклодекстрин; или где наноэмульсия содержит капельки со средним размером частиц менее 800 нм, или липосома содержит многослойную везикулу, или микроэмульсия содержит по меньшей мере одно неионогенное поверхностно-активное вещество, предпочтительно неионогенное поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полигидроксилированного касторового масла, сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот (полисорбатов), полоксамера, витамина Е, алкилового эфира полиоксиэтилена, полиоксиэтиленстеарата, насыщенного полигликолизированного глицерида или их комбинаций.
11. Композиция по любому из пп.6-10, где заболевание кожи или волосистой части головы выбрано из группы, состоящей из алопеции, экземы, псориаза, себорейного кератоза и себореи; или повреждение тканей связано с повреждением или поражением, выбранным из группы, состоящей из инфаркта миокарда, легочной эмболии, церебрального инфаркта, окклюзионного поражения периферических артерий, грыжи, инфаркта селезенки, венозной язвы, аксотомии, отслоения сетчатки, инфекции и хирургического вмешательства; или рана выбрана из группы, состоящей из трофической язвы, пролежневой язвы, язвы диабетической стопы, ожога, ампутационной раны, пролежня, раны после донорства расщепленного кожного лоскута, раны после донорства кожного лоскута, места имплантации медицинского устройства, укушенной раны, обморожения, колотой раны, осколочной раны, дермабразии, контузии, инфицированной раны и хирургической раны.
12. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что содержит от 0,01 до 25 мас.% полимера мирцена от общей массы композиции, где полимер мирцена представляет собой продукт химического синтеза или получен из растительного источника, включая синтетический полимер мирцена, имеющий среднечисленную молекулярную массу по меньшей мере от 800 до 50000 и степень чистоты по меньшей мере 80%.
13. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что указанная композиция содержит от 0,01 до 25 мас.% полимера мирцена, где полимер мирцена имеет среднечисленную молекулярную массу по меньшей мере 800 и степень чистоты по меньшей мере 80% и где указанный полимер мирцена находится в выделенной фракции, полученной способом, включающим стадии:

(a) осуществления контакта растительного материала по меньшей мере с одним полярным органическим растворителем, причем растительный материал выбран из группы, состоящей из смолы, листьев, веток, корней, цветов, семян, почек, коры, орехов и их комбинации;

(b) выделения фракции, остающейся растворимой в указанном по меньшей мере одном полярном органическом растворителе;

(c) возможно, удаления указанного органического растворителя;

(к) обработки растворимой фракции, полученной на стадии (Ь) или (с), по меньшей мере одним неполярным органическим растворителем;

(е) выделения фракции, растворимой в указанном неполярном органическом растворителе; и (ί) возможно, удаления неполярного органического растворителя, причем стадии (к)-(Г) могут предшествовать стадиям (а)-(с), а каждую из стадий (а)-(с) и стадий (к)(ί) можно независимо осуществлять в виде ряда циклов с получением выделенной фракции полимера мирцена.
14. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что содержит от 0,01 до 25 мас.% полимера мирцена от общей массы композиции, где полимер мирцена представляет собой продукт химического синтеза или получен из растительного источника и где полимер мирцена находится в выделенной фракции, полученной способом, включающим стадии:

(a) осуществления контакта растительного материала по меньшей мере с одним полярным органическим растворителем, причем растительный материал выбран из группы, состоящей из смолы, листьев, веток, корней, цветов, семян, почек, коры, орехов и их комбинации;

(b) выделения фракции, остающейся растворимой в указанном по меньшей мере одном полярном органическом растворителе;

(c) возможно, удаления указанного органического растворителя;

(к) обработки растворимой фракции, полученной на стадии (Ь) или (с), по меньшей мере одним неполярным органическим растворителем;

(е) выделения фракции, растворимой в указанном неполярном органическом растворителе; и (ί) возможно, удаления указанного неполярного органического растворителя, причем стадии (к)-(Е) могут предшествовать стадиям (а)-(с), а каждую из стадий (а)-(с) и стадий (к)(ί) можно независимо осуществлять в виде ряда циклов с получением выделенной фракции полимера мирцена.

- 41 021833
15. Способ лечения заболевания кожи или волосистой части головы, повреждения тканей или лечения раны, включающий введение фармацевтической композиции по любому из пп.6-14 пациенту, причем введение осуществляют посредством пути, выбранного из группы, состоящей из перорального, топического, парентерального, внутримышечного, подкожного, внутрикожного, вагинального, ректального, внутричерепного, интраназального, интраокулярного, аурикулярного, легочного, внутриочагового, внутрибрюшинного, внутриартериального, внутримозгового, интрацеребровентрикулярного, внутрикостного и интратекального введения; или фармацевтическую композицию готовят в виде лекарственной формы, выбранной из капсулы, таблетки, суппозитория, суспензии, мази, крема, лосьона, раствора, эмульсии, пленки, цемента, порошка, клея, аэрозоля и спрея.