KR20090037358A

KR20090037358A - 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 항암 조성물

Info

Publication number: KR20090037358A
Application number: KR1020080099718A
Authority: KR
Inventors: 박중현; 임민정; 오일석; 이대희; 이정창; 이은경; 진영우
Original assignee: 주식회사운화바이오텍
Priority date: 2007-10-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2009-04-15
Also published as: US8790927B2; AU2008202078A1; US20100272692A1; KR101073985B1; EP2227247A4; CN101842112A; WO2009048306A1; RU2440820C2; CN101842112B; AU2008311515A1; CA2700236A1; JP2011500559A; HK1144382A1; RU2010117202A; US20130315877A1; MX2010003934A; EP2227247A1; AU2008202078B2

Abstract

본 발명은 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주(cell line), 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양액은 기존 약물 치료제의 부작용을 최소화하여 인체에 안전하면서도, 암의 성장에 직접 관여하여 암세포 사멸을 유도하고, 암 발생 시 나타나는 신생혈관형성을 억제시키는 항암활성을 나타내므로, 암의 예방, 치료 및 증상완화에 유용하다.

주목, 형성층, 전형성층, 항암조성물, 암세포 독성, 암세포 사멸활성

Description

주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 항암 조성물{Anticancer Composition Comprising Plant Stem Cell Line Derived from Taxus Cambium or Procambium, Lysate, Extract or Media Thereof}

본 발명은 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주(cell line), 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

아폽토시스(apoptosis)는 세포 내부에서 예정된 신호를 따라 여러 유전자 및 단백질들의 발현과 활성이 조절되어 일어나는 능동적인 죽음이며, 그 과정을 통해 생성된 아포토소체 (apoptosome)들은 주변의 세포들이나 대식세포 (macrophage) 등의 식세포 작용에 의해 제거됨으로써, 염증을 유발하지 않는다. 이러한 아폽토시스는 생명체의 여러 정상적인 생리적 현상에서 쉽게 관찰되는데, 여러 질환들의 발병과정에도 깊이 관여하는 것으로 알려져 있다. 즉, 비정상적인 아폽토시스의 발생은 퇴행성뇌신경질환 (neurogegenerative disorder), 면역계 이상(immune disorder), 그리고 심장 혈관계질환 (cardiovascular disease) 등의 원인이 될 수 있으며, 세포사멸의 비정상적인 억제는 암의 원인이 될 수 있다.

아폽토시스가 정상적인 조절과정에서 벗어나 비정상적으로 발행하거나 억제되어 나타나는 질병을 좀 더 자세히 살펴보면, p53, p16과 Bcl-2 등의 유전자의 이상 발현에 의해 유도되는 암들, HIV Herpes 및 독감 (influenza) 바이러스들에 의한 감염증, 그리고 당뇨 (Type 1 diabetes), 류마티스 관절염 (Rheumatoid arthritis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis)과 근무력증(Myasthenia gravis) 등과 같은 자가면역 질환들이 있다. 개체를 구성하는 각 세포의 아폽토시스는, 유전적으로 손상을 입은 세포나 분화 자극제에 의해 부적절한 분화의 유도에 의한 종양의 발달을 막기 위해, 이들 비정상적인 세포를 개체에서 제거하기 위한 수단, 즉 회복 불가능한 유전적 상처를 지닌 세포들을 개체에서 제거하기 위한 일반적인 수단이다. 이 개념은 일반적으로 사용되는 항암제가 암세포의 증식억제와 연관된 아폽토시스 과정을 통해 암세포의 사멸을 유도한다는 사실에 의해 뒷받침되고 있다 (Barry, M.A. et al., Biochem Pharmacol., 40:2353, 1990; Hickman, J.A., Cancer Metastasis Rev., 11:121, 1992).

따라서 아폽토시스 과정의 교란은 손상되거나 손상이 시작된 세포의 생존과 그들 세포의 성장을 유도하기 때문에 아폽토시스의 억제는 암화과정에서 중요한 역할을 한다. 아울러 암예방 효과가 있는 물질들은 이러한 비정상적인 세포의 세포사멸을 유도하며, 이들에 의한 아폽토시스의 유발은 최소한 그들의 암예방 활성과 연 관되어 있음이 보고 되어져왔다 (Fesus, L., J. Cell Biochem., 22:151, 1995; Reddy, B.S., Cancer Res., 57:420, 1997).

한편, 암의 발생기전이나 치료에 대한 연구를 위해 막대한 연구비를 투자해 왔으나, 아직도 암은 난치성 질병으로 남아 있으며, 여러 가지 치료법은 부작용을 초래하는 것으로 나타난다 (Goodman et al., Cancer Res., 9:2295, 1987). 이에 따라 암을 억제하는 새로운 약물연구 및 제재개발에 많은 노력을 기울이고 있으며, 특히 부작용이 적은 천연물에서의 항암물질의 개발에 관한 연구에 관심이 집중되고 있다.

본 발명자 중 일부는 탈분화에 의한 변이의 문제를 해결하고 안정적으로 증식이 가능한 유전적 안정성이 높은 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 제공방법을 개발하고 상기 세포주 중 주목 유래 세포주를 배양하는 경우 파클리탁솔(paclitaxel)이 높은 수율로 얻어짐을 확인한 후 국제특허출원 (PCT/KR 2006/001544호)한 바 있으나, 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 자체의 항암효과는 아직 보고되지 않은 상태이다.

이에, 본 발명자들은 기존 항암제의 부작용을 최소화하고 항암활성이 우수한 천연물 유래 항암 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도된 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액이 암세포 사멸활성을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 기존 항암제의 부작용을 최소화한 암의 예방 및 치료 활성을 나타내는 천연물 유래 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주(cell line), 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:

(a) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄;

(b) 선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및

(c) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임.

본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나의 암의 예방 또는 치료용 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액은 천연물 유래 조성물로서 기존 약물 치료제의 부작용을 최소화하여 인체에 안전하면서도, 암의 성장에 직접 관여하여 암세포 사멸을 유도하고, 암 발생 시 나타나는 신생혈관형성을 억제시키는 항암활성을 나타내므로, 암의 예방, 치료 및 증상완화에 유용하다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본원에서 "형성층(cambium)"이란 식물의 줄기와 뿌리를 굵어지게 해서 식물이 부피생장을 할 수 있도록 하는 조직이다. 형성층은 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직으로써 식물조직배양의 절편체로 사용 시 세포의 고속 및 대량생산이 가능하다고 보고되어 있다 (대한민국 등록특허 제0533120).

본원에서 "전형성층(procambium)"이란 시원세포군에서 파생된 1기 분열조직 을 말하며, 1기 분열조직인 형성층은 중간에 영구조직의 개입 없이 이로부터 유래된다.

본원에서 "파쇄물"이란 세포를 detergent 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하며, 세포주의 "추출물"이란 세포를 용매에 녹여 분리한 물질로, 증류 또는 증발을 이용하여 농축될 수 있다.

본원에서 "선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)"란 탈분화 과정을 거쳐 미분화 상태로 존재하는 것이 아닌, 본래부터 분화 전 상태를 유지하는 것을 말한다.

본 발명은 일 관점에서, 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주는 (a) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄; (b) 선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및 (c) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임을 특징으로 한다. 또한, 추가적으로 (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함; (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및 (c) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 할 수 있다:

(a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및

(c) 상기 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)으로부터 세포주(cell line)를 회수하는 단계.

이때, 상기 (c) 단계는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO₃, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 소디움 아세테이트(sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 상기 증식된 세포주를 회수하는 것이 바람직하 다. 이때, 상기 메틸 자스모네이트는 10~100μM의 함량으로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용한 배지는 통상의 식물 조직 배양을 위한 배지로써, 일례로 N6배지, SH배지, MS 배지, AA 배지, LS 배지, B5배지, WPM 배지, LP배지, White배지, GD배지, DKW배지, DCR 배지 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 주목의 형성층 유래 세포주 및 전형성층 유래 세포주가 H₂O₂에 의해 유도되는 활성산소종을 억제하는 효과가 있음을 확인하여 항산화 효과가 있음을 확인하였다. 체내에서 생성된 산소종(ROS)는 세포 내 DNA, 단백질 및 지질 등 세포를 구성하는 분자들과 결합하여 세포 돌연변이를 일으키고 세포에 정상적인 기능을 저해함으로써 암조직 형성에 관여하는 바, 암을 예방하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 주목의 형성층 유래 세포주 및 전형성층 유래 세포주를 마우스에 투여한 후 암조직을 적출하여 관찰한 결과, 본 발명에 따른 주목의 형성층 유래 세포주 및 전형성층 유래 세포주가 암조직의 성장을 저해하고 항암기전의 일환으로 혈관생성을 억제시키며, 면역세포의 암조직 내 유입을 높임을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 또한, 대장암, 구강상피암, 폐암, 전립선암, 뼈암, 백혈병, 자궁암, 피부암, 췌장암, 유방암, 위암, 신장암 및 간암 세포주에 대하여 각각 상기 세포주의 증류수 추출물, 메탄올 추출물 및 아세톤 추출물을 처리하여 암세포 사멸효과를 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 세포주 추출물은 이에 한정되지는 않으나, 대장암, 구강상피암, 폐암, 전립선암, 뼈암, 백혈병, 자궁암, 피부암, 췌장암, 유방암, 위암, 신장암 및 간암의 치료 및 예방에 효과적인 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명에서는 상기 세포주 파쇄물 및 그 배양액을 함유하는 조성물이 암의 예방 및 치료 효과를 나타냄을 제시하는 구체적인 실시예가 없다 하더라도, 상기에서 살펴본 바와 같이 상기 세포주 및 그 추출물이 암의 예방 및 치료에 활성을 가지는 것을 확인한바, 본 발명에 따른 세포주 파쇄물 및 그 배양액을 함유한 조성물의 경우에도 암의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다고 할 것이다.

본 발명의 다른 실시예에서는 추가적으로 본 발명의 세포주의 파클리탁솔 함유여부를 측정하였다. 본 발명에 따른 세포주를 엘리시터를 포함하여 배양 시 높은 농도로 파클리탁솔을 생산할 수 있으나, 파클리탁솔 생산이 가능한 조건으로 배양하지 않은 또는 생산하지 않도록 특정조건을 처리한 본 발명에 따른 세포주는 파클리탁솔을 함유하는지 실험하여 LC data를 분석하여 본 결과, 파클리탁솔을 함유하지 않은 것으로 나타나는바, 이는 주목에서 생산되는 것으로 알려진 파클리탁솔의 작용이 아닌 본 세포주 자체의 항암활성 특성인 것으로 사료된다. 또한, 본 발명에 따른 세포주는 경구투여시에도 효과가 있는 것이 특징으로 이에 나타나므로, 경구 투여 시 효과가 없어 주사제로 사용하고 있는 파클리탁솔의 작용으로 볼 수 없다.

본 발명에 따른 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물은, 상기 세포주, 그 파쇄물 및 그 추출물 중 어느 하나 이상을 각각 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 세포주 또는 세포주의 파쇄물 또는 추출물은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.

상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사 용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.

본원에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명에 따른 세포주, 그 세포주의 파쇄물, 추출물 또는 배양액을 첨가함으로써 식품의 기능성을 향상시킨 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 세포주 또는 세포주 추출물의 항암효과를 이용하여 암의 예방 및 개선용 기능성 식품을 제조할 수 있다.

본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 및 그 추출물의 암의 예방 및 억제 효과를 확인하였으나, 그 파쇄물 또는 그 배양액을 사용해서도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 제조

1-1: 식물재료의 준비

주목(Taxus spp.)의 잔가지 및 줄기를 각각 채취한 후, 즉시 항산화제 100㎎/L 아스코르브산(L-ascorbic acid, DUCHEFA, The Netherlands) 용액에 침적하여 운송·보관하였다.

그 후, 1% 베노밀(benomyl, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% 다코닐(daconil, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% 스트렙토마이신(sterptomycin sulphate, DUCHEFA, The Netherlands), 0.1% 세포탁심(cefotaxime sodium DUCHEFA, The Netherlands)의 혼합용액에 24시간 전처리 후 페놀 화합물(phenolic compound)과 잔존 화학물질을 제거하기 위하여 수돗물(tap water)로 30분간 세척하였다. 그리고, 70% 에탄올(ethanol, DC Chemical, Korea)에 1분, 30% 과산화수소(hydrogen peroxide, LG Chemical, Korea) 15분, 1% CLOROX 용액에 15분, 3% CLOROX용액에 5분 표면 살균 후 3~4회 세척하였다.

1-2: 잔가지 및 줄기로부터 전형성층 및 형성층 조직 분리

상기 살균과정을 거친 잔가지 및 줄기의 바깥조직들을 세로방향으로 잡아당기면 쉽게 벗겨졌다. 벗겨진 조직들은 목부, 전형성층(잔가지) 또는 형성층(줄기), 사부, 피층, 표피로 구성되는데, 벗겨진 조직들의 가장 안쪽조직 즉, 목부가 배지면에 닿도록 배양하였다.

1-3: 주목의 전형성층 및 형성층 유래 세포주 유도단계

초기 배양 4~7일째 전형성층 및 형성층으로부터 세포 분열이 육안상으로 관찰되고, 배양 15일 이후에 사부·피층 및 표피로 이루어진 층으로부터 탈분화에 의한 무정형의 캘러스가 유도되기 시작하였다. 그러나 배양기간 내내 목부는 세포분열이 일어나지 않아 형성층의 층(layer)과의 분리가 자연스럽게 이루어졌다. 배양 30일 경과 후 형성층의 층(layer)과 사부를 포함한 윗층, 즉 무정형의 캘러스층으로 분리되기 시작했고(도 1(a)), 두 층이 자연스럽게 분리될 때까지 기다렸다가 완벽한 분리가 이루어지면 각기 다른 페트리디쉬(petridish)에 분리 배양하였다(도 1 (b)). 도 1(a)에서 top은 사부·피층·표피 포함조직을 middle은 형성층을 나타내고, Bottom은 목부를 나타내며, arrow head는 형성층의 층과 사부·피층·표피 포함조직 간의 분리를 표시한다. 또한, 도 1 (b)에서 A는 세포들간의 분열 차이로 부정형으로 증식되는 사부·피층·표피 포함 조직 유래 세포주를, B는 세포들간의 분열이 균일하여 일정한 판의 형태로 증식되는 형성층 유래 세포주를, C는 세포분열이 일어나지 않는 목부를 나타낸다. 또한, 도 1 (c)는 전형성층 유래 세포주를 유도하는 모습을 나타낸 것이다. 도 1(c)에서 A는 배양 30일 후 잔가지를 검사한 것 으로 전형성층(bottom)이 1기 사부, 피층, 표피로 구성된 조직으로부터 유래한 캘러스 세포와 분리되어짐을 보이는 사진이고, B는 배양 35일 후의 사진으로 유도된 전형성층의 층을 분리하여 배양한 모습을 나타내며, C는 배양 40일 후의 사진으로 전형성층의 층을 분리한 후 1기 사부, 피층, 표피로부터 구성된 조직의 캘러스가 증식되는 모습을 나타낸다.

상기와 같이 분리한 후, 생장률이 좋은 희고 무른 부분을 유도배지와 동일한 새로운 배지로 매 21일째 계대하였다.

한편, 전형성층 및 형성층 유래 세포주만을 유도하기 위해 사용한 배지는 <표 1>과 같다.

<표 1> 세포주 유도배지 in Taxus spp.(배지 1)

	Composition	Contents(㎎/L)
Inorganic salts	KNO₃	1011.1
	MgSO₄·7H₂O	121.56
	MnSO₄·4H₂O	10
	ZnSO_4·7H₂O	2
	CuSO₄·5H₂O	0.025
	CaCl₂·2H₂O	113.23
	KI	0.75
	CoCl₂·6H₂O	0.025
	NaH₂PO₄·H₂O	130.44
	H₃BO₃	3
	Na₂MoO₄·2H₂O	0.25
	FeNaEDTA	36.7
Vitamin	Myo-inositol	450
	Thiamine-HCl	20
	Nicotinic acid	2
	Pyridoxine-HCl	2
	L-ascorbic acid	100
	Citric acid	150
Phytohormone	Auxin	1~3
Phytohormone	Gibberellic acid	0.5
Amino acid	Casein hydrolysate	500
Sucrose		30,000
Activalted		100
Gelrite		4,000

배지에 생장 조절제로서 옥신(Auxin)을 1~3mg/L의 농도로 첨가하였다. 배양은 25±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다.

한편, 비교를 위하여 주목의 배(embryo)와 잎(needle) 절편체를 소독한 후 상기 <표 1>의 배지에서 배양하였으며, 그 결과, 배(embryo)와 잎(needle) 절편체는 탈분화에 의해 캘러스가 형성함을 관찰할 수 있었다. 배 및 잎 절편체에서 유도된 캘러스는 사부포함조직과 같이 여러 세포들 간의 분열 속도에 차이로 부정형을 이루었고, 생장률이 불안전하며 쉽게 갈변되는 경향을 보였다. 갈변 및 응집되어진 벼 및 잎 절편체에서 유도된 캘러스는 종국에는 자신이 분비하는 페놀 화합물에 의해 생장이 둔해지다가 종국에는 괴사하였다. 즉, 6개월 후부터 배(embryo)와 잎(needle)으로부터 유도된 캘러스들은 유지 및 배양이 어려웠다. 반면, 전형성층 및 형성층 유래 세포는 20개월 이상 장기 배양시 세포의 생장률, 생장 패턴, 응집 정도에 변이 없이 안정적으로 유지되어 대량 배양이 가능했다.

1-4: 분리된 세포주의 증식단계 및 특성관찰

상기 전형성층 및 형성층 유래 세포주를 하기 <표 2>의 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다.

<표 2> Suspension medium in Taxus spp. (배지 2)

	Composition	Contents(㎎/L)
Inorganic salts	KNO₃	1011.1
	MgSO₄·7H₂O	121.56
	MnSO₄·4H₂O	10
	ZnSO_4·7H₂O	2
	CuSO₄·5H₂O	0.025
	CaCl₂·2H₂O	113.23
	KI	0.75
	CoCl₂·6H₂O	0.025
	NaH₂PO₄·H₂O	130.44
	H₃BO₃	3
	Na₂MoO₄·2H₂O	0.25
	FeNaEDTA	36.7
Vitamin	Myo-inositol	200
	Thiamine-HCl	20
	Nicotinic acid	2
	Pyridoxine-HCl	2
	L-ascorbic acid	100
	Citric acid	150
Phytohormone	Auxin	1~3
Phytohormone	Gibberellic acid	0.1
Amino acid	Apartic acid	133
	Arginine	175
	Proline	115
	Glycine	75
Sucose		20,000

한편, 배 및 잎 유래 캘러스(callus)도 상기 <표 2>의 배지 2에서 배양하여 본 발명에 따른 전형성층 및 형성층 유래 세포주와 비교하였다.

세포 응집정도(biological microscope CX31, Olympus, Japan)를 살펴 볼 때, <표 3>과 같이 본 발명에 따른 세포주는 현탁배양 시 90%이상의 단세포 상태로 존재함을 확인할 수 있었으며, 도 1 (d)에 나타난 바와 같이, 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 관찰할 수 있었으며, 미분화상태임을 확인할 수 있었다. 도 1 (d)의 주목의 전형성층 유래 세포에서 화살표로 표시된 부분이 액포를 나타낸다.

<표 3> The type of cell aggregates of Taxus long-term cultures

Large cell aggregates	Moderate cell aggregates	Small cell aggregates	Single cell population	Explant source
60±3.2%	30±3.3%	7±0.6%	3±0.9%	embryo needle
0	0	9%	91%	cambium
0	0	7.4±0.8%	92.6±0.8%	procambium
Large cell aggregates, size higher than 1.5×10³㎛; Moderate cell aggregates 1×10³㎛; Small cell aggregates 4×10²㎛＜size＜ 1×10³㎛

한편, 대량 배양 가능성을 살펴보기 위하여, 3L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, Korea)에서 배(embryo)·잎(needle) 유래 캘러스와 전형성층 및 형성층 유래 세포를 배양하였다. 배지는 표 2의 액상배지를 사용하였고, 암조건에서 25±1°C로 일정하게 유지하였다.

그 결과, 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 주목의 전형성층 및 형성층 유래 세포 배양물의 배가시간은 4~5일로 플라스크와 반응기 사이에 차이가 없거나 오히려 단축된 것으로 나타난 데 반하여, 이질적인 세포주인 배(embryo)·잎(needles) 유래 배양물의 배가시간(doubling time)은 플라스크에서는 12일인데 반해 반응기(reactor)에서는 21일로 길어진 것으로 관찰되었다. 즉, 플라스크에서 배양 시 본 발명에 따른 세포주가 2~3배 정도의 높은 증식률을 보임을 확인하였으며, 대량 반응기에서는 본 발명에 따른 세포주가 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 5~6배의 높은 증식률을 보임을 확인하였다. 이는 타 조직 유래의 이질적인 세포주는 반응기 내에서의 생장고리 생성과 배양중의 식물 배양체 응집성과 세포벽이 단단하여 전단에 대한 민감성으로 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 판단되었다.

본 발명에 따른 주목의 전형성층 및 형성층 유래 세포주는 생물반응기 내의 생장고리 면적을 아주 작게 형성하고, 배양기에 간단한 자극을 주어 배지를 움직여주면 내벽의 링(ring)이 간단하게 해소되었다. 또한 응집이 작고, 많은 액포(vacuole)를 가지고 있어 전단에 대한 민감성이 약하여 세포 생존율(cell viability)의 감소를 가져오지 않는 것으로 나타났다. 즉, 본 발명에 따른 세포주는 대량배양을 위한 생물 반응기에서 교반작용에 따른 전단 스트레스에 대하여 낮은 민감성을 가지므로, 생물반응기 내에서 급속 대량 생장이 가능함을 확인하였다. 이때, 플라스크 배양 시의 증식률 차와 대량 배양기에서의 증식률차를 고려하면, 본 발명에 따른 주목의 전형성층 또는 형성층 유래 세포주가 주목의 전형성층 또는 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 전단스트레스에 대하여 2~3배의 낮은 민감성을 가짐을 알 수 있었다.

<표 4>

Explant source	Doubling time (day)
Explant source	flask	bioreactor
embryo	11.5±1.3	21±2.6
needle	12±2	21±2
procambium cambium	5±0.2	4±0.1

1-5: 당 및 메틸 자스모네이트의 처리

상기 실시예 1-4와 같이 14일간 현탁배양한 세포주를 멸균수에 원당 3~5중 량%(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100μM를 첨가한 배지에서 10일간 암배양한 후, 세포를 수거하여 다음의 실험을 수행하였다.

실시예 2. 주목의 전형성층 또는 형성층 유래 세포주의 추출물 제조

실시예 1에서 제조된 세포주로부터 다음과 같이 단계별로 유효물질을 추출하였다.

(ⅰ) 배양액을 제거시킨 상기 세포주 500g에 500ml의 증류수를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.

(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 증류수 가용성물질을 얻었다.

(ⅲ) 상기 증류수 가용성 물질을 얻은 후, 남은 증류수 불용성물질에 500ml의 메탄올(methanol)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.

(ⅳ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 취함으로써 메탄올 가용성물질을 얻었다.

(ⅴ) 상기 메탄올 가용성물질을 얻은 후, 남은 메탄올 불용성물질에 500ml의 아세톤(acetone)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.

(ⅵ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 취함으로써 아세톤 가용성물질을 얻었다.

(ⅶ) 상기에서 얻은 증류수, methanol, acetone 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다.

(ⅷ)- 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 세포배양액, 메탄올, 아세톤에 녹여 증류수 추출물, 메탄올 추출물, 아세톤 추출물을 얻었다.

실시예 3. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 항산화 활성 측정

항산화 효과와 암의 예방과의 상관관계에 대하여 알려져 있는바, 본 발명에 따른 세포주가 암을 예방하는 효과가 있는지 살펴보기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.

3-1: 피부섬유아 (HDF, Human diploid fibroblast) 세포 배양

HDF 세포는 태아의 음경포피로부터 분리 배양하였다. 세포 배양액은 DMEM (Invitroge Gibco life tech. Vienna, Austriea) 배지에 56℃에서 30분간 가열하여 비활성화시킨 우태아 혈청(FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA)을 10%, 페니실린(penicillin) (100unit/㎖)과 스트레토마이신(streptomycin) (100㎍/㎖) 및 300 ㎍/㎖-glutamine을 첨가하여 조제하였다. 세포는 위의 배양액을 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였고, 통상적으로 세포가 서로 융합되기 직전인 3~4일 간격으로 계대배양을 하였으며, 계대배양에 따라 20계대 이하의 어린 (Young) 세포, 21-49계대의 middle 세포와 50계대 이상의 노화세포로 구분하였다.

3-2: H ₂ O ₂ 에 의해 유도되는 활성산소종 측정

상기 피부섬유아 세포(HDF cell)에 실시예 2에서 수득한 추출물 중 증류수 추출물을 이용하여, 활성산소종을 유도하는 H₂O₂를 처리하였을 때, 활성산소종을 저해하는지 확인하기 위하여, 활성산소종 (ROS: reactive oxygen species)을 측정하는 실험을 수행하였다.

세포내 활성 산소의 측정은 활성산소에 민감한 DCFDA(2',7'-dichlorofluorescin diacetate, Fluka Cat 35847 Molecular Probes, USA) 형광 dye를 사용하여 Facscan analysis를 이용하여 분석하였다. 각각의 PD에 따른 HDF 세포를 100mm plate 에 키운 후 5uM 농도의 DCFDA 를 dark 상태로 처리하여 30분간 37℃에서 반응시킨 후 PBS로2회 세척후 trypsin-EDTA 처리로 세포를 회수하였다. 이후 900rpm에서 4분간 원심분리하여 세포를 모은 후 각각 세포 10,000개당 활성산소를 측정하였다 (도 2 (a), (b)).

5x10⁵ 의 세포를 6 well plate에 분주 후 각 실험에 따라 H₂O₂를 단독으로 처리하거나 실시예 2에서 수득한 추출물을 함께 처리하였다. 실시예2에서 수득한 추출물 중 증류수 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였는데, 바람직하게는 증류수 추출물 50㎍/㎖ 처리한 후 HBSS (Hank's balanced salt solution)로 2~3회 세척하고,재차 HBSS에 30분 정도 안정화시켰다. 10uM의 DCFDA (Molecular Probes USA)를 처리 후 Dark상태로 37℃에서 1시간 염색하고, HBSS로 3번 세척 후 형광 현미경으로 관찰하였다 (도 2 (c)).

HDF 세포에 H₂O₂ 200uM과 실시예 2에서 수득한 세포주의 증류수 추출물을 10~100㎍/㎖로 처리하였는데, 바람직하게는 50㎍/㎖을 처리하여 세포의 형태의 변 화 정도를 관찰하였다.

H₂O₂를 세포에 처리하고 24시간이 경과하면, HDF 세포는 산화적 스트레스에 의해 활성산소(ROS)를 발생하게 된다. 비형광성인, DCFDA는 활성산소에 의해 산화되어 강한 형광을 나타내는 DCF가 되므로, 이를 측정할 수 있다. 본 실시예에서는 측정을 위하여 FACS CAlibur (Becton Dickinson Analytic Flow Cytometer, USA)를사용하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 주목의 형성층 유래 세포주 추출물 및 주목의 전형성층 유래 세포주 추출물 모두 활성산소종(ROS)의 생성이 억제되는 것으로 나타났다 (P-WE:전형성층 증류수 추출물, C-WE: 형성층 증류수 추출물). 즉, 두 세포주 추출물 모두 활성산소종의 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

우수한 항산화력을 가진 물질은 세포산화에 의한 세포손상을 억제하는 유효물질로, 체내에서 생성된 산소종(ROS)는 세포 내 DNA, 단백질 및 지질 등 세포를 구성하는 분자들과 결합하여 세포 돌연변이를 일으키고 세포에 정상적인 기능을 저해함으로써 암조직 형성에 관여하게 된다.

따라서, 상기 실험에서 본 발명에 따른 주목의 형성층 유래 세포주 및 전형성층 유래 세포주가 항산화 효과가 있음을 확인한 바, 본 발명에 따른 주목의 형성층 유래 세포주 및 전형성층 유래 세포주가 암을 예방하는 효과가 있는 것으로 나타났다.

실시예 4. 주목의 형성층 및 전형성층에서 유도되는 세포주의 투여에 따른 항암활성 효과

①실험에는 다물사이언스(대전 유성구 노은동)로부터 구입한 Balb/C mouse를 일반적인 동물사육 규정에 적합하게 사육시켰다. 통상적으로 6주령의 마우스를 구입하여 5일 정도 적응시킨 후 1x 10⁶개의 CT-26 대장암세포주(한국세포주은행 KCLB80009)를 우측 등 부분의 피하에 주입시켰다.

암세포 도입 3일을 전후하여 대부분의 쥐에서는 좁쌀 크기의 암세포의 성장이 관찰되며, 따라서 3일째부터 실시예 1에서 분리한 형성층 유래 세포주와 전형성층 유래 세포주를 각각 자유로이 급식시켰다. 대조군은 통상적인 영양분이 함유된 쥐사료를 급식시키고, 상기 세포주 투여는 동일한 사료를 잘게 부순 후 1:1 비율로 상기 세포주를 첨가시켜 동일한 모양의 사료로 만든 후 자유 급식시켰다. 이때, 세포주의 평균 일일 투여량은 쥐 한 마리당 세포 생중량 (fresh weight) 2~3g이었다. 기타 모든 사양조건은 동일하게 하였으며, 3주간 암세포 크기를 관찰하였다. 실험에는 대조군과 상기 세포주 급여군을 15마리씩(형성층 유래 세포주 7마리, 전형성층 유래 세포주 8마리)으로 하였으며, 이를 3회 실시하였다.

② 세포주 투여 후, 3주간의 암세포 크기 관찰결과

본 발명에 따른 세포주 투여 후 2주 경과시점에서 모델 마우스에서의 암조직 크기를 관찰한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 형성층 유래 세포 주 및 전형성층 유래 세포주를 투여한 세포주 투여군에서 암조직의 성장을 저해되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 세포주 투여 후 3주 경과한 시점에서 세포주 투여군에서의 암조직의 부피는 100㎣ 정도이나, 대조군은 세포주 투여군의 6 배 이상의 부피를 나타내는 것으로 나타났다. 아울러 도 5에 나타난 바와 같이, 암조직을 적출하여 촬영한 결과, 외관적으로 그 부피에 큰 차이가 있음을 알 수 있었다. 적출된 암 조직의 무게를 측정한 결과, 대조군의 평균무게는 2.16g인 반면, 세포주 투여군에서는 암조직의 평균무게가 0.21g으로 약 1/10인 것으로 관찰되었다. 이에 암세포의 전반적인 성장을 저해하는 것을 확인할 수 있었는 바, 암의 예방 및 치료효과가 있음을 알 수 있었다.

③ 한편, 상기 대조군과 세포주 투여군에서 암조직 적출 후, 배율을 달리하여 내부조직을 관찰하였으며, 그 결과는 도 6에 나타난 바와 같다.

관찰 결과, 대조군에서는 전반적으로 아폽토시스(apoptosis)라 불리는 세포사멸을 보이는 부분이 없으며, 모든 영역에서 조직이 치밀하고 분열중인 세포(도 6 (a)의 b 부분)가 세포가 많은 특징을 보이고 있었다. 이러한 분열상태의 세포가 많은 것은 대조군에서는 계속 암조직이 성장하여 팽창하고 있음을 의미한다.

그러나, 세포주 투여군에서는 조직이 치밀하지 못하며, 아폽토시스 바디(apoptosis body, 도 6 (b)의 c 부분)라 불리는 핵이 응축되거나 여러 조직으로 분열되어 있는 모습이 관찰되는 세포가 대부분이었다. 이러한 아폽토시스 바 디(aoptosis body)는 대조군에서는 거의 나타나지 않고 있다.

그밖에 아주 특징적인 현상을 보이는 것은 적혈구의 염색으로(도 6 (a)의 a 부분), 이는 조직 내 혈관을 단편적으로 보여주는 것으로 대조군에서는 많은 혈관이 보이지만 세포주 투여군에서는 전혀 보이고 있지 않다. 또한, 세포주 투여군의 경우 면역세포로 예측되는 둥그런 핵을 보이는 세포가 상당부분 관찰되고 있으며(도 6 (b)의 d부분), 이는 대조군에서는 거의 보이지 않았다.

이에 본 발명의 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되는 세포주는 암의 성장에 직접 관여해 세포 사멸을 유도함으로써 암 조직의 전반적인 성장을 제어시켜 암을 예방하는 효과 및 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한 암 발생 시 나타나는 신생혈관형성을 억제시키며, 면역세포의 암조직 내 유입을 높여 강한 면역작용을 유도함으로써 강한 항암활성을 보임을 알 수 있다.

실시예 5. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유래 세포주 추출물의 제조 및 암세포 사멸활성

① 암세포배양

- 사람암세포주: 구강상피암세포주(KB cell, 한국세포주은행 KCLB10017), 폐암세포주(HCC95, 한국세포주은행 KCLB70095), 전립선암세포주(PC-3, 한국세포주은행 KCLB21435), 뼈암세포주(U2-OS, 한국세포주은행 KCLB30096), 백혈병(K-562 한국세포주은행 KCLB10243), 자궁암세포주(HeLa 한국세포주은행 KCLB10002), 피부암세 포주(HT1080 한국세포주은행 KCLB10121), 췌장암세포주(MIA CaPa-2 한국세포주은행 KCLB21420), 유방암세포주(MCF-7 한국세포주은행 KCLB30022), 위암세포주(AGS 한국세포주은행 KCLB21739), 신장암세포주(Caki-1 한국세포주은행 KCLB30046), 간암세포주(HepG2 한국세포주은행 KCLB88065)

- 쥐암세포주: 피부암세포주(B16F10, 한국세포주은행 KCLB8008), 대장암세포주(CT-26, 한국세포주은행 KCLB80009)

- 세포배양: 상기의 암세포주는 세포에 따라 RPMI와 DMEM 배지에 배양시켰다. 배양액에는 56℃에서 30분간 가열하여 비활성화시킨 우태아 혈청(FBS)을 10%, penicillin(100 unit/㎖)과 streptomycin(100 ㎍/㎖) 및 300 ㎍/㎖-glutamine을 첨가하였다. 세포주는 상기 배양액을 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO₂인큐베이터에서 배양하였고, 통상적으로 세포가 서로 융합되기 직전인 3~4일 간격으로 계대 배양을 하였으며, 실험에는 총 30 계대 이하인 세포만을 사용하였다.

- 추출물의 처리와 세포사멸활성측정 : 6 well plate의 배양용기에 1 x 10⁵ 개의 각각 세포를 배양시키고, 세포가 용기에 완전히 접착되는 6시간 후에 증류수, methanol, acetone 추출물(150, 400, 800μg/ml 배양액)처리 후 1일부터 3일까지 세포사멸정도를 실험하였다. 세포의 증식은 MTT (3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 방법으로 측정하였다.

성장의 저하정도는 아무것도 처리하지 않은 음성대조군(control), 메탄올과 아세톤을 첨가시킨 대조군(vehicle), 그리고 항암제로 주목 유래 파클리탁솔(paclitaxel, sigma)을 처리한 양성대조군과 상호비교하였다. 주어진 시간에 따라 37℃로 가온한 세포배양액으로 2회 세척 후 MTT용액 (5㎎/㎖, without phenol red) 1㎖를 가하여 4시간 동안 재배양시켰다. 상층액을 제거시키고, 생성된 formazen 침전물에 DMSO 1㎖를 넣어 용해시키고 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 생존세포수는 처리 3일째에 50% 메탄올로 고정시키고, 부착된 생존세포는 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 관찰하였다.

② 추출물 처리에 따른 실험의 결과

- 증류수, 메탄올, 아세톤 추출물(800㎍/㎖)을 각각의 세포에 처리시키고, 처리 3일째의 생존세포

각각의 추출물은 배양액을 제거하고 증류수, 에탄올, 아세톤 순으로 각각 녹인 후, 세포에 처리시킨 결과, 대부분의 실험세포에서 메탄올 추출물이 가장 높은 세포사멸활성을 보였으며, 이는 10μg/ml의 농도로 파클리탁솔을 처리한 양성대조군(도 7의 Taxol(파클리탁솔, paclitaxel))과 비슷한 사멸 효과를 나타내었다.

다음으로 증류수와 아세톤 추출물도 사멸효과를 보였지만 전반적으로 메탄올 추출물에 비교하여 낮은 활성을 보였다. 반면 메탄올(methanol)과 아세톤(acetone)만을 처리한 대조군(도 7의 vehicle)은 세포사멸에 전혀 영향을 미치지 않았다.

이로써 세포주의 추출물에는 암세포사멸활성을 나타내는 물질이 함유되었음 을 알 수 있었다. 다음 단계에서는 메탄올 추출물을 농도별로 처리하여 사멸정도를 실험하였다.

- 메탄올 추출물의 농도별 처리에 따른 세포사멸활성

메탄올 추출물을 200mg/ml의 농도로 메탄올에 녹이고, 실험세포주에 배양액 1㎖에 150, 400, 800㎍의 농도로 첨가시켰다. 첨가 1일부터 3일까지 1일 간격으로 세포성장을 MTT 방법으로 측정하였으며, 3일째 생존세포는 메탄올 고정 후 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하였다. 14개 암세포주의 결과는 도 8 내지 도 21과 같다.

상기 결과에서 본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 메탄올 추출물은 농도의존적으로 14개의 암세포에서 세포사멸활성을 보여주었다. 800ug/ml의 농도는 모든 세포주에서 강한 활성을 보였으며, 이는 양성대조군인 파클리탁솔(paclitaxel 10ug/ml의 세포사멸과 비슷한 결과를 나타내었다. 반면 CT-26 (도 8)과 B16F10(도 13)에서는 양성대조군보다 더 높은 세포사멸활성을 보였다. 양성대조군에서 사용된 파클리탁솔과 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물의 양적 차이는 실험에 사용한 파클리탁솔은 순수정제된 물질인 반면, 세포주의 추출물은 많은 화합물이 혼합된 상태임에 기인하는 것이다. 이에 순수 정제과정을 거치면 본 발명에 따른 세포주의 세포사멸활성은 더욱 향상될 것으로 판단된다.

실시예 6. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 파클리탁솔 함유 여부 조사

한편, 본 발명에 따른 세포주의 항암활성이 파클리탁솔에 의한 활성이 아님을 입증하기 위하여 다음과 같이, 본 발명에 따른 세포주의 파클리탁솔 함유여부를 조사하였다.

본 실험에 사용된 파클리탁솔(paclitaxel, Taxol) 표준시료는 sigma에서 구입하였고 이동상으로는 J.T. Baker사의 HPLC용 water, acetonitrile, methanol을 0.2㎛ filter로 여과한 후에 사용하였다.

상기 실시예 1에서 제조된 세포주 0.2g을 MeOH 0.4mL 넣고 5분간 vortex 후 1시간 동안 실온에서 추출하였다. 이 추출액을 13000rpm으로 5분간 원심분리 후 0.2㎛ filter로 여과한 후 UPLC로 정량 분석하였다.

UPLC (Waters, MA, USA) 분석은 UPLC BEH C18 column (100 mm×2.1 mmi.d, 1.7㎛)을 이용하여 표준시료와 비교하여 정량분석 하였다. 이동상으로는 water, acetonitrile을 gradient하여 유속은 0.4mL, UV 227nm에서 검출하였다.

흡광도 227nm 와 280nm에서 파클리탁솔 표준시료(taxol standard)를 UPLC로 분석한 결과, 도 22의 (a)에 나타난 바와 같이 retention time이 4.67분에서 나타났다. 아울러 227nm와 280nm에서 UV absorbance ratio이 약 0.05가 되어야 파클리탁솔이라고 보고되고 있는데(Castor & Tyler 1993), 본 실험에서 파클리탁솔 표준시료를 측정한 결과 A(280 nm) / A(227nm) = 0.048으로 나타났다.

이에 반하여 본 발명에 따른 세포주(sample)를 흡광도 227nm와 280nm에서 UPLC로 분석한 결과, 도 22의 (b)에 나타난 바와 같이 retention time이 4.70분에 서 나타났다. 아울러 세포주(Sample) 추출물 측정결과, 227nm와 280nm에서 UV absorbance ratio이 A(280nm) / A(227 nm) = 1.24로 나와서 파클리탁솔이 포함되어 있지 않음을 알 수 있었다.

또한, 추가적으로 파클리탁솔 표준시료와 본 발명에 따른 세포주 추출액의 PDA spectrums을 분석한 결과, 도 22의 (c)와 (d)에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 세포주에 파클리탁솔이 포함되어 있지 않음을 보였다.

실시예 7. 약학제제 제조예

제제예 1. 정제의 제조

실시예 1에서 제조된 세포주 추출물 100㎎을 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합하여 통상의 정제제조방법에 따라 제조하였다.

제제예 2. 캡슐제의 제조

실시예 1에서 제조된 세포주 추출물 500㎎을 연질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 3. 시럽제의 제조

실시예 1에서 제조된 세포주 1g, 이성화당 10g, 만니톨 5g, 적량의 정제수의 함량으로 통상적인 액제제의 제조방법에 따라 100㎖의 시럽제를 제조하였다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1에서 제조된 세포주 추출물 200㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1%의 농 도로 함유하는 주사제를 제조하였다.

실시예 8. 기능성 식품의 제조 : 기능성 음료의 제조

제조예 1.

실시예 1에서 제조한 세포주 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.

제조예 2.

실시예 1에서 제조한 세포주 추출물 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 세포주의 유도과정, 전형성층 및 형성층의 층의 분리 후 모습 및 탈분화된 세포와 주목의 전형성층 유래 세포 간 비교를 나타내는 사진이다.

도 2는 피부 섬유아세포(HDF)에 H₂O₂로 처리하여 노화를 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 항산화 활성을 나타내는 ROS 량을 비교 그래프와 DCFH 형광 촬영 사진이다 (p-WE: 전형성층 증류수 추출물, C-WE: 형성층 증류수 추출물).

도 3는 본 발명에 따른 세포주 투여한 다음, 2주일 후 대조군과 세포주 투여군의 마우스의 암조직의 크기를 외관적으로 비교한 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 세포주 투여 후, 3주간의 대조군 및 세포주 투여군의 암조직의 부피를 나타내는 그래프이다.

도 5는 본 발명에 따른 세포주 투여한 다음, 3주 후 대조군과 세포주 투여군의 마우스에서 암조직을 적출하여 촬영한 사진이다.

도 6은 본 발명에 따른 세포주 투여한 다음, 3주 후 암조직 적출 후 내부조직을 촬영한 사진이다.

도 7은 본 발명에 따른 세포주 추출물을 각 암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 8은 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 대장암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 9는 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 폐암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 10은 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 전립선암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 11은 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 뼈암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 12는 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 구강암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 13은 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 피부암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 14는 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 백혈병 세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 15는 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 자궁암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 16은 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 피부암(사람)세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 17은 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 췌장암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 18은 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 유방암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 19는 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 위암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 20은 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 신장암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 21은 본 발명에 따른 세포주의 메탄올 추출물을 농도별로 간암세포주에 처리 후 세포사멸정도를 나타낸 사진이다.

도 22는 본 발명에 따른 세포주의 파클리탁솔 함유 여부 분석결과를 나타내는 그래프이다.

Claims

주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주(cell line), 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물:

(a) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄;

(b) 선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및

(c) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임.
제1항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물:

(a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;

(b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및

(c) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐.
제1항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물:

(a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및

(c) 상기 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)으로부터 세포주(cell line)를 회수하는 단계.
제3항에 있어서, 상기 (c) 단계는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO₃, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 소디움 아세테이트(sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택 된 물질;을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 상기 증식된 세포주를 회수하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것임을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 대장암, 구강상피암, 폐암, 전립선암, 뼈암, 백혈병, 자궁암, 피부암, 췌장암, 유방암, 위암, 신장암 및 간암 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주( cell line), 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품:

(a) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄;

(b) 선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및

(c) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임.
제7항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품:

(a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;

(b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및

(c) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐.
제7항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품:

(a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및

(c) 상기 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)으로부터 세포주(cell line)를 회수하는 단계.