KR102604523B1 - 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법 - Google Patents
화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법에 관한 것으로서, 화살나무 귀전우와 에탄올을 교반하여 화살나무 귀전우의 주요 성분을 추출하는 추출단계; 추출단계에서 추출된 에탄올추출물을 여과하는 여과단계; 여과단계에서 여과물과 분리된 액상의 에탄올추출물을 건조하여 에탄올을 분리하는 진공건조단계; 진공건조단계에서 얻어진 건조물을 에탄올/헥산 혼합용매와 혼합하는 혼합단계; 혼합된 혼합물에서 클로로필 계열 화합물과 소수성 화합물이 있는 헥산추출물을 분리하여 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물을 얻는 분리단계; 마늘발효 원물을 농축, 건조한 후 그 건조물을 증류수에 용해, 여과하여 불용성 침전물이 제거된 마늘발효액을 얻는 마늘발효액 제조단계; 분리단계에서 얻어진 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 배합하는 배합단계; 를 포함한다.
본 발명에 따르면, 클로로 필 계열을 제거한 화살나무 귀전우의 추출물에 마늘발효액 또는 그의 분획물을 포함함으로써 노인성 인지기능 저하에 나타나는 아세틸콜린 에스터라제 활성, BDNF발현 감소, CREB 발현 감소, 산화질소 생성 감소 등의 다양한 증상을 효과적으로 개선시킬 수 있게 되어 기억력 감퇴 및 노인성 인지기능 저하 질환의 치료에 도움이 되는 건강식품의 개발에 널리 활용될 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따르면, 클로로 필 계열을 제거한 화살나무 귀전우의 추출물에 마늘발효액 또는 그의 분획물을 포함함으로써 노인성 인지기능 저하에 나타나는 아세틸콜린 에스터라제 활성, BDNF발현 감소, CREB 발현 감소, 산화질소 생성 감소 등의 다양한 증상을 효과적으로 개선시킬 수 있게 되어 기억력 감퇴 및 노인성 인지기능 저하 질환의 치료에 도움이 되는 건강식품의 개발에 널리 활용될 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 클로로필 계열을 제거한 귀전우 추출물에 마늘발효액 또는 그의 분획물을 포함함으로써, 기억력 감퇴 및 노인성 인지기능 저하를 개선시킬 수 있는 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법에 관한 것이다.
오늘날 건강과 삶의 질에 대한 관심이 높아지면서, 인지기능과 기억력은 청소년, 성인, 노인에 이르기까지 중요 관심의 대상이 되고 있으며, 최근에는 특히 ‘치매’에 대한 관심이 크게 높아지고 있다.
치매는 그 자체가 하나의 질환을 의미하는 것은 아니고, 여러 가지 원인에 의한 뇌 손상에 의해 기억력을 위시한 여러 인지기능의 장애가 생겨 예전 수준의 일상생활을 유지할 수 없는 상태를 의미하는 포괄적인 용어이다.
즉, 치매는 정상적으로 성숙한 뇌가 후천적인 외상이나 질병 등 외인에 의하여 손상 또는 파괴되어 전반적으로 지능, 학습, 언어 등의 인지기능과 고등 정신기능이 떨어지는 복합적인 증상을 말한다.
오늘날 치매는 심장병, 암, 뇌졸중에 이어 4대 주요 사인으로 불릴 정도로 중요한 신경 질환 중 하나인데, 주로 노년기로 갈수록 유병률과 발생률이 증가하는데, 의료기술의 발전으로 인한 평균수명의 증가로 인해 본격적인 고령화 사회로 접어들면서 치매 유병률과 발생률이 급속도로 증가하고 있다.
이러한 치매는 기억력 감퇴와 인지기능 저하로 인해 환자 본인뿐만 아니라, 환자의 보호자나 주변인 등의 삶의 질을 크게 저하시키기 때문에 이제는 환자 개인의 단순 질병의 차원을 넘어 국가적으로도 치매 예방, 조기 발견 및 조기 치료에 대한 대비가 이루어져야 한다는 인식의 전환이 이루어지고 있다.
한편, ‘인지기능’이란 사물을 분별하여 인지할 수 있는 능력으로 인지기능을 유지하는 것은 기억력이나 집중력을 저하시킬 수 있는 여러 요인을 조절함으로써, 정상적인 뇌의 기능을 유지하는 것이다.
인체의 대뇌의 겉 부분은 깊은 주름으로 되어 있는데 여기에는 많은 신경세포가 있다. 신경세포는 연락망을 만들어 서로 신호를 보내, 순식간에 여러 가지를 판단하고 느낄 수 있게 할 뿐만 아니라 두뇌 활동에 필요한 에너지를 만들어 내기도 한다.
일반적으로 사람의 뇌세포는 30세를 넘으면 감퇴하기 시작하는데, 지속적인 스트레스와 긴장은 뇌세포의 피로를 촉진시켜 일의 능률을 떨어뜨리고 우울, 초조 등의 심리적인 요인도 지각력을 떨어뜨릴 수 있다.
특히, 신체적인 피로와 수면 부족, 약물 및 정신자극제, 지나친 알코올 섭취 역시 인지기능의 감소를 촉진할 수 있으며, 치매 등으로 뇌가 위축되고 뇌신경세포의 파괴가 이루어져 기억력 장애 등이 올 수 있다.
또한, 뇌세포를 손상시키는 물질도 있는데, 에너지를 만드는 과정에서 생긴 활성산소뿐만 아니라 베타아밀로우즈라는 독성물질 역시 뇌세포를 공격할 수 있다.
따라서, 이러한 여러 유해물질을 조절하면, 뇌세포가 손상받지 않도록 보호하는 데 도움을 줄 수 있다.
한편, 기억력은 대뇌의 피질 특히 해마와 관련이 많은데, 해마에서 신경전달물질이 필요한 양만큼 존재해야 뇌세포 간에 신호가 원활히 이루어지며, 인지기능이 저하된 상태에서는 신경전달물질의 활동이 적어진다.
따라서, 신경전달물질을 조절하여 저하된 인지기능을 개선하는 데 도움을 줄 수 있다.
또한, 뇌세포는 다른 세포에 비해 특히 많은 인지질(포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 등)을 포함하고 있는데, 이는 세포를 보호하는 막을 구성하여, 뇌세포가 그 기능을 원활히 수행할 수 있도록 도와준다.
따라서 인지질을 포함하여 뇌세포의 주요 구성성분을 공급해 주고, 뇌기능에 필요한 효소나 신경전달물질 등의 원료를 공급해 줌으로써 뇌기능 유지에 도움을 줄 수 있는 것이다.
한편, 인지기능 저하는 콜린성 신경세포 퇴화에 의한 아세틸콜린(acetylcholine)의 부족이 중요한 원인 중 하나이며, 이러한 현상은 기억 중추와 밀접한 관련이 있는 것으로 판단되는 대뇌변연계 내 아세틸콜린 분해효소인 아세틸콜린 에스터라제(AChE : acetylcholinesterase)의 증가로 더욱 심화된다
따라서, 현재는 AChE의 증가를 억제하는 Tacrine, Don epezil, Rivastigmine, Galatamine 등이 인지기능 저하를 동반하는 노인성 질환의 치료제로 사용되고 있다.
그러나 종래의 AChE 억제제의 경우에는 신경세포 사멸을 직접 억제하는 것이 아니라 아세틸콜린의 양을 일시적으로 높이는 방법이므로 초기에만 효과가 나타난다는 단점이 있다.
이외에도 인지기능 저하를 동반하는 노인성 질환의 치료제로 NMDA glutamate 수용체 억제제인 Memantine'과 AMPA-glutamate 수용체 자극제, 그리고 somatostatin의 분비를 촉진 시키는 약물 등이 있으나 간독성과 오심, 구토 등의 부작용이 심각하여 만족할 만한 치료 효과는 얻지 못하고 있는 실정이다.
상술한 바와 같은 종래의 단점을 해결하기 위하여 본 발명은 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우의 추출물에 마늘발효액 또는 그의 분획물을 포함함으로써 기억력 감퇴 및 노인성 인지기능 저하를 개선시킬 수 있게 한 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 바와 같은 목적의 달성을 위하여 본 발명의 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법은,
화살나무 귀전우와 에탄올을 교반하여 화살나무 귀전우의 주요 성분을 추출하는 추출단계;
상기 추출단계에서 추출된 에탄올추출물을 여과하는 여과단계;
상기 여과단계에서 여과물과 분리된 액상의 에탄올추출물을 건조하여 에탄올을 분리하는 진공건조단계;
상기 진공건조단계에서 얻어진 건조물을 에탄올/헥산 혼합용매와 혼합하는 혼합단계;
상기 혼합된 혼합물에서 클로로필 계열 화합물과 소수성 화합물이 있는 헥산추출물을 분리하여 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물을 얻는 분리단계;
마늘발효 원물을 농축, 건조한 후 그 건조물을 증류수에 용해, 여과하여 불용성 침전물이 제거된 마늘발효액을 얻는 마늘발효액 제조단계;
상기 분리단계에서 얻어진 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 배합하는 배합단계; 를 포함한다.
일 실시 예에서 상기 추출단계는,
실온에서 1 내지 2일 간 건조한 화살나무 귀전우 100g과, 70% 에탄올 1,000㎖를 교반기에 투입하여 20 내지 80℃에서 3 내지 4 시간 동안 교반하는 것을 특징으로 한다.
일 실시 예에서 상기 진공건조단계는, 여과단계에서 여과물과 분리된 액상의 에탄올추출물을 진공 상태에서 30 내지 40℃ 온도로 3 내지 4 시간 건조하여 에탄올이 분리된 건조물을 얻는 것을 특징으로 한다.
일 실시 예에서 상기 마늘발효액 제조단계는,
마늘발효 원물을 대형농축기를 이용하여 농축하는 농축단계;
상기 농축단계에서 농축된 농축물을 동결건조기를 이용해 건조하여 건조물을 조제하는 동결건조단계;
상기 동결건조단계에서 건조된 건조물을 멸균된 증류수에 용해하는 용해단계;
상기 용해단계에서 용해된 용해물을 여과하여 용해물에 함유된 불용성 침전물을 제거하는 제거단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 실시 예에서 상기 농축단계는, 마늘발효 원물을 4 내지 5 Brix로 농축하는 것을 특징으로 한다.
상기 배합단계는, 분리단계에서 얻어진 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 부피기준 1:1 내지 1:2 비율로 배합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우의 추출물에 마늘발효액 또는 그의 분획물을 포함함으로써 노인성 인지기능 저하에 나타나는 아세틸콜린 에스터라제 활성, BDNF발현 감소, CREB 발현 감소, 산화질소 생성 감소 등의 다양한 증상을 효과적으로 개선시킬 수 있게 되어 기억력 감퇴 및 노인성 인지기능 저하 질환의 치료에 도움이 되는 건강기능식품의 개발에 널리 활용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 70% 에탄올을 이용하여 추출한 후 헥산용매를 이용하여 클로로필 계열을 제거한 귀전우 추출물을 얻는 공정도.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 마늘발효 원물에서 마늘발효액을 얻는 공정도.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 마늘발효액과 BALB/c 유래 복강 마크로파지를 이용한 면역활성 측정 결과 그래프.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 마늘발효액과 RAW 264.7 세포주를 이용한 면역활성 측정 결과 그래프.
도 5는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 화살나무 추출물을 이용한 인지기능 저하 억제 효능 확인 단백질 발현실험 결과 그래프.
도 6은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물 또는 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 저하 억제 효능 확인 동물실험 결과 그래프.
도 7은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 아세틸콜린 에스터라제 활성 저해 효능 측정 결과 그래프.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 마늘발효 원물에서 마늘발효액을 얻는 공정도.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 마늘발효액과 BALB/c 유래 복강 마크로파지를 이용한 면역활성 측정 결과 그래프.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 마늘발효액과 RAW 264.7 세포주를 이용한 면역활성 측정 결과 그래프.
도 5는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 화살나무 추출물을 이용한 인지기능 저하 억제 효능 확인 단백질 발현실험 결과 그래프.
도 6은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물 또는 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 저하 억제 효능 확인 동물실험 결과 그래프.
도 7은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 아세틸콜린 에스터라제 활성 저해 효능 측정 결과 그래프.
아래에서는 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시 예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다.
본 발명에 관한 설명은 구조적이나 기능적 설명을 위한 실시 예에 불과하므로, 본 발명의 권리범위는 본문에 설명된 실시 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
즉, 실시 예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 본 발명의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 발명에서 제시된 목적 또는 효과는 특정 실시예가 이를 전부 포함하여야 한다거나 그러한 효과만을 포함하여야 한다는 의미는 아니므로, 본 발명의 권리범위는 이에 의하여 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 될 것이다.
본 발명에 관한 설명에서 사용되는 모든 용어는 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다.
일반적으로 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석될 수 없다.
또한, "제1", "제2" 등의 용어는 서로 다른 구성 요소임을 구분하기 위해서 지칭할 것일 뿐, 제조된 순서에 구애받지 않는 것이며, 이들 용어에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 70% 에탄올을 이용하여 추출한 후 헥산용매를 이용하여 클로로필 계열을 제거한 귀전우 추출물을 얻는 공정도이고, 도 2는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 마늘발효 원물에서 마늘발효액을 얻는 공정도이며, 도 3은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 마늘발효액(garlic mf)과 BALB/c 유래 복강 마크로파지를 이용한 면역활성 측정 결과 그래프이고, 도 4는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 마늘발효액(garlic mf)과 RAW 264.7 세포주를 이용한 면역활성 측정 결과 그래프이며, 도 5는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 화살나무 추출물을 이용한 인지기능 저하 억제 효능 확인 단백질 발현실험 결과 그래프이고, 도 6은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물(EAE twig esp) 또는 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 저하 억제 효능 확인 동물실험 결과 그래프이며, 도 7은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물(twig esp)과 마늘발효액을 이용한 아세틸콜린 에스터라제 활성 저해 효능 측정 결과 그래프이다.
도 1 내지 도 7을 참조하여 설명한다.
본 발명의 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법은 추출단계, 여과단계, 진공건조단계, 혼합단계, 분리단계, 마늘발효액 제조단계, 배합단계; 를 포함한다.
상기 추출단계는 화살나무 귀전우와 에탄올을 교반하여 화살나무 귀전우의 주요 성분을 추출한다.
이때, 화살나무 귀전우는 실온에서 1 내지 2일 간 건조한 것을 사용하고, 에탄올은 70% 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 추출단계에서는 화살나무 귀전우 100g과, 에탄올 1,000㎖를 교반기에 투입하여 20 내지 80℃에서 3 내지 4 시간 동안 교반함으로써 화살나무 귀전우의 주요 성분이 추출된다.
상기 화살나무(Euonymus alatus)는 우리나라 전역의 산기슭과 산중턱의 암석지에서 자라는 낙엽떨기나무로서 높이 1~3m로 자라며 겉에 2~4줄의 화살나무 귀전우가 있다.
화살나무 귀전우(Euonymus alatus Twig)란, 코르크로 길이는 약 4cm 내외이고, 너비는 4∼10mm이다.
생김새는 납작하고 얇은 조각으로 고르지 않으며, 양쪽 가장자리의 두께는 같지 않으며, 가지에 붙어 있는 가장자리의 두께는 2mm에 이르고 밖으로 갈수록 점점 얇아져 칼날같은 날개 모양이다.
바깥면은 연한 회갈색이며 가지에서 떨어진 면은 색이 비교적 연하고 광택이 약간 나며 가늘고 빽빽한 세로무늬가 있으며, 가볍고 꺾어지기 쉬우며, 꺾인 면은 고르지 않고 회갈색이고, 냄새가 없고 맛은 담담하다.
민간에서 예로부터 암 치료용으로 사용하기도 하였으며, 도가에서는 신병, 놀라서 생긴 병, 상기증 등에 사용해왔고, 고약으로 만들어 피부병 치료에 쓰거나, 가시를 빼는 약으로 사용하기도 하였다.
화살나무 귀전우의 알려진 약리작용으로는 심박동이상 진정작용, 혈압강하작용, 혈당강하작용, 관상동맥혈류량 증가, 장관수축작용 등이 알려져 있다.
상기 여과단계는 추출단계에서 추출된 에탄올추출물을 여과한다.
이때, 에탄올추출물의 여과는 필터 멤브레인을 이용한 감압여과 방식을 적용하는 것이 바람직할 것이나 이에 한정하는 것은 아님을 미리 밝혀둔다.
상기 진공건조단계는 여과단계에서 여과물과 분리된 액상의 에탄올추출물을 진공 상태에서 30 내지 40℃ 온도로 3 내지 4 시간 건조하여 에탄올을 분리시킴으로써 추출물 성상문제(고점도, 색, 변성, 저장안정성 등)를 해결한 건조물을 얻을 수 있게 된다.
상기 혼합단계는 진공건조단계를 통해 얻어진 건조물을 에탄올/헥산 혼합용매와 혼합하고, 분리단계를 통해 혼합물에서 클로로필 계열 화합물과 지방 등 소수성 화합물이 있는 헥산추출물을 분리함으로써 클로로필 계열이 제거된 최종의 에탄올추출물을 얻을 수 있게 된다.
혼합단계에서 헥산 용매와 혼합되는 에탄올은 70% 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 분리단계는 혼합된 혼합물에서 클로로필 계열 화합물과 지방 등 소수성 화합물이 있는 헥산추출물을 분리함으로써 클로로필 계열이 제거된 최종의 에탄올추출물을 얻는다.
즉, 클로로필 계열과 헥산은 소수성이고, 에탄올은 친수성이므로 진공건조단계에서 얻어진 건조물과 에탄올/헥산 혼합용매가 혼합된 혼합물을 상온에서 정적상태로 유지하면, 상분리가 일어나면서 아래층은 에탄올층, 위층은 헥산층으로 분리된다.
따라서, 층분리된 헥산층과 에탄올층을 따로 회수함으로써 클로로필 계열이 제거된 최종의 에탄올추출물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 클로로필 계열 화합물을 제거함으로써 카데킨, 아로마덴드린, 나린제닌 등과 같은 후라보노이드 생리활성 물질의 손쉬운 분리가 가능케 된다.
상기 마늘발효액 제조단계는 농축단계, 동결건조단계, 용해단계, 제거단계를 포함한다.
상기 농축단계는 마늘발효 원물을 대형농축기를 이용하여 4 내지 5 Brix로 농축한다.
상기 마늘발효 원물은 마늘을 180일 동안 네 번 발효시킨 프리미엄 조성물로 비가열 천연으로 발효해 영양 성분을 약 600% 증폭시키고 이 과정에서 이로운 2차 합성물질로 산화질소와 NK세포 등을 생성한다.
또한, 마늘발효액은 고초균(枯草菌, 자연계에 널리 퍼져 있으나 병을 일으키지 않는 세균)을 함유하고 있다. 고초균은 청국장에 들어 있는 유익균으로 볏짚에 붙어 있는 미생물로서 장을 자극하고 소화를 도우며 혈전 분해 효소를 만들어, 혈액순환, 면역력 강화, 장운동 강화 등을 기대할 수 있다.
마늘의 대표성분인 ‘알리신(Allicin)’은 독특한 냄새를 내는 물질이지만 항암 효과, 피로 해소, 면역력 강화, 당뇨병 개선, 소화 개선 등에 효과가 있다고 알려져 있으며, 혈전 생성을 막아 심근경색, 뇌경색 등 심혈관질환에 도움을 주며, 혈소판 응집 현상을 막아 혈액순환을 돕는다.
상기 동결건조단계는 농축단계에서 농축된 농축물을 동결건조기를 이용해 건조하여 건조물을 조제한다.
상기 용해단계는 동결건조단계에서 건조된 건조물을 멸균된 증류수에 10 내지 15 mg/mL의 농도로 용해한다.
상기 제거단계는 용해단계에서 용해된 용해물을 0.45μm pore size의 시린지 필터(syringe filter)를 사용해 불용성 침전물을 제거하여 마늘발효액을 얻는다.
상기 배합단계는, 분리단계에서 얻어진 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물, 즉 클로로필 계열이 제거된 화살나무 귀전우 추출물과, 마늘발효액을 배합한다.
클로로필 계열이 제거된 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액의 배합비율은 부피기준 1:1 내지 1:2로 배합하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명에 의해 제조된 마늘발효액의 면역활성 및 클로로필 계열이 제거된 화살나무 추출물의 기억력 감퇴 및 인지기능 저하 개선 효과를 확인할 수 있는 다양한 실험결과를 설명하면 다음과 같다.
<실험예 1> 마늘발효액(garlic mf)과 BALB/c 유래 복강 마크로파지를 이용한 면역활성 측정 (도 3 참조)
BALB/c 마우스 복강으로부터 마크로파지를 분리하기 위하여 마우스 복강에 5% 티오글리콜레이트 미디엄(thioglycollate medium)을 1mL 주입하고 96시간 경과된 후에 유도된 복강 마크로파지를 회수하여 실험에 이용하였다.
복강으로부터 분리된 마크로파지는 100 U/mL의 페니실린(penicillin), 100μL/mL의 스트렙토마이신(streptomycin), 1.25μL/mL 암포테리신 B(fungizone-amphothericin B) 및 10% 소테아혈청(fetal bovine serum(FBS))를 함유한 RPMI 1640 medium(10% FBS/RPMI)으로 세척하고 1×10**6 cells/mL로 분산시킨 후 96-well plate(SPL Life Science Co. Ltd., Pocheon, Korea)에 200μL씩 분주하여 마크로파지 monolayer를 형성시켰다.
2시간 후 상등액을 제거하고 non-adherent cell을 RPMI 1640 medium으로 3회 세척한 후 10% FBS-RPMI 180μL와 시료 20μL를 분주하여 배양하면서 마크로파지를 자극하였다.
24시간 후 상등액을 제거하고 남은 10% Ez-cytox/PBS 용액 100μL를 가하여 변화된 크로모젠(chromogen)을 450nm에서 흡광도 측정기(ELISA reader)로 흡광도를 측정하여 용매인 증류수가 첨가된 대조군에 대한 상대활성(%)으로 나타내었다.
실험결과, 마늘발효액을 고농도로 사용할수록 마크로파지 활성이 높아짐을 확인하였다.
<실험예 2> 마늘발효액(garlic mf)과 RAW 264.7 세포주를 이용한 면역활성 측정 (도 4 참조)
Murine macrophage cell line인 RAW 274.7 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아 실험에 이용하였다
세포에 대한 시료의 독성 여부를 평가하기 위해 세포는 2×10**6/well로 96-well plate에 plating하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 12시간 배양하여 세포를 안정화시켰다.
이후 배양배지는 모두 제거하고 새로운 배지 180μL와 적당히 희석된 시료 20μL를 자극한 뒤 24시간 동안 재배양하였다.
이후 배양배지는 모두 제거한 뒤, PBS에 10%의 농도로 용해된 EZ-cytox(Daeil Labservice) 용액 100μL를 첨가해 450nm에서 흡광도를 측정하여 시료에 대한 생존율을 증류수 대조군에 대한 상대 생존율(%)로 나타내었다.
Nitric oxide (산화질소; NO)의 함량은 Griess법으로 측정하였다.
실험결과, RAW 264.7 세포가 분비하는 면역활성 물질인 산화질소(nitric oxide; NO)의 생성량을 비교한 결과, 시료는 대체로 농도-의존적인 생성량을 보여주었다.
특히, 마늘발효액 시료는 고농도에서 양성 대조군으로 사용된 LPS에 비해서도 우수하게 증진된 면역활성을 나타냈다.
<실험예 3> 화살나무 추출물을 이용한 인지기능 저하 억제 효능 확인 단백질 발현실험 (도 5 참조)
단백질 발현은 웨스턴 블랏(western blot) 실험으로 진행하였다.
실험결과, 인지기능저해제 스코폴아민(Scop) 처리시 BDNF, p-CREB, pERK (바이오마커)등 발현이 많이 줄어드는 것을 확인하였다.
또한, 양성대조군 도네페질(Done) 처리 시 이러한 단백질이 정상 회복됨을 확인하였다.
또한, 화살나무 귀전우 추출물(EAE twig), 또는 전체 화살나무 추출물(EAE WP)을 이용한 인지기능 저하 억제 효능 확인 동물실험에서 주요 단백질 발현이 도네페질 처리 수준으로 발현되는 것을 확인하였다.
<실험예 4> 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물(EAE twig esp) 또는 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 저하 억제 효능 확인 동물실험 (도 6 참조)
(a) 체중 변화 측정
인지기능저해제 스코폴아민(scopolamine) 2mg을 세포배양액에 넣어서 약물 처리하였다.
실험용 마우스의 체중을 기준으로 2mg/kg에 맞추어 복강에 주사하였다.
각 실험용 마우스에 클로로필 계열이 제거된 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액 혼합물 및 각 대조군을 경구투여하였다.
실험결과, 클로로필 계열이 제거된 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액 혼합물 및 각 대조군을 경구투여한 실험용 마우스에서 특이한 체중 변화는 나타나지 않았다.
(b) 수동회피시험(multiple-trial passive avoidance test)
수동회피시험은 설치류의 working memory ability를 측정하는 방법으로 수많은 연구자가 학습 및 기억력 측정을 위하여 널리 이용되고 있는 실험으로서 본 실험에서는 LeDoux의 방법을 응용하여 시행하였다.
수동회피 시험의 원리는 설치류가 어두운 곳을 선호하는 성향을 이용하여 기억력을 측정하는 실험방법이다.
시험물질의 기억력 손상 예방 효과를 알아보기 위하여 scopolamine 투여 30분 후 수동회피시험을 실시하였다.
측정기기는 내부가 두 개의 방으로 구성된 아크릴 상자(shuttle box, 53cm WX44 cm HX33 cm D)의 가운데에 guillotine door가 있으며 바닥(grid floor) 전체에 전기쇼크(scrambled foot-shock)를 가할 수 있는 장치가 되어 있다.
좌측 방은 전구가 켜져서 밝은 환경을 조성하고, 우측 방은 어두운 환경이지만 동물이 이동했을 경우 센서가 작동하여 전기자극(0.3 mA, 5sec)을 주었다.
동물을 좌측 방에 넣으면 전구가 켜지면서 30초 동안은 빛과 아크릴로 된 방에서 순화를 시킨다.
30초 후에 guillotine door가 열리면서 밝은 방에 머무는 시간이 측정되며 동물이 우측 방으로 네 발이 다 들어가면 문이 닫히고 0.3mA, 5초 조건의 전기자극을 줘서 회피할 수 있게 인식시켰다(학습시험: training trial).
위와 같은 방법으로 동물이 우측 방으로 120초 동안 이동하지 않을 때까지 반복하였다.
1차 측정 24시간 후 문이 열려도 밝은 방에 머무는 시간, 즉 쇼크실 도달시간(step-through latency time: 머무름 시 간)을 최대 300초(cut-off time)까지 측정하였다.
실험결과, 마늘발효액 50ug/ml와, 클로로필 계열이 제거된 화살나무 귀전우 50ug/ml를 혼합 처리하면 마늘발효액 100ug/ml를 단독 처리한 실험군보다 바이와마커 단백질이 정상 회복됨을 확인하였다.
그러나 클로로필 계열이 제거된 화살나무 귀전우 100ug/ml를 처리 했을 때 가장 좋은 결과를 얻었으나, 클로로필 계열이 제거된 화살나무 귀전우 50ug/ml와 마늘발효액 50ug/ml로 낮은 양을 처리해도 유사한 수준의 바이오마커 단백질의 회복을 볼 수 있음을 확인하였다.
<실험예 5> 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물(twig esp)과 마늘발효액을 이용한 아세틸콜린 에스터라제 활성 저해 효능 측정 (도 7 참조)
아세틸콜린 에스터라제는 신경전달물질은 아세틸콜린을 분해하여 인지기능 저하를 초래하므로 인지기능 저하를 방지하기 위해서는 아세틸콜린 에스터라제의 활성 억제가 중요하다. 도네페질, 후라보이드 혼합물 등은 낮은 활성을 보여 인지기능개선 효과가 있으나, 클로로필 계열이 제거된 귀전우와 마늘발효액 총 50ug/ml을 처리하면 에스터라제 활성이 높으나, 클로로필 계열이 제거된 귀전우와 마늘발효액 총 100ug/ml을 처리하면 에스터라제 활성이 대폭 줄어드는 것을 확인하였다.
따라서 클로로필 계열이 제거된 귀전우와 마늘발효액 혼합물의 인지기능개선 효과의 높음을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 실시 예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (5)
- 화살나무 귀전우와 에탄올을 교반하여 화살나무 귀전우의 주요 성분을 추출하는 추출단계;
상기 추출단계에서 추출된 에탄올추출물을 여과하는 여과단계;
상기 여과단계에서 여과물과 분리된 액상의 에탄올추출물을 건조하여 에탄올을 분리하는 진공건조단계;
상기 진공건조단계에서 얻어진 건조물을 에탄올/헥산 혼합용매와 혼합하는 혼합단계;
상기 혼합된 혼합물에서 클로로필 계열 화합물과 소수성 화합물이 있는 헥산추출물을 분리하여 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물을 얻는 분리단계;
마늘발효 원물을 농축, 건조한 후 그 건조물을 증류수에 용해, 여과하여 불용성 침전물이 제거된 마늘발효액을 얻는 마늘발효액 제조단계;
상기 분리단계에서 얻어진 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 배합하는 배합단계; 를 포함하고
상기 마늘발효액 제조단계는,
마늘발효 원물을 대형농축기를 이용하여 농축하는 농축단계;
상기 농축단계에서 농축된 농축물을 동결건조기를 이용해 건조하여 건조물을 조제하는 동결건조단계;
상기 동결건조단계에서 건조된 건조물을 멸균된 증류수에 용해하는 용해단계;
상기 용해단계에서 용해된 용해물을 여과하여 용해물에 함유된 불용성 침전물을 제거하는 제거단계; 를 포함하며,
상기 배합단계는,
분리단계에서 얻어진 클로로필 계열을 제거한 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 부피기준 1:1 내지 1:2 비율로 배합하는 것을 특징으로 하는 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서 상기 추출단계는,
실온에서 1 내지 2일 간 건조한 화살나무 귀전우 100g과, 70% 에탄올 1,000㎖를 교반기에 투입하여 20 내지 80℃에서 3 내지 4 시간 동안 교반하는 것을 특징으로 하는 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법.
- 제1항에 있어서 상기 진공건조단계는,
여과단계에서 여과물과 분리된 액상의 에탄올추출물을 진공 상태에서 30 내지 40℃ 온도로 3 내지 4 시간 건조하여 에탄올이 분리된 건조물을 얻는 것을 특징으로 하는 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220060832A KR102604523B1 (ko) | 2022-05-18 | 2022-05-18 | 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220060832A KR102604523B1 (ko) | 2022-05-18 | 2022-05-18 | 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102604523B1 true KR102604523B1 (ko) | 2023-11-23 |
Family
ID=88974453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220060832A KR102604523B1 (ko) | 2022-05-18 | 2022-05-18 | 화살나무 귀전우 추출물과 마늘발효액을 이용한 인지기능 개선 건강기능식품 조성물 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102604523B1 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130039309A (ko) * | 2011-10-11 | 2013-04-19 | 김선미 | 마늘과 난황의 복합 활성물질를 건강개선 기능성 약효제로 포함하는 식품조성물과 그 제조방법. |
| KR20180094208A (ko) | 2017-02-14 | 2018-08-23 | 동의초석잠영농조합법인 | 인지기능개선 효능을 가진 초석잠 발효대사체 제조방법 |
| KR102367058B1 (ko) * | 2021-09-08 | 2022-02-28 | 동성제약주식회사 | 기억력 감퇴 및 인지기능 저하를 개선시킬 수 있는 클로로필 계열이 제거된 화살나무 귀전우 추출물 제조방법 |
-
2022
- 2022-05-18 KR KR1020220060832A patent/KR102604523B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130039309A (ko) * | 2011-10-11 | 2013-04-19 | 김선미 | 마늘과 난황의 복합 활성물질를 건강개선 기능성 약효제로 포함하는 식품조성물과 그 제조방법. |
| KR20180094208A (ko) | 2017-02-14 | 2018-08-23 | 동의초석잠영농조합법인 | 인지기능개선 효능을 가진 초석잠 발효대사체 제조방법 |
| KR102367058B1 (ko) * | 2021-09-08 | 2022-02-28 | 동성제약주식회사 | 기억력 감퇴 및 인지기능 저하를 개선시킬 수 있는 클로로필 계열이 제거된 화살나무 귀전우 추출물 제조방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 장소영 외 4인. 산화질소 대사체 함유 마늘 발효 추출물 이용 혈관성 치매 흰쥐 모델의 기억력 및 신경가소성 장애 개선 효과. 동의생리병리학회지. 2022년 4월 25일, Vol. 36, No. 2, pp. 59~65 1부.* * |
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