BRPI1013222B1

BRPI1013222B1 - composição que consiste em uma fração isolada de goma mastique obtida de pistacia lentiscus l.

Info

Publication number: BRPI1013222B1
Application number: BRPI1013222-8A
Authority: BR
Inventors: Zadik Hazan; Shimon Amselem
Original assignee: Regenera Pharma Ltd.
Priority date: 2009-03-04
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2021-03-16
Also published as: CN102413834B; PL2403512T3; EP2403512A2; WO2010100651A3; BRPI1013222A2; CN102413834A; DK2403512T3; IL248056A0; AU2010220057A1; EP3578191A1; WO2010100651A4; AU2010220057B2; US20120039992A1; US20170252387A1; US20190255132A1; AU2010220057C1; WO2010100651A2; IL214923A0; EA201492273A1; US20140294928A1

Abstract

FRAÇÃO ISOLADA DE GOMA DE MASTIQUE E COMPOSIÇÃO DE MIRCENO POLIMÉRICO A invenção refere- se a composições e formulações que compreendem mirceno polimérico. Mais particularmente, a invenção refere-sea composições que compreendem uma fração isolada de mirceno polimérico em um carregador hidrofóbico que mantém a atividade biológica do polímero ativo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A invenção refere-se a composições isoladas de goma mastique, e seus usos terapêuticos. Mais particularmente, a invenção refere-se a composições que compreendem uma fração isolada de mirceno polimérico e formulações que mantêm a atividade biológica do polímero ativo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002]A busca por novas entidades de medicamentos derivados de vegetais e produtos vegetais para várias aplicações terapêuticas tem suas origens na antiguidade e continua até o presente. Uma dessas fontes é a mastique, também conhecida como goma mastique ou mastique goma, que é uma resina de árvore obtida como um exsudato de Pistacia lentiscus L., um membro da família Anacardiaceae. Mastique foi usado no mundo Mediterrâneo antigo para distúrbios gastrointestinais, tais como gastralgia, dispepsia e úlcera péptica. A administração oral de mastique em pacientes humanos com úlcera duodenal e em ratos experimentais com indução de úlceras gástricas e duodenais foi revelada como tendo efeitos terapêuticos (Al- Habbal et al (1984) Clin Exp Pharmacop Physio 11(5):541-4; Said et al (1986) J Ethnopharmacol 15(3):271-8). Enquanto tem sido revelado que mastique tem efeito bactericida in vitro contra Helicobacter pylori, o agente etiológico causador da doença úlcera péptica (Marone et al (2001) J Chemother 13:611-614), outros relatos revelam que mastique não exerce atividade antibacteriana quando administrado em pacientes que possuem H. pylori (Bebb et al (2003) J Antimicrob Chemother 52:52223) ou em camundongos experimentais infectados (Loughlin et al (2003) J Antimi- crob Chemother 51:367-371).

[003]A patente grega No. GR 1003541 revela a ação antimicrobiana e anti- fúngica do óleo de mastique chios extraído das folhas, ramos e frutos de Pistacia lentiscus var Chia.

[004]A patente grega No. GR 1.003.868 revela o uso de um produto derivado de Pistacia lentiscus var. Chia como um antioxidante, como um indutor de cicatriza- ção de feridas e como um agente citostático.

[005]O pedido de patente de publicação U.S. No 2005/0238740 revela que certas frações extraídas da resina mastique exibem atividades antimicrobianas e anti proliferativas de células.

[006]De acordo com o revelado, um primeiro extrato (chamado de "fração total" ou "extrato total") contém todos os compostos de goma mastique exceto a resina polimérica; um segundo extrato é uma fração ácida contendo todos os ácidos triterpênicos da fração total, e um terceiro extrato é uma fração neutra contendo todos os outros terpenos da fração total.

[007]É também revelado um óleo essencial obtido por destilação que contém monoterpenos, entre outros, β-mirceno. O pedido revela formulações farmacêuticas compreendendo qualquer uma das frações totais, ácidas, ou neutras acima mencionadas, opcionalmente combinadas com o óleo essencial, ou equivalentes sintéticos dos mesmos, ou compreendendo produtos com componentes isolados ou equivalentes sintéticos dos mesmos, bem como a utilização dos mesmos em métodos para tratar infecções microbianas incluindo H. pylori, Propionibacterium, Staphlococcus, Pseudomonas, e hiperproliferação celular.

[008]Paraschos et al (2007), de autoria de alguns dos inventores do pedido de patente acima mencionado, revela a preparação de um extrato total de mastique sem polímero (TMEWP), preparado por extração com solvente polar de mastique bruta e remoção do polímero insolúvel poli-β-mirceno desse, e frações ácidas e neutras separadas a partir do TMEWP (Paraschos et al (2007) Antimicrob Agents Che- mother 51 (2):551-559). De acordo com o revelado, a administração de TMEWP a camundongos infectados por H. pylori em um período de três meses resultou em uma redução de 30 vezes da colonização bacteriana, em grande parte atribuível a um composto especial purificado a partir da fração ácida. Os autores indicam que TMEWP foi preparado uma vez que o alto percentual de poli-β-mirceno em preparações de mastique bruta, como usado em estudos anteriores, foi especulado em impedir a potencial atividade in vivo durante a administração oral.

[009]Os autores ainda revelam que a remoção do poli β-mirceno pode produzir um grupo mais terapêutico com atividade anti H. pylori.

[0010]O pedido de patente EP No. 1520585 revela o uso de um produto obtido de uma planta do gênero Pistacia para a fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de câncer. De acordo com o revelado, os óleos essenciais destilados de folhas, galhos, frutas, nozes e flores de diferentes espécies Pistacia contêm um grande número de compostos monoméricos de terpeno em proporções variáveis, entre outros β-mirceno. O pedido revela ainda que os óleos possuem atividade contra certas linhagens de células tumorais como adenocarcinomas de cólon e ovário, e que o acetato de bornila foi o único componente encontrado que teve atividade anti-câncer.

[0011]O pedido de patente internacional No. WO 2005/112967 revela a purificação a partir de mastique de um composto anti-câncer com efeito anti-proliferativo, que é encontrado em uma fração solúvel obtida pela suspensão de mastique em um solvente selecionado a partir de um hidrocarboneto alifático não ácido, uma solução aquosa contendo pelo menos 25% de um hidrocarboneto alifático não-ácido solúvel em água, ou uma combinação dos mesmos, e removendo a fração insolúvel. O pedido ainda revela um método para o tratamento de células cancerígenas compreendendo a administração de uma quantidade farmaceuticamente efetiva de uma fração da resina de goma mastique que inibe o crescimento de células cancerígenas. De acordo com o revelado, o composto anti-câncer é eficaz contra vários tipos de células cancerígenas, incluindo as células de câncer de cólon humanas.

[0012]Van der Berg et al (1998) revela o isolamento e purificação da fração de polímero de mastique utilizando extração e cromatografia de exclusão por tamanho (Van der Berg et al (1998) Tetrahedron Lett 3:2645-2648). De acordo com o revelado, o polímero tem uma distribuição de peso molecular ampla, ou seja, 20.000 a 100.000 Da, é formado a partir de unidades de monômero de 136 Da, e tem a estrutura do 1,4-poli-β-mirceno, com configurações cis e trans na proporção de 3:1. Os autores afirmam que o que foi revelado por eles é o primeiro relato de um polímero de ocorrência natural de um monoterpeno.

[0013]Barra et al (2007) revela a extração e análise cromatográfica do óleo essencial de P. lentiscus L. (Barra et al (2007) J Agric Food Chem 55 β17):7093- 7098). De acordo com o revelado, um total de 45 compostos foi identificado, incluindo β-mirceno como um dos principais compostos.

[0014]Marner et al (1991) revela a identificação de vários triterpenóides de goma mastique de P. lentiscus (Marner et al (1991) Phytochemistry, 30, 3709-3712).

[0015]A patente U.S. No 5.506.406 revela o óleo de mastique produzido através da dissolução de mastique em um óleo ou gordura, e colocado em uma cápsula mole que opcionalmente contém ainda uma substância anfipática como a quiti- na ou quitosana. De acordo com o revelado, a cápsula é eficaz para eliminar e inibir H. pylori, e para reduzir o cheiro das fezes. A patente U.S. No. 5.637.290 revela um produto de higiene oral que compreende a combinação de uma pasta de dentes e um ingrediente selecionado a partir de mastique natural, óleo de mastique extraído e agentes sintéticos de óleo de mastique. Também é revelado o uso de mastique para incorporação em protetor solar, produtos de cabelo e cosméticos.

[0016]A patente U.S. No. 6.623.728 revela compostos cosméticos de emulsão para cuidado da pele compreendendo de cerca de 0,001% em peso a cerca de 10% em peso de goma mastique solubilizada, um solvente volátil miscível em água e um veículo cosmeticamente aceitável. De acordo com o revelado, a emulsão é preferencialmente uma emulsão de óleo em água e os solventes preferenciais incluem o etanol, metanol, propanol, álcool isopropílico e misturas dos mesmos. De acordo com o revelado, os mesmos tipos de solventes são usados para obter a goma mastique solubilizada.

[0017]A patente U.S. No. 6.811.769 revela uma composição oral compreendendo um extrato de óleo de mastique, como o preparado com azeite de oliva ou óleo de palma, e um antiflogístico, como o ácido glicirrízico. De acordo com o revelado, a composição tem ação antibacteriana contra doença periodontal relacionada com bactérias e contra a cárie dentária relacionada com bactérias.

[0018]A patente U.S. No. 7.294.651 revela o uso de compostos isoprenoi- des, entre outros, compostos de terpeno para inibir a produção de exoproteínas de bactérias Gram-positivas, tais como a Toxina-1 da Síndrome do Choque Tóxico produzida por S. aureus. De acordo com o revelado, terpenos adequados podem ser cíclicos ou acíclicos, saturados ou insaturados, e também incluem politerpenos. Também é revelado o uso de tais compostos para preparar composições que podem ser incorporadas em soluções aquosas, tais como formulações de limpeza vaginal.

[0019]A patente U.S. No. 4.564.718 revela a preparação de polímeros com terminações funcionais, referidas como "borrachas líquidas", tendo a temperatura de transição vítrea substancialmente menor que a temperatura ambiente, por polimeri- zação de um terpeno ou derivado oxigenado do mesmo tendo uma ligação dupla ou ligação dupla conjugada disponível para polimerização, com um iniciador que fornece a terminação funcional desejada. De acordo com o revelado, os polímeros preferíveis têm um peso molecular de 500 a 20.000, e os monoterpenos acíclicos preferidos para a preparação desses são entre outros, β-mirceno. A patente revela a preparação de mirceno polimérico de peso molecular de cerca de 2000 e de cerca de 4000. A patente revela ainda que os polímeros da invenção possam ser ainda reagidos com outros reagentes para fornecer elastômeros, selantes ou adesivos, ou eles podem ser usados como agentes de endurecimento da borracha. Além disso, é revelada a preparação de polimirceno com hidroxila terminal a partir do mirceno, e seu uso para preparar um elastômero de poliuretano.

[0020]Newmark et al J. Polymer Sci. 26, 71-77 (1988) revela a síntese de po- limirceno tendo um peso molecular observado de 87.000 e um peso molecular calculado de 46.000.

[0021]A patente U.S. No. 4.374.957 revela um polímero tribloco linear elas- tomérico termoplástico adesivo correspondendo à fórmula A-B-A, onde A é um bloco homopolímero linear não elástico de um hidrocarboneto aromático monovinil tendo um peso molecular médio entre 10.000 e 60.000 e uma temperatura de transição vítrea acima de 70°C, e no qual B é um bloco elastomérico homopolímero de mirce- no tendo um peso molecular médio entre 50.000 e 200.000 e uma temperatura de transição vítrea abaixo de cerca de -40°C.

[0022]A patente U.S. 5.759.569 revela artigos compostáveis biodegradáveis que, pelo menos parcialmente compreendem certos trans-polímeros, em que os polímeros têm uma massa molecular média por peso de pelo menos cerca de 20.000 e são feitos por polimerização de um componente de monômero que compreende: (1) de cerca de 70 a 100% mols de 1,3-dienos entre outros β-mirceno; e (2) até cerca de 30% mols de outros comonômeros compatíveis De acordo com o revelado, os artigos incluem inter alia materiais de embalagem; artigos absorventes descartáveis (por exemplo, fraldas, absorventes higiênicos); artigos de vestuário, como roupas de proteção, cortinas cirúrgicas, batas cirúrgicas, lençóis cirúrgicos; tecidos, malha e tecidos não-tecidos (TNT); esponjas cirúrgicas, aplicadores de tampões, seringas descartáveis e recipientes.

[0023]As patentes U.S. 7.232.872 e 7.214.750 revelam um processo de po- limerização compreendendo o contato de um ou mais monômero(s) mirceno entre outros, um ou mais ácido(s) de Lewis, um ou mais iniciador(es), e um diluente com- preendendo um ou mais hidrofluorcarbonos(s) em um reator.

[0024]O pedido de patente de publicação U.S. No 2007/0179260 e a patente U.S. 7.417.103 revelam polímeros à base de 3,4-isopreno com regioregularidade elevada e um método para produzir o mesmo. De acordo com estas revelações, a massa molar média numérica do polímero é de 5000 a 6.000.000, e o polímero pode também incluir unidades de 1,4-isoprenos como o mirceno. De acordo com o revelado, o polímero é adequado para uso como um material plástico devido à sua durabilidade mecânica e térmica.

[0025]A técnica anterior não contém qualquer ensinamento ou sugestão do uso de uma fração isolada de mirceno polimérico, seja derivada de mastique, ou de síntese química, como um ingrediente ativo em uma composição farmacêutica ou em uma aplicação terapêutica. A técnica anterior não ensina ou sugere o uso de uma fração isolada de mirceno polimérico em uma composição para o tratamento de condições neurológicas ou doenças de pele.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0026]A presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo formas poliméricas do composto monoterpeno conhecido como mirceno, que exibe uma variedade de atividades biológicas benéficas que podem ser exploradas para aplicações terapêuticas. Mais especificamente, as composições compreendendo frações isoladas de mirceno polimérico, incluindo as quimicamente sintetizadas e os derivados de fontes vegetais como a goma mastique, são agora revelados tendo atividade na neuroproteção, regeneração de tecidos e reparo dos tecidos e feridas.

[0027]As composições reveladas aqui podem ser preparadas por extração com solvente de determinados materiais vegetais, como a goma mastique, a fim de obter frações isoladas que são solúveis em ambos os solventes polares e os não polares, e possui depleção de vários compostos monoméricos de terpeno que inter- ferem com a atividade biológica desejada.

[0028]Os ensinamentos da presente invenção foram exemplificados com extratos de goma mastique preparados por um procedimento de extração em duas etapas, de modo a obter uma fração que é solúvel em ambos os solventes polares e os solventes não polares, onde o material de goma mastique que é solúvel no solvente polar, mas permanece insolúvel no solvente não polar é eliminado. A presente invenção também foi exemplificada com ambos o mirceno polimérico isolado de uma fonte natural, ou seja, resina de árvore de mastique, e o mirceno polimérico quimicamente sintetizado tendo o peso molecular na mesma faixa e estrutura química como a do polímero correspondente isolada de mastique.

[0029]Além disso, os ensinamentos da presente invenção são particularmente surpreendentes e inesperados sobre os ensinamentos que revelam o uso de frações extraídas de goma mastique a partir do qual o mirceno polimérico foi removido. Além disso, a técnica anterior afirma que as frações poliméricas derivadas de masti- que não são terapeuticamente úteis, e que a presença de mirceno polimérico em composições terapêuticas realmente inibe as atividades biológicas benéficas e a bi- odisponibilidade dos compostos ativos. A técnica anterior ensina que os compostos ativos em gomas mastique correspondem a várias moléculas tipo terpeno de baixo peso molecular, entre outros mirceno monomérico. No entanto, os inventores da presente invenção surpreendentemente demonstraram, contrariando os ensinamentos da técnica anterior, que mirceno monomérico, pequenas formas oligoméricas de mirceno, e alguns outros terpenos de baixo peso molecular interferem e bloqueiam a atividade de mirceno polimérico em induzir a diferenciação celular.

[0030]Sem querer vincular com qualquer teoria ou mecanismo de ação em particular, a atividade do mirceno polimérico para indução de diferenciação celular neuronal, conforme revelado aqui, torna a presente invenção útil para reformar as junções inter-neuronais e superar o defeito de comunicação inter-neuronal em tecido neural e cerebral afetados por patologias associadas à formação inapropriada de sinapses. Esta patologia delineia a muitas patologias do sistema nervoso, incluindo, por exemplo, a doença de Alzheimer.

[0031]A invenção ainda é útil para promover a cicatrização de feridas e o re-juvenescimento de um grande número de células e tecidos.

[0032]Como usado aqui "mirceno polimérico" engloba formas poliméricas de mirceno tendo um grau de polimerização de pelo menos 6. Mirceno polimérico inclui, entre outros, β-mirceno polimérico(poli—3—mirceno), a-mirceno polimérico (poli-a- mirceno), homopolímeros dos mesmos e heteropolímeros (também conhecidos como copolímeros), que contêm subunidades mirceno.

[0033]Também estão incluídos os isômeros geométricos, isômeros ópticos e diastereoisômeros de compostos de mirceno polimérico.

[0034]Deve ser entendido explicitamente que o escopo da presente invenção não inclui mirceno em sua forma monomérica, tais como β-mirceno e a-mirceno, como ingredientes ativos das frações e composições revelados neste documento.

[0035]Como usado neste documento, β-mirceno refere-se a 7-metil-3- metileno-1,6-octadieno e a-mirceno refere-se ao isômero estrutural 2-metil-6- metileno-1,7-octadieno.

[0036]Deve ainda ser entendido que a atividade biológica das frações e composições reveladas neste documento é inibida pela presença de certas formas monoméricas e pequenas formas oligoméricas de terpenos diversos.

[0037]De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma composição que compreende uma quantidade eficaz de uma fração isolada de goma mastique, onde a fração é caracterizada na qual ela é solúvel em pelo menos um solvente orgânico polar e em pelo menos um solvente orgânico não polar, e em que a tal fração é substancialmente desprovida de compostos que são solúveis em dito solvente orgânico polar, mas insolúvel em dito solvente orgânico não polar.

[0038]Em uma modalidade particular, a composição é obtida por um processo compreendendo as etapas de: (a) tratar a goma mastique com um solvente orgânico polar; (b) isolar a fração solúvel em dito solvente orgânico polar; (c) remoção opcional de dito solvente orgânico polar; (d) tratar a fração solúvel obtida na etapa (b) ou (c) com um solvente orgânico não polar, (e) isolar uma fração solúvel em dito solvente orgânico não polar; e (f) remoção opcional de dito solvente orgânico não polar; onde as etapas (d) a (f) podem preceder as etapas (a) a (c)

[0039]Em modalidades particulares, as etapas (a) a (c) são realizadas antes das etapas (d) a (f); ou etapas (d) a (f) são realizadas antes das etapas (a) a (c). Em modalidades particulares, (a) a (c) e/ou etapas (d) a (f) são repetidos por uma multiplicidade de ciclos.

[0040]Em uma modalidade particular, cada uma ou ambas as etapas (c) e (f) incluem a remoção do solvente por um meio selecionado do grupo que consiste de evaporação rotatória, aplicação de alto vácuo e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade particular, o processo inclui ainda a etapa de fracionamento do tamanho da fração obtida por dito processo.

[0041]Solventes orgânicos polares adequados para uso na invenção podem ser selecionados a partir de um álcool, um éter, um éster, uma amida, um aldeído, uma cetona, uma nitrila, e combinações dos mesmos.

[0042]Exemplos específicos de solventes orgânicos polares adequados incluem etanol, metanol, propanol, isopropanol, 1-butanol, 2-butanol, sec-butanol, t- butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, neopentanol, 3-metil-1-butanol, & fB ;, 3- metil-2-butanol, 2-metil-2-butanol, etilenoglicol, etilenoglicol monometil éter, éter die- tílico, metiletil éter, etilpropil éter, metilpropil éter, 1,2 dimetoxietano, tetrahidrofurano, dihhidrofurano, furano, pirano, diidropirano, tetrahidropirano, acetato de metila, ace- tato de etila, acetato de propila, acetaldeído, metilformato, etilformato, propionato de etila, propionato de metila, diclorometano, clorofórmio, dimetilformamida, acetamida, dimetilacetamida, N-metilpirrolidona, acetona, etilmetilcetona, dietilcetona, acetonitri- la, propionitrila e combinações dos mesmos.

[0043]Em modalidades particulares, o solvente orgânico polar é o etanol.

[0044]Solventes orgânicos não polares adequados para uso na invenção podem ser selecionados a partir de hidrocarbonetos alifáticos saturados ou insatura- dos, cíclicos ou acíclicos e hidrocarbonetos aromáticos, cada um dos quais é opcionalmente substituído por um ou mais halogênios, e combinações dos mesmos. Em modalidades particulares, o solvente orgânico não polar é selecionado a partir de alcanos C5-C10, cicloalcanos C5-C10, hidrocarbonetos aromáticos C6-C14 e perflu- oroalcanos C7-C14 e combinações dos mesmos.

[0045]Em modalidades particulares, o solvente orgânico não polar é selecionado a partir de pentanos, hexanos, heptanos, octanos, nonanos, decanos, ciclopen- tano, ciclohexano, cicloheptano, benzeno, tolueno, xileno, e isômeros e suas dos mesmos.

[0046]Em modalidades particulares, o alcano C5-C10 é selecionado do grupo que consiste de pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, ciclo hexano e isômeros e misturas dos mesmos.

[0047]Em modalidades particulares, o solvente orgânico não polar é o hexano.

[0048]Em uma modalidade particular, o solvente orgânico polar compreende etanol e o solvente orgânico não polar compreende hexano.

[0049]Em uma modalidade particular, a composição é substancialmente desprovida de compostos de terpenos, que são solúveis em dito solvente orgânico polar e insolúveis em dito solvente orgânico não polar. Em uma modalidade particular, os compostos de terpeno são compostos monoméricos de terpeno. Em uma modalidade particular, os compostos de terpeno são selecionados a partir de β- mirceno, a-mirceno, cis-a-ocimeno, dihidromirceno, limoneno, a-pineno, β-pineno e combinações dos mesmos.

[0050]Em uma modalidade particular, a composição compreende de cerca de 0,01 a cerca de 25% (p/p) da fração isolada de goma mastique, com base no peso total da composição. Em uma modalidade particular, a composição compreende de cerca de 0,01 a cerca de 12% (p/p) da fração isolada de goma mastique, com base no peso total da composição.

[0051]Em uma modalidade particular, a fração isolada de goma mastique compreende mirceno polimérico.

[0052]Em outro aspecto a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma fração isolada de mirceno polimérico, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0053]Em uma modalidade particular, a composição compreende de cerca de 0,01 a cerca de 12% (p/p) mirceno polimérico, com base no peso total da composição.

[0054]Em modalidades particulares, o mirceno polimérico é selecionado do grupo que consiste de β-mirceno polimérico (poli-β-mirceno), a-mirceno polimérico (poli-a-mirceno), copolímeros de mirceno e combinações dos mesmos. Em modalidades particulares, o poli-β-mirceno é selecionado do grupo que consiste de 1,4-poli- β-mirceno, 3,4-poli-β-mirceno, 1,2-poli-β-mirceno e combinações dos mesmos. Em modalidades particulares, o mirceno polimérico compreende um isômero mirceno selecionado do grupo que consiste de um isômero cis, um isômero trans e combinações dos mesmos. Em modalidades particulares, o 1,4-poli-β-mirceno é selecionado do grupo que consiste de cis-1,4-poli-β-mirceno, trans-1,4-poli-β-mirceno, e combinações dos mesmos. Em modalidades particulares, o mirceno polimérico compreende cis-1,4-poli-β-mirceno. Em modalidades particulares, o mirceno polimérico tem uma conformação cíclica. Em modalidades particulares, o mirceno polimérico tem uma conformação ramificada.

[0055]Em uma modalidade particular, o mirceno polimérico tem um grau de polimerização na faixa de pelo menos cerca de 6 a cerca de 1800. Em uma modalidade particular, o grau de polimerização é de pelo menos cerca de 10. Em uma modalidade particular, o grau de polimerização é de pelo menos cerca de 15. Em uma modalidade particular, o grau de polimerização é de pelo menos cerca de 25. Em uma modalidade particular, o grau de polimerização é de pelo menos cerca de 35. Em uma modalidade particular, o grau de polimerização é na faixa de cerca de 6 a cerca de 30. Em uma modalidade particular, o grau de polimerização é na faixa de cerca de 30 a cerca de 500, por exemplo, na faixa de cerca de 33 a cerca de 150.

[0056]Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0057]Em uma modalidade particular, o mirceno polimérico tem uma massa molar média numérica de pelo menos cerca de 800. Em uma modalidade particular, a massa molar média numérica é de pelo menos cerca de 1.000. Em uma modalidade particular, a massa molar média numérica é de pelo menos cerca de 2000. Em uma modalidade particular, a massa molar média numérica é de pelo menos cerca de 3000. Em uma modalidade particular, a massa molar média numérica é de pelo menos cerca de 5000. Em uma modalidade particular, o mirceno polimérico tem uma massa molar média numérica na faixa de pelo menos cerca de 800 para cerca de 100.000. Em modalidades particulares, a massa molar média numérica é de um intervalo selecionado do grupo que consiste em: pelo menos cerca de 800 a cerca de 80.000; pelo menos cerca de 800 a cerca de 50.000; pelo menos cerca de 800 a cerca de 20.000; pelo menos cerca de 800 a cerca de 10.000; pelo menos cerca de 800 a cerca de 5000, pelo menos cerca de 1.000 a cerca de 50.000; pelo menos cerca de 1.000 a cerca de 10.000; pelo menos cerca de 1.000 a cerca de 5000; cer- ca de 5000 para cerca de 10.000; cerca de 10.000 a cerca de 15.000; cerca de 5000 a cerca de 20.000; cerca de 15.000 a cerca de 30.000; cerca de 25.000 a cerca de 40.000; cerca de 35.000 a cerca de 50.000; cerca de 45.000 a cerca de 60.000; cerca de 55.000 a cerca de 70.000; cerca de 65.000 a cerca de 80.000; cerca de 75.000 a cerca de 90.000; cerca de 85.000 a cerca de 100.000; ou quaisquer combinações e sub-faixas dos mesmos. Em uma modalidade particular, o mirceno polimé- rico tem uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 5.000 a cerca de 20.000.

[0058]Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0059]Deve ser entendido que a composição pode incluir frações de diferentes pesos moleculares de mirceno polimérico, por exemplo, na faixa de pelo menos cerca de 800 a cerca de 100.000, ou várias combinações dos mesmos. Em uma modalidade particular, o mirceno polimérico tem um índice de polidispersividade inferior a 5.

[0060]Em uma modalidade particular, o mirceno polimérico é o produto de uma síntese química. Em uma modalidade particular, a síntese química compreende o uso de mirceno monomérico como substrato. Em uma modalidade particular, o substrato é o β-mirceno. Em uma modalidade particular, o substrato é o β-mirceno é derivado de um vegetal.

[0061]Em uma modalidade particular, o produto da síntese química compreende o cis-1,4-poli-β-mirceno. Em uma modalidade particular, a síntese química compreende uma reação de polimerização aniônica. Em uma modalidade particular, a síntese química compreende ainda a dissolução do mirceno polimérico obtido a partir de um veículo hidrofóbico, como pelo menos um óleo vegetal.

[0062]Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico é derivada de uma fonte natural. As fontes naturais incluem plantas classificadas na família Anacardiaceae. Em uma modalidade particular, goma mastique é de uma planta classificada na família Anacardiaceae. Plantas apropriadas incluem aquelas classificadas em um gênero selecionado do grupo que consiste de Pistacia, Pinus, Picea, Juniperus, Alsies, Larix, Antirrhinum, Boswellia, Citrus e Gynura. Em uma modalidade particular, a espécie de Pistacia é selecionada do grupo que consiste de P. lentiscus, P atlantica., P. palestina, P.saportae, P.terebinthus, P. vera e P. integerrima. Em uma modalidade particular, a espécie de Pistacia é Pistacia lentiscus L.. Em uma modalidade particular, a fonte natural é um material vegetal selecionado do grupo que consiste de resinas, folhas, galhos, raízes, flores, sementes, brotos, casca, nozes e raízes. Em uma modalidade particular, a fonte natural é uma planta classificada em um gênero selecionado do grupo que consiste de Ocimum, Laurus e Lavendula.

[0063]Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico é obtida por um processo compreendendo as etapas de: (a) contatar o material vegetal em contato com pelo menos um solvente orgânico polar; (b) isolar uma fração que é solúvel em pelo menos um solvente orgânico polar (c) remover opcionalmente opcional dito solvente orgânico polar; (d) tratar a fração solúvel obtida na etapa (b) ou (c) com pelo menos um solvente orgânico não polar; (e) isolar uma fração solúvel no tal solvente orgânico não polar; e (f) opcionalmente remover dito solvente orgânico não polar; onde as etapas (d) a (f) podem preceder as etapas (a) a (c), e onde as etapas (a) a (c) e as etapas (d) a (f) são efetuadas independentemente por um número de ciclos; de modo a obter uma fração isolada de mirceno polimérico.

[0064]Em modalidades particulares, a fração isolada de mirceno polimérico tem um grau de pureza de pelo menos cerca de 80% (p/p). A fração isolada de mir- ceno polimérico pode ter um grau de pureza de pelo menos cerca de 85% (p/p). Em modalidades particulares, a fração isolada de mirceno polimérico tem um grau de pureza de pelo menos cerca de 90% (p/p), ou de pelo menos cerca de 93%, ou de pelo menos cerca de 95%, ou de pelo menos cerca de 97%, ou de pelo menos cerca de 98% ou de pelo menos cerca de 99%.

[0065]Em modalidades particulares, a fração isolada de mirceno polimérico tem um grau de pureza de pelo menos cerca de 80%, e o mirceno polimérico tem um grau de polimerização de pelo menos 6.

[0066]Em modalidades particulares, a fração isolada de mirceno polimérico tem um grau de pureza de pelo menos cerca de 90%, e o mirceno polimérico tem um grau de polimerização de pelo menos 10.

[0067]Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende uma mistura de cis- 1,4-poli-β-mirceno e trans-1,4-poli-β-mirceno, onde a mistura compreende pelo menos 50% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β- mirceno tendo uma massa molar média numérica de pelo menos 800, ou de pelo menos 1.000, ou de pelo menos 5.000, ou de pelo menos 10.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende de pelo menos 80% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 800 a cerca de 5.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 1.000 para cerca de 10.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende de pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 5000 para cerca de 20.000.

[0068]Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende de pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de pelo menos 10.000 a cerca de 20.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de pelo menos 20.000 a cerca de 30.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4- poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de pelo menos 30.000 a cerca de 50.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirce- no polimérico compreende de pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 50.000 a cerca de 80.000.

[0069]Em modalidades particulares, a composição compreende menos do que de cerca de 10% (p/p), e mais preferencialmente, menos do que cerca de 5% (p/p), de compostos de terpeno que são solúveis em um solvente orgânico polar e insolúveis em um solvente orgânico não polar. Em uma modalidade particular, a composição é substancialmente desprovida de compostos terpenos que são solúveis em solvente orgânico polar e insolúveis em solvente orgânico não polar. Em modalidades particulares, a composição compreende menos do que cerca de 10% (p/p), e mais preferencialmente, menos do que cerca de 5% (p/p), de compostos monoméricos terpeno. Em uma modalidade particular, a composição é substancialmente desprovida de monômeros de mirceno.

[0070]Conforme referido neste documento, compostos de terpeno incluem formas monoméricas e oligoméricas de compostos de terpeno, incluindo os vários classificados como monoterpenos, diterpenos, sequiterpenes, triterpenos e tetrater- penos, incluindo suas formas ácidas, aldeídicas e alcoólicas. Em uma modalidade particular, a composição compreende menos do que cerca de 10% (p/p), e mais pre- ferencialmente, menos do que cerca de 5% (p/p), de composto de terpeno selecionado do grupo que consiste em: β-Mirceno, α-mirceno, cis-α-ocimeno, dihidromirce- no, limoneno, α-pineno, β-pineno e combinações dos mesmos.

[0071]Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico é derivada de uma planta e a composição é substancialmente desprovida das formas monoméricas e oligoméricas de mirceno tendo um grau de polimerização inferior a cerca de 6. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimé- rico é derivada de uma planta e a composição é substancialmente desprovida de compostos de terpenos que são solúveis em pelo menos um solvente orgânico polar e insolúvel em pelo menos um solvente orgânico não polar.

[0072]Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico é o produto de uma síntese química e a composição é substancialmente desprovida das formas monoméricas e oligoméricas de mirceno tendo um grau de polimerização inferior a cerca de 6. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico é o produto de uma síntese química e a composição é substancialmente desprovida de compostos de terpenos que são solúveis em um solvente orgânico polar e insolúvel em pelo um solvente orgânico não polar.

[0073]De acordo com outro aspecto, a presente invenção revela uma composição farmacêutica compreendendo um mirceno polímerico sintético em que o mirceno polimérico tem uma massa molar média numérica na faixa de pelo menos cerca de 800 até cerca de 50.000, e no qual a fração isolada de mirceno polimérico tem um grau de pureza de pelo menos 80%.

[0074]Em uma modalidade particular, o veículo farmaceuticamente aceitável compreende um veículo hidrofóbico. Em uma modalidade particular, o veículo hidro- fóbico compreende pelo menos um óleo. Em uma modalidade particular, o óleo é selecionado do grupo que consiste de um óleo mineral, um óleo vegetal e combinações dos mesmos. Em uma modalidade particular, o óleo vegetal é selecionado do grupo que consiste de óleo de amêndoas, óleo de canola, óleo de coco, óleo de milho, óleo de algodão, óleo de semente de uva, óleo de amendoim, óleo de azeite, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de soja, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade particular, o óleo mineral é o óleo mineral leve. Em uma modalidade particular, o transportador hidrofóbico compreende pelo menos uma cera. Em uma modalidade particular, o veículo hidrofóbico compreende a combinação de pelo menos um óleo e pelo menos uma cera.

[0075]Em várias modalidades, uma composição de acordo com a invenção é uma forma apropriada para administração por uma via selecionada do grupo que consiste de oral, tópica, parenteral e transdérmica.

[0076]Em modalidades particulares, a composição está em uma forma apropriada para administração por injeção. Em modalidades diversas, a composição é uma formulação parenteral para administração por uma via selecionada do grupo que consiste de intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intraperitoneal, intra-arterial, intracerebral, intracerebroventricular, intra-óssea e intratecal. Em várias modalidades, a composição é uma formulação tópica para administração por uma via selecionada do grupo que consiste de dérmica, vaginal, retal, inalatória, intranasal, ocular, auricular e bucal.

[0077]Em modalidades particulares, a composição está em uma forma apropriada para administração cosmética ou dermatológica.

[0078]Em modalidades particulares, a composição farmacêutica está em uma forma selecionada do grupo que consiste de uma cápsula, um comprimido, um lipossoma, um supositório, uma suspensão, uma pomada, um creme, uma loção, uma solução, uma emulsão, um filme, um cimento, um pó, uma cola, um aerossol e um spray. Em uma modalidade particular, a cápsula é selecionada do grupo que consiste de uma cápsula gelatinosa dura e uma cápsula gelatinosa mole. Em uma modalidade particular, a emulsão é uma nanoemulsão ou uma microemulsão.

[0079]Em modalidades particulares, a formulação compreende pelo menos um de um complexo de inclusão, uma nanoemulsão, uma microemulsão, um pó, uma série de lipídios, uma micropartícula lipídica, um dendrímero e um lipossoma. Em uma modalidade particular, o complexo de inclusão compreende pelo menos uma ciclodextrina. Em uma modalidade particular, pelo menos uma ciclodextrina compreende de hidroxipropil-β-ciclodextrina. Em uma modalidade particular, a na- noemulsão compreende gotículas com o tamanho médio de partícula inferior a 800 nm. Em uma modalidade particular, a gotícula tem o tamanho médio de partícula inferior a 500 nm. Em uma modalidade particular, a gotícula tem o tamanho médio de partícula inferior a 200 nm. Em uma modalidade particular, o pó é um pó que passou pelo processo de spray drying. Em uma modalidade particular, o lipossoma compreende uma vesícula multilamelar. Em uma modalidade particular, a microe- mulsão compreende um tensoativo não-iônico. Em uma modalidade particular, o tensoativo não-iônico é selecionado do grupo que consiste de um óleo de rícino polioxil, um éster de ácido graxo polioxietileno sorbitano (polissorbatos), um poloxâmero, um derivado da vitamina E, um éter de polioxietileno alquil, um estearato de polioxietileno ou glicerida poliglicolisada saturada ou combinações dos mesmos.

[0080]Em uma modalidade particular, a composição está disposta no artigo de manufatura na forma de um revestimento. Em uma modalidade particular, o artigo de fabricação compreende um frasco, onde a composição é disposta dentro do frasco. Em uma modalidade particular, o artigo de fabricação é selecionado do grupo que consiste de um artigo de tecido, uma fralda, um curativo, um dispositivo médico, uma agulha ou pluralidade de agulhas, uma microagulha ou pluralidade de microagulhas, um dispositivo de injeção e um pulverizador. Em uma modalidade particular, o artigo de fabricação compreende uma pluralidade de microagulhas. Em modalidades particulares, o dispositivo médico é selecionado do grupo que consiste de uma prótese, um órgão artificial ou um componente dele, uma válvula, um catéter, um tubo, uma endoprótese, uma membrana artificial, um marca-passo, um sensor, um endoscópio, um dispositivo de imagem, uma bomba, um fio e um implante. Em uma modalidade particular, o implante é selecionado do grupo que consiste em um implante cardíaco, um implante coclear, um implante de córnea, um implante craniano, um implante dentário, um implante maxilo-facial, um implante de órgão, um implante ortopédico, um implante vascular, um implante intra-articular e um implante mamário.

[0081]Em uma modalidade particular, a composição é apropriada para administração por um recurso selecionado do grupo que consiste de eletroporação, soni- cação, rádio frequência, spray pressurizado e combinações dos mesmos.

[0082]Em uma modalidade particular, a composição é para o tratamento da função neurológica comprometida. Em uma modalidade particular, a função neurológica comprometida compreende uma diminuição em uma função selecionada do grupo que consiste de função cognitiva, função sensorial, função motora e combinações das mesmas. Em modalidades particulares, a função neurológica comprometida está associada a uma condição ou doença, incluindo, por exemplo, a função neurológica comprometida está associada a uma condição ou doença, incluindo, por exemplo, trauma, demência vascular, demência senil, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (ALS), esclerose múltipla, doença de Parkinson, derrame, esquizofrenia, transtorno bipolar, depressão, obesidade, anorexia, caquexia, infecção, e um distúrbio imunológico. Em uma modalidade particular, a função neurológica comprometida é devido à exposição a uma droga, como um anestésico.

[0083]Em uma modalidade particular, a composição é para o tratamento de uma doença de pele ou couro cabeludo selecionada do grupo que consiste de alopecia, eczema, psoríase, queratose seborréica e seborréia. Distúrbios de pele e couro cabeludo revelados incluem apêndices da pele, do couro cabeludo e do cabelo, incluindo, por exemplo, unhas e folículos pilosos. Em uma modalidade particular, a doença de pele é uma ferida na pele, incluindo, por exemplo, uma úlcera venosa de perna, uma úlcera de pressão, uma úlcera do pé diabético, uma queimadura, uma ferida da amputação, uma úlcera de decúbito (ferida de cama), um enxerto de pele de um doador, a pele do local do enxerto do doador, um local de implantação de um dispositivo médico, uma ferida por mordida, uma ferida produzida pelo frio, um ferimento por punção, ferida por estilhaços, uma dermoabrasão, uma contusão, uma infecção, uma ferida e uma ferida cirúrgica.

[0084]Em uma modalidade particular, a composição é para induzir ou promover a reparação do tecido. Como usado aqui, reparação de tecidos compreende a indução e promoção da regeneração de tecidos, incluindo o de tecidos neurais.

[0085]Em uma modalidade particular, a composição é para induzir ou promover a reparação do tecido após uma lesão ou insulto. Em uma modalidade particular, a lesão ou insulto é selecionado do grupo que consiste de um infarto do mio- cárdio, uma embolia pulmonar, um infarto cerebral, doença arterial oclusiva periférica, uma hérnia, um infarto esplênico, uma úlcera venosa, uma axotomia, um descolamento de retina, uma infecção e um procedimento cirúrgico.

[0086]Deve ser entendido explicitamente que o escopo da presente invenção abrange formas mais curtas e mais longas de mirceno polimérico, incluindo formas sintéticas e semi-sintéticas, incluindo os copolímeros de mirceno, e derivados substituídos com várias funcionalidades, e conjugados com moléculas adicionais, como são conhecidos na técnica, com a estipulação de que estas variantes e modificações preservam a capacidade terapêutica do mirceno poliméricos no contexto dos métodos da presente invenção.

[0087]Outros objetos, características e vantagens da presente invenção ficarão claros a partir das seguintes descrições e desenhos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0088]A Figura 1 mostra a cromatografia de exclusão por tamanho de um ex- trato de resina mastique usando detectores SEDEX e PDA.

[0089]A Figura 2 mostra as frações com baixo (Fig. 2A) e alto (Fig. 2B) peso molecular de um extrato de resina mastique obtida por cromatografia preparativa de exclusão por tamanho.

[0090]A Figura 3 mostra o espectro de 1H-RMN da fração pesada de MW obtido por SEC preparativa de um extrato de resina mastique.

[0091]A Figura 4 mostra o espectro de 13C-RMN da fração pesada de MW obtida por cromatografia preparativa de exclusão por tamanho do extrato de resina mastique.

[0092]A Figura 5 mostra cromatografia analítica de exclusão por tamanho do produto alto (Fig. 5A) e baixo (Fig. 5B) obtidos em um processo químico sintético para mirceno polimérico.

[0093]A Figura 6 mostra o espectro 1H-RMN do 1,4-poli-β-mirceno sintetizado.

[0094]A Figura 7 mostra o espectro 13C-RMN do 1,4-poli-β-mirceno sintetizado.

[0095]A Figura 8 mostra os efeitos da RPh-1 em células ARPE-19. Fig. 8A, culturas de controle tratados com o veículo óleo; Fig. 8B, culturas de teste 48 horas após administração de RPh-1 (0,1%; 1mg/ml) e incubação; Fig. 8C, culturas de teste 4872 horas após administração de RPh-1 (0,25%, 2,5 mg/ml) e incubação; Fig. 8D culturas de teste 72 horas após administração de RPh-1 (0,25%, 2,5 mg/ml) e incubação.

[0096]A Figura 9 mostra a análise da imunofluorescência das células ARPE- 19 antes (painéis à esquerda) e após (direita) 72 horas de incubação com RPh-1, indicando a expressão da tubulina, beta 3 (TUBB3), proteína associada a regulação da atividade do citoesqueletoto (Arc/Arg3.1) e pentraxina II neuronal (NPTX2) após o tratamento.

[0097]A Figura 10 mostra o efeito da RPh-1 na proliferação celular de ARPE- 19 monitorada por um ensaio para avaliar o conteúdo total de proteína.

[0098]A Figura 11 mostra células ARPE-19 de vários graus de diferenciação. Fig. 11A, grau de diferenciação 3; Fig. 11B, grau de diferenciação 4; Fig. 11C, grau de diferenciação 5.

[0099]A Figura 12 mostra o efeito da RPh-1 em células de melanoma humano. Fig. 12A, células controle tratadas com o veículo óleo; Fig. 12B, células tratadas com RPh-1 (5 μL) após 48 horas de incubação, Fig. 12C, as células tratadas com RPh-1 (2 μL) após 48 horas de incubação; Fig. 12D, células tratadas com RPh- 1 (5 μL) após 72 horas de incubação.

[00100]A Figura 13 mostra os efeitos dos polímeros de mirceno quimicamente sintetizados nas células RPh-1 Fig. 13A, diferenciação induzida com Fração 18,1; Fig. 13B, diferenciação induzida com Fração 18.2.A Figura 14 mostra a regeneração da pele em um cão envelhecido Golden Retriever macho com uma lesão cutânea associada à alopecia após o tratamento com RPh-1. Fig. 14A, antes do tratamento; Fig. 14B, após 2 semanas de tratamento.

[00101]Figura 15 mostra o efeito da RPh-1 na cicatrização de feridas em feridas em camundongos experimentais, como indicado pelo tamanho da ferida (mm2) em vários pontos do tempo após a imposição das feridas em camundongos tratados com RPh-1 por injeção SC (Grupo A, barras cinzentas), topicamente (Grupo B, barras pretas) e em camundongos tratados com o veículo sozinho (Grupo C, barras abertas).

[00102]A Figura 16 mostra o efeito da RPh-1 na recuperação de hipoperfu- são cerebral em um modelo de demência vascular de ratos, avaliada pelo teste do labirinto aquático de Morris.

[00103]O desempenho de animais tratados com RPh-1 (Grupo A; barras ha- churadas), animais tratados com veículo (Grupo B; bares com listras horizontais) e nos animais do grupo controle (barras pretas) foram testados para a frequência no local da plataforma (Fig. 16A), o tempo gasto na área da plataforma (Fig. 16B), a latência para encontrar a plataforma (Fig. 16C); a frequência na zona de localização 1 (Fig. 16D); o tempo gasto na parte com luz (Fig. 16E); a latência para encontrar a plataforma (Fig. 16F); e a velocidade (Fig. 16G).

[00104]A Figura 17 mostra o efeito da RPh-1 no ganho de peso.

[00105]A Figura 17A mostra o ganho de peso nos animais após hipoperfu- são cerebral em um modelo de demência vascular de ratos. O peso dos animais do Grupo B (tratados com RPh-1; símbolo triângulo) está se recuperando significativamente mais rápido do que os animais do Grupo A (tratados com veículo; símbolo quadrado).

[00106]A Figura 17B mostra o ganho de peso de camundongos obesos (ob/ob) após tratamento com RPh-1, quer por administração subcutânea (Grupo A; símbolo diamante) ou por administração tópica (Grupo B; símbolo quadrado), ou o tratamento com o veículo sozinho (Grupo C; símbolo triângulo). Camundongos dos Grupos B e C ganharam 10,2% e 9,1%, respectivamente. A taxa de ganho de peso em todos os grupos conforme expresso pelos declives foi semelhante (p= 0,07 (A vs. B), 0,08 (A vs. C) e 0,43 (B vs. C).

[00107]A Figura 18 mostra o efeito da RPh-1 na recuperação da oclusão transitória da artéria cerebral média (tMCAO) em um modelo de derrame de ratos.

[00108]A Fig. 18A mostra a pontuação neuro-muscular (Neuroscore) em vários pontos do tempo em dias (d) como indicado, seguindo MCAO em ratos tratados com RPh-1 (Grupo A) ou com veículo (Grupo B). Foram observadas diferenças significativas apenas no Grupo A, entre o dia 8 e dia 14, e entre o dia 8 e dia 28.

[00109]A Fig. 18B mostra os resultados do teste de pisar em vários pontos do tempo seguintes a MCAO em ratos tratados com o tratamento RPh-1 (Grupo A; barras pretas) ou com veículo (Grupo B; barras abertas). Foram encontradas dife- renças significativas entre os dois grupos apenas no dia 28.

[00110]A Fig. 18C mostra os resultados do teste de remoção do adesivo em vários pontos do tempo em dias (d) como indicado, seguindo a MCAO em ratos tratados com RPh-1 (Grupo A) ou com veículo (Grupo B). Foram observadas diferenças significativas apenas no Grupo A, entre o dia 2 e os outros dias.

[00111]A Figura 19 mostra o número médio de células ganglionares da retina (RGC) sobreviventes após axotomia do nervo óptico em ratos tratados com RPh- 1 e ratos tratados com o controle.

[00112]A Figura 20 mostra a análise de Western blot da expressão do SEMA3 (Fig. 20A) e caspase-3 (Fig. 20B) em retinas descoladas (RD) e retinas não feridas (controle) de animais tratados com RPh-1 ou veículo após o descolamento de retina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00113]O inventor da presente invenção surpreendentemente demonstrou que as frações isoladas de goma mastique têm atividade na melhora da função neurológica comprometida, cicatrização de feridas e de doenças de pele e couro cabeludo, e na promoção da reparação tecidual. Tais frações são conhecidas por conter mirceno polimérico. Além disso, também tem sido surpreendentemente demonstrado que as frações purificadas de mirceno polimérico exibem as mesmas atividades biológicas observadas com frações isoladas de goma mastique. As atividades biológicas do mirceno polimérico acima mencionadas têm sido demonstradas tanto quando ele é derivado de uma fonte vegetal quanto quando é quimicamente sintetizado. Além disso, a faixa de peso molecular do polímero, bem como o grau de pureza da preparação são fatores importantes que influenciam a atividade biológica do mirceno polimérico. Essas descobertas são altamente inesperadas em função da técnica anterior que ensina que a fração polimérica obtida a partir de mastique não tem benefício terapêutico, e de fato dificulta certas atividades biológicas atribuídas a prepara- ções de mastique brutas e extratos de mastique.

[00114]É revelado aqui pela primeira vez que, devido a suas diversas atividades para estimular e induzir a regeneração celular, a fração isolada de goma mas- tique como descrita aqui pode ser empregada como um ingrediente ativo em uma composição farmacêutica para um número de indicações terapêuticas.

[00115]De forma vantajosa, as composições da invenção podem ser usadas em métodos de tratamento da deficiência na função neurológica e condições da pele e do couro cabeludo. Em contato com as células de ambos os indivíduos humanos e os não-humanos, a composição induz a diferenciação das células em uma ampla variedade de tecidos, compartimentos celulares e linhagens celulares, incluindo pele, endotélio, membranas das mucosas, ossos, tendões e cartilagens. Além disso, a atividade de diferenciação celular da composição farmacêutica pode ser explorada para a promoção da incorporação in vivo de dispositivos médicos, implantes e transplantes de órgãos.

Definições

[00116]Como usado aqui, os termos "mastique", "resina mastique", "goma mastique" e "mastique goma", são usados de forma intercambiável para se referir a uma resina de árvore (também conhecida como uma oleoresina) obtida como um exsudato de qualquer árvore classificada na família Anacardiaceae. Árvores no gênero Pistacia, principalmente Pistacia lentiscus L., e em particular a variedade P. lentiscus L. cv. Chia (cultivada na ilha grega de Chios), são conhecidas por seu alto rendimento de mastique. Outras variedades incluem P. lentiscus L. var. emarginata Engl. e P. lentiscus L. var. latifolia Coss. Outras espécies de Pistacia incluem, por exemplo, P. atlantica, P. palestina, P. saportae, P. terebinthus, P. vera e P. integerrima.

[00117]Como usado aqui, o termo "polímero" se refere a um composto ou uma mistura de compostos, compreendendo subunidades de repetição (também co- nhecidos como monômeros) da mesma estrutura química, onde os monômeros estão em ligação covalente. Um exemplo de um monômero do qual um polímero pode ser formado é um terpeno, por exemplo, um monoterpeno como mirceno. Polímeros podem ter vários graus de polimerização e, portanto, abranger formas poliméricas com comprimento de cadeia diferentes. Polímeros incluem homopolímeros e hetero- polímeros (também conhecido como copolímeros), e podem ter diferentes configurações isoméricas e diastereoisoméricas.

[00118]Como usado aqui, os termos "mirceno polimérico" e "polimirceno" al-ternadamente referem-se a um polímero formado a partir de monômeros de mirceno. Mirceno polimérico abrange formas poliméricas possuindo vários graus de polimeri- zação e os polímeros de mirceno de preferência têm um grau de polimerização de pelo menos 6. A invenção inclui, entre outros, β-mirceno polimérico (poli-β-mirceno) α-mirceno polimérico (poli-α-mirceno) homopolímeros dos mesmos, heteropolímeros (também conhecido como copolímeros) compreendendo monômeros de mirceno em conexão covalente direta ou indireta com monômeros heterólogos, isômeros trans e cis dos mesmos, enantiômeros D e L dos mesmos, ou combinações dos mesmos. Mirceno polimérico pode ser obtido de forma isolada a partir de uma fonte vegetal, especialmente a partir de mastique, ou pode ser o produto de uma reação de síntese química.

[00119]Como usado aqui, o termo "uma fração isolada de goma mastique" refere-se a uma fração obtida pela extração de goma mastique em pelo menos um solvente orgânico polar ou não polar, ou combinações dos mesmos. A fração isolada da invenção é geralmente solúvel em um ou ambos os solventes orgânicos polar e não polar.

[00120]Como usado aqui, o termo "uma fração isolada de mirceno poliméri- co" refere-se a uma preparação de mirceno polimérico com um peso molecular definido ou uma faixa de peso molecular, que é separado de outros componentes quí- micos presentes na fonte de onde o mirceno polimérico foi isolado, em particular uma mistura de reação química ou um extrato da planta.

[00121]Como usado aqui, o termo "grau de pureza" refere-se ao conteúdo de um composto químico especificado na preparação, expressa em percentagem na base peso por peso do composto químico especificado em relação a outros compostos químicos na preparação.

[00122]Como usado aqui, "homopolímero" refere-se a um polímero que é produzido a partir de um único tipo de monômero. Por exemplo, mirceno polimérico é um homopolímero quando é produzido apenas a partir de monômeros de mirceno, por exemplo β-mirceno. Um homopolímero também pode ser uma mistura de polímeros produzidos a partir do mesmo monômero, mas tendo um grau variável de po- limerização, ou seja, comprimento de cadeia. Assim, mirceno polimérico pode abranger uma faixa de compostos de diferentes comprimentos de cadeia e, consequentemente, diferentes pesos moleculares. Além disso, um homopolímero pode conter monômeros com diferentes configurações isoméricas, por exemplo, β-mirceno e a-mirceno.

[00123]Como usado aqui, "heteropolímero" e "copolímero" referem-se a um polímero produzido a partir de mais de um tipo de monômero. Assim, por exemplo, um copolímero de mirceno é produzido a partir de monômeros de mirceno, além de um tipo heterólogo de monômero que não é mirceno. Copolímeros incluem copolí- meros alternados, copolímeros periódicos, copolímeros aleatórios, copolímeros em bloco e copolímeros estatísticos, como são conhecidos na técnica.

[00124]Como usado aqui, "grau de polimerização" se refere ao número de monômeros ou unidades monoméricas que são covalentemente associadas para formar um polímero, por exemplo, o número de monômeros de mirceno em um composto polimérico de mirceno.

[00125]Como usado aqui, "massa molar média por peso" refere-se ao peso molecular médio de um polímero tendo moléculas de diferentes comprimentos de cadeia, conforme expresso pela equação:

onde Ni é o número de moléculas com peso molecular Mi. A massa molar média por peso pode ser determinada, por exemplo, por espalhamento de luz, espalhamento de nêutrons a baixo ângulo, espalhamento de raios-X, e velocidade de se- dimentação.

[00126]Como usado aqui, "massa molar média numérica" refere-se à média do peso molecular de um polímero tendo moléculas de diferentes comprimentos de cadeia, conforme expresso pela equação:

onde Ni é o número de moléculas com peso molecular Mi. A massa molar média numérica pode ser determinada, por exemplo, por cromatografia de permea- ção em gel (também conhecida como cromatografia de exclusão por tamanho) ou viscosimetria.

[00127]Os termos "índice de polidispersividade" e "distribuição molecular" são aqui usados alternadamente para se referir à relação entre massa molar média por peso e massa molar média numérica.

[00128]Como usado aqui, "compostos de terpeno" refere-se a hidrocarbone- tos contendo isopreno e compostos contendo oxigênio relacionados tais como álcoois, aldeídos ou cetonas (terpenóides). A unidade de isopreno (CH2=C(CH3)- CH=CH2) é o bloco básico de construção de tais compostos. Hidrocarbonetos terpê- nicos em geral têm a fórmula molecular (C5H8)n, e incluem monoterpenos, sesqui- terpenos, diterpenos, triterpenos, e tetraterpenos que tem, respectivamente, 2, 3, 4, 6 e 8 unidades de isopreno. Terpenos podem ser classificados como acíclicos ou cíclicos.

[00129]Exemplos de monoterpenos incluem mirceno, limoneno e pineno, que são, respectivamente, exemplos de monoterpenos acíclicos, monocíclicos e bi- cíclicos. Exemplos de sesquiterpenos incluem nerolidol e farnesol. Exemplos de di- terpenos incluem cafestol e fitol. Exemplos de um triterpeno e um tetraterpeno são esqualeno e caroteno, respectivamente.

[00130]Como usado aqui, "substancialmente desprovido" significa que uma preparação ou composição farmacêutica de acordo com a invenção que geralmente contém menos do que 3% da substância declarada, preferível menos de 1% e mais preferencialmente menos de 0,5%.

[00131]Como usado aqui, "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a quantidade de um ingrediente farmacêutico que substancialmente induz, promove ou resulta em um efeito terapêutico desejado.

[00132]Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um diluente ou veículo que é utilizado para melhorar a entrega e/ou propriedades farmacocinéticas de um ingrediente farmacêutico com o qual é formulado, mas não tem efeito terapêutico por si próprio, nem induz ou causa qualquer efeito indesejável ou desagradável ou reação adversa no indivíduo.

[00133]Como usado aqui, "veículo hidrofóbico farmaceuticamente aceitável" refere-se a um diluente hidrofóbico não polar ou veículo em que o mirceno poliméri- co é dissolvido ou suspenso.

[00134]Como usado aqui, "diferenciação celular" se refere ao processo no qual uma célula menos especializada torna-se uma célula mais especializada. A diferenciação celular pode ser estabelecida com base em alterações em qualquer de uma série de características celulares, incluindo, entre outras, o tamanho, forma, aparência da organela, potencial de membrana, atividade metabólica, e capacidade de resposta aos sinais. Um "grau" em particular pode ser dado a um tipo de célula para descrever a extensão da diferenciação.

[00135]Como usado aqui, "função neurológica comprometida" refere-se a um declínio ou diminuição de pelo menos uma das funções sensorial, cognitiva ou motora, em comparação com um nível anterior de função ou atividade, e/ou em comparação aos indivíduos não comprometidos pareados de acordo com critérios aceitos.

[00136]Valores numéricos aqui descritos devem ser entendidos como o valor declarado +/- 10%. Frações isoladas de goma mastique e mirceno polimérico

[00137]A presente invenção emprega frações isoladas compreendendo mir- ceno polimérico. A fração pode ser de uma fonte vegetal, em particular goma masti- que, ou pode ser o produto de uma síntese química. Mirceno polimérico para uso na invenção é um composto de polímeros, ou uma mistura de polímeros de diferentes pesos moleculares, que são formados a partir de subunidades de mirceno. Fontes vegetais adequadas de mirceno polimérico incluem aquelas classificados na família Anacardiaceae ou em uma família diferente de plantas. Espécies de plantas úteis na obtenção de composições da invenção incluem, entre outras, aquelas dos gêneros Pistacia, Pinus, Picea, Juniperus, Alsies, Larix, Ocimum, Laurus e Lavendula. Espécies úteis de Pistacia incluem, entre outras, P. lentiscus, P. atlantica, P. palestina, P. saportae, P. terebinthus, P. vera e P. integerrima. O mirceno polimérico pode ser obtido a partir de qualquer parte da planta, incluindo, por exemplo, resina, folhas, ramos, frutos e sementes.

[00138]Uma fração isolada de mirceno polimérico pode ser mais convenientemente obtida a partir de goma mastique, embora outras partes das plantas e produtos possam ser utilizadas. Vários métodos para obtenção e caracterização de uma fração isolada compreendendo mirceno polimérico de goma mastique são exemplificados nos Exemplos 1 e 2 aqui. Preparações comerciais de mastique estão disponíveis, por exemplo, na Associação dos Plantadores de gomas mastiques Chios, ou na G. Baldwin & Co., do Reino Unido.

[00139]Alternativamente, mirceno polimérico pode ser produzido quimicamente como um equivalente sintético de um polímero de ocorrência natural, como cis-1,4-poli-β-mirceno, ou pode ser um polímero de mirceno que não se conhece a ocorrência na natureza, tais como α-mirceno polimérico. A invenção não se limita ao processo pelo qual o mirceno polimérico é produzido ou se é natural, sintético ou semi-sintético.

[00140]Prevê-se que o mirceno polimérico pode ser um produto sintético, produzido por um processo químico usando a forma monomérica do monoterpeno mirceno como substrato. O substrato monomérico mirceno pode ser isolado de uma planta, ou pode ser convertido quimicamente ou enzimaticamente a partir de um precursor terpeno, como é conhecido na técnica. Por exemplo, β-mirceno monoméri- co isolado de uma fonte vegetal pode ser posteriormente polimerizado para β- mirceno polimérico por um processo químico. Quando o substrato mirceno é derivado de uma fonte natural, o produto resultante pode ser referido como um produto semi-sintético. Processos químicos para polimerização do β-mirceno são revelados, por exemplo, nas patentes U.S. Nos 4564718; 5.759.569; 7.232.872 e 7.214.750, e em Newmark et al (1988) J. Polymer Sci. 26, 71-77 (1988) e em Cawse et al (1986) Journal of Applied Polymer Science, Vol. 31, 1963-1975.

[00141]Um processo químico sintético adequado emprega uma reação de polimerização aniônica, por exemplo a que compreende uso de pelo menos um solvente alcano ou cicloalcano e pelo menos uma alquila de metal alcalino. Por exemplo, a alquila de metal alcalino pode ser butil lítio, e o solvente alcano pode ser hexano, ou o solvente cicloalcano pode ser cicloexano. O solvente alcano e o iniciador alquila de metal alcalino podem estar presentes na mistura reacional em uma proporção de pelo menos 20:1. A reação de polimerização aniônica pode ser finalizada por um composto como a água, um álcool, oxigênio molecular e dióxido de carbono.

[00142]O processo sintético para 1,4-poli-β-mirceno aqui revelado (Exemplo 3) é particularmente adequado para manter as diversas atividades biológicas do polímero, tais como a promoção da diferenciação celular. β-mirceno monomérico é conhecido por ocorrer em uma variedade de plantas, incluindo árvores dos gêneros Pinus, Picea, Juniperus, Alsies e Larix, e flores nos gêneros Antirrhinum, Boswellia, Citrus e Gynura.

[00143]Uma fração isolada de mirceno polimérico pode ser obtida como o produto purificado de uma reação de síntese química, como exemplificado no Exemplo 3 daqui. O mirceno polimérico quimicamente sintetizado pode ser isolado do substrato que não reagiu e outros reagentes, analisado e ainda fracionado de acordo com o peso molecular utilizando métodos analíticos e de separação como são conhecidos na técnica. Tais métodos incluem aqueles que separam moléculas com base no tamanho, carga, ou hidrofobicidade, incluindo, por exemplo, cromato- grafia de exclusão por tamanho (SEC), cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), cromatografia líquida de gás (GLC) e combinações dos mesmos.

[00144]Métodos analíticos para a determinação da estrutura química precisa do polímero obtido incluem ressonância magnética nuclear (por exemplo, 1HNMR e 13CNMR),viscosimetria, vários métodos de espectrometria de massa (por exemplo, MALDI-TOF), os métodos combinados, como Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massa (LC-MS), técnicas de dispersão da luz como, por exemplo, Espalhamento de Luz de Multiângulo a Laser (MALLS), análise de carbono total, espectrofotome- tria UV-VIS, espectrofotometria IR e FT-IR e outros métodos como são conhecidos na técnica. Os mesmos métodos e abordagens podem ser usados para a purificação e caracterização de mirceno polimérico a partir de plantas, como mostrado aqui no Exemplo 2.

[00145]Em uma modalidade particularmente preferencial, a fração de mirce- no polimérico que é o produto de uma síntese química deve ser substancialmente desprovida de formas monoméricas e oligoméricas de mirceno tendo um grau de polimerização inferior a cerca de 5. Também é preferencial que o produto isolado seja substancialmente desprovido de compostos monoméricos de terpenos que são solúveis em um solvente orgânico polar.

[00146]Métodos semelhantes podem ser usados para a obtenção de frações isoladas de goma mastique e frações isoladas de mirceno polimérico, quando o mir- ceno polimérico é derivado de uma fonte vegetal, como a goma mastique. Por meio de uma descrição geral, o material vegetal coletado, por exemplo goma mastique, é combinado em um frasco adequado com um solvente apropriado, geralmente um solvente polar. Solventes polares adequados incluem, por exemplo, álcoois, éteres, ésteres, amidas, aldeídos, cetonas, nitrilas e combinações dos mesmos. Exemplos específicos de solventes orgânicos polares incluem metanol, etanol, propanol, isopropanol, 1-butanol, 2-butanol, sec-butanol, t-butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3- pentanol, neopentanol, 3-metil-1-butanol, 2-metil-1-butanol, 3-metil-2-butanol, 2- metil-2-butanol, etilenoglicol, etilenoglicol monometil éter, éter dietílico, metiletil éter, etilpropil éter, metilpropil éter, 1,2 dimetoxietano, tetrahidrofurano, dihidrofurano, furano, pirano, diidropirano, tetrahidropirano, acetato de metila, acetato de etila, acetato de propila, acetaldeído, metilformato, etilformato, propionato de etila, propionato de metila, diclorometano, clorofórmio, dimetilformamida, acetamida, dimetilacetami- da, N-metilpirrolidona, acetona, etilmetilcetona, dietilcetona, acetonitrila, propionitrila e combinações dos mesmos.

[00147]A goma mastique e o solvente são preferencialmente combinados de tal forma que o solvente fique em grande excesso, por exemplo, 10:1 ou 20:01. A mistura pode ser periódica ou continuamente agitada durante um período que varia de alguns minutos a um número de horas. O solvente pode ser decantado sem qualquer tratamento ou, opcionalmente, a mistura pode ser primeiramente submetida à centrifugação com baixa velocidade, por exemplo, de 100 a 2000 rpm, como é conhecido na técnica. O material insolúvel é recuperado a partir do extrato e uma nova porção de solvente é adicionada ao material insolúvel, de tal forma que a extração e o processo de dissolução sejam repetidos por um número de ciclos, a fim de obter o máximo possível dos compostos solúveis em solvente polar. Após a etapa de dissolução final, os extratos contendo material solúvel em solvente polar são combinados e o solvente polar é evaporado (por exemplo, usando uma evaporação rotatória como é conhecido na técnica), de modo a produzir material solúvel em solvente polar, que pode ser chamado como bruto, ou extrato da "primeira etapa".

[00148]O material extraído da primeira etapa é combinado com um solvente orgânico não polar e extraído por agitação durante o período de uma hora. Solventes não polares adequados incluem hidrocarbonetos alifáticos saturados ou insatu- rados, cíclicos ou acíclicos e hidrocarbonetos aromáticos, por exemplo, alcanos C5C10, cicloalcanos C5-C10, hidrocarbonetos aromáticos C6-C14, e combinações dos mesmos. Cada um dos precedentes pode ser opcionalmente substituído por um ou mais halogênios, por exemplo, perfluoroalcanos C7-C14. Exemplos específicos de solventes orgânicos não polares são pentanos, hexanos, heptanos, octanos, nona- nos, decanos, ciclopentano, cicloexano, cicloheptano, benzeno, tolueno, xileno, e isômeros e a mistura dos mesmos. O material que permanece insolúvel ou precipita na presença do solvente não polar é retirado e descartado. A fração solúvel em solvente não polar é então obtida por evaporação do solvente não-polar (por exemplo, por evaporação rotativa). Esta fração pode ser referida como purificada ou extrato da "duas etapas", correspondendo a uma fração isolada de goma mastique que é ca-racterizada pelo fato de ser solúvel tanto em um solvente polar quanto em um solvente não polar, enquanto os materiais que são solúveis no solvente polar mas insolúveis no solvente não polar, foram removidos. Esta característica distingue as frações isoladas da invenção dos extratos de goma mastique de técnicas anteriores, as quais geralmente incluem uma grande variedade de compostos que são solúveis apenas em solventes polares. De acordo com os ensinamentos da presente invenção, tais compostos interferem com as atividades biológicas benéficas das frações isoladas reveladas aqui.

[00149]O extrato de duas etapas pode ainda ser seco, por exemplo, pelo tratamento com alto vácuo (por exemplo, <0,01 mbar por até vários dias) para remover solvente residual e outros materiais voláteis, pesado e combinado com um solvente orgânico não polar adequado ou outro veículo para realizar sua dissolução. Conforme revelado aqui nos Exemplos 1 e 2, tais frações isoladas contêm mirceno polimé- rico. As frações obtidas contendo mirceno polimérico podem ser utilizadas diretamente, ou ainda purificadas, caracterizadas e/ou fracionadas usando recursos conhecidos na técnica, como acima enumerados.

[00150]Em modalidades particulares, as frações isoladas da invenção podem ser obtidas por um processo compreendendo as etapas de: (a) tratar a goma mastique com um solvente orgânico polar; (b) isolar a fração solúvel no dito solvente orgânico polar; (c) opcionalmente remover o dito solvente orgânico polar; (d) tratar a fração solúvel obtida na etapa (b) ou (c) com um solvente orgânico não polar, (e) isolar uma fração solúvel nos ditos solventes orgânicos não polares; e (f) opcionalmente remover o dito solvente orgânico não polar; onde as etapas (d) a (f) devem preceder as etapas (a) a (c).

[00151]O processo pode ainda compreender o fracionamento do tamanho da fração solúvel obtida seguindo a etapa (c) ou etapa (f), por exemplo, por cromatogra- fia de exclusão por tamanho, ou qualquer outro método conhecido na técnica.

[00152]O processo pode ainda compreender a remoção do solvente, após uma ou ambas as etapas (c) e (f). A remoção do solvente pode ser efetuada por qualquer recurso conhecido na técnica, por exemplo evaporação rotatória, aplicação de alto vácuo e uma combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, as etapas (a) a (c) são realizadas antes das etapas (d) a (f) ou vice-versa. Em uma modalidade particular, o solvente orgânico polar compreende etanol e o solvente orgânico não polar compreende hexano. Como é facilmente compreendida por um especialista na técnica, as etapas (a) a (c) e as etapas (d) a (f) podem ser independentemente realizadas para um número de ciclos a fim de otimizar o processo de extração e o grau de purificação do produto.

[00153]Para a preparação de uma composição para uso terapêutico, veículos apropriados podem ser usados, tais como veículos hidrofóbicos incluindo óleos farmaceuticamente aceitáveis, opcionalmente em combinação com ceras, como aqui descrito.

[00154]Em modalidades particularmente preferenciais, as composições compreendendo as frações isoladas de goma mastique, como aqui descritas, deve incluir menos do que de cerca de 20% (p/p) de compostos de terpeno monoméricos e oligoméricos, que são solúveis no solvente orgânico polar e substancialmente insolúveis no solvente orgânico não polar, onde os solventes acima mencionados referem-se aos utilizados na preparação da fração. Mais preferencialmente, as frações isoladas correspondem menos do que de cerca de 5% (p/p) de tais compostos de terpeno. Ainda mais preferencialmente, as frações isoladas são substancialmente desprovidas de tais compostos de terpeno. Os efeitos inibitórios de frações compreendendo tais compostos de baixo peso molecular sobre a atividade biológica do mir- ceno polimérico são exemplificados aqui no Exemplo 8.

[00155]Em outra modalidade particular, a fração isolada compreendendo mirceno polimérico é derivada de uma planta e é substancialmente desprovida das formas de mirceno monomérico e mirceno oligomérico tendo um grau de polimeriza- ção inferior a 6. Em outra modalidade particular, a fração isolada compreendendo mirceno polimérico é derivada de uma planta e é substancialmente desprovida de compostos de terpenos que são solúveis em um solvente orgânico polar e substancialmente insolúvel em um solvente orgânico não polar.

[00156]Deve-se entender que o mirceno polimérico pode não ter um peso molecular único, mas sim, uma distribuição de pesos moleculares, representando uma população de moléculas poliméricas de mirceno de diferentes comprimentos de cadeia, ou seja, graus de polimerização.

[00157]Não há limite superior específico para o peso molecular ou grau de polimerização do mirceno polimérico. Em uma modalidade atualmente preferencial da invenção, o grau de polimerização é de pelo menos cerca de 6. Em uma modalidade particular, o grau de polimerização é de pelo menos cerca de 10. Em uma modalidade particular, o grau de polimerização é de pelo menos cerca de 25. Em uma modalidade particular, o grau de polimerização é de pelo menos cerca de 35. Em uma modalidade particular, o mirceno polimérico tem um grau de polimerização na faixa de pelo menos cerca de 6 a cerca de 1800. Exemplos de faixas apropriadas de variação incluem cerca de 30 a cerca de 500, ou cerca de 35 a cerca de 150. A massa molar média numérica do mirceno polimérico é de preferência, pelo menos, cerca de 800. Mais preferencialmente, a massa molar média numérica é de pelo menos cerca de 1.000, como de pelo menos 2000, ou pelo menos 3000, e ainda mais preferencialmente, a massa molar média numérica é de pelo menos cerca de 5000. Em uma modalidade particular, o mirceno polimérico tem uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 5000 para cerca de 20.000. Em uma modalidade particular, o mirceno polimérico tem uma massa molar média numérica na faixa de pelo menos cerca de 800 para cerca de 100.000. Em modalidades particulares, uma massa molar média numérica está em um intervalo selecionado do grupo que consiste em: pelo menos cerca de 800 a cerca de 5000, pelo menos cerca de 800 para cerca de 15.000, cerca de 5000 para cerca de 15.000, cerca de 5000 para cerca de 20.000, cerca de 15.000 a cerca de 30.000, cerca de 25.000 para cerca de 40.000, cerca de 35.000 a cerca de 50.000, cerca de 45.000 para cerca de 60.000, cerca de 55.000 para cerca de 70.000, cerca de 65.000 para cerca de 80.000, cerca de 75.000 para cerca de 90.000, cerca de 85.000 para cerca de 100.000; e combinações dos mesmos. Em uma modalidade particular, a massa molar média numérica é de pelo menos cerca de 5000. É preciso entender que a composição pode incluir frações de diferentes pesos moleculares de mirceno polimérico, por exemplo, na faixa de pelo menos cerca de 5000 para cerca de 20.000, bem como na faixa de cerca de 25.000 para cerca de 40.000. Em uma modalidade particular, o mirceno poliméri- co tem uma distribuição molecular inferior a 5.

[00158]Em uma modalidade particular, a fração isolada consiste essencialmente de mirceno polimérico que tem uma massa molar média numérica na faixa de 5.000 a cerca de 20.000.

[00159]O peso molecular do produto polimérico pode ser expresso em diversas maneiras, por exemplo, massa molar média por peso ou massa molar média numérica, como é conhecido na técnica. O peso molecular pode ser determinado por qualquer um de uma série de meios, como espalhamento de luz, espalhamento de luz de multiângulo a Laser (MALLS), espalhamento de nêutrons a baixo ângulo, espalhamento de raios-X, velocidade de sedimentação, viscosimetria (equação Mark-Houwink), espectrometria de massa (por exemplo, MALDI-TOF) e cromatografia de permeação em gel.

[00160]Os mircenos poliméricos podem existir como diferentes isômeros ge-ométricos resultantes do arranjo dos substituintes em torno das ligações duplas carbono-carbono. Tais isômeros são designados como de configuração cis ou trans (também referidos, respectivamente, como as configurações Z ou E), onde cis (ou Z) representa substituintes no mesmo lado da ligação dupla carbono-carbono, e trans (ou E) representa substituintes em lados opostos da ligação dupla carbono-carbono. Os vários isômeros geométricos e suas misturas estão incluídos dentro do escopo da invenção.

[00161]O produto de mirceno polimérico pode conter um ou mais átomos de carbono assimétrico e pode, portanto, apresentar isomeria óptica e/ou diastereoiso- meria. Todos os estereoisômeros e diastereoisômeros estão incluídos dentro do escopo da invenção, tanto como um isômero único ou como uma mistura de formas estereoquimicamente isoméricas. Os vários estereoisômeros e diastereoisômeros podem ser separados utilizando técnicas convencionais, por exemplo, cromatografia ou cristalização fracionada. Isômeros ópticos alternativamente desejados podem ser fabricados pela reação das matérias-primas opticamente ativas apropriadas em condições que não irão causar racemização ou epimerisação, ou por derivação, por exemplo, com um ácido homoquiral seguido de separação dos derivados diastereo- méricos por recursos convencionais.

[00162]Formas adequadas de mirceno polimérico incluem β-mirceno polimé- ricos (poli-β-mirceno), incluindo 1,4-poli-β-mirceno, 3,4-poli-β-mirceno, 1,2-poli-β- mirceno, cis -1,4-poli-β-mirceno, trans-1,4-poli-β-mirceno, α-mirceno polimérico (poli- α-mirceno) ou combinações dos mesmos. O isolamento e caracterização de 1,4-poli- β-mirceno a partir de mastique é revelada, por exemplo, em Van der Berg et al (1998) Tetrahedron Lett 3:2645-2648.

[00163]Em modalidades particulares, o mirceno polimérico tem uma conformação linear, uma conformação ramificada ou uma conformação cíclica.

[00164]A fração isolada de mirceno polimérico de acordo com a invenção tem um grau de pureza de pelo menos 90%, como no mínimo de 93%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Como é entendido na técnica, o maior grau de pureza possível é desejável entre outros para assegurar a conformidade com os requisitos das agências regulatórias de saúde. Deve ser entendido, no entanto, que a fração de mirceno polimérico pode conter espécies poliméricas de mirceno tendo vários pesos moleculares, como dentro de um intervalo definido estreito ou largo, sem reduzir o grau de pureza especificado. Além disso, a fração isolada de mirceno polimérico pode conter diferentes isômeros estruturais, como descrito acima, de mircenos poliméricos sem reduzir o grau de pureza especificado. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende de pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende uma mistura de cis-1,4-poli-β-mirceno e trans-1,4-poli-β-mirceno, onde a mistura compreende pelo menos 80% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4- poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica de pelo menos 800. A massa molar média numérica pode ser de pelo menos 1.000. O peso médio molecular pode ser de pelo menos 2000. A massa molar média numérica pode ser de pelo menos 3000. A massa molar média numérica pode ser de pelo menos 5000. A massa molar média numérica pode ser de pelo menos 10.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 800 para cerca de 5000. Em uma determinada modalidade, a fração isolada de mir- ceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 1.000 para cerca de 10.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 10.000 para cerca de 20.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 5000 para cerca de 20.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mir- ceno polimérico consiste essencialmente de cis-1,4-poli-β-mirceno, que tem uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 5000 para cerca de 20.000.

[00165]Em modalidades particulares, a fração isolada de mirceno polimérico tem um grau de pureza de pelo menos cerca de 90%, e o mirceno polimérico tem um grau de polimerização de pelo menos 10.

[00166]Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno poliméri- co compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de pelo menos 20.000 a cerca de 30.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β-mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 30.000 a cerca de 50.000. Em uma modalidade particular, a fração isolada de mirceno polimérico compreende pelo menos 90% (p/p) de cis-1,4-poli-β- mirceno tendo uma massa molar média numérica na faixa de cerca de 50.000 para cerca de 80.000.

[00167]Em modalidades particularmente preferenciais, a fração isolada de mirceno polimérico é substancialmente purificada de compostos de terpeno que são solúveis em um solvente orgânico polar mas substancialmente insolúvel em um solvente orgânico não polar. Em particular, a composição deve compreender menos do que cerca de 10% (p/p), e mais preferencialmente, menos do que cerca de 5% (p/p), e mais preferencialmente ainda menos do que cerca de 3% (p/p), de compostos de terpeno que são solúveis em um solvente orgânico polar, mas substancialmente insolúvel em um solvente orgânico não polar. Em modalidades particulares, a composição é substancialmente desprovida de compostos de terpenos que são solúveis em solvente orgânico polar mas insolúveis em solvente orgânico não polar. Em mo-dalidades particulares, a composição compreende menos do que cerca de 10% (p/p), e mais preferencialmente, menos do que cerca de 5% (p/p), e mais preferencialmente ainda, menos do que cerca de 3% (p/p) de compostos monoméricos de ter- peno. Em uma modalidade particular, a composição é substancialmente desprovida das formas monoméricas e oligoméricas de mirceno tendo um grau de polimerização inferior a cerca de 5. Em uma modalidade particular, a composição compreende menos do que cerca de 10% (p/p), e mais preferencialmente, menos do que cerca de 5% (p/p), e mais preferencialmente ainda, menos do que cerca de 3% (p/p), de um composto de terpeno selecionado do grupo que consiste em: β-Mirceno, α-mirceno, cis-α-ocimeno, dihidromirceno, limoneno, α-pineno, β-pineno e combinações dos mesmos. Composições farmacêuticas

[00168]A composição para uso na invenção compreende uma quantidade te- rapeuticamente eficaz de uma fração isolada de mirceno polimérico, e um veículo hidrofóbico farmaceuticamente aceitável.

[00169]Um veículo hidrofóbico adequado compreende de pelo menos um óleo, como por exemplo um óleo mineral, um óleo vegetal ou combinações dos mesmos.

[00170]O termo "óleo mineral" refere-se a um líquido incolor, quase inodoro e insípido, provenientes da destilação de petróleo Também pode ser referido como óleo branco, óleo mineral branco, petrolato líquido, parafina líquida ou óleo de parafina branca. De acordo com uma modalidade particular da invenção, o óleo mineral é o óleo mineral leve, um produto comercialmente disponível que pode ser obtido tanto como um produto com grau NF (Formulário Nacional) ou como um produto de grau USP (Farmacopéia dos EUA). Para uso na invenção, o óleo mineral é de preferência livre de compostos aromáticos e insaturados.

[00171]Óleos vegetais adequados incluem, mas não estão limitados a óleo de amêndoas, óleo de canola, óleo de coco, óleo de milho, óleo de algodão, óleo de semente de uva, óleo de azeite, óleo de amendoim, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de soja, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade particular, o óleo mineral é o óleo mineral leve.

[00172]O veículo farmaceuticamente aceitável pode alternadamente ou em adição compreender uma substituição apropriada do óleo. Substituições do óleo in-cluem alcanos tendo pelo menos 10 carbonos (por exemplo, isohexadecano), ben- zoato de ésteres, ésteres alifáticos, ésteres não comedogênicos, compostos de sili-cone volátil (por exemplo, ciclometicona), e substitutos de silicone volátil. Exemplos de ésteres benzoato incluem C12C15 benzoato de alquila, benzoato isoestearílico, 2-etil hexil benzoato, benzoato de dipropileno glicol, benzoato de octildodecila, ben- zoato de estearila, e benzoato de beenila. Exemplos de ésteres alifáticos incluem C12C15 octonoato de alquila e maleato de dioctil. Exemplos de ésteres não come- dogênicos incluem isononanoato de isononila, isononanoato de isodecila, dilinoleato dímero de diisoestearila, propionato de araquidila e isononanoato de isotridecilo. Exemplos de substitutos de silicone volátil incluem decanoato de isohexila, isonona- noato de octila, octanoato de isononilo e dioctanoato dietileno glicol.

[00173]Ciclometicona é um silicone evaporativo que pode ser incluído no veículo para ajudar a fazer a composição passível de ejeção de um pulverizador. Além disso, devido à sua propriedade de evaporação, ciclometicona pode ajudar na retenção e fixação da formulação sobre a superfície a qual é pulverizada, por exemplo, um sítio de ferida.

[00174]O veículo hidrofóbico pode ainda incluir pelo menos uma cera. Ceras incluem, por exemplo, cera de abelha; ceras vegetais, ceras de cana-de-açúcar, ceras minerais e ceras sintéticas. Ceras vegetais incluem, por exemplo, carnaúba, candelila, ouricuri e cera de jojoba. Ceras minerais incluem, por exemplo, cera de parafina, cera de lignita, ceras microcristalinas e ozoquerita. Ceras sintéticas incluem, por exemplo, ceras de polietileno.

[00175]A composição farmacêutica pode ser formulada em qualquer uma de uma série de formas, como por exemplo, uma cápsula (incluindo uma cápsula gelatinosa mole), um comprimido, um gel, um lipossoma, um supositório, uma suspensão, uma pomada, uma solução, uma emulsão ou microemulsão, um filme, um ci- mento, um pó, uma cola, um aerossol, um spray e um gel.

[00176]Para a preparação da composição farmacêutica, o mirceno poliméri- co pode ser adequadamente formulado como complexos de inclusão, nanoemul- sões, microemulsões, pós e lipossomas. Em uma modalidade particular, o complexo de inclusão compreende pelo menos uma ciclodextrina. Em uma modalidade particular, ciclodextrinas compreendem hidroxipropil-β-ciclodextrina. Em uma modalidade particular, nanoemulsão compreende gotículas com o tamanho médio de partícula inferior a 800 nm. Em uma modalidade particular, a gotícula tem o tamanho médio de partícula inferior a 500 nm. Em uma modalidade particular, a gotícula tem o tamanho médio de partícula inferior a 200 nm. Em uma modalidade particular, o pó é um pó que passou pelo processo de spray drying. Em uma modalidade particular, o lipossoma compreende vesículas multilamelares. Em uma modalidade particular, a microemulsão compreende um tensoativo não-iônico. Tensoativos não-iônicos incluem, entre outros, óleo de rícino polioxil, um éster de ácido graxo polioxietile- no sorbitano (polissorbatos), um poloxâmero, um derivado da vitamina E, um éter de polioxietileno alquil, um estearato de polioxietileno ou glicerida poliglicolisada saturada ou combinações dos mesmos.

[00177]Várias formulações de mircenos poliméricos e preparações dos mesmos são reveladas aqui nos Exemplos 17-21. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por qualquer recurso que atingir sua finalidade. Por exemplo, a administração pode ser por via oral, parenteral, tópica ou transdér- mica. Administração parenteral inclui as vias de administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intraperitoneal, intra-arterial, intrauterina, intrau- retral, intracardíaca, intracerebral, intracerebroventricular, intra-renal, intra-hepática, intra-tendão, intra-óssea e intratecal. Administração tópica inclui a aplicação através de uma via selecionada entre a derme, vaginal, inalação, retal, inalatória, intranasal, ocular, auricular e bucal. A administração pode também compreender uma técnica ou recurso como eletroporação, sonicação para ajudar na sua entrega, por exemplo, transdérmica. Outras técnicas que podem ser empregados incluem, por exemplo, rádiofrequência ou aplicação por pulverização pressurizada.

[00178]A dosagem administrada será dependente da idade, saúde e peso do indivíduo, o uso de tratamento concomitante, se algum, a frequência de tratamento e da natureza do efeito desejado. A quantidade de mirceno polimérico da presente invenção em qualquer unidade de forma compreende uma quantidade terapeutica- mente eficaz que pode variar dependendo do indivíduo destinatário, via e frequência de administração.

[00179]Em geral, a quantidade de mirceno polimérico ou fração isolada de goma mastique na composição farmacêutica pode ser convenientemente na faixa de cerca de 0,01% para cerca de 25%, como 0,01% a cerca de 12%, na base peso por peso, com base no peso total da composição. Para uso tópico, o percentual de mir- ceno polimérico ou fração isolada de goma mastique na composição pode estar na faixa de cerca de 0,05% a cerca de 2,5%. Para administração por injeção, o percentual de mirceno polimérico ou fração isolada de goma mastique na composição pode estar convenientemente na faixa de cerca de 0,1% a cerca de 7%. Para administração oral, o percentual de mirceno polimérico ou fração isolada de goma mastique na composição pode estar na faixa de cerca de 0,005% a cerca de 7%.

[00180]As composições farmacêuticas da invenção podem ser fabricadas da forma que ele próprio é conhecido por um especialista na técnica, por exemplo, por meio dos processos de mistura convencional, granulação, formação de drágea, encapsulamento em cápsulas gelatinosas moles, dissolvendo, extraindo, ou por liofili- zação. Em modalidades preferenciais, as formulações são não aquosas e/ou não compreendem solventes polares que entram em contato direto com o ingrediente ativo mirceno polimérico, de modo a evitar a perda de atividade biológica do ingrediente ativo. Assim, composições farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas pela combinação de compostos ativos com excipientes sólidos e semi-sólidos e conservantes adequados e/ou antioxidantes. Opcionalmente, a mistura resultante pode ser moída e processada. A mistura resultante de grânulos pode ser usada, após a adição de auxiliares adequados, se necessário, para obter comprimidos, cápsulas gelatinosas moles, cápsulas, ou núcleos de drágea.

[00181]Excipientes adequados são, em particular, diluentes tais como saca- rídeos, por exemplo, lactose ou sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose e/ou fosfatos de cálcio, por exemplo, fosfato tricálcico ou hidrogenofosfato de cálcio; bem como aglutinantes, usando, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, tragacanto, metilcelulose, hidroxipro- pilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e/ou polivinil pirrolidona. Se desejado, agentes desintegrantes podem ser acrescentados, como os amidos acima mencionados e também amido carboximetil, polivinil pirrolidona com ligação cruzada, ágar, ácido algínico ou um sal do mesmo, como o alginato de sódio. Auxiliares são agentes reguladores de fluxo e lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico ou seus sais, como o estearato de magnésio ou estearato de cálcio, e/ou polieti- leno glicol. Núcleos de drágea são fornecidos com revestimentos adequados que, se desejado, são resistentes ao suco gástrico. Para este propósito, soluções de sacarí- deo concentradas podem ser usadas, que pode opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de verniz e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. A fim de produzir revestimentos resistentes ao suco gástrico, preparações de soluções de celulose adequadas, como ftalato de acetilcelulose ou ftalatos de hidroxipropilmetil celulose, são usadas. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drágea, por exemplo, para a identificação ou a fim de caracterizar as combinações de doses do composto ativo.

[00182]Outras composições farmacêuticas para uso oral incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, bem como moles, cápsulas seladas feita de gelatina e um plastificante, tais como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os compostos ativos na forma de grânulos, que pode ser misturado com diluentes, como a lactose; aglutinantes, tais como amidos; e/ou lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos ativos são preferencialmente dissolvidos ou suspensos em líquidos apropriados, tais como óleos graxos, ou parafina líquida. Além disso, os estabilizantes podem ser adicionados.

[00183]Outras composições farmacêuticas para uso oral incluem um filme projetado para aderir à mucosa oral, conforme revelado, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 4,713,243; 5,948,430; 6,177,096; 6,284,264; 6,592,887, e 6,709,671.

[00184]Composições farmacêuticas na forma de supositórios consistem em uma combinação do(s) composto(s) ativo(s) com uma base de supositório. Bases de supositório adequadas incluem, por exemplo, triglicerídeos naturais ou sintéticos, polietileno glicóis, ou hidrocarbonetos de parafina.

[00185]Formulações para administração parenteral incluem suspensões e dispersões de micropartículas dos compostos ativos como apropriado. Em uma modalidade particular, suspensões injetáveis oleosas podem ser administradas. Solventes lipofílicos adequados ou veículos incluem óleos graxos, por exemplo, óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, por exemplo, oleato de etila, trigli- cérides, polietileno glicol 400, cremofor, ou ciclodextrinas. Suspensões injetáveis podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextran. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizadores.

[00186]Composições farmacêuticas também podem ser preparadas usando lipossomas compreendendo o ingrediente ativo. Como é conhecida na técnica, os lipossomas são geralmente derivados de fosfolipídios ou outras substâncias lipídi- cas. Lipossomas são formados por cristais líquidos hidratados mono ou multi- lamelares, que estão dispersos em meio aquoso. Qualquer lipídio não-tóxico, fisiolo- gicamente aceitável e metabolizável capaz de formar lipossomas pode ser usado. Em geral, os lipídios preferenciais são fosfolipídios e as fosfatidilcolinas (lecitinas), ambos as naturais e as sintéticas. Métodos para formar lipossomas são conhecidos na técnica, conforme revelado, por exemplo, em Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976) e na Patente U.S. No. 7.048.943.

[00187]Formulações para administração tópica incluem pomadas. Veículos adequados incluem óleos vegetais ou minerais, petrolato branco, gorduras ou óleos de cadeia ramificada, gorduras animais e ceras. Os veículos preferidos são aqueles em que o ingrediente ativo é solúvel. Estabilizantes, umectantes e antioxidantes também podem ser incluídos, bem como agentes que transmitem cor ou fragrância, se desejado. Pomadas podem ser formuladas, por exemplo, através da mistura de uma solução do ingrediente ativo em um óleo vegetal, como óleo de amêndoa com parafina macia aquecida, e permitindo que a mistura esfrie.

[00188]A composição farmacêutica pode incluir uma emulsão de óleo em água ou microemulsão a fim de facilitar a sua formulação para uso oral, parenteral ou tópico. Estas emulsões/microemulsões geralmente incluem lipídios, tensoativos, opcionalmente, umectantes e água. Lipídios adequados incluem aqueles geralmente conhecidos por serem úteis para a criação de emulsões óleo em águas/microemulsões, por exemplo, ésteres de glicerídeo de ácido graxo. Tensoati- vos adequados incluem aqueles geralmente conhecidos por serem úteis para a criação de emulsões/microemulsões de óleo em água onde lipídios são utilizados como o componente oleoso da emulsão. Tensoativos não iónicos podem ser preferidos, como por exemplo, óleo de rícino etoxilado, fosfolipídios, e copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de propileno. Umectantes adequados, se utilizados, incluem, por exemplo, propileno glicol ou polietileno glicol.

[00189]A composição farmacêutica pode ser formulada na forma de um gel, como um hidrogel formado a partir de um polímero de formação de gel, tal como car- ragena, goma xantana, goma caraia, goma acácia, goma de alfarroba, goma guar. Um hidrogel pode ser combinado com uma emulsão de óleo em água compreendendo o ingrediente ativo.

[00190]A composição farmacêutica pode ser formulada na forma de um cimento como aqueles compreendendo depolimetilmetacrilato (PMMA) ou fosfato de cálcio, que são utilizados em cirurgia ortopédica.

[00191]A composição farmacêutica pode ser formulada na forma de pó, em particular tais como aqueles usados para aplicações transdérmicas que utilizam ra-diofrequência, como descrito, por exemplo, nas patentes U.S. Nos. U.S. 6,074,688 e 6,319,541 e WO 2006/003659.

[00192]A composição farmacêutica pode ser formulada na forma de uma cola, como aquelas compreendendo octocianoacrilato utilizado em aplicações para fechamento de feridas.

[00193]Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica é subs-tancialmente desprovida de compostos de terpeno monomérico e de baixo peso molecular, incluindo, por exemplo, aqueles classificados como monoterpenos, diterpe- nos, sesquiterpenos, triterpenos, tetraterpenos. Exemplos de compostos de terpeno incluem β-mirceno, α-mirceno, cis-α-ocimeno dihidromirceno, limoneno, α-pineno, β- pineno, tirucalol, betulonal, ácido masticadienonico, ácido masticadienoico, ácido isomasticadienonico, ácido isomasticadienoico, ácido oleanólico, e ácido oleanônico. Usos terapêuticos

[00194]A presente invenção fornece usos terapêuticos e métodos de tratamento de deficiência na função neurológica, tratamento de doenças de pele e couro cabeludo, indução da reparação dos tecidos e feridas em indivíduos que necessitam da mesma. Os métodos compreendem a administração no indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende uma fração isolada de goma mastique, ou uma fração isolada de mirceno polimérico, como aqui descrita.

[00195]A etapa de administrar as composições pode incluir qualquer via aceitável incluindo oral, tópica, parenteral e transdérmica. Administração parenteral inclui as vias de administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intraperitoneal, intra-arterial, intra-uterina, intrauretral, intracardíaca, intracerebral, intracerebroventricular, intra-renal, intra-hepática, intra-tendão, intra-óssea e intrate- cal. A administração tópica inclui a aplicação através de uma via selecionada entre derme, vaginal, inalação, retal, intranasal, ocular, auricular e bucal.

[00196]Em modalidades particulares, a etapa de administração compreende de colocar as células de um tipo particular, de uma linhagem particular ou em um determinado estágio de diferenciação em contato com a composição. As células podem ser qualquer uma de uma grande variedade de tipos de células, incluindo, em particular, células neurais, células neuronais, células endoteliais, células epiteliais e células-tronco de ditas linhagens. Além disso, as células podem ser de qualquer linhagem, por exemplo, linhagens ectodérmica, mesodérmica, endodérmica e células-tronco de ditas linhagens. Em diversas modalidades, a etapa de colocar as células em contato é realizada in vivo, ex vivo ou in vitro.

[00197]O método revelado aqui para o tratamento da deficiência na função neurológica é particularmente vantajoso para os indivíduos afligidos com condições neurodegenerativas e doenças, incluindo, em particular, trauma, demência vascular, demência senil, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (ALS), esclerose múltipla, derrame e doença de Parkinson. Em outros casos, o método pode ser van-tajosamente aplicado em indivíduos que sofrem de deficiência na função neurológica devido a uma infecção (por exemplo, viral, bacteriana, fúngica, parasítica) ou um distúrbio imunológico. Em uma modalidade particular, a função neurológica é prejudicada devido à exposição a uma droga, como um anestésico. A função neurológica comprometida também pode estar associada com uma condição selecionada do grupo que consiste de esquizofrenia, transtorno bipolar, depressão, obesidade, anorexia e caquexia.

[00198]Distúrbios de pele e couro cabeludo incluem todas as doenças dos apêndices da pele, do couro cabeludo e do cabelo, incluindo, por exemplo, unhas e folículos pilosos. Condições particulares que podem se beneficiar da invenção incluem alopecia, eczema, psoríase, queratose seborréica, seborréia e feridas na pele. Feridas da pele incluem as úlceras venosas de perna, úlceras de pressão, úlceras do pé diabético, queimaduras, feridas de amputações, úlceras de decúbito (ferida de cama), enxerto de pele de um doador, a pele do local do enxerto do doador, zonas de implantação de dispositivos médicos, feridas por mordida, feridas produzidas pelo frio, ferimentos por punção, feridas por estilhaços, dermoabrasões, contusões, feridas por infecção e feridas cirúrgicas. Feridas podem ser o resultado de infecção; exposição à radiação ionizante, exposição a laser, ou a exposição a um agente químico.

[00199]A invenção pode ser particularmente eficaz para o reparo de feridas com menor formação de cicatriz.

[00200]A invenção pode ser particularmente eficaz e econômica para o tratamento de feridas crônicas que não cicatrizam. Como é conhecido por qualquer especialista no assunto, a eficácia de um tratamento específico para promover a cica- trização da ferida pode ser avaliada por vários critérios, incluindo a taxa de fechamento medida pelo comprimento, largura e profundidade da ferida ao longo do tempo, a taxa de epitelização, formação de tecido de granulação e resistência à tração do tecido.

[00201]Os métodos revelados neste documento para induzir ou promover a regeneração do tecido são particularmente vantajosos para os indivíduos que têm dano tecidual que, por exemplo, pode estar associado a, ou ser resultado de uma lesão ou insulto. Os métodos para induzir ou promover a regeneração do tecido po-dem ser utilizados em indivíduos que sofreram uma lesão ou insulto selecionado do grupo que consiste de um infarto do miocárdio, embolia pulmonar, infarto cerebral, doença arterial oclusiva periférica, uma hérnia, um infarto esplênico, uma úlcera ve-nosa, uma axotomia, um descolamento de retina, uma ferida (por exemplo, uma feri-da por queimadura, uma ferida por mordida, uma ferida produzida pelo frio, um feri-mento por punção, ferida por estilhaços, uma contusão, uma ferida por infecção ou uma ferida cirúrgica), uma infecção e um procedimento cirúrgico.

[00202]Os métodos da invenção são exemplificados nos Exemplos revelados aqui. O Exemplo 4 revela que uma fração isolada de mirceno polimérico (derivado da mastique de Pistacia) induz a diferenciação das células do epitélio pigmentado da retina.

[00203]O Exemplo 5 revela que mirceno polimérico encurta o tempo de recuperação da anestesia em animais experimentais.

[00204]O Exemplo 6 revela que a mesma fração tem atividade na indução de diferenciação de linhas de células tumorais de melanoma e neuroblastoma.

[00205]O Exemplo 7 revela que mircenos poliméricos quimicamente sintetizados de várias faixas de peso molecular induzem a diferenciação em células do epitélio pigmentado da retina.

[00206]O Exemplo 8 revela que os compostos de pequena massa molecular de mastique que são separados a partir de mirceno polimérico durante a preparação dos mesmos com base na sua solubilidade somente em um solvente polar de acordo com a invenção, interfere, reduz e impede a atividade de diferenciação celular exercida por mirceno polimérico.

[00207]Os Exemplos 9, 10 e 11 revelam que a invenção pode ser aplicada a cicatrização de feridas em indivíduos mamíferos e não mamíferos.

[00208]O Exemplo 12 revela que as composições compreendendo mirceno polimérico de acordo com a invenção têm amenizado os efeitos da demência vascular em um modelo animal.

[00209]O Exemplo 13 revela que a invenção pode ser usada para estimular o apetite em indivíduos afetados por várias doenças que resultam em perda de apetite ou o resultado de ganho de peso patológico na obesidade.

[00210]O Exemplo 14 revela que as composições compreendendo mirceno polimérico de acordo com a invenção têm amenizado os efeitos do derrame em um modelo animal.

[00211]O Exemplo 15 revela que as composições compreendendo mirceno polimérico de acordo com a invenção têm amenizado os efeitos da lesão/trauma no nervo óptico em um modelo animal.

[00212]O Exemplo 16 revela que as composições compreendendo mirceno polimérico de acordo com a invenção têm amenizado os efeitos do descolamento de retina e fornece evidência de reparo de ferida com pequena formação de cicatriz em um modelo animal. A etapa de colocar a célula em contato pode ser realizada in vitro ou ex vivo. Em particular, as células, ou um órgão ou tecido derivado dele que se destina para a implantação ou transplante no indivíduo pode ser tratado de acordo com a invenção. Por exemplo, explantes de células ou células ou tecidos cultivados e mantidos em cultura podem entrar em contato com a composição. As células podem ter origem, por exemplo, a partir de células-tronco de um doador autólogo ou homólogo, e ser destinada para a regeneração de órgãos e/ou implantação em um receptor. Em outros casos, as células são de um doador heterólogo e são destinados a implantação ou transplante em um receptor. Em uma modalidade particular, as células são de um doador ou tecido de um doador heterólogo e são destinados a implantação ou transplante em um receptor. Em uma modalidade particular, as célu- las são aquelas que secretam fatores solúveis.

[00213]O método pode ser realizado antes ou após a implantação de um dispositivo médico em um sujeito. Dispositivos médicos incluem, entre outros, uma prótese, um órgão artificial ou um componente dele, uma válvula, um catéter, um tubo, uma endoprótese, uma membrana artificial, um marca-passo, um sensor, um endoscópio, um dispositivo de imagem, uma bomba, um fio e um implante. Implantes incluem, entre outros, um implante cardíaco, um implante coclear, um implante de córnea, um implante craniano, um implante dentário, um implante maxilo-facial, um implante de órgão, um implante ortopédico, um implante vascular, um implante intra-articular e um implante mamário.

[00214]Em uma modalidade particular, o dispositivo médico é um órgão im-plantado, que podem em certos casos compreender células autólogas do indivíduo.

[00215]Em uma modalidade particular, a etapa de colocar em contato compreende os recursos selecionados do grupo que consiste de eletroporação, sonica- ção, rádio frequência, spray pressurizado e combinações dos mesmos.

[00216]Em uma modalidade particular, a etapa de colocar em contato compreende estabelecer contato entre o líquido intersticial e a composição. Isto pode ser particularmente vantajoso para feridas que estão rodeados por líquido intersticial. O contato entre o líquido intersticial e da composição pode ser obtido por perfuração e/ou irritação da derme com uma agulha, uma microagulhas, ou um aparelho compreendendo uma pluralidade de agulhas ou microagulhas. Tais agulhas ou microagulhas são preferencialmente não ocas e podem ser moldadas em uma pluralidade, por exemplo, em um aparelho como um pente ou escova.

[00217]O método da invenção é adequado para aplicação em seres humanos, mamíferos não-humanos, peixes e aves. Artigos de fabricação

[00218]O método da invenção pode incluir o uso de um artigo de manufatura que incorpora a composição compreendendo mirceno polimérico aqui descrito.

[00219]A composição farmacêutica pode ser na forma de um revestimento sobre o artigo de fabricação, ou pode ser contido dentro de um vaso que é parte integrante do artigo de fabricação. A composição farmacêutica é vantajosamente presente como um revestimento sobre os dispositivos que são inseridos ao corpo e são destinados a integração no mesmo, por exemplo, um implante. A composição farmacêutica pode, assim, promover o fechamento de tecido sobre o implante, devido à atividade do mirceno polimérico na indução de diferenciação celular.

[00220]A composição farmacêutica pode ser vantajosamente incorporada em cima nos artigos usados na cicatrização de feridas ou reparo de tecidos, por exemplo, um curativo ou bandagem. A composição farmacêutica pode, assim, promover a cicatrização da ferida devido à atividade do mirceno polimérico na indução de diferenciação celular.

[00221]Em outros casos, a composição farmacêutica pode ser incorporada a um dispositivo de entrega, como uma agulha, um dispositivo de injeção ou um pulverizador a partir do qual a composição é entregue a um local do corpo que necessite de terapia, por exemplo, um local de ferida.

[00222]Artigos de fabricação incluem, entre outros, um artigo de tecido, uma fralda, um curativo, um dispositivo médico, uma agulha, uma microagulhas, um dispositivo de injeção e um pulverizador. Em uma modalidade particular, o artigo de fabricação compreende uma pluralidade de microagulhas. Dispositivos médicos e implantes são como os acima descritos.

[00223]Os exemplos a seguir são apresentados a fim de ilustrar mais plenamente certas modalidades da invenção. Eles devem de modo algum, no entanto, ser interpretados como limitando o amplo escopo da invenção. Um especialista na técnica pode facilmente imaginar muitas variações e modificações dos princípios revelados neste documento sem se afastar do escopo da invenção. EXEMPLOS Exemplo 1 Preparação de frações isoladas de Goma de Mastique a partir de fontes vegetais

[00224]Método 1. Resina de mastique (10 g) foi combinada com etanol absoluto (200 ml) e a mistura foi deixada em repouso durante a noite. A mistura foi agitada, e partículas insolúveis maiores assentaram em 20 minutos, e o etanol foi transferido para um novo frasco. O remanescente foi agitado em uma parte fresca de etanol absoluto (150 ml) por 10 minutos. Esta fração de etanol foi combinada com a primeira fração. O procedimento foi repetido com outra porção de 150 ml de etanol absoluto que foi combinada com as duas primeiras frações de etanol. Subsequentemente, o etanol foi removido a vácuo usando um evaporador rotatório (banho de água a temperatura de 30°C). Hexano (300 ml) foi adicionado ao resíduo remanescente e a mistura foi agitada repetidamente por um período de duas horas. Após repouso durante a noite em um frasco fechado para completar a dissolução do material estável e precipitação de qualquer material insolúvel, a solução clara de hexano foi transfe-rida para um frasco limpo pré-pesado e o hexano foi removido usando evaporador rotatório. À fração isolada obtida foi adicionada imediatamente a quantidade desejada de óleo e a mistura foi agitada até que uma mistura homogênea foi obtida.

[00225]Método 2. Resina mastique (10 g) foi combinada com metanol absoluto (300 ml) e a mistura foi deixada em repouso durante a noite. A mistura foi agitada, partículas insolúveis maiores assentaram em 20 minutos, e a fração solúvel de metanol foi transferida para um novo frasco. O remanescente insolúvel foi agitado em uma parte fresca de metanol absoluto (200 ml) por 10 minutos. Esta segunda fração de solúvel em metanol foi combinada com a primeira fração solúvel em metanol. O procedimento foi repetido com outra porção de 200 ml de metanol absoluto, e uma terceira fração solúvel de metanol foi combinada com as duas frações solúveis de metanol. Subsequentemente, o metanol foi removido a vácuo usando um evapo- rador rotatório (banho de água a temperatura de 30°C). Hexano (300 ml) foi adicionado ao resíduo remanescente e a mistura foi agitada repetidamente por um período de duas horas. Após repouso durante a noite em um frasco fechado para completar a dissolução do material estável e precipitação de qualquer material insolúvel, a solução clara de hexano foi transferida para um frasco limpo pré-peado e o hexano foi removido usando evaporador rotatório. À fração isolada obtida foi adicionada imediatamente a quantidade desejada de óleo e a mistura foi agitada em um frasco fechado até que uma mistura homogênea fosse obtida.

[00226]Método 3. Resina mastique (5 g) foi pulverizada com pilão e gral e combinada com hexano (200 ml). A mistura foi agitada a cada 30 minutos durante um período de oito horas e em seguida deixada em repouso durante a noite. A fração solúvel em hexano foi removida a partir do material insolúvel e transferida para um frasco limpo. O hexano foi removido da fração solúvel em hexano usando um evaporador rotatório. O resíduo remanescente foi então submetido a um sistema de alto vácuo (< 0,01 mbar) por pelo menos 24 horas para remover materiais voláteis adicionais. Etanol absoluto (100 ml) foi então adicionado ao resíduo remanescente e a mistura foi repetidamente agitada por um período de 1 hora. A fração solúvel em etanol foi transferida para um frasco limpo e a extração foi repetida com duas porções adicionais de 100 ml de etanol absoluto. As frações solúveis em etanol foram combinadas com qualquer material insolúvel remanescente e deixadas para assentar durante a noite. A solução clara etanol foi transferida para um frasco pré-pesado limpo e o etanol foi removido sob vácuo. Ao remanescente foi adicionada imediatamente a quantidade desejada de óleo e a mistura foi agitada até que uma formulação homogênea fosse obtida.

[00227]Método 4. Folhas, galhos moles, frutas e bagas de árvores Pistacia lentiscus L., P. atlantica ou P. palestina foram coletados, limpos e pulverizados. A dissolução com etanol ou metanol foi inicialmente conduzida essencialmente con- forme descrito nos Métodos 1 e 2, e as dissoluções subsequentes foram conduzidas usando combinações de etanol ou metanol com um óleo vegetal por um número de ciclos.

[00228]Método 5. Folhas (30 g) de Pistacia lentiscus L. foram coletadas, limpas e cortadas em pequenos pedaços com uma faca e colocados em um processador de alimentos. Óleo de oliva (100ml) foi adicionado e processado. A mistura total foi removida e colocada em um béquer de vidro. Duzentos ml de etanol (96%) foram adicionados e a mistura foi aquecida a 65°C por 20 min. A mistura total foi colocada em gaze e o líquido foi pressionado para fora. A fase etanólica superior foi removida com pipeta e descartada. O etanol residual pode ser removido da fase oleosa por evaporação.

[00229]Método 6. Bagas (25 gramas) de Laurus nobilis (coletado em maio ou junho) foram lavadas com etanol (96%, 200 ml) por 30 segundos. O etanol e as bagas foram removidos e o óleo de oliva foi adicionado ao resíduo remanescente. Qualquer material insolúvel foi deixado precipitar e a solução oleosa clara foi isolada.

[00230]Método 7. Para cada preparação, aproximadamente dez gramas de exsudato resinoso coletado de árvores Pistacia lentiscus L., P. atlantica ou P. palestina na área de Zikhron Yaakov, Israel fora usados. A resina foi combinada com 30 ml de metanol em um frasco de vidro apropriado e a mistura foi vigorosamente agitada durante um período de tempo de 30 minutos a 2 horas. Uma porção de resina se dissolveu, enquanto material insolúvel assentou no fundo do frasco. O líquido superior foi decantado e alíquotas adicionais de metanol foram adicionadas conforme acima, e o processo de agitação e decantação foram repetidos. O material insolúvel remanescente foi então imerso em água destilada por 30 segundos a 1 minuto, resultando em um líquido claro leitoso com material insolúvel remanescente. Após vários ciclos alternados rápidos de tratamento com água, e metanol, o material insolúvel remanescente foi seco a ar e pesado. Tipicamente, cerca de 1-3 gramas de ma- terial insolúvel foram obtidos a partir de dez gramas de resina inicial. Resultados semelhantes foram obtidos usando etanol como o solvente no lugar de metanol. A dissolução da fração final de material insolúvel foi conduzida imediatamente após a secagem pela adição de um óleo vegetal, tipicamente óleo de oliva ou óleo de semente de uva, em uma quantidade suficiente para fornecer a concentração desejada, tipicamente 1% ou 10%.

[00231]Método 8. Para cada preparação, aproximadamente dez gramas de (i) exudato de resina coletado da casca de árvores de Pistacia lentiscus L. ou P. palestina que cresceram na Região do Monte Carmelo, Israel, ou (ii) obtido comercialmente de mastique Chios (disponível por exemplo de Chios Mastic Gum Growers Association ou de G. Baldwin & Co.) foi usado. A resina foi pulverizada em um gral, transferida para um béquer de vidro e 100 ml de etanol (98%) foram adicionados. Após agitação por alguns minutos, o etanol foi decantado, deixando uma massa reduzida devido à remoção de material solubilizado. Uma quantidade adicional de eta- nol foi adicionada, e as etapas de agitação, decantação e adição de solvente foram rapidamente repetidas por um número de ciclos, cada um durando entre 5 a 30 minutos. O material insolúvel remanescente após o ciclo final (tipicamente correspon-dendo a 20 a 35% em peso do material de partida comercial, ou 10 a 25% da resina coletada do material de partida) foi solubilizado em um de óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de semente de uva, óleo de gergelim, óleo de algodão ou óleo de soja para gerar uma concentração final de 8 a 10% (p/p).

[00232]Método 9. Mastique pulverizado (~10 g) foi combinado com 100 ml de metanol. Após agitação por alguns minutos, o metanol foi decantado, deixando uma massa reduzida de material não solúvel devido à remoção de material solubili- zado. Uma quantidade adicional de metanol foi adicionada, e as etapas de agitação, decantação e adição de solvente foram rapidamente repetidas por um número de ciclos. O material insolúvel remanescente após o ciclo final (tipicamente correspon- dendo a 20 a 30% em peso do material de partida) foi solubilizado em óleo de oliva. O processo de dissolução tipicamente envolve óleo de oliva aquecido a 45 °C e agitação leve no béquer.

[00233]Método 10. Mastique pulverizado (~10 g) foi combinado com 25 ml óleo de soja e 100 ml de metanol em um béquer de vidro. Agitação usando agitador magnético foi conduzida por 2 horas. O solvente foi decantado e metanol fresco foi adicionado, seguido por agitação por uma hora. O solvente foi decantado, seguido pela evaporação sob vácuo para remover o solvente residual.

[00234]Método 11. Mastique pulverizado (~10 g) foi combinado com 100 ml etanol (96%) em um béquer de vidro. Agitação usando agitador magnético foi conduzida por 10 minutos. O solvente foi decantado de uma quantidade adicional de etanol, seguida por agitação por 5 minutos e decantação do solvente. As etapas de adição de solvente, agitação e decantação foram repetidas por 4 ciclos. Em seguida n-hexano (100 ml) foi adicionado ao material insolúvel, seguido por agitação repetida até o material dissolver. Uma pequena amostra foi dessecada e pesada para determinar a concentração. O bulk da solução de hexano foi aplicado em uma coluna de exclusão por tamanho calibrada e a fração contendo peso molecular até 1500 foi descartada. A fração contendo peso molecular maior do que 1500 foi misturada com 20 gramas de pomada de parafina pesada. A mistura é homogeneizada por mistura repetida e o hexano foi removido por evaporação sob vácuo.

[00235]Este procedimento pode ainda ser realizado por mistura de parafinas e ceras contendo peso molecular aumentado para obter um produto mais sólido.

[00236]O termo “RPh-1” é usado aqui para referir-se a uma fração isolada preparada como em qualquer um dos métodos acima, e seguido por dissolução em um óleo apropriado, cera ou combinação dos mesmos.

[00237]RPh-1 foi usado diretamente para experimentos de cultura de célula in vitro ou para o tratamento de animais de testes, tipicamente em concentrações finais variando de 0,025 a 5% em um óleo particular ou misturas de óleos, conforme especificado aqui. Além disso, conforme mostrado no Exemplo 2, o principal componente de RPh-1 foi determinado como sendo 1,4-poli-β-mirceno de peso molecular na faixa de 5000 a 20.000. Exemplo 2. Caracterização química de mirceno polimérico isolado de fontes vegetais. Visão Geral

[00238]Resina mastique de Pistacia lentiscus L. foi extraída de acordo com o método 1 ou 2 para obter a fração desejada (chamada RPh-1) que foi analisada por Cromatografia por Exclusão por Tamanho (SEC) para definir a distribuição de peso molecular. A estrutura química da RPh-1 foi analisada por ressonância magnética nuclear (RMN) seguida por fracionamento em SEC preparativa.

[00239]Foi demonstrado que RPh-1 contém uma fração "leve" com pesos moleculares abaixo de 1.000 e uma fração de polímero "pesado" com peso molecular na faixa de 5000 a 20.000. Baseado em análise de RMN (1H-RMN e 13C-RMN), o composto predominante na fração "pesada" tem uma estrutura consistente com a do 1,4-poli-β-mirceno.

[00240]Separações preparativas foram conduzidas usando acetato de etila e tetrahidrofurano (THF) como eluentes. Em ambos os casos, a fração de polímero "pesada" demonstrou apresentar várias atividades biológicas definidas, incluindo a de induzir a diferenciação celular, conforme descrito nos Exemplos 4 e 6. Em contraste, a fração "leve" demonstrou toxicidade em experimentos de eficácia in vitro usando células epiteliais de retina pigmentadas. Foi descoberto que para preservar a atividade da fração de polímero, é altamente importante protegê-la da reação de oxidação ou cruzamento de ligação pela diluição em um solvente hidrofóbico, preferencialmente óleo, opcionalmente em combinação com uma cera. Métodos

[00241]Resina mastique (10 g) foi combinada com etanol absoluto (200 ml) e a mistura foi deixada em repouso durante a noite. A mistura foi agitada, partículas insolúveis maiores assentaram em 20 minutos, e o etanol foi transferido para um novo frasco. O remanescente foi agitado em uma parte fresca de etanol absoluto (150 ml) por 10 minutos. Esta fração de etanol foi combinada com a primeira fração. O procedimento foi repetido com outra porção de 150 ml de etanol absoluto que foi combinada com as duas primeiras frações de etanol. Subsequentemente, o metanol foi removido a vácuo usando um evaporador rotatório (banho de água a temperatura de 30°C). Ao remanescente foi adicionado hexano (300 ml) e a mistura foi agitada repetidamente por um período de duas horas. Depois de deixada em repouso durante a noite no frasco fechado para completar a precipitação de qualquer material insolúvel, a solução clara de hexano foi transferida para um frasco limpo e usado para separações analíticas e preparativas.

[00242]Macromoléculas são separadas usando Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC) baseado no fato de serem excluídas da fase estacionária. Em SEC os compostos de peso molecular mais alto são totalmente excluídos dos poros de empacotamento e, portanto, eluem primeiro. Os pesos moleculares de compostos de polímero em teste podem ser estimados por SEC baseado na comparação com uma curva padrão construída com compostos de peso molecular conhecidos, por exemplo, padrões de poliestireno. No entanto, pesos moleculares de polímeros determinados com base em tais comparações podem estar sujeitos a uma margem de erro inerente de pelo menos cerca de 10 a 15%, uma vez que a relação hidrodinâmica de volume e peso molecular não é a mesma para todos os polímeros, de moco que somente uma determinação aproximada pode ser feita.

[00243]Para SEC analítico, uma coluna PLgel (7.5*300 mm 5μ 103 A°) foi usada e calibrada com padrões de poliestireno de pesos moleculares de 1.000, 2000, 5000, 10.000, 30000 e 70000. Os solventes usados (hexano, acetato de etila, tetrahidrofurano (THF), diclorometano (DCM) e acetona) foram todos de grau analítico para cromatografia líquida. Para fins analíticos, o THF demonstrou ser ótimo. O instrumento de cromatografia usado foi um ThermoPhinnigan TSP ajustado com um detector por araste de diodo ou um detector ELSD, usando uma velocidade de fluxo de 1ml/min, tempo de corrida de 15 min e 100% THF para a fase móvel.

[00244]SEC Preparativa foi conduzida usando as seguintes condições: 1. Condições para THF: Coluna: PLgel: 25*300 mm 5μ 103A° Fase móvel: hexano 60% /THF 40% velocidade de fluxo 11ml/min. A separação foi repetida 12 vezes com 1ml de extrato cada e duas frações foram coletadas: 1) conteúdo de MW pesado; 2) Conteúdo de MW leve. 2. Condições para DCM: Coluna: PLgel: 25*300 mm 5μ 103A° Fase móvel: hexano 70% /DCM 30% velocidade de fluxo 11ml/min. A separação foi repetida 12 vezes com 1ml de extrato cada e duas frações foram coletadas: 1) conteúdo de MW pesado; 2) Conteúdo de MW leve.

[00245]Para cada corrida de SEC preparativa, a coluna foi calibrada com padrões de poliestireno de pesos moleculares 1.000, 2000, 5000, 10.000, 30000 e 70000.

[00246]As frações coletadas destas duas fases móveis diferentes foram divididas em duas, metade foi evaporada até secagem usando evaporador e 3ml de óleo foram adicionados. À segunda metade foram adicionados 3 ml de óleo e em seguida o solvente orgânico foi evaporado. As amostras obtidas foram analisadas para atividade biológica.

[00247]O material MW pesado da eluição de THF foi analisado por 1H-RMN e 13C-RMN a 300 MHz e 75 MHZ respectivamente. Resultados SEC Analítica

[00248]A Figura 1 mostra que o cromatograma de SEC analítico obtido usando um detector PDA (linha tênue) e um detector ELSD-SEDEX (linha em negrito). Uma fração correspondente ao peso molecular na faixa de cerca de 60.000 a cerca de 5000 (eluindo em 5-7 minutos) foi detectado somente com o detector ELSD. Ambos os detectores indicaram a presença de uma fração de peso molecular na faixa de <1.000. SEC Preparativa

[00249]A Figura 2 mostra as frações de peso molecular pesado (Fig. 2B) e baixo (Fig. 2A) obtidas por SEC preparativa. A fração pesada foi obtida por corrida em SEC em DCM/hexano, enquanto a fração leve foi obtida por corrida SEC em THF/hexano. A Tabela 1 sumariza as frações obtidas durante a SEC preparativa e vários sistemas solventes. Tabela 1. Frações coletadas de colunas preparativas usando vários eluentes e modos de evaporação

Análise de RMN

[00250]A Figura 3 mostra os espectros de 1H-RMN obtidos de material MW pesado de corrida de SEC preparativa em hexano 60% /THF 40%. A Figura 4 mostra os espectros de 13C-RMN obtidos de material MW pesado de corrida de SEC preparativa em hexano 50% /THF 50%.

[00251]As análises de 1H-RMN e 13C-RMN indicam que o 1,4-polimérico β- mirceno é o componente principal da fração MW pesada obtida de SEC preparativa do material insolúvel em solvente polar (RPh-1) de mastique. Exemplo 3. Síntese química de 1,4-polimérico β-mirceno

[00252]Preparações sintéticas de 1,4-polimérico β-mirceno de vários pesos moleculares foram preparadas, usando métodos geralmente baseado em procedimentos revelados em Newmark et al (1988) J. Polim Sci.26:71-77. Métodos

[00253]Os seguintes reagentes foram adicionados a um frasco de 250 mL de 3 pescoços equipados com um condensador: β-mirceno, hexano e sec-butil lítio em ciclohexano, todos sob atmosfera de nitrogênio, nas quantidades mostradas abaixo na Tabela 2. O volume de hexano usado em cada reação foi geralmente de cerca de 20 a 25 vezes o volume de iniciador butil lítio. Cada mistura de reação foi aquecida a 80°C e agitada por cerca de 1 hora. Para estimar a concentração de polímero, uma pequena quantidade (alguns ml) de solução foi retirada e evaporada até secagem.

[00254]Para algumas misturas de reação, o lítio foi removido após a reação ser diluída à mistura final com um excesso de hexano e lavagem duas vezes com água. A fase orgânica foi separada e seca com sulfato de sódio.

[00255]Para uso em ensaios de atividade biológica e caracterização de peso molecular, uma solução 10% de polímero sintetizado em óleo de oliva foi preparada pela adição de óleo de oliva até uma concentração final de 10% (sem hexano) e o solvente hexano evaporado. O peso molecular aparente foi determinado usando SEC e o cálculo a partir de uma curva de calibração padrão usando padrões de poli- estireno de peso molecular 2000, 5000, 10.000, 30000 e 70000. As condições usadas para SEC foram conforme a seguir: Coluna: PLgel: 7.5*300 mm 5μ 103A° Fase móvel: 100% THF Velocidade de fluxo 1ml/min Detector: ELSD Resultados

[00256]Os pesos moleculares esperados e calculados do β-mirceno polimé- rico produzidos sob diferentes condições de reação são apresentados na Tabela 2. Tabela 2. Quantidades de reagentes e peso molecular do produto de mirce- no polimérico quimicamente sintetizado.

[00257]Como pode ser observado a partir da Tabela 2, as várias condições de reação geraram polimérico contendo pesos moleculares calculados na faixa de cerca de 3000 a cerca de 46.000. Os produtos podem ser designados como estando na faixa de mirceno polimérico de “alto” peso molecular, ou seja, <20.000 a cerca de 50.000, e mirceno polimérico de “baixo” peso molecular, ou seja, <3000 a ~11.000. Perfis de SEC analítico representativos para β-mirceno polimérico de “alto” e “baixo” peso molecular são mostrados nas Figuras 5A e 5B, respectivamente.

[00258]Produtos de reação lavados com água geraram substancialmente resultados idênticos em SEC analítico.

[00259]A Figura 6 mostra um espectro de 1H-RMN representativo de produto de polimerização de β-mirceno. A Figura 7 mostra um espectro de 13C-RMN representativo de produto de polimerização de β-mirceno.

[00260]As análises de 1H-RMN e 13C-RMN indicam que o produto da reação de polimerização tem uma estrutura consistente com a de 1,4-poli-β-mirceno.

[00261]A reação sintética usada para produzir β-mirceno polimérico envolve um mecanismo de polimerização aniônica (conhecida como "reação de Michael").

[00262]Para a iniciação ser bem-sucedida, a energia livre da etapa de iniciação deve ser favorável. Portanto, é necessário relacionar o monômero com a força apropriada do iniciador de modo que a primeira adição seja "downhill". Uma reação atípica aniônica é a polimerização de estireno usando butillítio, C4H9Li, em um solvente inerte como n-hexano. Quando conduzido sob as condições apropriadas, as reações de terminação não ocorrem em polimerização aniônica. Tipicamente, uma adiciona um composto como água, um álcool, oxigênio molecular ou dióxido de carbono para terminar a propagação, devido à rápida reação com os carbânions nas terminações das cadeias.

[00263]A polimerização aniônica gera distribuições de massa molecular muito finas porque os processos de transferência estão ausentes. Se o solvente é extremamente puro, as cadeias poliméricas ainda serão ativas após todo o monômero ser consumido.

[00264]O grau de polimerização é expresso como:

Onde M=monômero e I=iniciador.

[00265]Como indicado acima, butil lítio é um iniciador apropriado para poli- merização aniônica para moléculas contendo isopreno como terpenos. Portanto, de- ve ser usado na síntese de 1,4-polimircenos para a presente invenção.

[00266]Enquanto o procedimento acima descrito é geralmente revelado na técnica anterior (vide, por exemplo Newmark et al (1988) J. Polim Sci.26:71-77), importantes modificações reveladas aqui são trabalhar em uma diluição alta de hexano e a etapa final de alterar o solvente para óleo, para obter polímero puro que retém sua atividade biológica com alta potência. Exemplo 4. RPh-1 induz diferenciação tipo neuronal em culturas de células epiteliais de retina pigmentadas. Visão Geral

[00267]A presente invenção é direcionada para a indução de diferenciação e maturação celular, e tem aplicação direta na regeneração de tecido funcional, em tecido neuronal particular. Nossos achados experimentais mostram que RPh-1 induz a diferenciação de células pigmentadas de retina, um tecido de origem neuronal, células neuronais morfológicas que produzem axônios, células dendríticas e de junção conhecidas como sinapses. A diferenciação morfológica em células RPh-1 tratadas é acompanhada pela expressão de novo da do antígeno de diferenciação especifico de neurônio β3 tubulina. A indução de diferenciação de célula neuronal sugere fortemente que RPh-1 afeta a diferenciação de célula tronco neuronal em neurônios funcionais. O dogma corrente da patologia da demência e da doença de Alzheimer mantém que a deficiência envolve a falha de neurônios para formar junções sinápticas funcionais (vide, por exemplo, Kimura R, Ohno M. Impairments in remote memory stabilization precede hippocampal synaptic and cognitive failures in 5XFAD Alzheimer mouse model. Neurobiol Dis. 2008 Nov 5).

[00268]Consequentemente, os experimentos descritos aqui suportam o uso de uma fração isolada de mastique são descritas no Exemplo 1, bem como de mir- ceno polimérico, uma molécula ativa em RPh-1, como uma modalidade terapêutica para descobrir neuro-regeneração em doenças neurodegenearativas como demên- cia e doença de Alzheimer.

[00269]Mirceno polimérico sintético é ainda o escopo da invenção e é útil em métodos terapêuticos da invenção. Células epiteliais de pigmento de retina (RPE)

[00270]Estudos direcionados a avaliar os efeitos de RPh-1 em várias linhagens celulares levarão ao uso de células ARPE-19, uma linhagem celular de epitélio de pigmento de retina não maligno.

[00271]O epitélio de pigmento de retina (RPE) é uma camada simples de células epiteliais pigmentadas hexagonais de origem neuronal, que forma a camada celular mais externa da retina ocular e está ligada à coróide subjacente. As funções de RPE incluem suporte, nutrição e fotorreceptores subjacentes da neuro-retina.

[00272]As células RPE estão envolvidas na fagocitose do segmento externo das células fotorreceptoras, no ciclo de vitamina A onde eles isomerizam todos os trans retinol a 11-cis retinal e no fornecimento de fotorreceptores com D-glicose, aminoácidos e ácido ascórbico.

[00273]Embora in vivo RPE seja pigmentada, as células ARPE-19 não forma melanina a e não as pigmentadas. Em cultura, as células crescem na forma de fuso e como células poligonais. Métodos

[00274]Células ARPE-19 (obtidas da Coleção Americana de Tipo de Cultura, ATCC) foram plaqueadas em microplacas de cultura de tecido de células de 96 poços de fundo chato (Costar) em uma concentração de 2 - 5x103 células por poço (1 - 2,5x104 células/mL) em um meio de crescimento que consiste de DMEM:Ham F-12, 1:1, complementado com 10% de Soro Bovino Fetal, 200 mM glutamina, 100 unida- des/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina. Deixou-se que as células aderissem às superfícies da placa durante a noite antes do tratamento com RPh-1.

[00275]RPh-1 foi preparado essencialmente conforme descrito no Exemplo 1, Método 1 para fornecer uma solução a 10% em carreador composto de óleo de semente de uva, óleo de oliva, óleo de semente de algodão, Mygliol® 810 ou Mygli- ol® 812. As preparações foram adicionadas às culturas nos volumes de 0,5 μl, 2 μl, 5 μl e 20 μl. Estes volumes, introduzidos em um volume médio de uma amostra geral de 200 μl, corresponde às concentrações finais de RPh-1 de 0,025%, 0,1%, 0,25% e 1%, respectivamente. O óleo carreador serviu como um veículo e foi aplicado às cul-turas de controle nos mesmos volumes.

[00276]As culturas foram incubadas em um incubador a 37oC, 5% CO2 por 72 hrs. O meio foi então removido, as culturas foram lavadas duas vezes com salina de fosfato tamponada (PBS), fixada com metanol absoluto por 10 min e corada como reagentes Hemacolor® (Boehringer Mannheim), que corou as células de maneira semelhante à Giemsa, pode ser usado em um ensaio quantitativo de viabilidade celular (vide Keisari, Y. A colorimetric microtiter assay for the quantitation of cytokine activity on adherent cells in tissue culture. J. Immunol. Metods 146, 155-161, 1992). O corante foi eluído com 20% de SDS, e quantificado em um leitor de ELISA em 630 nm (amostras avaliadas em triplicata). Para determinar a expressão de beta-3 tubu- lina, as células foram plaqueadas em lamínulas de vidro estéreis imersas em micro- placas de 6 poços em uma concentração de 105 células/poço em um meio que consiste de 1:1 mistura de meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) e meio Ham F12, complementado com 10 soro bovino fetal e penicilina (100 unidades/ml), es- treptomicina (100 Dg/ml) e glutamina (2mM). Deixou-se que as células aderissem durante a noite em lamínulas e 7% RPh-1 em óleo de oliva (ou óleo de oliva isolado para as preparações controle) foi administrado às culturas em um volume de 25 Dl/ml de meio e incubado a 37oC, 5% CO2 por 72 hrs. As células foram então lavadas com 2X com PBS e fixadas com 4% para-formaldeído. Para determinar a expressão da proteína beta-3 tubulina nas células as lamínulas de vidro foram coradas com um anticorpo primário monoclonal de camundongo direcionado contra beta-3 tubulina humana seguido por um segundo IgG anti-camundongo marcado para FITC. Os núcleos celulares foram contracorados com DAPI. As preparações de teste e de controle foram então avaliadas em um microscópio confocal. Resultados

[00277]O tratamento das células ARPE-19 RPE com RPh-1 demonstrou inesperadamente induzir alterações morfológicas drásticas que são características inequivocamente de neuro-diferenciação. As alterações morfológicas não ocorreram nas culturas de controle tratados somente com o óleo carreador e resultados semelhantes foram observados entre as culturas de teste tratadas com RPh-1, independentemente do óleo usado como carreador para o composto ativo. As alterações morfológicas foram ainda associadas com a cessação da proliferação celular, dando suporte à conclusão de que RPh-1 induz a neuro-diferenciação.

[00278]Culturas tratadas com óleo apresentaram padrão de crescimento poligonal e em forma de eixo típico característico de células ARPE-19 RPE (Fig. 8A). Após 48 horas de incubação em cultura, as células tratadas que foram tratadas com RPh-1 (0,1%; 1 mg/ml) foram alteradas na forma, e desenvolveram protrusões de reminiscência finas, muito longas densamente coradas de células de axônios neuro- nais (Fig. 8B). Após 48 horas de incubação, as células tratadas com RPh-1 (0,25%; 2,5 mg/ml) apresentaram um número maior de protrusões de reminiscência mais finas de dendritos (Fig. 8C) após 72 horas de incubação com RPh-1 as protrusões longas finas formaram junções com protrusões semelhantes em células adjacentes criando uma rede de células inter-conectadas, potencialmente capazes de comunicar informação entre outras (Fig. 8D). Redes semelhantes ocorrem normalmente entre neurônios no sistema nervoso central e permitem a transmissão e processamento de informações.

[00279]Enquanto as células de controle proliferaram durante 72 horas de período de incubação, células tratadas com RPh-1 cessaram rapidamente pararam de se proliferar e permaneceram em densidade esparsa, dando suporte ainda à diferenciação celular.

[00280]Usando preparações inativas de RPh-1 que não induziu diferenciação conforme descrito acima, células ARPE-19 começaram a produzir grandes quantidades de grânulos de melanina a e estas culturas continuaram a proliferar e a densidade celular aumentou para confluência.

[00281]O tratamento de células ARPE-19 com RPh-1 (5% em óleo de semente de algodão) demonstrou resultar na expressão neuronal e marcadores de si- naptogênese β3 tubulina (TUBB3), um marcador de diferenciação tipo neuronal; Arc/Arg3.1, associado com plasticidade sináptica; e pentraxina neuronal II (NPTX2), um gene neuronal de início imediato que funciona em sinaptogênese excitatória. Análise de imunofluorescência de células ARPE-19 diferenciadas mostrou que após 72 horas de incubação com RPh-1, as células coraram de forma positiva para β3TUB, Arc/Arg3.1 e NPTX2 (Fig. 9, painéis da direita), enquanto que pouca ou nenhuma expressão destes marcadores foram observados antes do tratamento (Fig. 9, painéis a esquerda).

[00282]Foi evidenciado ainda que o tratamento com RPh-1 de células ARPE-19 leva à cessação na replicação celular. As células foram tratadas com RPh- 1 por 72 horas e o conteúdo total de proteína (relacionado ao número total de células presentes na cultura) foi comparado às células controle não tratadas. Como mostrado na Fig. 10, as culturas tratadas com RPh-1 continham significativamente menor conteúdo de proteína conforme comparado com culturas controles, confirmando que a proliferação celular foi substancialmente terminada. Um sistema de classificação da potência de RPh-1 na indução de diferenciação celular

[00283]Com base nos resultados acima, um sistema de classificação foi de-senvolvido para avaliar a potência de RPh-1 na indução da diferenciação na cultura celular, com células plaqueadas a 2x103 por poço. Os graus e respectivas descrições estão estabelecidos na Tabela 3. Tabela 3.

[00284]Exemplos representativos de culturas de células nos graus 3, 4 e 5 são apresentados nas Figuras 11A, 11B e 11C, respectivamente. Exemplo 5. RPh-1 encurta o período de recuperação de anestesia

[00285]Tem se tornado cada vez mais evidente que a anestesia está associada com dano neuronal, e métodos efetivos de segurança são necessários para a neuroproteção contra tal dano. Métodos

[00286]Camundongos C57Bl/6, 8 por grupo foram injetados com RPh-1 por via subcutânea três vezes em 7 dias (em dias alternados) com 0,05 ml de uma solução 3% em óleo de semente de uva para uma dose de 30 mg/kg. Os camundongos foram então injetados com uma dose sub-letal (120 mg/kg) de cetamina foi então administrado aos camundongos. Um grupo controle foi tratado com 0,05 ml do veículo óleo de semente de uva. Resultados

[00287]Após a anestesia, os camundongos tratados com RPh-1 se recuperaram significativamente mais rápidos, conforme evidenciado por suas mobilidades completas, enquanto os controles ficaram ainda imóveis. A recuperação no grupo controle conforme definido por uma capacidade de se tornar móvel levou 3 minutos a mais no grupo controle quando comparado ao grupo tratado com RPh-1. Esta observação indica que o ingrediente ativo mirceno polimérico em RPh-1 reduz o período de recuperação e pode ser usado para neuroproteção contra os efeitos adversos associados com drogas anestésicas. Exemplo 6. RPh-1 induz diferenciação celular seguida por morte celular em linhagens de células tumorais

[00288]Os efeitos de RPh-1 em duas linhagens de células de melanoma e três linhagens de células de neuroblastoma foram investigados. Linhagem de células de melanoma humano 5151 e linhagem de células de melanoma murina B16F10 proliferam em cultura de tecido de maneira diferenciada e não produzem melanina. Linhagens de células de neuroblastoma humanas Lan-1, Lan-5 e SY5Y se proliferam em cultura como células em forma de fuso que não exibem diferenciação morfológica. Métodos

[00289]As células foram plaqueadas a 2x103 células por poço em micropla- cas de 96 poços de fundo chato (Costar) e cultivadas em 200 ml de meio DMEM (meio Dulbecco) complementado com 10% de soro bovino fetal, 200 mM L- glutamina, 100 unidades/ml de penicilina e 100 microgramas/ml de estreptomicina (todos os reagentes de Gibco-BRL). Após acoplamento durante a noite, RPh-1 (de uma solução 10% em óleo de semente de uva) foi adicionado às culturas de células para fornecer concentrações finais de 0,025%, 0,1%, 0,25% e 0,5%, e a incubação continuou por 48 e 72 horas. O veículo óleo de semente de uva foi usado como controle. Após 72 horas, as células foram fixadas com metanol e coradas com reagentes Hemacolor® (Boehringer Mannheim). Resultados

[00290]O tratamento de células de melanoma com RPh-1 demonstrou induzir a formação de melanina após 24-48 hrs, conforme mostrado pela Fig. 12B e Fig. 12C, quando comparado às células tratadas com o controle na Fig. 12A. O tratamento com RPh-1 causou ainda captura de replicação, conforme mostrado pela diminuição da densidade celular, por exemplo na Fig. 12D. Por 72 horas, a morte celular foi observada em culturas incubadas com cada uma das quatro concentrações de RPH- 1 testadas.

[00291]No tratamento de linhagens de células de neuroblastoma Lan-1, Lan- 5 e SY5Y com RPh-1 (concentração final 0,025%), as células começaram a desenvolver protrusões tipo dendrito e cessou a proliferação celular. Concentrações mais altas de RPh-1 causaram morte celular na cultura total. Assim, o tratamento com RPh-1 induziu as características de diferenciação tipo neurônio que foram acompanhadas por morte celular. Conclusão

[00292]Mirceno polimérico, um componente ativo em RPh-1, está associado coma indução de diferenciação de várias linhagens celulares derivadas dos cânce- res malignos melanoma e neuroblastoma.

[00293]Um bloco na diferenciação terminal é reconhecido como uma grande avenida na perpetuação de proliferação celular no câncer. Superar este bloco já provou ser uma modalidade efetiva de tratamento de várias formas de câncer (por exemplo, retinoides no tratamento de leucemia promielocítica aguda) e é agora conhecido como "terapia marcadora". Terapia marcadora não mata células cancerígenas, mas modifica seu comportamento, principalmente pela indução da diferenciação. Consequentemente, a agressividade de muitos cânceres pode ser reduzida.

[00294]Conforme revelado aqui, o mirceno polimérico, um ingrediente ativo de RPh-1 demonstrou superar o bloco na diferenciação celular do tumor, conforme indicado pela formação de dendritos de células neuronais em linhagens de células de neuroblastoma, e indução de formação na linhagem de células de melanomas. Em ambos os casos estas alterações foram associadas com a cessação da proliferação celular e morte celular. Exemplo 7. Mirceno polimérico quimicamente sintetizado induz a diferenciação celular em culturas de células epiteliais pigmentadas de retina.

[00295]Os experimentos foram conduzidos para determinar se o mirceno po- limérico sintético de duas faixas diferentes de peso molecular induzem a neuro- diferenciação em células ARPE-19. Métodos

[00296]Células ARPE-19 foram plaqueadas em microplacas de cultura de tecido de células de 96 poços de fundo chato (BIOFIL) em uma concentração de 5x103 células por poço (2,5x104 células/mL) em um meio de crescimento que consiste de DMEM:Ham F-12, 1:1, complementado com 10% de Soro Bovino Fetal, 200 mM glutamina, 100 unidades/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina. Deixou-se que as células aderissem às superfícies da placa durante a noite antes do tratamento com as frações quimicamente sintetizadas de mirceno polimérico.

[00297]As frações isoladas de mirceno polimérico quimicamente sintetizado, contendo distintos pesos moleculares foram testadas para atividade no ensaio de RPE diferenciação celular. A fração 18-1 (peso molecular na faixa de cerca 50.000 daltons), e fração 18-2 (peso molecular na faixa de cerca de 20.000 daltons), descritas no Exemplo 3 foram usadas. Frações 18-1 e 18-2, e RPh-1 foram, cada uma, preparadas em uma concentração de 10% em óleo de oliva. Cada preparação foi adicionada às culturas de células ARPE-19 usando volumes de 0,5 μl, 2 μl, 5 μl e 20 μl, correspondente a concentrações finais de 0,025%, 0,1%, 0,25% e 1%, respectivamente. Óleo de oliva serviu como veículo controle e foi aplicado às culturas de controle nos mesmos volumes. As culturas foram incubadas em um incubador a 37°C, 5% CO2 por 72 h. O meio foi então removido, as culturas lavadas duas vezes com salina de fosfato tamponada (PBS), fixada com metanol absoluto por 10 min e corada com reagentes Hemacolor®. Resultados

[00298]Ambas as frações 18-1 e 18-2 demonstraram ter uma atividade na indução de neuro-diferenciação nas células ARPE-19 (Fig. 13 e Tabela 4). A atividade ótima foi observada com fração 18-1 a 0,25% (conforme mostrado na Fig. 13A), enquanto 0,1% foi de alguma forma efetivo e 0,025% não teve efeito (Tabela 4). O efeito da fração 18-2 é mostrado na Fig. 13B. Tabela 4. Efeitos das frações 18-1 e 18-2 na diferenciação celular de ARPE- 19

Conclusão

[00299]Os resultados observados suportam a conclusão de que RPh-1, uma formulação de uma fração isolada de goma de mastique, tem atividade na indução da diferenciação de células neuronais.

[00300]Os resultados observados suportam a conclusão de que mirceno po- limérico, quer seja isolada de uma fonte vegetal ou quimicamente sintetizado, tem atividade na indução da diferenciação de células neuronais. Exemplo 8. O efeito de RPh-1 na indução de diferenciação celular é bloqueado pela fração solúvel em solvente polar na resina mastique. Visão Geral

[00301]A resina mastique e vários compostos identificados aqui foram associados com uma variedade de atividades biológicas benéficas e terapêuticas. Várias revelações anteriores da técnica indicam que a atividade biológica está associada com uma fração que é obtida pela extração de matique com um solvente polar, e recuperação de material solúvel em solvente polar. Em contraste, RPh-1 é uma fração que foi isolada da resina mastique por ser solúvel em ambos solventes polar e orgânicos e solventes orgânicos não polares, enquanto os compostos que são somente solúveis em solvente polar e orgânicos mas não em solventes orgânicos não polares são descartados (o último sendo aqui designado como Fração SP). Um componente principal em RPh-1 é o mirceno polimérico, conforme mostrado no Exemplo 2. Este composto, no entanto, não foi anteriormente atribuído com efeitos benéficos, mas tem sido reconhecido por interferir com a administração oral e bio- disponibilidade de compostos ativos presentes na resina mastique. Fração SP corresponde às frações mastique da técnica anterior que foi atribuída por ter várias atividades biológicas benéficas. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da SP no efeito da diferenciação celular exercida por RPh-1. Revela-se agora que os compostos presentes em SP interferem come bloqueiam os efeitos da diferenciação celular induzidos por RPh-1. Métodos

[00302]Resina mastique foi tratada para obter RPh-1, essencialmente conforme descrito no Método 1 do Exemplo 1, usando etanol como o solvente polar. A fração solúvel em etanol foi decantada do material insolúvel para obter a Fração SP. Misturas de RPh-1 e Fração SP em proporções diferentes foram preparadas como a seguir:

[00303]Adicionalmente, o mastique total dissolvido em óleo (aquecido a 60°C) foi preparado para obter preparação TC.

[00304]Os resultados do estudo, sumarizados na Tabela 5, indicam que as frações ricas em RPh-1 (A0 e A1) foram efetivas na indução de diferenciação de ARPE-19. As alterações morfológicas observadas nestas culturas foram semelhantes às mostradas nas Figuras 8B e 8C. Conforme aumentou a proporção de Fração SP nas misturas, aumentou a morte celular, sem diferenciação celular observada. As células em culturas tratadas com SP isolada morreram em todas as doses testadas, e a fração TC exerceu somente efeito desprezível.

[00305]Estes resultados mostram que atividades potentes de indução de neuro-diferenciação somente contribuíram pelos polímeros em RPh-1 enquanto a fração polar SP somente causou morte celular. Tabela 5. Efeitos das misturas de RPh-1 e SP na diferenciação celular

Exemplo 9. Cura de feridas em cães

[00306]Um cão macho de idade Golden Retriever tinha uma ferida aberta crônica na pata por mais de 6 meses. A lesão dérmica estava associada com alopecia (perda de pelo) e despigmentação do pelo ao redor. O cão foi tratado por vários ciclos de tratamento tópico com RPh-1. Após a aplicação inicial, um edema transitório com inchaço ocorreu por 16-20 h. Isto foi acompanhado por nova formação de tecido epitelial (epitelização) e neoangiogênese (nova formação de microvasculatu- ra) com contornos de tecido normal, resultando de formação rápida e vigorosa de tecido de granulação. A cicatrização de feridas contraídas para dentro na direção do centro da ferida sugeriu a presença de fibromiócitos (de origem mesodérmica).

[00307]A ferida foi completamente curada em aproximadamente 12 semanas com pele predominantemente funcional e novo crescimento de pelo. A Figura 14 mostra a área atingida antes (Fig. 14A) e após (Fig. 14B) o tratamento com RPh-1.

[00308]Em outro cão macho envelhecido afetado por alopecia, o tratamento tópico com RPh-1 resultou em novo crescimento do pelo para se tornar integrado com o pelo ao redor.

[00309]Um cão diferente teve um tumor na mandíbula (não induzido), cujas porções migraram para a cavidade bucal. As porções salientes foram retiradas cirurgicamente, enquanto as seções do tumor que estavam embutidas na mandíbula não puderam ser removidas. O tumor foi diagnosticado como um sarcoma. RPh-1 formulado em óleo de semente de uva foi aplicado à área da mandíbula afetada. O tratamento acarretou cura completa das gengivas que cobriram o local da incisão cirúrgica à extensão de que nenhuma cicatriz foi deixada e o local da incisão cirúrgica não foi discernível. Mesmo a recorrência esperada do tumor das partes embutidas na mandíbula foi prevenida por um intervalo estendido de várias semanas. O tratamento com RPh-1 induziu uma cura extraordinariamente rápida do local da incisão cirúrgica e regeneração completa do gengivas.

[00310]Em ambos os casos acima, a cura da ferida foi acompanhada por um aumento geral na vitalidade, consciência mental e atividade física nos cães tratados.

[00311]Os resultados acima suportam o uso do mirceno polimérico, o componente ativo de RPh-1, para cura de ferida, regeneração de folículos capilares e reversão de degeneração neurológica. Exemplo 10. Tratamento de feridas em peixe.

[00312]Peixes dourados bem como peixes koi (ambos da família da carpa) são propensos a úlceras de tegumento causadas por bactérias, em particular Aeu- romonas hidrophila.

[00313]Peixe dourado pesando aproximadamente 100 gramas cada, que desenvolveram ulcerações bacterianas foram divididos em dois grupos em tanques separados, cada grupo contendo quatro peixes. Cada tanque foi preenchido com um volume de 100 litros de água e mantida sob aeração com bomba de ar. Os grupos foram randomizados em peso e tamanho da ferida (na faixa de 1-1,5 cm por 1-1,5 cm). Cada peixe foi injetado via intramuscular por um tegumento intacto em um local aproximadamente 5 mm de uma úlcera com 20 microlitros de óleo de semente de uva isolado (grupo controle), ou uma solução 1% de RPh-1 em óleo de semente de uva (grupo de tratamento).

[00314]O peixe no grupo teste começou a melhorar progressivamente após 4 ciclos de tratamento com RPh-1 e foi curado em um período de um mês. Todos os peixes neste grupo sobreviveram ao longo dos seis meses da duração do estudo. Estes peixes também apresentaram comportamento alerta e responsivo incluindo nado ativo, buscando e arrebatando a comida fornecida na superfície da água e rá- pido movimento assustado de afastamento em resposta à percussão na parede do tanque.

[00315]Em contraste, peixe no grupo controle não apresentou melhora na condição de suas úlceras. Os peixes ficaram letárgicos, apresentaram comportamento sedentário no fundo do tanque e não responderam à estimulação. Todos os peixes deste grupo morreram próximo ao fim das seis semanas.

[00316]AS diferenças entre estes grupos foram altamente significativas em ambos os parâmetros: sobrevivência de peixe e fechamento da ferida. Exemplo 11. Efeito de RPh-1 na cura de ferida usando modelo de camundongo B6.V-Lepob/Olahsd

[00317]Camundongos B6.V-Lepob/OlaHsd (ob/ob) (expressando obesidade na idade de 4 semanas) foram usados para avaliar o efeito de RPh-1 na cura de feridas. Uma punção de pele de espessura total foi realizada usando um perfurador de biopsia descartável (Uni-Punch® Disposable Biopsy Punch, Premier) na zona distal de cada camundongo preto. A punção tem um formato de elipse. O comprimento médio do eixo longo variou entre 5,1 a 5,3 mm. O comprimento médio do eixo de largura variou entre 4,8 a 5,1 mm. RPh-1 (5%) em óleo de oliva foi injetado via subcutânea em dois locais ao redor da ferida em uma distância de 3-5 milímetros da borda da ferida (Grupo A, n=6) ou via tópica na ferida (Grupo B, n=6). O veículo foi aplicado via tópica sobre as feridas dos camundongos (Grupo C, n=6). Subsequentemente, RPh1 (5%) foi aplicado 3 vezes por semana, 7 vezes no total, durante os 16 dias do estudo em um volume de dose de 20ul (injeção) ou um volume de dose de 50 ul (administração tópica).

[00318]A Fig. 15 mostra que o dia 11 após a formação da ferida, o tamanho da ferida (área da ferida) foi significativamente reduzido em camundongos tratados com RPh-1 (Grupo A) quando comparado aqueles tratados com veículo isolado (p=0,005) (Grupo C). A taxa de cura de ferida durante o período do Dia 0 ao Dia 11 seguido à geração da ferida foi significativamente mais rápido em camundongos tratados com RPh-1 quando comparado aqueles tratados com veículo isolado (p0,034). Exemplo 12. Efeito de RPh-1 na reversão de efeitos neurodegenerativos de hipoperfusão cerebral crônica (demência vascular) em um modelo de rato.

[00319]Demência vascular (VD) é um subtipo de demência com uma prevalência que é a segunda somente após a doença de Alzheimer nas sociedades ocidentalizadas. VD causa muitos problemas neuropsiquiátricos e físicos, e representa um gasto econômico significativo. A imagem cerebral revelou alterações óbvias no córtex cerebral e matéria branca, e acredita-se que estas lesões sejam o centro patológico para os declínios cognitivos em pacientes com demência vascular (vide por exemplo, Farkas et al., Experimental cerebral hypoperfusion induces white matter injury and microglial activation in the rat brain. Acta Neuropathol. 2004;108:57-64; Stenset et al., White matter lesion subtypes and cognitive deficits in patients with memory impairment. Dement Geriatr Cogn Disord. 2008 26: 424-431).

[00320]As lesões cerebrais podem ser experimentalmente induzidas em cérebros de ratos por oclusão permanente de ambas as artérias carótidas que podem afetar a função cognitiva. Este modelo é semelhante à demência vascular e a técnica experimental pode diminuir o fluxo sanguíneo no córtex cerebral e o hipocampo em até 40-80% por várias semanas, induzindo certos transtornos de aprendizagem. Assim, este modelo foi usado para estudar os efeitos do tratamento de RPh-1 na reversão das deficiências causadas por lesões da demência vascular

[00321]Um total de 40 animais foi randomizado em 3 grupos, ou seja, um grupo controle simulado não tratado, um grupo controle veículo, e um grupo tratado com RPh-1 (10-15 animais por grupo). Foram randomizados em 3 grupos, um grupo controle simulado não tratado, um grupo controle veículo, e um grupo tratado com RPh-1. Dez μl de RPh-1 (5% em óleo de semente de algodão) ou veículo foram ad- ministrados subcutaneamente 2x/semana, com a primeira dose administrada 14 dias após a indução de demência vascular.

[00322]O teste do labirinto aquático de Morris (MWM) é sensível à função do hipocampo. A tarefa do labirinto aquático é realizada para avaliar os déficits de aprendizagem relacionados a CCA usando o método descrito anteriormente (Watanabe et al., Cilostazol Stroke. 2006;37(6):1539-1545). Em uma piscina circular de 160 cm de diâmetro preenchida com água a 20 cm de profundidade, uma plataforma acrílica transparente é preparada, a superfície superior da qual está 3 cm abaixo da água. Os ratos são liberados faceando a parede e o tempo que levam para escapar para a plataforma é registrado como a latência de fuga. Os testes são realizados no dia 3 antes da oclusão CCA e nos dias 14, 35, 56, 84 e 112 após a oclusão CCA. Nos dias de treinamento, os ensaios de treinamento são conduzidos por dia com um intervalo entre ensaios de 2 min. Os animais são colocados na piscina em uma das seis posições iniciais. Em cada ensaio de treinamento e o tempo e a duração da trajetória requerida para escapar para a plataforma escondida são registrados. Os resultados dos seis ensaios de treinamento são ponderados para obter um valor único representativo, e as médias são usadas para análises estatísticas finais. Os animais que encontraram a plataforma são mantidos na plataforma por 30 segundos. Os animais que não encontraram a plataforma dentro de 90 segundos são levemente guiados para a plataforma por 30 segundos ao final do ensaio.

[00323]O desempenho dos animais tratados com RPh-1 (barras hachura- das), animais tratados com veículo (barras abertas) e animais do controle simulado (barras pretas) foram testados para frequência na localização da plataforma (Fig. 16A); o tempo gasto na área de plataforma (Fig. 16B); a latência para encontrar a plataforma (Fig. 16C); a frequência na localização da zona 1 (Fig. 16D); o tempo gasto na parte leve (Fig. 16E); a latência para encontrar a plataforma (Fig. 16F); e a velocidade (Fig. 16G). Todos os testes mostraram desempenho significativamente maior nos animais tratados com RPh-1 conforme comparados a pelo menos um dos grupos controle. Exemplo 13. Efeito na regulação patológica de controle de peso de RPh-1 (Efeito orexigênico e anti-obesidade).

[00324]Os cães com várias feridas descritos no Exemplo 9 sofreram adicionalmente de perda de apetite e não podiam comer o alimento colocado a frente deles. Após aproximadamente 10 dias de tratamento com RPh-1 conforme descrito, os cães gradualmente ganharam novamente interesse pelo alimento e começaram a comer. Dentro de um mês, os cães mostraram interesse forte pelo alimento, e o apetite foi semelhante ao dos cães normais e saudáveis.

[00325]O peixe com ulcerações descrito no Exemplo 10 sofreu adicionalmente de perda de apetite. O grupo controle continuou a ignorar o alimento colocado na água, enquanto o peixe tratado com RPh-1 respondeu avidamente com movimento rápido na resposta à administração do alimento.

[00326]Os ratos descritos no Exemplo 12 adicionalmente sofreram perda de peso após hipoperfusão cerebral crônica. Após 35 dias de tratamento (dia 56 do estudo) os ratos tratados com RPh-1, conforme descrito, recuperaram seus pesos significativamente mais rápido do que os animais tratados com o veículo (Fig. 17A).

[00327]Os camundongos descritos no Exemplo 11 geralmente sobre de obesidade como resultado da mutação do gene leptina. A Figura 17B mostra que a administração subcutânea de RPh-1 aos camundongos (Grupo A; símbolos diamantes), causa um ganho de peso corporal significativamente menor comparado aos animais tratados com veículo (Grupo C; símbolos triângulo) ou animais tratados com administração tópica de RPh-1 (Grupo B; símbolos quadrados). Os camundongos do grupo A ganharam 4,9% durante os 11 dias. O ganho de peso corporal foi comparado ao peso corporal inicial (dia 0). O ganho de peso corporal do grupo A é significativamente inferior do que o ganho de peso corporal médio dos camundongos no gru- po B (valor de p = 0,02, TESTE T, Excel). Os Camundongos do grupo C foram semelhantes (p = 0,08) aos camundongos do grupo B e ganharam peso corporal significativamente diferente (valor p = 0,04) dos camundongos do grupo A. Os camundongos do grupo B e C ganharam 10,2% e 9,1% respectivamente. A taxa de ganho de peso corporal em todos os grupos, conforme expresso pelos declives foi semelhante (p= 0,07 (A vs. B), 0,08 (A vs. C) e 0,43 (B vs. C).

[00328]As observações acima suportam a conclusão de que RPh-1 é regulador do transtorno patológico de peso e pode servir como um orexígeno (estimulador do apetite) ou agente anti-obesidade. Exemplo 14. Efeito de RPh-1 no modelo de derrame em ratos por Oclusão Transitória da Arterial Média Cerebral (tMCAO).

[00329]Em um estudo para avaliar a capacidade de RPh-1 em prevenir ou reverter o déficit neurológico como resultado de isquemia utilizando um modelo de oclusão transitória de artéria média cerebral (tMCAO), RPh-1 (5% em óleo de semente de algodão) foi administrado via subcutânea em uma dose de 10ul e uma primeira administração foi realizada 3 h após o procedimento cirúrgico e em seguida duas vezes por semana até o término do estudo no dia 28. Durante o estudo as funções neurológicas, motora e somatosensorial foram testadas em uma bateria de testes comportamentais.

[00330]Ao longo do estudo, nenhuma diferença significativa nas condições gerais psicológicas, ganho de peso corporal ou sinais clínicos gerais entre os dois grupos foi observada.

[00331]Diferenças claras foram observadas entre o grupo tratado com RPh-1 e o grupo controle tratado com veículo na recuperação da função neurológica após o derrame durante 28 dias após o derrame. Em geral, recuperação acelerada e melhorada foi demonstrada em animais que foram tratados com RPh-1. As funções soma- tosensoriais foram mais sensíveis ao tratamento e uma resposta significativa foi de- monstrada precocemente cerca do dia 8 após o derrame (Figs. 18A e 18C). Avaliação de Neuro escore mostrou diferenças significativas que foram observadas somente nos ratos tratados com RPh-1 (Grupo A), entre o dia 8 e o dia 14, e entre o dia 8 e o dia 28 (Fig. 18A). A recuperação neurológica conforme avaliada pelo teste de remoção da trajetória foi significativa somente nos ratos tratados com RPh-1 (Grupo A) entre o dia 2 e os outros dias (Fig. 18C). A melhora da função motora, conforme avaliado pelo teste de pisada, foi significativo somente nos ratos tratados com RPh-1 (barras pretas), pelo dia 28 (Fig. 18B). Exemplo 15. Efeito de RPh-1 nas Células Ganglionares de Retina (RGC).

[00332]A axotomia do nervo óptico foi realizada no olho direito de ratos pro-fundamente anestesiados (19 ratos por grupo). O grupo teste recebeu uma injeção sub-dermal na área posterior do pescoço de RPh-1 (5% em óleo de semente de algodão); 0,025ml/injeção), e o grupo controle foi injetado de maneira semelhante com o mesmo volume de veículo. A primeira injeção foi administrada a todos os animais diretamente após a cirurgia. Injeções subsequentes (mesma dosagem e método de administração) foram administradas duas vezes por semana, a cada 3 a 4 dias.

[00333]Quatorze dias após a axotomia, um neurotraçador retrógrado fluorescente (Di-Asp) foi inserido no nervo óptico axotomizado para corar as células ganglionares de retina sobreviventes (RGC) e, 24 horas após, os ratos foram sacrificados em uma câmara saturada com CO2 e o olho direito ferido foi enucleado. As retinas foram isoladas, achatadas em uma lâmina e fixadas com meio de montagem à base de xileno.

[00334]As retinas montadas foram avaliadas com um microscópio de fluorescência. As células coradas foram contadas manualmente. O número médio de RGC por grupo é mostrado na Fig. 19, mostrando um número significativamente maior de células no grupo teste com RPh-1. Exemplo 16. Modelo de Deslocamento de Retina (RD).

[00335]O deslocamento de retina (RD) foi realizado no olho direito de animais profundamente anestesiados (xilazina 50mg/kg e cetamina 35mg/kg) após dilatação da pupila com gotas de Tropicamida 0,5%. RD foi induzido pela geração de uma pequena abertura na retina na ora serata seguida por uma injeção sub-retinal de 5μl de salina com uma agulha de seringa 30G. Aproximadamente metade da área da retina foi deslocada com este procedimento.

[00336]Os ratos com RD foram divididos em dois grupos experimentais, com o grupo teste recebendo uma injeção sub-dermal na área posterior do pescoço de RPh-1 (5% em óleo de semente de algodão; 0,025ml/injeção), e o grupo controle foi injetado de maneira semelhante com o mesmo volume de veículo. A primeira injeção foi administrada a todos os animais diretamente após a cirurgia. A segunda injeção (mesma dosagem e método de administração) foi administrada 48 após a cirurgia.

[00337]Nos dias 3 e 14 dias após RD, os ratos operados foram submetidos a eutanásia em uma câmara saturada com CO2. O olho direito ferido e o olho esquerdo não tratado foram enucleados. As retinas foram isoladas, congeladas em gelo seco e processadas para análise de Western blot ou análise imunohistoquímica. As retinas esquerdas deixadas serviram como controles não operados.

[00338]Os níveis de expressão de Semaphorin3A (Sema3A), Neuropilin1 (NP1), e GAP43 foram estudados, Caspase3 foi usada como um marcador de apop- tose, e alterações morfológicas em células de Müller e microgliais foram examinados.

[00339]Sema3A é um inibidor de crescimento de axônio que demonstrou estar envolvido na perda de células ganglionares de retina após o dano ao nervo óptico. Níveis altos de Sema3A foram detectados em retinas após RD conforme demonstrado pela análise de Western (Fig. 20A). O tratamento com RPh-1 diminuiu clareamento os níveis de expressão de Sema3A, ambos nas retinas não-feridas controle e aquelas com RD (Fig. 20A). As amostras foram normalizadas para expressão de beta-actina (banda inferior, Fig.20A).

[00340]A análise de imunohistoquímica de seções de retina de 20 μm incubadas com anticorpo anti-Sema3A e o corante Sytox Blue mostrou que a expressão de Sema3A foi claramente superior em retinas deslocadas quando comparadas com as de controle. A expressão de Sema3A foi observada principalmente ao redor das células ganglionares de retina. Semelhante aos resultados observados na análise de Western blot, a expressão de Sema3A foi reduzida nos animais com RD tratados com RPh-1.

[00341]NP1 é um receptor funcional de Sema3A. As células positivas para TUNEL, indicando processos apoptóticos, foram evidentes 24 horas após o deslocamento da retina e aumentou após 7 dias.

[00342]Caspase-3 foi ativada em resposta a RD. No entanto, a elevação de caspase-3 foi significativamente atenuada nos animais RD tratados com RPh-1 (Fig. 20B).

[00343]GAP43 é uma proteína intracelular que é justamente conectada à membrana dos cones de crescimento. É normalmente expressão durante o processo de sinaptogênese. Na retina, GAP43 é expressa nos neurônios no estágio inicial de embriogênese, enquanto o nervo óptico está ainda se alongando. No nervo óptico do rato, GAP43 é encontrado em ambos axônio e corpos celulares de RGCs, mas a expressão desaparece na idade de 8 a 16 semanas, e é encontrada novamente após isquemia ou dano do nervo óptico.

[00344]As alterações morfológicas nas células de Muller foram estudadas por coração de proteína ácida fibrilar glial (GFAP). GFAP marca as células de Muller na retina, e é comumente usado como um indicador de estresse. A marcação de GFAP nas retinas controle intactas foi concentrada em GCL. As análises imunohis- toquímicas mostraram níveis elevados de GFAP nas retinas deslocadas em comparação as de controle. As retinas deslocadas tratadas com RPh-1 mostraram níveis mais altos de GFAP.

[00345]A invasão e ativação microglial são considerados tão nocivos ou benéficos aos neurônios. A ativação microglial após o dano agudo ao SNC é primariamente uma resposta reativa e adaptativa da célula glial, que é disparada por neurônios danificados e que é designado para amenizar o dano tecidual primário e para promover o reparo e gliose subsequentes (cicatriz glial) como resultado. Microglia se torna ativa na retina geralmente após o dano estimular e recrutar células endoteliais e fibroblastos. Análise Imunohistoquímica de seções de retinas deslocadas e não- danificadas marcadas com IB4 e coradas com o corante nuclear PI mostraram evidência de células de microglia ativadas somente nas retinas deslocadas. No entanto, nas retinas deslocadas de animais tratados com RPh-1, menos ativação de microglial foi evidente quando comparado às retinas deslocadas de animais que foram tratados com o veículo.

[00346]Os resultados mostraram recrutamento reduzido de microglia ativa ao redor de uma região danificada e suporta um mecanismo de reparo de menos cicatrizes de feridas. Exemplo 17. Preparação de complexos de ciclodextrina com mirceno polimé- rico.

[00347]Ciclodextrinas, em virtude de suas capacidades de formar complexos de inclusão com muitas drogas, podem aumentar substancialmente a solubilidade aquosa de biofármacos, em particular aqueles que são definidos como insolúveis em água como mirceno polimérico. Ciclodextrinas são compostos solúveis em água, que podem formar complexos reversíveis como moléculas fracamente solúveis em água resultando em um complexo de inclusão molecular solúvel. Quando o complexo de inclusão da combinação de ciclodextrina droga é diluído em um volume suficientemente grande de água ou sangue, se dissocia rapidamente, liberando o agente far- maceuticamente ativo sequestrado.

[00348]A complexação de of mirceno polimérico com β-HPCD será formada conforme a seguir: a. Dissolução de mirceno polimérico pré-pesado em uma quantidade mínima de solvente não polar como hexano, heptano ou semelhantes. b. Adição, sob gotejamento, do solvente não polar ao pó de β-HPCD. c. Secar a 50-80°C até que os solventes não polares evaporem. d. Misturar com quantidade necessária de água. e. Dissolução com sonicação e aquecimento. f. Filtração por filtro de 0,2-0,45 μm. Exemplo 18. Preparação de nanoemulsões de mirceno polimérico.

[00349]Formulações nanoemulsão de óleo em água devem ser preparadas por técnicas de emulsificação em alta pressão de todos os ingredientes lipídicos e o componente ativo mirceno polimérico dissolvido na fase lipídica oleosa e emulsifica- da com uma fase aquosa, projetada para resultar na formação de nanogotas lipídi- cas estáveis e esféricas contendo a droga dispersa uniformemente. A redução do tamanho da gota da emulsão é essencial para gerar formulações da droga com alta estabilidade. Gotas de nanoemulsão têm um tamanho médio de gota de menos do que um mícron (geralmente na faixa de 0,1-0,2 μm) uniformemente dispersas na fase aquosa. A singularidade do grande núcleo oleoso hidrofóbico interno das gotas de nanoemulsão fornece uma alta capacidade de solubilização para compostos insolúveis em água como mircenos poliméricos. 1. Preparação da fase oleosa

[00350]A fase oleosa é composta de 13% lipídeo E-75, 0,026% αTP- succinato, propilparabeno como antioxidante e 86,9% Miglyol® 810. Mirceno polimé- rico preparado como no Exemplo 1 é dissolvido na fase oleosa. Os componentes são misturados com aquecimento brando até uma solução completamente homogênea e solubilizada é obtida. 2. Preparação da fase aquosa

[00351]A fase aquosa é composta de 0,1% EDTA, 0,5% Tween-80, 2,3% gli- cerol, metilparabeno como preservativo e 97,1% água, pH foi ajustado a 7,4 por Na- OH 1N. 3. Mistura das fases oleosa e aquosa

[00352]A fase oleosa (3,7g) é aquecida e adicionada a 70 ml de fase aquosa (pré-aquecida). A mistura é suavemente agitada por 10-15 min em temperatura ambiente. 4. Preparação de emulsão grossa óleo em água

[00353]Uma emulsão óleo em água é preparada usando a unidade distribuidora de tamanho médio e homogeneizador de alto cisalhamento Politron®, em 20.000 rpm por 5 min. 5. Dimensionamento da emulsão para a faixa de submícron por homogenei- zador de alta pressão Gaulin®

[00354]O tamanho da gotícula da emulsão obtida após a etapa 4 é reduzida à faixa de submícron (tamanho nano) ao submeter a emulsão a uma homogeneização de cisalhamento usando homogeneizador de alta pressão Gaulin® Microlab 70 em pressão de 800 bar. Um total de 5-6 ciclos poderia ser realizado para obter gotí- culas de nanoemulsão homogêneas apresentando tamanho médio de partícula de menos do que 200nm. O tamanho da partícula deve der determinado por espectros- copia de correlação de fóton (PCS) usando um analisador de tamanho de partícula N4MD (Coulter® Electronics, UK). Quando a maior parte das partículas (> 90%) é menor do que 200nm, o processo de dimensionamento é determinado como sendo completo. 6. Filtração estéril

[00355]Filtração em condições assépticas da nanoemulsão para frascos estéreis usando um filtro estéril 0,2 μm PES e armazenamento a 40°C. Exemplo 19. Preparação de pó de mirceno polimérico spray-dryed.

[00356]Um processo conveniente para produção de um produto mistura de lipídeo e mirceno polimérico é submeter a secagem por spray-drying da formulação a partir de uma mistura de dispersão em solvente não polar contendo todos os ingredientes lipídicos e água contendo os componentes hidrofílicos, levando em consideração a efetividade de custo e considerações de aumento de escala. O método selecionado de spray-drying é otimizado para se obter um pó fino de livre fluidez. Mirceno polimérico é dissolvido na fase lipídica contendo os ingredientes lipídicos lecitina, tricaprina (triglicerídeo de ácido cáprico), tocoferol succinato e aquecido (~40°C) em um solvente não polar até uma boa dispersão ser obtida. Uma dispersão de dióxido de silicone defumado (Cab-O-Sil®) em água (5%) foi preparada pela submersão do pó em água purificada. A mistura resultante (pré-aquecida a 40°C) é então lentamente vertida em dispersão lipídica em solvente não polar e a mistura é agitada a 40°C por cerca de 1 até que uma dispersão homogênea seja obtida. A mistura foi então submetida a spray-dried usando o spray-dryer Yamato Pulvis® GA32. As condições de spray-drying são: velocidade de fluxo 7ml/min, temperatura de entrada 130°C, temperatura de saída 70°C, e fluxo de ar de secagem 0,5 m3/min. Um pó seco homogêneo contendo a mistura lipídeo-mirceno polimérico é esperada de ser obtida.

[00357]A formulação de mistura mirceno polimérico-lipídeo preparada pelo processo direito de spray drying é esperado que apresente boa dispersibilidade em água, sendo assim apropriado para a preparação de formas de dosagem sólidas como cápsulas gelatinosas duras ou comprimidos para liberação oral aumentada de mirceno polimérico como bom potencial de biodisponibilidade oral. Exemplo 20. Preparação de preparações lipossomais contendo mirceno polimérico.

[00358]Os lipídeos contendo mircenos poliméricos foram dissolvidos em 100 ml de diclorometano em um frasco de fundo redondo, e agitados por 30 min em temperatura ambiente até obtenção de uma solução clara e transparente. O solvente foi evaporado usando uma unidade de evaporação rotatória a 39°C. Primeiro, o fras-co foi rotacionado a 4,5 rpm, 5 min sob pressão atmosférica, seguido por 10-30 min (até evaporação completa do solvente) sob vácuo fraco, e finalmente 15 min sob vácuo forte. Ao fim do processo de evaporação, um filme lipídico uniforme será criado. O filme lipídico será dissolvido em 15 ml de tampão isotônico. Os lipossomas são preparados por agitação vigorosa por 10-30 min usando um agitador de múltiplos frascos, até ser formada uma dispersão leitosa e uniforme de veículo multilamelar (MLV) e sem nenhum filme lipídico remanescente ficar aparente. Para obter uma preparação de lipossoma homogênea e equilibrada o frasco será ainda agitado a 37°C por 30-90 min. a 270 rpm. Exemplo 21. Preparação de microemulsões contendo mircenos poliméricos.

[00359]Vários surfactantes comumente usados em parenterais podem ser utilizados para desenvolver microemulsões água em óleo e óleo em água aceitáveis para uso injetável, oral e tópico. Os surfactantes farmaceuticamente aceitáveis apropriados para a formação de formulações de microemulsão são surfactantes não iôni- cos incluindo óleo de rícino polioxil 40 hidrogenado (vendido sob o nome comercial Cremophor RH40®), óleo de rícino polioxil 35 (vendido sob o nome comercial Cre- mophor® EL), ésteres de ácido graxo polioxietileno sorbitan (polisorbatos), poloxâ- meros (Pluronics®), vitamina E-TPGS 1.000 (VE-TPGS 1.000), éteres alquil de poli- oxietileno, Solutol® HS-15, Tagat® TO, Peglicol 6-oleato, estearatos de polioxietileno, ou glicerídeos saturados poliglicolisados, todos os quais estão disponíveis comercialmente. Os surfactantes preferenciais incluem óleo de rícinco polioxil 40 hidrogena- do (Cremophor® RH40®), óleo de rícino polioxil 35 hidrogenado (Cremophor® EL), ésteres de ácido graxo polioxietileno sorbitan (polisorbatos), poloxâmeros (Pluro- nics®), e vitamina E-TPGS 1.000. A quantidade total de surfactante presente na composição será geralmente de cerca de 100 a cerca de 700 mg/g, e preferencialmente de cerca de 300 a cerca de 500 mg/g.

[00360]A preparação de microemulsões contendo mirceno polimérico pode ser formada pela dissolução de mircenos poliméricos em uma quantidade apropriada de óleo como um triglicerídeo de cadeia média (Miglyol) em um frasco apropriado. O frasco é então tapado. O frasco é colocado em um banho de água de cerca de 5060°C e agitado suavemente até que todo o material de droga seja completamente dissolvido. Após o frasco ser resfriado até temperatura ambiente, uma quantidade apropriada de surfactante (como Cremophor® EL ou VE-TPGS) é adicionado e seguido pela mistura de mono e diglicerídeos de ácidos graxos, se algum. O frasco é então tapado e colocado em um banho de água de cerca de 50-60°C. O frasco é então suavemente agitado para obter uma solução clara e uniforme. Esta solução pode ser preenchida em cápsulas de HPMC e armazenada em temperatura ambiente antes de doseamento oral. Alternativamente, os pós de polímero substituídos (como HPMC) podem ser adicionados na solução com uma agitação adequada (ou seja, agitação) para obter uma suspensão uniforme de polímero. A composição resultante pode ser então preenchida em cápsulas gelatinosas duras ou mole e armazenada em temperatura ambiente antes do doseamento oral. De forma alternativa, a formulação de microemulsão pode ser usada topicamente ou ser filtrada por membranas de 0,2 μm para ser administrada via parenteral.

[00361]As microemulsões contendo mircenos poliméricos têm boas propriedades de dispersibilidade em água e auto-emulsificação quando diluídas em meio aquoso para formar pequenas micelas nanométricas que aumentarão a biodisponibi- lidade.

[00362]A descrição acima das modalidades específicas revelará completamente, portanto, a natureza geral da invenção que outros podem, pela aplicação do conhecimento atual, prontamente modificar e /ou adaptar para várias aplicações co mo modalidades específicas sem experimentação indevida e sem se afastar do conceito genérico e, portanto, tais adaptações e modificações devem ser entendidas como compreendidas dentro do significado e abrangência de equivalentes das modalidades reveladas. Deve ser entendo que a fraseologia ou terminologia aqui tem a intenção de descrever e não limitar. Os significados, materiais e etapas para conduzir várias funções reveladas pode tomar uma variedade de formas alternativas sem se afastar da invenção.

Claims

1. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que consiste em uma fração isolada de goma mastique obtida de Pistacia lentiscus L., em que a fração isolada compreende de 0,01 a 25% (p/p) de mirceno polimérico, com base no peso total da composição, que é solúvel em pelo menos um solvente orgânico polar e em pelo menos um solvente orgânico não polar, em que o mirceno polimérico é selecionado a partir do grupo que consiste em copolímeros de β-mirceno polimérico, α-mirceno polimérico, mirceno e combinações dos mesmos, em que o poli-β-mirceno é selecionado a partir do grupo que consiste em cis-1,4-poli-β-mirceno, trans-1,4-poli-β- mirceno, 3,4-poli-β-mirceno, 1,2-poli-β-mirceno e combinações dos mesmos, e a fração compreende de 0 a 1% (p/p) de compostos selecionados a partir de β-mirceno, α-mirceno, cis-α-ocimeno, di-hidromirceno, limoneno, α-pineno, β-pineno e combinações dos mesmos, que são solúveis no dito solvente orgânico polar, mas insolúveis no dito solvente orgânico não polar, em que a fração isolada é obtida por um processo compreendendo as etapas de: (a) tratar a goma mastique com um solvente orgânico polar; (b) isolar uma fração solúvel no dito solvente orgânico polar; (c) opcionalmente remover o dito solvente orgânico polar; (d) tratar a fração solúvel obtida na etapa (b) ou (c) com um solvente orgânico não polar, (e) isolar uma fração solúvel no dito solvente orgânico não polar; e (f) opcionalmente remover o dito solvente orgânico não polar; em que as etapas (d) a (f) podem preceder as etapas (a) a (c); em que o dito processo compreende ainda a etapa de fracionar por tamanho a fração obtida na etapa (c) ou na etapa (f), ou em que uma ou ambas as etapas (c) e (f) compreendem remover o solvente por um meio selecionado a partir do grupo que consiste em evaporação rotativa, aplicação de alto vácuo e uma combinação dos mesmos, ou em que o dito processo compreende ainda repetir as etapas (a) a (c) e/ou as etapas (d) a (f) por uma multiplicidade de ciclos; em que o solvente orgânico polar é um álcool selecionado a partir do grupo que consiste em metanol, etanol, propanol, isopropanol, 1-butanol, 2-butanol, secbutanol, t-butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, neopentanol, 3-metil-1- butanol, 2-metil-1-butanol, 3-metil-2-butanol, 2-metil-2-butanol, etilenoglicol, etileno- glicol monometil éter e misturas dos mesmos, em que o solvente orgânico não polar é um alcano selecionado a partir do grupo que consiste em pentanos, hexanos, heptanos, octanos, nonanos, decanos, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano e isômeros e misturas dos mesmos, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, em que o veículo é um veículo hidrofóbico que é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos um óleo, pelo menos uma cera e combinações dos mesmos, em que o pelo menos um óleo é selecionado a partir do grupo que consiste em óleo de semente de algodão, óleo de amêndoa, óleo de canola, óleo de coco, óleo de milho, óleo de semente de uva, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de soja e combinações dos mesmos.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a fração isolada de goma mastique está na faixa de 0,01 a 25% (p/p) com base no peso total da composição.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o veículo é um veículo hidrofóbico que é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos um óleo, pelo menos uma cera e combinações dos mesmos, em que o pelo menos um óleo é selecionado a partir do grupo que consiste em óleo de semente de algodão, óleo de amêndoa, óleo de canola, óleo de coco, óleo de milho, óleo de semente de uva, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de açafrão, óleo de gergelim, óleo de soja e combinações dos mesmos.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o veículo é óleo de semente de algodão.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o mirceno polimérico tem um peso molecular médio numérico de pelo menos 800, e em que o mirceno polimérico tem um grau de pureza de pelo menos 80%; ou em que o mirceno polimérico tem um peso molecular médio numérico de pelo menos 1.000; ou em que o mirceno polimérico tem um peso molecular médio numérico de pelo menos 1.000 e o mirceno polimérico tem um grau de pureza de pelo menos 90%; ou em que o mirceno polimérico é um produto de uma síntese química, ou é derivado de uma fonte vegetal; ou em que o mirceno polimérico tem um peso molecular médio numérico na faixa de 1.000 a 50.000.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o mirceno polimérico tem um grau de pureza de pelo menos 90% ou 95%; em que o mirceno polimérico tem um peso molecular médio numérico de pelo menos 5.000; ou em que o mirceno polimérico tem um peso molecular médio numérico de 5.000 a 20.000; ou em que o mirceno polimérico tem um peso molecular médio numérico em uma faixa selecionada a partir do grupo que consiste em: pelo menos 1.000 a 10.000; pelo menos 1.000 a 20.000; 5.000 a 10.000; 5.000 a 20.000; 10.000 a 15.000; 15.000 a 30.000; 25.000 a 40.000; 35.000 a 50.000; e sub-faixas dos mesmos.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que está em uma forma apropriada para administração cosmética ou dermatológica; ou está em uma forma apropriada para administração por uma via selecionada a partir do grupo que consiste em oral, tópica, parenteral, intramuscular, subcutânea, intradérmica, vaginal, retal, intracranial, intranasal, intraocular, auricular, pulmonar, intralesional, intraperitoneal, intra-arterial, intracerebral, intracerebroventricular, intra- óssea e intratecal; ou está em uma forma apropriada para administração por injeção; ou compreende pelo menos um de um complexo de inclusão, uma nanoemul- são, uma microemulsão, uma micropartícula lipídica e um dendrímero.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o complexo de inclusão compreende pelo menos uma ciclodextrina, ou em que a nanoemulsão compreende gotículas tendo tamanho de partícula médio menor que 800 nm, ou em que o lipossoma compreende uma vesícula multilamelar ou em que a microemulsão compreende pelo menos um surfactante não iônico, ou em que o surfactante nao iônico é selecionado a partir do grupo que consiste em um óleo de rícino polioxil, um éster de ácido graxo polioxietileno sorbitano (polisorbatos), um poloxâmero, um derivado de vitamina E, um polioxietileno alquil éter, esteratos de polioxietileno, um glicerídeo poliglicolisado saturado e combinações dos mesmos.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que está em uma forma selecionada a partir do gru- po que consiste em uma cápsula, um comprimido, um supositório, uma suspensão, uma pomada, um creme, uma loção, uma solução, uma emulsão, um filme, um cimento, um pó, uma cola, um aerossol e um spray.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o mirceno polimérico é um produto de uma síntese química, ou é derivado de uma fonte vegetal; em que o mirceno polimérico tem um peso molecular médio numérico de pelo menos 800 até 50.000, e em que o mirceno polimérico tem um grau de pureza de pelo menos 80%.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a fração compreende de 0 a 0,5% (p/p) de compostos que são solúveis no dito solvente orgânico polar, mas insolúveis no dito solvente orgânico não polar.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o solvente orgânico polar compreende metanol, etanol ou uma mistura dos mesmos, e o solvente orgânico não polar compreende hexano.