CN105796579A

CN105796579A - 抗老年性脑痴呆药物

Info

Publication number: CN105796579A
Application number: CN201410844959.3A
Authority: CN
Inventors: 师彦平; 戚欢阳
Original assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2016-07-27

Abstract

本发明公开了一种抗老年性脑痴呆药物，该药物由金盏花有效组分和药用添加剂组成，其中金盏花有效组分在药物中所占的重量百分数为15%~80%；金盏花有效组分由槲皮万寿菊素、槲皮万寿菊素-7-甲醚和槲皮万寿菊素-7-<i>O</i>-葡萄糖苷组成。该药物具有药效明确，剂型稳定，毒副作用低，制备成本低的优点。

Description

抗老年性脑痴呆药物

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种抗老年性脑痴呆药物。

背景技术

金盏花（marigold）为菊科万寿菊属万寿菊（TageteserectaLinn.）的花，金盏花常通过发酵的方式制成干花颗粒，目前金盏花及其干花颗粒是提取叶黄素酯和制备叶黄素的最佳原料。自1985年研究确定叶黄素和玉米黄素是视网膜黄斑色素的组成成分后，欧美科研人员对叶黄素进行了深入研究，不仅证明叶黄素有着类胡萝卜素的抗氧化活性，而且发现及时补充叶黄素，可预防位于眼球视网膜中心含高密度视觉细胞的黄斑因老年性退化引起的视力下降与失明，降低患白内障的几率；能够抵御自由基对人体细胞和机体（器官）损伤，从而可以预防细胞和机体衰老，提高免疫系统功能，防止因机体衰老引起的心血管硬化、冠心病和肿瘤等疾病的发生。联合国FAO/WHO食品添加剂专家委员会（JECFA）和欧洲经济共同体（EEC）许可叶黄素为天然食用色素和具有营养素及营养着色双重作用的食品添加剂。美国FDA在1995年批准叶黄素作为食品营养补充剂。我国也于2008年批准叶黄素酯为新资源食品的公告（卫生部公告2008年第12号）。我国先后在东北、华北、西北地区投资建立金盏花种植基地，现已形成一定规模和优势。

老年性脑痴呆又称阿尔茨海默病（AD），是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。病理改变主要为皮质弥漫性萎缩，沟回增宽，脑室扩大，神经元大量减少，并可见老年斑，神经原纤维结等病变，胆碱乙酰化酶及乙酰胆碱含量显著减少。

AD的重要病理特征为海马等重要部位的神经元丢失，阻断神经元凋亡可改善学习记忆能力并减慢AD的进展。β淀粉样蛋白(Aβ)可以激活通常情况下处于静止状态的神经元，使之重新进入细胞周期，但终极分化的神经元由于自身有丝分裂能力的限制，不能协调地经过细胞周期的各个阶段，只能停滞在细胞周期的某一过渡点，从而导致细胞凋亡。因此，对细胞周期进程有抑制作用的药物可能改善AD的神经元凋亡。

目前，针对老年性脑痴呆、脑神经损伤等疾病仍缺乏毒副作用较低的天然药物来源的理想治疗药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗老年性脑痴呆药物。

抗老年性脑痴呆药物，其特征在于该药物由金盏花有效组分和药用添加剂组成，其中金盏花有效组分在药物中所占的重量百分数为15%~80%；所述金盏花有效组分由槲皮万寿菊素、槲皮万寿菊素-7-甲醚和槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷组成。

所述药用添加剂包括可溶性淀粉、蔗糖、糊精、糖蜜素、柠檬酸和薄荷油，在药物中所占的重量百分数依次为10%~60%、1%~15%、1%~15%、0.5%~3%、0.5%~3%、0.5%~3%。

所述药用添加剂还包括硬脂酸镁，在药物中所占的重量百分数为0.5%~3%。

所述槲皮万寿菊素、槲皮万寿菊素-7-甲醚和槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷在所述金盏花有效组分中的重量百分比均不小于0.01%。

所述金盏花有效组分的制备方法包括如下步骤：

1）在粉碎干燥后的金盏花或金盏花干花颗粒粉末中加入5~10倍重量的质量浓度为40%~95%乙醇水溶液进行提取；

2）提取液经过滤、减压回收至无醇味，得浓缩液或浓缩成总浸膏后加水制成混悬液；

3）浓缩液或混悬液上大孔吸附树脂柱，先用水洗涤至流出液无色即得洗脱液I，然后用质量浓度为40%~85%的乙醇水溶液洗涤，流出液经紫外分光光度仪检测至其在359nm处无紫外吸收为止即得洗脱液II；将洗脱液II浓缩至无醇味，干燥，即得金盏花有效组分。

所述步骤1）中提取的次数为1~3次，提取的时间为1~3小时。

所述步骤2）中加水的重量为所述总浸膏重量的2~5倍。

所述步骤3）中大孔吸附树脂的型号为D101。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

A）该药物具有药效明确，剂型稳定，毒副作用低，制备成本低的优点。

B）以大宗栽培的金盏花的干燥花或干花颗粒为原料，研究出一种制备金盏花有效组分的制备方法，该制备方法原料资源丰富，且具有药用及可食性的特点，制备工艺简单、经济，质量可控，适合大规模生产。

C）该有效组分中含有三种多羟基黄酮类活性成分，具有抗老年性脑痴呆的活性，可以用于药品及保健品的添加剂或作为原料。

具体实施方式

为了更清晰的理解本发明，以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1

取粉碎后金盏花1000g，加入5L的质量浓度为40%乙醇水溶液提取1次，提取的时间为1小时。提取液过滤、减压回收至无醇味，得浓缩液500mL。浓缩液上D101大孔吸附树脂柱，先用水洗涤至流出液无色得洗脱液I，然后用质量浓度为40%的乙醇水溶液洗涤，流出液经紫外分光光度仪检测至其在359nm处无紫外吸收为止得洗脱液II；将洗脱液II浓缩至无醇味，干燥，即得金盏花有效组分。经HPLC检测确定，金盏花有效组分是由重量百分数分别为0.01%的槲皮万寿菊素、0.05%的槲皮万寿菊素-7-甲醚、99.94%的槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷组成。

实施例2

取粉碎后金盏花干花颗粒500g，加入10L的质量浓度为95%乙醇水溶液提取3次，提取的时间为3小时/次。提取液过滤、减压回收至无醇味，得总浸膏100g，加入200mL水制成混悬液。混悬液上D101大孔吸附树脂柱，先用水洗涤至流出液无色得洗脱液I，然后用质量浓度为85%的乙醇水溶液洗涤，流出液经紫外分光光度仪检测至其在359nm处无紫外吸收为止得洗脱液II；将洗脱液II浓缩至无醇味，干燥，即得金盏花有效组分。经HPLC检测确定，金盏花有效组分是由重量百分数分别为99.94%的槲皮万寿菊素、0.05%的槲皮万寿菊素-7-甲醚、0.01%的槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷组成。

实施例3

从洗脱液II中分离制备的三种多羟基黄酮醇类化合物，其结构表征数据如下：

槲皮万寿菊素（Quercetagetin），分子式：C₁₅H₁₀O₈。黄色无定形粉末。¹HNMR(400MHZ,TMS,DMSO-d₆,δ,ppm,J/Hz):7.66(1H,s,H-2'),6.87(1H,d,J=8.8,H-5'),7.52(1H,d,J=8.4,H-6'),6.49(1H,s,H-8).¹³CNMR(100MHz,TMS,DMSO-d ₆,δ,ppm):146.6(C,C-2),135.3(C,C-3),175.8(C,C-4),145.9(C,C-5),128.5(C,C-6),153.6(C,C-7),93.3(CH,C-8),148.8(C,C-9),103.3(C,C-10),122.2(C,C-1'),115.1(CH,C-2'),145.1(C,C-3'),147.6(C,C-4'),115.6(CH,C-5'),119.9(CH,C-6')。

槲皮万寿菊素-7-甲醚（Quercetagetin-7-methylether），分子式：C₁₆H₁₂O₈。黄色无定形粉末。¹HNMR(400MHz,TMS,acetone-d ₆,δ,ppm,J/Hz):7.82(1H,s,H-2),6.59(1H,s,H-8),6.99(1H,d,J=8.4,H-5'),7.70(1H,d,J=8.4,H-6'),3.86(3H,s,OCH₃).¹³CNMR(100MHz,TMS,acetone-d₆,δ,ppm):146.8(C,C-2),136.1(C,C-3),176.5(C,C-4),153.7(C,C-5),131.3(C,C-6),157.6(C,C-7),94.2(CH,C-8),152.7(C,C-9),104.2(C,C-10),123.4(C,C-1'),115.4(CH,C-2'),145.5(C,C-3'),148.1(C,C-4'),115.9(CH,C-5'),121.1(CH,C-6'),60.4(OCH₃)。

槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷（Quercetagetin-7-O-glucoside），分子式：C₂₁H₂₂O_14。黄色无定形粉末。¹HNMR(400MHz,TMS,acetone-d ₆,δ,ppm,J/Hz):7.69(1H,d,J=2.4,H-2'),6.89(1H,d,J=8.4,H-5'),7.53(1H,dd,J=2.4,8.4,H-6'),6.94(1H,s,H-8),5.0(1H,d,J=3.2,H-1''),3.74-3.2(m,othersugarprotons).¹³CNMR(100MHz,TMS,acetone-d ₆,δ,ppm):147.5(C,C-2),129.6(C,C-3),176.1(C,C-4),145.3(C,C-5),129.6(C,C-6),151.6(C,C-7),93.5(CH,C-8),148.1(C,C-9),105.1(C,C-10),122.0(C,C-1'),115.4(CH,C-2'),145.0(C,C-3'),147.8(C,C-4'),115.9(CH,C-5'),119.9(CH,C-6'),100.9(CH,C-1''),73.2(CH,C-2''),75.8(CH,C-3''),69.6(CH,C-4''),77.3(CH,C-5''),60.6(CH₂,C-6'')。

实施例4

为证明本发明所得金盏花有效组分的技术效果，特作以下抗AD活性试验。以SH-SY5Y细胞系（人神经母细胞瘤细胞）为作为神经元代表，在β淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导凋亡的阿尔茨海默症(AD)体外细胞模型上测定金盏花有效组分对神经元的保护作用。

1．实验材料

1.1细胞株：

SH-SY5Y细胞系来自于南京凯基生物科技发展有限公司，细胞株在20-35代进行试验。

1.2试剂：

金盏花有效部位为实验室自制并表征；1640培养基（南京凯基生物科技发展有限公司）；小牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶（南京大治生物技术有限公司）；Aβ25-35（Sigma公司）；小檗碱（中检院）；Hoechst33342（Sigma公司）；Propidiumiodide（Sigma公司）；其它试剂均为分析纯。

1.3仪器：

超净工作台（上海洁佳）；CO₂细胞培养箱（ThermoFisherScientific，3111）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂，xds-1B）；移液枪（eppendorf）；细胞自动计数仪（invitrogen，countess）；高内涵设备（MD）

1.4药品配制

Hoechst33342溶液：100mgHoechst33342溶于10mlPBS中，配成10mg/ml母液，-20℃保存。

Propidiumiodide溶液：250mgPropidiumiodide溶于12.5mlDMSO中，配成20mg/ml母液，-20℃保存。

Aβ25-35溶液：1mgAβ25-35溶于943μl无菌超纯水中，配成1mM的母液，放于37℃培养箱中老化7d，-20℃保存备用。

样品及阳性药小檗碱：称取一定量的样品粉末，均用DMSO溶解为10mg/ml母液，-20℃保存备用。

2．实验方法

2.1细胞培养

细胞传代接种于培养瓶中，于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，当培养瓶中的细胞基本长满后（细胞保持在对数生长期），弃去培养液，加入适量PBS溶液轻轻荡洗，弃去，然后加入0.25%胰蛋白酶溶液0.5ml消化2-3分钟（37℃），加入含有血清的培养基（完全培养基）2ml终止胰酶的作用，将细胞转入玻璃离心管中，1000r，离心4min，弃去上清，加入完全培养基，小心吹打成单细胞。细胞自动计数仪计数，然后用完全培养基稀释到细胞浓度约为6×104个/mL,按照每孔100μL接种于96孔细胞培养板中，边缘孔加100μLPBS，继续于37℃、5%CO₂培养箱中培养18-20小时左右后进行给药试验。

2.2分组及给药

实验设DMSO组（加入100μL含1/1000DMSO的空白培养基）、模型组（加入100μL含1/1000DMSO的空白培养基）、阳性对照组（加入100μL含25μg/ml小檗碱的空白培养基，DMSO含量在1/1000）和样品组（加入100μL含25μg/ml样品的空白培养基，DMSO含量在1/1000）。每组设3个复孔。药物作用4h后，DMSO组加入100μL无血清空白培养基，模型组、阳性药组及样品组均加入100μL含20μM的Aβ25-35溶液（终浓度为10μM），板中终体积为200μL，继续孵育48h。

2.3Hoechst33342和Propidiumiodide双染

Aβ25-35损伤细胞48h后，弃掉板中所有液体，无血清培养基洗板一次，各孔加入100μL的Hoechst33342/Propidiumiodide染液（用无血清1640培养基稀释母液，Hoechst33342终浓度10μg/ml，Propidiumiodide终浓度15μg/ml），避光，放入细胞培养箱中孵育10min后，无血清培养基洗板一次，每孔加入100μL无血清培养基，高内涵设备摄片。（PI染色计为阳性细胞，1-阳性细胞率为细胞存活率）

3．实验结果

表1金盏花有效组分对Aβ25-35致SH-SY5Y细胞损伤模型的保护作用

分组	细胞存活率1	细胞保护率1	细胞存活率2	细胞保护率2
					DMSO组	99.06		98.96
Aβ25-35	67.42		74.18
					小檗碱	99.63	101.80	98.84	99.51
金盏花有效组分	99.04	99.94	99.03	100.79

4.实验结论：

实验结果表明金盏花有效组分能显著提高用Aβ处理的SH-SY5Y细胞的存活率，减少Aβ导致的SH-SY5Y细胞凋亡，有神经保护作用，可以成为AD治疗的理想候选药物或保健品。

实施例5

抗老年性脑痴呆药物，由金盏花有效组分、可溶性淀粉、蔗糖、糊精、糖蜜素、柠檬酸和薄荷油组成，各组分在药物中的重量百分数为：金盏花有效组分15%、依次加入60%可溶性淀粉、1%蔗糖、15%糊精、3%糖蜜素、3%柠檬酸、2%薄荷油以及适量85%乙醇。可用来制成片剂，包括普通片剂和口含片，压片时加入1%硬脂酸镁。

实施例6

抗老年性脑痴呆药物，由金盏花有效组分、可溶性淀粉、蔗糖、糊精、糖蜜素、柠檬酸和薄荷油组成，各组分在药物中的重量百分数为：金盏花有效组分80%、依次加入10%可溶性淀粉、1%蔗糖、7.5%糊精、0.5%糖蜜素、0.5%柠檬酸和0.5%薄荷油以及适量85%乙醇。可用来制成固体颗粒剂。

实施例7

含金盏花有效组分的含片制备（湿法制粒）：根据中药片剂防吸湿、潮解、霉变等辅料添加的要求，同时考虑到制剂的低成本，选用辅料为可溶性淀粉、蔗糖、糊精、硬脂酸镁、柠檬酸等（药用级）。称取实施例1所得的金盏花有效组分5g（17.79%）、可溶性淀粉11g、蔗糖5g、糊精6g、乙醇85%适量、硬脂酸镁0.3g（压片时加入）、糖蜜素0.2g、柠檬酸0.5g、薄荷油（300mL85%的乙醇中加15mL）。处方中金盏花有效组分及辅料混匀后，于制粒机中湿法制粒，压片时加入0.3g硬脂酸镁，制成长椭圆形的异型口含片，每片重0.75g，每片中含多羟基黄酮醇0.133g。此口含片采用防潮性好、耐热、耐寒性好、方便运输、携带及贮存的铝塑包装（11cm×5.6cm），8片/板，1板/盒，可供4天服用。

实施例8

含金盏花有效组分的颗粒剂（湿法制粒）：称取实施例1所得的金盏花有效组分10g（35.58%）、可溶性淀粉8g、蔗糖5g、糊精4g、乙醇85%适量、糖蜜素0.2g、柠檬酸0.5g、薄荷油（10mL）。处方中金盏花有效组分及辅料混匀后，于制粒机中湿法制粒，干燥后即得。

Claims

1.抗老年性脑痴呆药物，其特征在于该药物由金盏花有效组分和药用添加剂组成，其中金盏花有效组分在药物中所占的重量百分数为15%~80%；所述金盏花有效组分由槲皮万寿菊素、槲皮万寿菊素-7-甲醚和槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷组成。

2.如权利要求1所述的药物，其特征在于所述药用添加剂包括可溶性淀粉、蔗糖、糊精、糖蜜素、柠檬酸和薄荷油，在药物中所占的重量百分数依次为10%~60%、1%~15%、1%~15%、0.5%~3%、0.5%~3%、0.5%~3%。

3.如权利要求2所述的药物，其特征在于所述药用添加剂还包括硬脂酸镁，在药物中所占的重量百分数为0.5%~3%。

4.如权利要求1所述的药物，其特征在于所述槲皮万寿菊素、槲皮万寿菊素-7-甲醚和槲皮万寿菊素-7-O-葡萄糖苷在所述金盏花有效组分中的重量百分比均不小于0.01%。

5.如权利要求1所述的药物，其特征在于所述金盏花有效组分的制备方法包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的药物，其特征在于所述步骤1）中提取的次数为1~3次，提取的时间为1~3小时。

7.如权利要求5所述的药物，其特征在于所述步骤2）中加水的重量为所述总浸膏重量的2~5倍。

8.如权利要求5所述的药物，其特征在于所述步骤3）中大孔吸附树脂的型号为D101。