KR100323571B1 - 가시오갈피 배발생 세포로부터 생식용 유식물체의 제조방법 및 그 추출물의 용도 - Google Patents
가시오갈피 배발생 세포로부터 생식용 유식물체의 제조방법 및 그 추출물의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 가시오갈피(Eleutherococcus senticosusMax)의 배발생 세포 (Eleutherococcus senticosus/ Embryogenic cells)를 MS (Murashige and Skoog) 액체배지에서 현탁배양하여 체세포배발생과정(somatic embryo- genesis)을 통해 유식물체(seedlings또는 plantlet라고함)를 대량 생산하여 한천배지에 옮겨 무균, 무공해 상태의 가시오갈피 유식물체를 생식용 식품으로 공급하는데 있다. 또한, 가시오갈피 유식물체로 부터 추출물을 얻어 항산화 및 항지질과산화 활성의 의약품 및 건강식품 원료로 공급하는데 있다.
본 발명은 세계 최초로 가시오갈피 배발생 세포로부터 유식물체를 생산하는 기술을 개발하여 공업적인 규모로 탱크배양에 의해 단기간에 가시오갈피 유식물체를 대량으로 생산할 수 있다. 이와 같이 생산된 가시오갈피 유식물체를 메탄올, 에탄올 등과 같은 저급알코올로 추출하고 다시 핵산, 에칠아세테이트 및 부탄올 등을 사용하여 순차적으로 분획한 가시오갈피 유식물체 추출물을 얻는다. 상기의 추출물은 탁월한 항산화 활성 뿐만아니라 항지질과산화, 항암, 항바이러스, 항미생물 등에도 활성을 나타내므로 의약품, 식품, 음료, 차, 화장품 및 신기능성 건강보조식품 등에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 가시오갈피(Elutherococcus senticosusMax) 배발생 세포 (Eleutherococcus senticosus/ Embryogenic cells)를 액체배지에서 현탁배양하여 체세포 배발생과정을 통하여 유식물체(seedlings또는 plantlet라고함)를 대량으로 배양할 수 있는 기술을 세계 최초로 개발하여 가시오갈피를 생식용의 식품으로 공급하는데 있다. 또한, 가시오갈피 유식물체의 성분을 메탄올, 에탄올 등의 저급 알코올로 추출하고 다시 핵산, 에칠아세테이트 및 부탄올 등을 사용하여 순차적으로 분획한 가시오갈피 유식물체 추출물을 얻어 항산화, 항지질과산화, 항암, 항바이러스, 항미생물 등에도 활성을 나타내는 유효성분을 함유하고 있으므로 의약품, 식품, 음료, 차, 화장품 및 신기능성 건강보조식품 등에 사용될 수 있다.
가시오갈피는 약용으로서 가치가 높이 평가되어 러시아를 비롯한 여러 나라에서 자연산 가시오갈피의 성분분석 연구가 많이 진행되어 그 효능이 탁월한 것으로 입증되었다. 즉, 가시오갈피에는 소염작용이 아스피린보다 5배 강한 아칸토산 (acanthoic acid)과 β-사이토스테롤(β-sitosterol), 엘루세로사이드(eleuthero side) A-G, 스티그마스테롤(stigmasterol) 등의 유용성분이 함유되어 정력증진, 고혈압, 당뇨, 항암작용, 항염증작용, 진통해열작용, 신경통, 건강상태평형유지, 생명연장 등에 약효가 탁월하여 그 효능이 산삼과 같은 것으로 알려져 있다. 특히, 가시오갈피는 러시아에서 연구 발표된 피로회복제의 묘약으로서 운동선수나 정신노동자들에게 큰 효과가 있으며 초중고 학생들의 급식에 자주 활용되고 있다 (가시오갈피 재배와 이용, 조선행). 우리 나라에서는 호남농업시험장의 약용식물연구팀에 의해 1992년 가시오갈피가 덕유산에서 발견된 이후 해발 1,000 m 이상의 심산에 자생하고 있는 것으로 알려져 있지만 무분별한 남획에 의해 현재는 멸종 위기에 있어 보호수로 지정되어 있다. 한국산 가시오갈피는 여러 생리활성이 있는 엘루세로사이드 이(eleutheroside E) 함량이 토종오갈피인 지리오갈피, 서울오갈피, 당오갈피, 섬오갈피 등에 비해 1.7∼5.5배정도 많은 것으로 보고되었다(박호기, 전북대학교 박사학위논문, 1997). 그러나 우리 나라에서는 일반 농가에서 가시오갈피를 재배할 경우 기후조건이 맞지 않아 종자를 맺지 못하고, 삽목도 잘 되지 않아 증식에 많은 어려움이 있다. 또한, 관목인 가시오갈피는 근피 및 수피를 약용으로서 채취하기 때문에 비교적 오랜 재배기간이 필요하고 일단 근피 및 수피를 채취하면 그 식물체는 더 이상 생존할 수 없어 약용으로서 이들을 얻는 것은 1회에 지나지 않아 반복적으로 생산할 수 없는 문제점이 있다.
최근 인삼의 경우는 세포를 배양 용기내에서 대량으로 배양하여 사포닌을 추출하는데 성공하였고 그 배양체를 가공하지 않고 그대로 건조, 분말화하여 건강식품으로 시판하고 있다(일본 日東電工). 또한, 여러 기업에서 주목세포를 배양하여 항암 성분인 택솔을 추출하고 있다.
그러나 지금까지 본 발명과 같이 세포배양에 의해 재분화된 소식물체를 대량으로 생산하여 이를 생식용으로 상품화한 예는 거의 없고, 이들의 성분을 분석하여 그 용도를 구명한 예도 또한 없는 실정이다.
조직배양에 의한 가시오갈피의 부정아 발생 및 체세포배 발생에 의한 식물체 재분화가 보고(Plant Cell Reports 9: 514-516, 1991; Korean J Plant Tissue Culture 20: 216-266, 1993)되었지만 이것은 한천배지에서 소규모로 이루어진 것이고, 본 발명과 같이 액체배지에서 배발생 세포주를 확립시킨 후 이들로부터 유식물체를 대량으로 생산하는 방법과는 다르다. 따라서 지금까지 가시오갈피를 조직배양에 의해 대량으로 생산하여 건강식품 및 건강보조식품으로 상업화하는 시스템과 이 유식물체로부터 유용성분을 추출하여 분석한 연구가 이루어지지 않았다.
본 발명자들은 조직배양기술을 이용하여 액체배지에서 현탁배양한 가시오갈피의 배발생 세포를 그물망으로 걸러 그물망을 통과한 것은 새배지에 옮겨 배지용으로 다시 사용하고, 그물망을 통과하지 못한 것은 밀도를 높게 현탁배양하여 체세포배 발생과정을 거처 유식물체를 대량으로 얻어 이들을 한천배지에 옮겨 생식용 식품으로 상품화한다.
또한, 대량으로 얻어진 가시오갈피 유식물체로부터 유효성분을 추출하여 의약품, 식품, 음료, 화장품, 차의 원료 및 신기능성 건강보조식품의 원료로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 가시오갈피 유식물체에 함유된 약리활성 물질은 은행잎 추출물, 인삼추출물 등과 같이 의약품 등에 폭 넓게 이용될 수 있다.
본 발명은 가시오갈피의 배발생 세포(Eleutheroccus senticosus/ Embryogenic cells)를 식물호르몬이 첨가되지 않은 MS 액체배지에서 현탁배양하여 증식시킨 후 250 μm 그믈망으로 걸러 망을 통과한 배발생 세포는 배지용으로 다시사용하고 망을 통과하지 못한 세포괴는 체세포배 발생과정을 통해 대량의 유식물체를 얻어, 이를 한천배지에 이식하여 이들 가시오갈피 유식물체를 무균상태의 생식용 식품으로 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 현탁배양으로 대량 생산한 가시오갈피 유식물체의 추출물을 이용하여 신기능성 의약품, 식품, 음료, 화장품, 차의 원료 및 건강보조식품 등의 원료로 제공하는데 있다.
도 1a는 식물호르몬 무첨가 MS 액체배지에서 현탁배양되는 가시오갈피 배발생 세포(Eleutherococcus senticosus/ Embryogenic cells) 및 세포괴의 사진이다
도 1b는 현탁배양한 배발생 세포를 증식시킨 후 250 μm 그물망으로 걸러주는 사진이다.
도 1c는 배발생 세포를 2,000 ml의 액체배지가 들어 있는 5,000 ml 용기에서 배양하여 체세포배를 대량으로 유도한 것을 나타낸 사진이다.
도 1d는 도 1c와 같은 조건에서 2-3주 간격으로 4-5회 계대배양하여 한천배지에 옮기기 전의 유식물체를 나타낸 사진이다.
도 1e는 유식물체를 한천배지에 옮겨 자엽과 유근을 생장시켜 건강식품으로 상품화한 것을 나타낸 사진이다.
본 발명은 가시오갈피의 배발생 세포를 300 ml의 식물호르몬이 첨가되지 않은 MS 액체배지가 들어있는 1,000 ml의 삼각플라스크에서 20일 정도 현탁배양(이하 모두 rpm 100)하여 약 10배 정도로 증식시킨 후 250 μm 그물망으로 걸러 그물망을 통과한 세포(전체 생중량의 약 1/10)는 배지용으로 재사용하였다. 이 배발생 세포는 300 ml의 새로운 배지를 동일한 양으로 첨가하여 배양하였을 때 잘 증식되었다. 그물망을 통과하지 못한 세포괴(전체생중량의 약 9/10)는 2,000 ml의 식물호르몬 무첨가 MS 액체배지가 들어있는 5,000 ml의 용기에서 2-3주 간격으로 3-4회 계대배양하였을 때 체세포배 발생과정을 통해 유식물체를 유도할 수 있었다. 이들은 이식하기 전에 구멍 크기가 7 mm인 그물망으로 걸러 균일한 유식물체를 MS 한천배지가 들어있는 멸균된 페트리디쉬에 무균적으로 옮겨(생중량 약 10 g) 1주일 정도 형광빛 아래에서 배양하였다. 유식물체가 한천배지의 환경에 잘 적응하는 것이 확인되면 다시 새 한천배지에 페트리디쉬당 약 200여개(생중량 약 1.2 g)씩 이식하여 1주일 동안 배양한 후 가시오갈피 유식물체를 무균상태의 생식용 식품으로 상품화한다. 그리고 가시오갈피 유식물체 추출물을 얻기 위하여 메탄올이나 에탄올 등의 유기용매로 추출하고 다시 핵산(n-Hexane)으로 분획한 후 에칠아세테이트(Ethyl acetate)로 분획하고, 재차 부탄올(n-Buthanol)로 분획한 가시오갈피 유식물체 추출물은 항산화, 항지질과산화, 항암, 항바이러스, 항미생물에 대하여 활성이 있다. 본 발명의 가시오갈피 유식물체의 추출방법은 다음과 같다.
제1단계: 상기의 핵산으로 분획한 가시오갈피 유식물체 추출물을 핵산에 용해시킨 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography: 7734, Merck) 컬럼으로 핵산, 핵산:에칠아세테이트, 에칠아세테이트, 에칠아세테이트:메탄올, 메탄올의 용매를 사용하여 순차적으로 활성 물질을 용출시켰다. 이과정에서 인체 암세포주, 바이러스, 미생물에 활성을 나타내는 분획을 얻고 다시 2차로 핵산:아세톤을 이용하여 실리카겔(9385, Merck) 컬럼을 실시하여 용출시키고, 활성분획을 ODS 중압 컬럼을 실시함으로서 항암, 항바이러스 및 항미생물 활성을 나타내는 활성물질을 부분 정제하였다.
제2단계: 상기의 에칠아세테이트(Ethyl acetate)로 분획한 가시오갈피 유식물체 추출물을 메탄올과 증류수 1대1비율로 혼합한 용매로 용해시킨 다음 실리카겔(7734, Merck) 컬럼으로 벤젠, 벤젠:에칠아세테이트, 에칠아세테이트, 에칠아세테이트:메탄올, 메탄올의 용매를 사용하여 순차적으로 활성 물질을 용출시켰다. 이과정에서 항산화 및 항지질과산화 활성을 나타내는 분획을 얻고 다시 2차로 벤젠:아세톤을 이용하여 실리카겔(9385, Merck) 컬럼을 실시하여 용출시키고, 활성분획을 ODS 중압 컬럼을 실시함으로서 항산화 및 항지질과산화 활성을 나타내는 활성물질을 부분 정제하였다.
제3단계: 상기 부탄올(n-BuOH)로 분획한 가시오갈피 유식물체 추출물을 메탄올과 증류수 2대8의 비율로 혼합한 용매로 용해시킨 다음 10% 메탄올(증류수 대비)에서 95%메탄올(증류수 대비)의 그래디언트(gradient system, fraction size: 5ml) 용매조건으로 ODS 중압 컬럼을 실시함으로서 항산화 및 항지질과산화 활성을 나타내는 분획을 얻고 다시 2차로 50% 메탄올을 이용하여 세파덱스 컬럼을 실시하여 항산화 및 항지질과산화 활성을 나타내는 분획을 얻고, 3차로 에칠아세테이트:메탄올:증류수 6대3.5대0.5의 비율로한 용매조건으로 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피를 실시하여 항산화 및 항지질과산화 활성을 나타내는 활성물질을 정제하였다.
제4단계: 상기 증류수(H2O)로 분획한 가시오갈피 유식물체 추출물을 메탄올과 증류수로 1대9비율로 혼합한 용매로 용해시킨 다음 10% 메탄올(증류수 대비)에서 95% 메탄올(증류수 대비)의 그래디언트(gradient system, fraction size: 5 ml) 용매조건으로 세파덱스 중압 컬럼을 실시함으로서 항산화 및 항지질과산화 활성을 나타내는 분획부분을 정제하였다.
이하 본 발명을 다음의 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예가 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.
<실시예1>현탁배양에 의한 가시오갈피 배발생 세포
(Eleutherococcus senticosus
/ Embryogenic cells)로부터 대량의 유식물체 생산
가시오갈피의 배발생 세포(Eleutherococcus senticosus/ Embryogeniccells)를 300 ml의 MS hormone free 액체배지(pH 5.8로 조정하여 121℃, 1.2 기압하에서 습열 멸균)가 들어있는 1,000 ml의 삼각플라스크에서 rpm 100, 24℃, 암소(dark condition)에서 현탁 배양하였다. 본 발명의 가시오갈피 배발생 세포는 한국과학기술원 생명공학연구소내 유전자은행에 1998년 7월 14일 기탁번호 KCTC 0504BP로 기탁하였다. 배발생 세포는 상기 배양조건에서 분열증식을 계속하면 세포가 분열하여 세포괴(cell clusters)를 이루는데(도 1a), 20일 정도 배양하였을 때 약 10배 정도로 생중량이 증가하였다. 이들은 250 μm 그물망으로 걸러(도 1b) 그물망을 통과한 세포(전체 생중량의 약 1/10)는 새배지에 옮겨 전과 동일한 방법으로 배양하였을 때 배발생 세포는 배발생능을 유지하면서 증식되었다. 따라서 이 방법에 의해 배발생 세포는 영구적으로 유지 및 증식이 가능하다. 한편, 그물망을 통과하지 못한 세포괴(전체생중량의 약 9/10)는 2,000 ml의 식물호르몬 무첨가 MS 액체배지가 들어있는 5,000 ml의 용기에 옮겨 형광빛 조건에서 배양하였다. 세포괴가 대부분 구상형배로 되는 기간은 약 4- 5주 정도 필요한데 이는 체세포배 발생단계의 후기에 비해 비교적 긴 기간이다. 따라서 3주 후에 계대배양하면 세포괴와 구상형배가 혼재되어 있는데 이들을 균일한 시기의 것으로 나누기 위해 배양용기를 1-2분 정도 정치한 후 구상형배가 대부분 가라앉으면 천천히 다른 용기에 배지를 따라낸다. 이때 배지와 함께 먼저 옮겨지는 것은 무게가 가벼운 세포괴이고, 늦게까지 배지와 함께 남는 것은 세포괴보다 무거운 구상형배가 배부분이다. 이와 같이 중력을 이용한 동조 계대배양은 체세포배 발생과정에서 비교적 균일한 체세포배를 한 용기내에 모을 수 있다(도 1c). 체세포배가 성숙(자엽기 이후)함에 따라 계대배양시 배지의 양을 어린 체세포배 시기보다 약 1/3 적게하고, 계대배양 기간을 3주에서 2주 정도로 단축하였을 때 옅은 황녹색을 띄는 유식물체(또는 소식물체, plantlets)가 많이 발달하였다. 액체배지에서 유도된 유식물체는 구멍 크기가 7 mm인 그물망으로 걸러 그물망 위의 균일한 유식물체(그림 1d)를 약 10 g 정도씩 MS 한천(1.2% agar)배지가 들어있는 멸균된 페트리디쉬에 무균적으로 옮겨 형광빛 아래에서 1차 배양하였다. 이 과정에서 유식물체들은 액체배지의 환경에서 한천배지의 배양환경에 잘 적응할 수 있게 된다. 약 1주일 정도 배양한 가시오갈피 유식물체는 생장이 양호한 개체만을 선발하여 다시 한천배지의 페트리디쉬에 약 200여개(생중량 약1.2 g)씩 이식하여 1주일 정도 형광빛 아래에서 2차 배양하여 자엽과 뿌리가 정상적으로 발달한 균일한 유식물체로 키워 무균상태의 생식용 식품으로 상품화하였다(도 1e).
<실시예 2> 가시오갈피 소식물체 추출물의 용매 분획
상기에서 설명한 바와 같이 가시오갈피 유식물체에 메탄올 또는 에탄올로 추출한 다음 핵산, 에칠아세테이트, 부탄올등의 유기 용매로 순차적으로 분획함으로서 메탄올 및 에탄올 추출물, 핵산 분획, 에칠아세테이트 분획, 부탄올 분획 및 물 분획 등을 분리하였다.
조직배양법에 의하여 유도된 가시오갈피(Eleutherococcus senticosus) 유식물체 300g을 99.9%메탄올에 침적하고 균질기(Homogenizer; NIHONSEIKI, model; pH91)를 이용하여 마쇄(10,000rpm x 10min)한 후 실온에서 72시간 추출하여 얻은 메탄올 추출물 17.5 g에 증류수로 희석한 후 핵산(n-Hexane) 400 ml를 첨가하여 물층과 핵산층으로 분획하였다. 다시 물층에 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 400 ml를 첨가하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획하고, 계속하여 물층에 부탄올(n-Buthanol) 250 ml을 첨가하여 부탄올층과 물층으로 최종적으로 분획하였다. 상기에서 얻은 각 분획을 감압농축한 결과, 핵산분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획 및 물 분획물을 각각 772mg, 600mg, 2100mg, 11400g씩 얻었다.
또한, 상기에서 얻은 가시오갈피 유식물체 추출물을 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 중압 ODS 컬럼 크로마토그래피 및 세파덱스 컬럼 크로마토그래피 등을 수행하여 항산화, 항지질과산화, 항암, 항바이러스 및 항미생물 활성을 나타내는 활성물질을 정제하였다.
그 결과, 상기 가시오갈피 유식물체 추출물의 핵산 분획 및 에칠아세테이트 분획에서 약간의 항암(표 1), 항미생물(표 5), 항바이러스(표 4) 활성을 나타내고, 에칠아세테이트 분획과 부탄올 분획에서 항산화(표 2) 및 항지질과산화(표 3) 활성이 강하게 나타냄을 확인하였다.
<시험예 1> 가시오갈피 유식물체 추출물의 용매 분획의 항암활성 조사
상기 가시오갈피 유식물체 추출물에 대한 항산화, 항지질과산화, 항암, 항바이러스 및 항미생물 활성은 각 분획을 사용하여 다음과 같이 조사하였다. 본 발명은 가시오갈피 유식물체 추출물의 항암활성을 조사하기 위하여, 실시예 2에서 얻은 각 분획을 이용하여 인체 암세포에 대한 항암활성을 에스알비(SRB법, Skehan, et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 30: 612, 1989)방법으로 조사하였다. 이때 암세포주로는 전림선(Prostate)암세포주인 PC-3, 결장(Colon)암 세포주인 HCT-15와SW-620, 위(Renal)암 세포주인 ACHN, 폐(Lung)암 세포주인 A549, 백혈병(Leukemia) 세포주인 MOLT-4F를 사용하였다.
상기 암세포주는 10% 소태아 혈청이 포함된 RPMI 1640배지를 사용하여 배양하고, 배양된 세포는 일주일에 한번 또는 두 번 정도 분주하여 유지하였다. 항암활성을 측정하는데 사용하는 세포 농도는 3,000-6,000개/ml이었으며, 상기 방법에 사용한 모든 시약은 100% 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹이고 이를 단계적으로 희석하여 시료의 농도를 10, 3, 1, 0.3, 0.1 ㎍/ml로 맞추었다. 세포의 수를 측정하여 일정한 농도로 96-웰 플레이트에 분주하고 하루가 경과한 다음 세포가 나타내는 기본적인 흡광도를 나타내는데 필요한 Tz(Time/Zero) 플레이트로서 시료를 처리할 플레이트와 동일한 세포 농도를 가진 다른 플레이트를 50% TCA를 사용하여 고정하였다. 그리고 시료를 처리할 플레이트는 시료의 최종 농도를 0.1% DMSO로 맞추어 5가지 시료 농도로 처리하였다. Tz 플레이트는 1시간이 경과하면 수돗물(Tap water)로 세척하고, 시료를 처리한 플레이트는 2일이 경과한 다음 50% TCA를 웰당 50㎕씩 처리하여 고정하고 역시 1시간이 경과하면 수도물로 세척하였다. 세척한 플레이트는 상온에서 건조시키고, 그 후 0.4% SRB 용액(1% 아세트산에 용해되어 있는 용액)을 웰 당 100 ㎕씩 가한 다음 30분이 경과하면 1% 아세트산 용액으로 세척하였고 이를 다시 상온에서 건조 시켰다. 다음 10 mM 트리스 염기(pH 10.5)를 웰 당 100 ㎕씩 가하여 다시 용해시키고, 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 ELISA 해독기를 사용하여 540 nm에서 흡광도를측정하였다. 이 때 GI50(㎍/ml)은 암세포의 성장을 50% 억제하는 화합물의 농도를 나타낸다.
그 결과 표 1에서 나타낸 바와 같이, 핵산분획이 4종의 암세포주에 대해 성장을 억제하는 활성을 나타냄을 확인하였다. 특히 백혈병 암세포주인 MOLT-4F에 높은 활성을 나타내었다. 이 때 비교군으로 아드리아마이신(Adriamycin)을 사용하였다.
표 1. 각 용매분획의 인체 암세포주에 대한 항암활성 (단위 GI50: ㎍/ml)
| 분획/표준화합물 | 전림선암세포주 PC-3 | 결장암 세포주 HCT-15 | 위암 세포주 ACHN | 결장암 세포주 SW-620 | 폐암 세포주 A549 | 백혈병세포주 MOLT-4F | GI50 |
| 유식물체추출물 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| 핵산 분획 | 22.9 | 30 | 18.21 | 21.99 | 30 | 13.57 | 22.78 |
| 에틸아세테이트 분획 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| 부탄올 분획 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| 물 분획 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| 아드리아마이신 | 0.13 | 0.16 | 0.13 | < 0.03 | < 0.03 | 0.05 | 0.09 |
<시험예 2> 가시오갈피 유식물체 추출물 용매 분획의 항산화활성 조사
상기 가시오갈피 유식물체 추출물의 항산화 활성을 조사하기 위하여, 본 발명의 가시오갈피 유식물체 추출물의 용매 분획이 나타내는 항산화활성은 자유 라디칼(Free radical)인 1, 1-디페닐-2-피크릴하이드라질(1, 1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, DPPH)을 사용한 항산화활성 측정방법(Blois, Nature, 188: 1199, 1958; Choi, et al., Kor. J. Phamacogn, 24: 299-303, 1993)으로 조사하였다. 유리 시험관에 4ml의 메탄올을 넣고 시료 화합물을 농도 별 (1.5-30 ㎕)로 첨가한 다음 상기 DPPH(0.15 mM)용액을 1 ml첨가하여 실온에서 30분간 반응시키고 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 RC50(㎍/ml)은 화합물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 화합물의 농도를 나타낸다.
그 결과 표 2에서 나타낸 바와 같이, 에틸아세테이트분획, 부탄올 분획에서 강한 항산화 활성이 보였고 물 분획에서도 약간의 활성을 보였다. 이 때 비교군으로 알파-토코페롤(α-Tocoperol)을 사용하였다.
표 2. 각 용매분획의 항산화활성 (단위 RC50: ㎍/ml)
| 분획/표준화합물 | 항산화 활성(DPPH 라디칼 제거 활성) |
| 유식물체 추출물 | 12 |
| 핵산 분획 | 50 |
| 에틸아세테이트 분획 | 4 |
| 부탄올 분획 | 6 |
| 물 분획 | 19 |
| α-토코페롤 | 12 |
<시험예 3> 가시오갈피 유식물체 추출물의 용매 분획의 항지질과산화 활성 조사
상기 가시오갈피 유식물체 추출물의 항지질과산화 활성을 측정하기 위하여 본 발명의 가시오갈피 유식물체 추출물의 용매 분획이 나타내는 지질과산화 활성은 쥐 간의 마이크로좀을 이용하여 상기 화합물이 지질과산화를 저해하는 활성을 오카와(Ohkawa, et al., Anal. Biochem., 95: 351, 1979)등의 방법에 따라 조사하였다. 먼저 쥐의 간에서 마이크로좀을 분획하고 분리하여 100 ml 트리스-염산 완충용액(pH 7.4)에 현탁시켰다. 얻어진 마이크로솜 분획 0.3%와 농도별 화합물을혼합하여 그 혼합액에 500 μM FeSO4·7H2O를 첨가하고 37℃에서 30분 동안 진탕반응 시킨다음 20% TCA(3M 트리클로로아세트산 :2.5염화암모니움=1:1)을 첨가하여 반응을 정지 시켰다. 상기 반응을 통해 지질과산화물은 화합물의 농도에 따라 생성되는 말로디알데히드(Malondialdehyde, MDA)는 티오바빅튤릭산(Thiobarbituric acid, TBA)과 반응하게 되는데, 지질과산화 반응은 이 TBA반응산물을 측정하여 다음의 수학식 1로부터 % 지질과산화 저해 활성을 계산할 수 있다.
＜수학식 1＞ 1-(T-B)/C-B x 100
여기서 T는 화합물을 첨가한 과산화 반응이 일어난 시험군, C는 화합물을 첨가하지 않은 과산화 반응이 일어난 시험군 그리고 B는 과산화 반응이 이루어 지지않는 대조군에서 나타난 흡광도를 각각 530 nm에서 측정하여 얻은 값이다.
그 결과 표 3에 나타난 바와 같이, 에틸아세테이트 분획에서 강한 항지질과산화 활성이 보였고 부탄올 분획에서도 약간의 활성을 보였다. 이 때 비교군으로 알파-토코페롤(α-Tocoperol)을 사용하였다.
표 3. 각 용매분획의 항지질과산화 활성 (단위 RC50: ㎍/ml)
| 분획/표준화합물 | 항지질과산화 활성 |
| 유식물체 추출물 | 100 |
| 핵산 분획 | 100 |
| 에틸아세테이트 분획 | 5 |
| 부탄올 분획 | 49 |
| 물 분획 | 100 |
| α-토코페롤 | 2.8 |
<시험예 4> 가시오갈피 유식물체 추출물의 용매 분획의 간염 바이러스에 대한 활성 조사
상기 가시오갈피 소식물체 추출물의 항바이러스 활성은 세포의 형태 및 세포의 성장억제를 관찰하여 조사하고, 구체적으로는 간염바이러스에 대한 활성을 확인하였다. 본 발명의 가시오갈피 유식물체 추출물의 용매 분획이 나타내는 간염 바이러스에 대한 활성은 브렌트 및 존(Brent and John, Antiviral Research, 19: 55-70, 1992)의 방법에 준하여 조사 하였다. 간염 바이러스에 감염된 세포를 24 웰 플레이트에 접종하여(접종농도: 2 x 104세포/웰/2 ml) 24시간동안 반응시킨 다음, 배지를 0.01% 중성 적색 염색시약(Netural red dye)을 포함한 인산 완충용액 2 ml로 교체하고 본 발명의 시료를 농도별(0 - 50ppm)로 첨가하여 2시간동안 반응시켰다. 다음 이를 인산 완충용액으로 세척하고 1% 아세트산(Glacial acetic acid)을 포함한 50% 에탄올 용액으로 고정하여 30분 동안 가볍게 진탕하였다. 다음 현미경으로 세포의 형태가 변화하고 세포의 성장이 억제됨을 관찰하였다.
그 결과 표 4에서 나타난 바와 같이, 핵산 분획, 에틸아세테이트 분획에서 약간의 인체 간염바이러스의 성장을 억제하는 활성이 나타냈다.
표 4. 용매분획의 간염 바이러스에 대한 성장 억제 활성 (단위 RC50: ㎍/ml)
| 분획/표준화합물 | HepG2 | Hep3B | HeLa |
| 유식물체 추출물 | 25 | 50 | 25 |
| 핵산 분획 | 12.5 | 25 | 12.5 |
| 에틸아세테이트분획 | 25 | 25 | 25 |
| 부탄올 분획 | 50 | 50 | 50 |
| 물 분획 | 50 | 50 | 50 |
본 발명의 가시오갈피 유식물체 추출물의 용매 분획이 나타내는 항미생물 활성은 고바야시(Kobayashi, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58: 133-134, 1994)등의 방법에 따라 조사하였다. 곰팡이 균주로는 아스페리길루스 아와모리 (Asperigillus awamori), 클라도스포리움 허바룸(Cladosporium herbarum), 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum)을 사용하고, 이들 곰팡이 배양용 PDB 슬란트(Slant)에 곰팡이 포자발아저해시험용 배지 2 ml를 첨가하여 유리봉으로 상기 상기 곰팡이 포자를 분리 시키고 이를 다시 가제로 여과하였다. 그 여과액을 얻에 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 현미경으로 관찰하면서 시야에 50개의 포자가 관찰될때까지 희석하였다. 상기의 시료를 4 에서 1000ppm 농도까지 제조하여 상기 웰에 가하고 27℃에서 24시간 동안 암배양 후 현미경으로 포자발아가 저해되는 활성을 측정하였다.
또한, 세균균주로는 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 에스체리시아 콜라이(Escherichia coli)를 사용하고, 이들 세균주들을 NB배지 10 ml에 이식하여 27℃에서 12시간 동안 진탕배양한 후 바실루스 섭틸리스는 106/ml, 에스체리시아 콜라이는 107/ml이 되도록 NB배지로 희석한다. 그 다음 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 상기의 시료를 4 에서 1000 ppm 농도까지 제조하여 상기 웰에 가하고 27℃에서 24시간 동안 암배양 후 현탁도를 기준으로 세균 성장저해 활성을 측정한다.
그 결과 표 5에서 나타난 바와 같이, 페니실리움 옥살리쿰(Penicilliumoxalicum) 곰팡이 균주에서 전반적으로 약한 활성을 보였고, 에스체리시아 콜라이(Escherichia coli) 세균주에서 핵산 분획, 에틸아세테이트 분획에서 성장을 억제하는 활성이 나타냈다.
표 5. 각 용매분획의 항미생물 활성 (단위 MIC: ㎍/ml)
| 분획/표준화합물 | Asperigillus awamori | Cladosporium herbarum | Penicillium oxalicum | Bacillus subtilis | Escherichia coli |
| 유식물체 추출물 | 1000 | 1000 | 500 | 1000 | 1000 |
| 핵산 분획 | 1000 | 1000 | 500 | 1000 | 125 |
| 에칠아세테이트 분획 | 1000 | 1000 | 500 | 1000 | 250 |
| 부탄올 분획 | 1000 | 1000 | 500 | 1000 | 1000 |
| 물 분획 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
상기 과정을 통하여 제조된 본 발명의 추출물이 치료용 약제로 이용되기 위해서는 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체(Carrier), 부형제(Forming agent), 희석제(Diluent)등과 혼합하여, 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한, 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일에 2-5 mg정도를 투여하나 10 mg정도를 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 단위 투여형 제제는 전술한 유효량 범위를 고려하여 본 발명의 활성물질을 10-100 mg을 함유하도록 제형화하는 것이 좋다. 바람직하게는 5-20 mg을 함유하도록 제형화하는 것이 좋다. 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 가시오갈피 배발생 세포를 현탁배양하여 무한정으로 증식시켜 짧은 기간내에 간편하게 가시오갈피 유식물체를 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공한다. 이 유식물체는 MS 한천배지가 들어있는 멸균된 페트리디쉬에서 자엽과 뿌리가 정상적으로 발달한 균일한 유식물체로 성장시켜 무균, 무공해의 생식용 가시오갈피를 상품화할 수 있다.
또한, 본 발명의 가시오갈피 유식물체 추출물 및 용매 분획물들은 항암, 항바이러스, 항미생물, 항산화, 항지질과산화에 대한 활성을 나타내므로 이들 천연성분을 의약품 이외에도 식품첨가물, 음료첨가물, 화장품첨가물, 차의 원료 및 건강보조식품 등에 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (10)
- 가시오갈피 배발생세포(Eleutheroccus senticosus/Embryogenic cells, 세포기탁번호 KCTC 0504BP)를 호르몬 무첨가 액체배지에서 10-20여일간 암소에서 현탁배양하여 배발생 세포가 분열증식하여 대량으로 증식시키는 공정과: 배발생 세포 및 세포괴를 150-300 μm 그물망을 사용하여 그물망을 통과한 배발생능이 있는 세포가 함유된 여액과 그물망을 통과하지 못한 세포괴를 분리하는 공정과: 전기의 그믈망을 통과하지 못한 배발생 세포괴를 호르몬 무첨가 액체배지에 옮겨 형광빛 하에서 현탁배양하여 균일한 체세포배발생과정을 통해 다량의 유식물체를 얻어 5-9 mm의 그물망으로 걸러 분리회수하는 공정과: 균일한 유식물체를 MS 한천배지에 옮겨 형광빛 아래에서 5-9일간 배양하는 공정과: 생장이 양호한 가시오갈피 유식물체를 선발하여 재차 한천배지에 이식하여 5-9일간 형광빛 아래에서 배양하여 자엽과 뿌리가 정상적으로 발달한 균일한 유식물체를 얻는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 가시오갈피 배발생 세포로부터 유식물체의 제조방법.
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- 제 1항에 있어서, 배발생 세포와 세포괴를 분리하여 그물망을 통과한 배발생능 세포가 함유된 여액을 배지용으로 재 사용하는 것을 특징으로 하는 가시오갈피배발생 세포로 부터 유식물체의 제조방법.
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