CN111201320B - 具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分或组合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法等。具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法包括：将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度；在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液；以及在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液。

Description

具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分或组合物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法，以及具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分的制备方法等。
背景技术
在培养细胞的情况下，对于许多确立的细胞株，如果在细胞增殖而覆盖培养容器表面的时期时用胰蛋白酶等分散、将细胞在新鲜的培养基中稀释、向其他培养容器转移并进行培养，则它们能够进行无限增殖。此过程称为传代，但如果不进行传代而直接继续培养，则细胞会死亡。
在专利文献1中，公开了从培养恶性肿瘤细胞后的培养基中去除肿瘤细胞而获得恶性肿瘤细胞增殖抑制剂。然而，从培养基中去除恶性肿瘤细胞而获得的剩余物是含有极为复杂的物质的组合物，认为从这样的组合物分离具有抗肿瘤活性的物质会非常困难，并且事实上是不可能的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭59-33223号公报
发明内容
迄今为止以癌症治疗为目的而进行了各种治疗剂的研究与开发，但以往的抗癌剂副作用大，往往不能获得足够的效果，因此仍需寻求进一步的药剂开发。
根据本发明的一个方面，可以提供一种用于从培养的细胞制造能够用作新型抗癌剂的组合物，或者可用于获得作为新型抗癌剂而有用的物质的组合物的方法。
另外，根据本发明的一个方面，可以提供一种能够获得具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分的方法。
本发明人等进行了深入研究，结果新发现：在细胞覆盖培养容器表面并进一步增殖为过密度(overpopulation)而出现增殖受到抑制的时期，即使更换培养基来补充充分的营养源和能源也会出现在不进行传代而继续培养细胞的情况下的细胞死亡的现象。
另外，本发明人等新发现：即使将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度并且然后将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液(不含营养源和/或能源)的情况下，所述细胞也产生了导致自身最终死亡的物质。这个发现表明，细胞仅以在细胞内存在的物质为材料产生具有细胞杀伤活性的物质，导致自身最终死亡。这样的发现迄今为止未在任何报告中有所提示，并且能够利用生理缓冲盐溶液获得从恶性肿瘤来源的细胞提取的具有细胞杀伤活性的成分，是完全出乎意料的。
本发明的一种实施方案涉及以下内容：
〔1〕具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法，包括：
将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度，
在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，以及
在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液。
〔2〕根据上述〔1〕所述的制造方法，其中，所述生理缓冲盐溶液不含有葡萄糖。
〔3〕根据上述〔1〕或〔2〕所述的制造方法，其中，所述生理缓冲盐溶液选自由汉克氏平衡盐溶液、厄尔氏平衡盐溶液和磷酸盐缓冲生理盐水组成的组。
〔4〕根据上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的制造方法，还包括：
获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物，以及
将所述干燥物溶解在介质中，从得到的溶液中去除盐类、核酸和蛋白质。
〔5〕根据上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的制造方法，其中，所述具有细胞杀伤活性的组合物包含来自所述恶性肿瘤来源的细胞的细胞提取物成分。
〔6〕细胞提取物成分的制备方法，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，其中，所述细胞提取物成分具有细胞杀伤活性，该方法包括：
将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度，
在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，
在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液，
获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物，
使用含有碳原子数为1～3的醇的溶剂提取所述干燥物，对得到的溶液进行干燥，
将所述溶液的干燥物溶解于水中，向得到的水溶液中添加非极性有机溶剂以形成水层和有机层，并提取所述水层，以及
通过色谱从所述水层分离来自所述恶性肿瘤来源的细胞的细胞提取物成分。
〔7〕根据上述〔6〕所述的制备方法，其中，所述色谱包括凝胶过滤色谱和/或阳离子交换色谱。
〔8〕根据上述〔1〕～〔7〕中任一项所述的制造方法或制备方法，其中，所述恶性肿瘤来源的细胞是未进行基因操作且在不加入除培养液以外的生理活性物质的情况下培养的细胞。
〔9〕具有细胞杀伤活性的组合物，其是通过上述〔1〕～〔5〕和〔8〕中任一项所述的制造方法获得的。
〔10〕细胞提取物成分，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，所述细胞提取物成分是通过上述〔6〕或〔7〕所述的制备方法获得的。
〔11〕用于癌症治疗的药物组合物，其含有具有细胞杀伤活性的组合物，所述具有细胞杀伤活性的组合物是通过上述〔1〕～〔5〕和〔8〕中任一项所述的制造方法获得的。
〔12〕用于癌症治疗的药物组合物，其含有细胞提取物成分作为有效成分，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，其中，所述细胞提取物成分是通过上述〔6〕或〔7〕所述的制备方法获得的。
〔13〕具有细胞杀伤活性的组合物在用于制造治疗癌症用的药物中的用途，所述具有细胞杀伤活性的组合物是通过上述〔1〕～〔5〕和〔8〕中任一项所述的制造方法获得的。
〔14〕细胞提取物成分在用于制造治疗癌症用的药物中的用途，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，其中，所述细胞提取物成分是通过上述〔6〕或〔7〕所述的制备方法获得的。
根据本发明的一个方面，能够廉价、简便和/或在短时间内制造能够用作新型抗癌剂的组合物或可用于获得作为新型抗癌剂而有用的物质的组合物。
根据本发明的一个方面，能够廉价、简便和/或在短时间内获得具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分。具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分对各种的癌症均有效。
附图说明
图1是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用含血清培养基(含10％FBS的Eagle's MEM)在由HRC23制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。
图2是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用无血清培养基(Eagle's MEM)在由HRC23制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。
图3是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用生理缓冲盐溶液(不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液：HBSS-)在由HRC23制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。
图4是利用凝胶过滤色谱的色谱图。在A～H的8个组分中，检测到细胞杀伤活性的A组分用斜线示出(105分钟～141分钟)。
图5示出了在通过凝胶过滤色谱获得的A组分的连续稀释系列中通过MTT分析观察到的微孔板上的显色情况以及示出所测定的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。
图6是利用离子交换色谱的色谱图。检测到细胞杀伤活性的组分(Na2SO4浓度为165～170mM的组分)用斜线示出。
图7是利用凝胶过滤色谱的色谱图。在前面的峰中检测到细胞杀伤活性，在该峰中包含3个组分(Fr57、Fr58和Fr59)。
图8是关于组分57的质谱。
图9是关于组分58的质谱。
图10是关于组分59的质谱。
图11是关于仅基质的质谱。
图12是将组分58的谱图中m/z值为114.09的信号附近进行放大而显示的图。
图13是示出各种细胞的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用生理缓冲盐溶液(不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液：HBSS-)在由HRC23制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度将显示HRC23的生存率为0％的测试样品的最小浓度表示为任意单位(arbitrary unit)1。
图14是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用生理缓冲盐溶液(不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液：HBSS-)在由LLC制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。
图15是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用生理缓冲盐溶液(不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液：HBSS-)在由SKN制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。
图16是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用生理缓冲盐溶液(不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液：HBSS-；厄尔氏平衡盐溶液：Earle；磷酸盐缓冲生理盐水：PBS(+))在由HRC23制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。
图17是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用生理缓冲盐溶液(不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液：HBSS-)在由培养后的细胞密度不同的HRC23制作的各测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。
图18是示出LK-2的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用含血清培养基(含10％FBS的RPMI1640)或生理缓冲盐溶液(不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液：HBSS-)在由LK-2制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。
图19是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用含血清培养基(含10％FBS的RPMI1640)或生理缓冲盐溶液(不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液：HBSS-)在由LK-2制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。
具体实施方式
下面，对本发明进行详细说明。
本发明的一种实施方案涉及一种具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法，包括：
将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度，
在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，以及
在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液。
本说明书中，“恶性肿瘤来源的细胞”是指从恶性肿瘤获得的培养的细胞(原代培养细胞)或恶性肿瘤来源的确立的细胞系。予以说明，确立的经培养的细胞系具有以下共同点：如果进行传代则可以无限地培养，如果没有传代，则在新鲜的培养基中也会死亡。由此认为，细胞来源的具有细胞杀伤活性的物质参与“细胞的自然死亡”(坏死)以杀死细胞。因此，认为所有确立的细胞系是用于产生具有这样的细胞杀伤活性的物质的原料。
“恶性肿瘤”通常被称为癌症，并且以广义使用，包括癌、肉瘤和血液恶性肿瘤(造血系统肿瘤)。
例如，无论是上皮性还是非上皮性，“恶性肿瘤来源的细胞”可以是来自肺癌、胃癌、食道癌、肝癌、胆道癌、胰腺癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、皮肤癌、喉癌、结肠直肠癌、黑素瘤、甲状腺癌、纤维肉瘤、皮肤纤维肉瘤、子宫肉瘤、脂肪肉瘤、肌肉瘤、血管肉瘤、Kaposi肉瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、和骨髓瘤等癌症的细胞。这些癌症可以来自人，也可以来自小鼠等哺乳动物(人除外)。
另外，无论是上皮性还是非上皮性，“恶性肿瘤来源的细胞”不限于腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌和大细胞癌，也可以是来自包括肉瘤在内的所有组织学分型的癌症。
在本发明的一种实施方案中，“恶性肿瘤来源的细胞”可以是未进行基因操作且在不加入除培养液以外的生理活性物质的情况下培养而得的细胞。
在本发明的制造方法中，“将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度”可基于已知技术适当实施。
例如，培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度是指可以将细胞培养至汇合(confluent)的状态或将细胞培养至完全汇合(fully confluent)的状态。此外，培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度不限于上述情形，并且培养至60～100％、优选为70～100％汇合的状态，在细胞为粘附细胞的情况下，培养至培养容器的粘附面被完全覆盖或培养至培养容器的粘附面被覆盖至少80％左右，或者在细胞为浮游细胞的情况下，也可以培养至培养基的液面被完全覆盖或培养至培养基的液面被覆盖至少80％左右。从具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分的生产效率的角度出发，更优选将细胞培养至80～100％汇合的状态，进一步优选将细胞培养至90～100％汇合的状态，更进一步优选将细胞培养至汇合的状态或完全汇合的状态。对于细胞的密度是否至少达到不会妨碍传代的密度，可以基于本领域技术人员的普通知识而进行适当判断。
在本发明的制造方法中，培养基只要使用适合于所使用的恶性肿瘤来源的细胞的培养基即可。例如，培养基可举出：Eagle's MEM、Dulbecco改良的MEM、RPMI1640、HAM F-12、不需要FBS的完全合成培养基等。此外，根据需要，在这些培养基中也可以添加维生素、辅酶、氨基酸、金属离子、糖、细胞生长因子、白细胞介素、细胞因子、血清、血清来源的成分、抗生素等。
在本发明的制造方法中，使用的恶性肿瘤来源的细胞可以是已经传代的细胞，传代可以基于本领域技术人员的普通知识来进行。
在本发明的制造方法中，“将培养基更换为生理缓冲盐溶液”是指例如从培养烧瓶等培养容器去除培养基，然后将生理缓冲盐溶液添加到培养容器中。
生理缓冲盐溶液没有特别限定，例如可举出：汉克氏(Hanks)平衡盐溶液(HBSS)、厄尔氏(Earle)平衡盐溶液、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、林格氏(Ringer)平衡盐溶液、西姆氏(Simms)平衡盐溶液、台氏(Tyrode)平衡盐溶液、盖氏(Gey)平衡盐溶液、帕克氏(Puck)平衡盐溶液、伊格尔氏(Eagle)平衡盐溶液等。优选地，生理缓冲盐溶液不含有葡萄糖。生理缓冲盐溶液中也可以添加或不添加抗生素等附加成分。
在本发明的一种实施方案中，生理缓冲盐溶液是汉克氏平衡盐溶液、厄尔氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲生理盐水，优选不含有葡萄糖。更优选生理缓冲盐溶液是不含有葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液(HBSS-)。
在本发明的制造方法中，“在生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液”是指例如在能够通过显微镜观察或MTT法等从恶性肿瘤来源的细胞的形态学上确认细胞死亡的时期之后，回收生理缓冲盐溶液。从恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察或确认细胞死亡可根据所使用的恶性肿瘤来源的细胞的种类，基于本领域技术人员的普通知识来适当地判断。例如，在轻叩烧瓶查看时可见细胞剥落样状态或用肉眼可见细胞(碎片)浮游的情况下，能够从恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察或确认到细胞死亡。
“在从恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后”虽然根据所使用的恶性肿瘤来源的细胞的种类或细胞培养的条件而有所不同，但例如可以是从培养基更换为生理缓冲盐溶液之日起3～7天后。予以说明，回收后，即使包含死细胞碎片，它们也可以在培养时水平的无菌状态下在4℃稳定1个月。
另外，回收后的生理缓冲盐溶液优选离心分离并收集得到的上清液。离心分离的条件可以是在4℃～室温(例如25℃)，以1,000～17,000×g进行10～20分钟等，但并不限定于此条件。此外，优选用0.1μm的膜滤器等膜滤器对该上清液进行过滤，并收集滤液。
在本发明的制造方法中，在从恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后到回收生理缓冲盐溶液的期间，可以适当选择用于培养生理缓冲盐溶液中的恶性肿瘤来源的细胞的条件。基本而言，在HBSS-这样的设计为开放体系的生理缓冲盐溶液的情况下，孵育在封闭体系内在孵化器或恒温室等中在36℃～37℃进行，所述封闭体系不允许在大气下会蒸发的水分逃逸。或者，生理缓冲盐溶液中的恶性肿瘤来源的细胞也可以在与通常的培养条件相同的条件下进行孵育。与通常的培养条件相同的条件是指例如温度可以在30～38℃、优选35～37℃的范围内，湿度可以在70～100％、优选90～100％的范围内，二氧化碳浓度可以在2～8％、优选4～6％的范围内，但并不限定于这些条件。此外，也可以使用需要利用二氧化碳气体控制pH的生理缓冲盐溶液，以减少NaHCO3含量。
本发明的制造方法还可以包括获得含有回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物。分子量为1kDa以下的组分可以使用市售的膜滤器等通过超滤等已知的方法获得。此外，含有分子量为1kDa以下的组分的干燥物可以通过减压干燥等已知的方法获得。
本发明的制造方法还可以包括：将这样获得的干燥物溶解在介质中，从得到的溶液中去除盐类、核酸和蛋白质。将干燥物溶解于介质中，从所得到的溶液中去除盐类、核酸和蛋白质具体地可以通过以下的步骤来实施，但并不限定于以下的步骤。
(1)使用含有碳原子数为1～3的醇的溶剂提取干燥物，对得到的溶液进行干燥的步骤，以及将所述溶液的干燥物溶解于水中，向得到的水溶液中添加有机溶剂，或将所述溶液的干燥物添加到添加有水的有机溶剂中，以形成水层和有机层，并提取所述水层的步骤。
此处，含有碳原子数为1～3的醇的溶剂具体地是指含甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇的溶剂。含有碳原子数为1～3的醇的溶剂也可以是与氯仿等有机溶剂或醇等的混合液。
另外，有机溶剂只要是足以形成水层和有机层的有机溶剂即可，没有特别限定，例如，非极性有机溶剂具体地可以使用氯仿、氯仿/乙酸乙酯混合液等。
“使用含有碳原子数为1～3的醇的溶剂提取干燥物”是指例如向干燥物中添加含有碳原子数为1～3的醇的溶剂，以1000～2000×g持续5～10分钟离心分离以获得上清液。
(2)将干燥物添加到添加有水的有机溶剂中以形成水层和有机层，并提取所述水层的步骤，以及通过色谱从所述水层去除盐类等的步骤。
此处，有机溶剂只要是足以形成水层和有机层的有机溶剂即可，没有特别限定。对于通过色谱去除盐类等，优选凝胶过滤色谱，但并不限定于此。
通过本发明的制造方法获得的具有细胞杀伤活性的组合物包含来自恶性肿瘤来源的细胞的具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分。具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分如以下实施例中所证实的对各种癌症均有效，甚至对被认为对各种抗癌剂具有耐受性的小鼠Lewis肺癌也有效。
不含葡萄糖的生理缓冲盐溶液对于细胞来说是不具有营养源和能源的介质。因此可知，通过本发明的制造方法获得的具有细胞杀伤活性的组合物中所含的来自恶性肿瘤来源的细胞的具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分是仅以在该细胞内存在的物质为材料由该细胞产生的。
用于细胞培养的含血清培养基或无血清培养基包含适于细胞培养的各种成分。因此，从含血清培养基或无血清培养基分离和纯化来自恶性肿瘤来源的细胞的具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分非常困难。另一方面，从生理缓冲盐溶液分离和纯化来自恶性肿瘤来源的细胞的具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分与从含血清培养基或无血清培养基的分离和纯化相比是容易的。因此，本发明的制造方法能够廉价、简便和/或在短时间内获得具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分。特别是，如果使用不含葡萄糖的生理缓冲盐溶液，则通过本发明的制造方法获得的具有细胞杀伤活性的组合物成为不含能量来源的体系，其能够减少所产生的乳酸量并防止pH下降，而且由于乳酸可溶于乙醇等有机溶剂中，因此通过减少所产生的乳酸量，能够抑制对纯化的影响。
本发明的一种实施方案涉及细胞提取物成分的制备方法，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，其中，所述细胞提取物成分具有细胞杀伤活性，该方法包括：
将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度，
在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，
在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液，
获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物，
使用含有碳原子数为1～3的醇的溶剂提取所述干燥物，对得到的溶液进行干燥，
将所述溶液的干燥物溶解于水中，向得到的水溶液中添加非极性有机溶剂以形成水层和有机层，并提取所述水层，以及
通过色谱从所述水层分离来自所述恶性肿瘤来源的细胞的细胞提取物成分。
在本发明的制备方法中，“将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度”、“将培养基更换为生理缓冲盐溶液”、“在生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液”、和“获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物”与上述具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法中的相同。
在本发明的制备方法中，“使用含有碳原子数为1～3的醇的溶剂提取干燥物，对得到的溶液进行干燥”可以通过通常的提取操作来进行。
此处，含有碳原子数为1～3的醇的溶剂具体地是指含甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇的溶剂。含有碳原子数为1～3的醇的溶剂也可以是与氯仿等有机溶剂或醇等的混合液。
“使用含有碳原子数为1～3的醇的溶剂提取干燥物”是指例如向干燥物添加含有碳原子数为1～3的醇的溶剂，以1000～2000×g持续5～10分钟离心分离以获得上清液。
在本发明的制备方法中，“将溶液的干燥物溶解于水中，向得到的水溶液中添加非极性有机溶剂以形成水层和有机层，并提取所述水层”可以通过通常的提取操作来进行。
非极性有机溶剂只要是足以形成水层和有机层的溶剂即可，没有特别限定，例如可以使用氯仿、氯仿/乙酸乙酯混合液等。
在本发明的制备方法中，“通过色谱从水层分离来自所述恶性肿瘤来源的细胞的细胞提取物成分”可以通过已知的色谱技术来进行。优选通过凝胶过滤色谱和/或阳离子交换色谱分离来自恶性肿瘤来源的细胞的具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分。
此处，凝胶过滤色谱和阳离子交换色谱可使用市售的装置、载体和色谱柱来适当进行。阳离子交换色谱可以通过梯度法(浓度梯度法)洗脱出靶物质，也可以通过等度法(固定组成溶液洗脱法)洗脱出靶物质。
另外，在阳离子交换色谱中，优选使用强阳离子交换色谱柱。
本发明的一种实施方案涉及具有细胞杀伤活性的组合物，其是通过上述本发明的制造方法获得的。
本发明的一种实施方案涉及细胞提取物成分，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，所述细胞提取物成分是通过上述本发明的制备方法获得的。
通过上述本发明的制造方法获得的具有细胞杀伤活性的组合物来自恶性肿瘤来源的细胞，根据其结构或特性直接确定所述组合物是不可能或不实际的。关于通过上述本发明的制备方法获得的来自恶性肿瘤来源的细胞的细胞提取物成分，该物质的结构确定需要大量的纯样品，并需要非常昂贵的测定设备，除了研究该物质的稳定性等各种性质，还要重复显著多的试错，由于花费巨大的时间和费用，所以基本是不切合实际的。
本发明的一种实施方案涉及用于癌症治疗的药物组合物，其含有具有细胞杀伤活性的组合物，所述具有细胞杀伤活性的组合物是通过上述本发明的制造方法获得的。
本发明的一种实施方案涉及用于癌症治疗的药物组合物，其含有细胞提取物成分作为有效成分，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，其中，所述细胞提取物成分是通过上述本发明的制备方法获得的。
本发明的一种实施方案涉及具有细胞杀伤活性的组合物在用于制造治疗癌症用的药物中的用途，所述具有细胞杀伤活性的组合物是通过上述本发明的制造方法获得的。
本发明的一种实施方案涉及细胞提取物成分在用于制造治疗癌症用的药物中的用途，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，其中，所述细胞提取物成分是通过上述本发明的制备方法获得的。
能够通过本发明的用于癌症治疗的药物组合物或治疗癌症用的药物治疗的癌症，并不限定于在上述本发明的制造方法或制备方法中使用的恶性肿瘤来源的细胞的种类。即，本发明的用于癌症治疗的药物组合物或治疗癌症用的药物，能够对与在上述本发明的制造方法或制备方法中使用的恶性肿瘤来源的细胞相同种类的癌症以及不同种类的癌症均有效。
另外，本发明的用于癌症治疗的药物组合物或治疗癌症用的药物，能够在癌、肉瘤和血液恶性肿瘤(造血系统肿瘤)中任一种均有效。能够通过本发明的用于癌症治疗的药物组合物或治疗癌症用的药物治疗的癌症，不限于腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌和大细胞癌，也可以是来自包括肉瘤在内的所有组织学分型的癌症。例如，能够通过本发明的用于癌症治疗的药物组合物或治疗癌症用的药物治疗的癌症，可举出：肺癌、胃癌、食道癌、肝癌、胆道癌、胰腺癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、皮肤癌、喉癌、结肠直肠癌、黑素瘤、甲状腺癌、纤维肉瘤、皮肤纤维肉瘤、子宫肉瘤、脂肪肉瘤、肌肉瘤、血管肉瘤、Kaposi肉瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等，但并不限定于这些。
本发明的用于癌症治疗的药物组合物或治疗癌症用的药物可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂等可用于药物的添加剂。这样的添加剂可以基于本领域技术人员的技术常识来适当选择。
通过上述本发明的制备方法获得的来自恶性肿瘤来源的细胞的具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分，被预测为水溶性低分子量化合物，所述细胞提取物成分具有1kDa以下的分子量，并因此被预测以多种形式作为药物被利用。例如，本发明的用于癌症治疗的药物组合物或治疗癌症用的药物可以经口或通过注射等肠胃外途径向受试者给药。
实施例
下面，参照具体的实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的范围不受这些实施例的任何限定。
[使用的恶性肿瘤来源的确立的细胞系]
(1)人肾癌来源的细胞系：HRC23
HRC23是通过将人肾细胞癌传代移植到裸鼠中而得的细胞作为确立的细胞株的细胞。向不含酚红、抗生素的Eagle's MEM(日水制药)中添加10％FBS以用于传代，且添加0.1％胰蛋白酶、0.01％EDTA以用于细胞分离。此外，根据需要进行克隆。培养在37℃、5％CO2下进行。
(2)小鼠Lewis肺癌来源的细胞系
使用从日本理化学研究所获得的细胞(RCB0558:LLC)。向Eagle's MEM中添加10％FBS以用于传代，且添加0.1％胰蛋白酶、0.01％EDTA以用于细胞分离，在37℃、5％CO2下培养。该细胞是高度转移性的，且对各种抗癌剂有耐受性，并且是对在体内传代的该细胞进行培养而得的(Bertram JS,Janik P.,Cancer Lett.1980November,11(1),p.63-73)。
(3)其他人恶性肿瘤来源的细胞系
使用4种人恶性肿瘤来源的细胞株。这些细胞全部从日本医药基础研究所JCRB细胞库获得，对于传代和检测，使用指示的培养基和细胞分离用酶，在37℃、5％CO2下培养。
使用的细胞的种类如表1所示。
[表1]
细胞名 来源 组织学分型 培养基(+10％FBS)
HRC23 人肾细胞癌 腺癌 Eagle′s MEM
MKN74(JCRB0255) 人胃癌 腺癌 RPMI1640
LK-2(JCRB0829) 人肺癌 鳞状细胞癌 RPMI1640
VMRC-JCP(JCRB0103) 人肺癌 鳞状细胞癌 RPMI1640
SKN(JCRB0173) 人子宫肉瘤 平滑肌肉瘤 Eagle′s MEM
LLC(RCB0558) 小鼠Lewis肺癌 髓样癌 Eagle′s MEM
另外，恶性肿瘤在病理学上被分类为上皮性和非上皮性，且大多是上皮性。表1中，SKN是非上皮性，而其他细胞则是上皮性，其中LLC是种类上不同的小鼠来源的上皮性恶性肿瘤细胞，并对各种抗癌剂具有耐受性。此外，还根据组织学分型选择了代表性的细胞。
[实施例1：样品原液的制作]
(1)使用含血清培养基制作的样品原液
作为材料的HRC23与传代同样地用含10％FBS的Eagle′s MEM进行培养。使用的Eagle′s MEM是不含抗生素和酚红的培养基。在烧瓶内将HRC23培养至细胞的增殖达到汇合的状态，进一步培养至过度生长(过密度)，然后，与上述相同地用含10％FBS的Eagle′s MEM进行最终的培养基更换，在37℃、5％CO2下孵育。9天后，从HRC23的形态学上观察到细胞死亡。然后，回收培养基，以3×103×g持续10分钟离心分离，以获得上清液，用0.1μm膜滤器(Millex(注册商标)VV，默克株式会社(Millipore))对该上清液进行过滤，将过滤后的溶液作为样品原液无菌地保存在4℃。
(2)使用无血清培养基制作的样品原液
作为材料的HRC23与传代同样地用含10％FBS的Eagle′s MEM进行培养。使用的Eagle′s MEM是不含抗生素和酚红的培养基。在烧瓶内将HRC23培养至细胞的增殖达到汇合的状态，进一步培养至过度生长(过密度)，然后，用不含抗生素和酚红的无血清Eagle′sMEM进行培养基的更换，在37℃、5％CO2下孵育5～7小时。在此期间，用与上述相同的无血清Eagle′s MEM数次冲洗细胞。用与上述相同的无血清Eagle′s MEM进行最终的培养基更换，在37℃、5％CO2下孵育。9天后，从HRC23的形态学上观察到细胞死亡。然后，回收培养基，以3×103×g持续10分钟离心分离，以获得上清液，用0.1μm膜滤器(Millex(注册商标)VV，默克株式会社(Millipore))对该上清液进行过滤，将过滤后的溶液作为样品原液无菌地保存在4℃。
另外，对该样品原液进行超滤，收集分子量为1kDa以下的组分(具备Ultracel(注册商标)Amicon(注册商标)YM1或Ultracel(注册商标)超滤膜PLAC04310的Stirred CellModel 8050，默克株式会社(Millipore))，无菌地保存在4℃。
(3)使用生理缓冲盐溶液制作的样品原液
作为材料的HRC23与传代同样地用含10％FBS的Eagle's MEM进行培养。使用的Eagle's MEM是不含抗生素和酚红的培养基。在烧瓶内将HRC23培养至细胞的增殖达到汇合的状态，进一步培养至过度生长(过密度)，然后，将培养基用不含抗生素和葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液(pH7.3，也称为HBSS-)进行更换，在37℃、5％CO2下孵育5～7小时。在此期间，用与上述相同的汉克氏平衡盐溶液数次冲洗细胞。然后，将细胞最终在与上述相同的汉克氏平衡盐溶液中，在37℃、5％CO2下孵育。4天后，从HRC23的形态学上观察到细胞死亡。然后，回收汉克氏平衡盐溶液，以2×103×g持续10分钟离心分离，以获得上清液，用0.1μm膜滤器(Millex(注册商标)VV，默克株式会社(Millipore))对该上清液进行过滤，将过滤后的溶液作为样品原液无菌地保存在4℃。
另外，对该样品原液进行超滤，收集分子量为1kDa以下的组分(具备Ultracel(注册商标)Amicon(注册商标)YM1或Ultracel(注册商标)超滤膜PLAC04310的Stirred CellModel 8050，默克株式会社(Millipore))，无菌地保存在4℃。
而且，使用不含葡萄糖的厄尔氏平衡盐溶液(Earle)和不含葡萄糖的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS(+))替代不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液(HBSS-)，分别制作样品原液。不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液、厄尔氏平衡盐溶液和磷酸盐缓冲生理盐水的组成如表2所示。
[表2]
[实施例2：关于细胞杀伤活性的测试]
(1)测试样品的连续稀释系列的制作
向上述实施例1(1)中制作的样品原液(含血清培养基)中新加入10％FBS、Eagle'sMEM用的氨基酸配合液和维生素配合液(KOHJIN BIO；氨基酸配合液为50倍浓缩液，维生素配合液为100倍浓缩液)和葡萄糖至Eagle's MEM的规定量，用7.5％NaHCO3调节pH至7.1～7.4后，加入规定量的谷氨酰胺和10％体积的FBS，制成测试样品。这是为了补充在用含血清培养基进行最终的培养基更换之后所消耗的营养物。将该测试样品用对照用的培养基(添加10％FBS的Eagle's MEM)进行2倍的连续稀释，制作测试样品的连续稀释系列。
向在上述实施例1(2)中制作的样品原液(无血清培养基)中与上述含血清培养基的样品原液的情况相同地添加氨基酸和维生素，调节pH，然后添加谷氨酰胺、10％FBS和葡萄糖，制成测试样品。将该测试样品用对照用的培养基(添加10％FBS的Eagle's MEM)进行2倍的连续稀释，制作测试样品的连续稀释系列。此外，对于由样品原液通过超滤收集分子量为1kDa以下的组分而成的溶液，也同样制作了连续稀释系列。
向在上述实施例1(3)中制作的样品原液(汉克氏平衡盐溶液)中与上述含血清培养基的样品原液的情况相同地添加氨基酸和维生素，调节pH，然后添加谷氨酰胺、10％FBS和葡萄糖，制成测试样品。将该测试样品用对照用的溶液(添加10％FBS的Eagle's MEM)进行2倍的连续稀释，制作测试样品的连续稀释系列。此外，对于由样品原液通过超滤收集分子量为1kDa以下的组分而成的溶液，也同样制作了连续稀释系列。
(2)通过MTT分析的细胞生存率的测定
将HRC23以用于通常传代的稀释率进行稀释，分注到96孔微孔板中，在37℃、5％CO2下在含10％FBS的Eagle's MEM中培养24小时，然后(在第1日)将培养基更换为170μL的各连续稀释的测试样品。进一步，每隔1日(第3日、第5日)用新鲜测试样品更换2次，同时进行孵育。在第6日，通过MTT分析测定细胞生存率(n＝3)。
予以说明，MTT分析如下进行：将MTT(同仁化学研究所)溶解于不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲生理盐水(PBS-)中，制成为使用时的10倍浓度的5mg/mL，在无菌情况下用0.1μm膜滤器过滤并分注，保存在4℃。用200μL培养基(含10％FBS的Eagle's MEM)洗涤细胞，然后，向各培养基中添加上述5mg/mL的MTT溶液至培养基的1/10体积而获得含0.5mM的MTT的溶液，将150μL该溶液加入到96孔微孔板的各孔中。在37℃孵育30～40分钟，然后抽吸去除各孔中的溶液，用200μL的培养基进行洗涤。接着，向各孔中加入200μL的二甲基亚砜。用酶标仪(Model 550，Bio-Rad Laboratories)测定在570nm波长下的吸光度。细胞生存率由下式算出。
[数1]
A样品表示使用各连续稀释的测试样品如以上所描述的测定的吸光度。
A对照表示除了不使用各连续稀释的测试样品以外，如以上所描述的测定的吸光度。
A空白表示除了不使用HRC23以外，如以上所描述的测定的吸光度。
结果如图1～3所示。在使用含血清培养基制作的样品、使用无血清培养基制作的样品和使用生理缓冲盐溶液制作的样品中，均确认到浓度依赖性的细胞杀伤活性。此外，在使用无血清培养基制作的样品的分子量为1kDa以下的组分和使用生理缓冲盐溶液制作的样品的分子量为1kDa以下的组分中，也同样地均确认到浓度依赖性的细胞杀伤活性。
使用生理缓冲盐溶液制作的样品是使用不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液，即不具有营养源和能源的介质来制作的。即，这表明，即使在阻断来自外部的营养源和能源供给的状态下，细胞也与营养源和能源存在下同样地产生具有细胞杀伤活性的物质，这是非常意想不到的。根据该结果显示，细胞仅以在细胞内存在的物质为材料，产生具有细胞杀伤活性的物质，导致自身最终死亡。
[实施例3：具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分的制备]
(1)浓缩
用与在上述实施例1(3)中制作样品原液同样的方法，使用用于大量处理的具有181cm2表面积的烧瓶制作样品原液。生理缓冲盐溶液使用不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液(HBSS-)，最终的生理缓冲盐溶液更换使用40mL的HBSS-。将这样获得的样品原液减压干燥，加入为该原液的1/10体积的乙醇，以溶解干燥物。以3×103×g持续10分钟离心分离，以获得上清液，再次减压干燥。重复该乙醇提取，获得浓缩至样品原液的约1000倍的干燥物。将该干燥物保存在-80℃。
(2)凝胶过滤色谱
将在上述实施例3(1)中获得的干燥物溶解于纯水中，用氯仿/乙酸乙酯混合液洗涤，回收水层以获得样品，将该洗涤后的样品溶解于300μL的50mM Na2SO4中，在以下的装置和条件下进行凝胶过滤色谱。
送液泵：880PU(日本分光株式会社)
检测器：825UV(日本分光株式会社)
混合器：HG-980-31(日本分光株式会社)
注射器：Rheodyne8125(Rheodyne公司)
色谱柱：Superformance(26mm×600mm)(默克株式会社)
载体：HP-Cellulofine sf(Chisso株式会社)
流动相：50mM Na2SO4
流速：0.6ml/分钟
分离体积：1.8ml(3分钟)
检测：230nm；灵敏度：0.16aufs
凝胶过滤色谱的结果如图4所示。回收如图4所示的A～H的8个组分，通过MTT分析测定各组分的细胞杀伤活性。结果，仅在A组分(105分钟～141分钟)中检测到细胞杀伤活性。
予以说明，此处的MTT分析是如下进行的：HRC23以用于通常传代的稀释率进行稀释，分注到96孔微孔板中，在37℃、5％CO2下在含10％FBS的Eagle's MEM中培养24小时，然后，将该培养基更换为170μL由各组分制备的样品，孵育2天后，向各孔中加入200μL的二甲基亚砜，用酶标仪(Model 550，Bio-Rad Laboratories)测定在570nm波长下的吸光度。样品的制备如下：向各组分的等分试样(aliquot)中加入等量的甲醇，用0.22μm膜滤器(Millex(注册商标)GV，默克株式会社(Millipore))过滤，去除Na2SO4，然后进行干燥，将干燥所得物溶解于含10％FBS的Eagle's MEM中，进行2倍的连续稀释。
将通过该MTT分析观察到的微孔板上的显色情况与显示出细胞生存率的浓度依赖性的图一起示于图5。予以说明，在图5中，样品浓度为换算成原液的浓度。
向回收的A组分中加入等量的甲醇，用0.22μm膜滤器(Millex(注册商标)GV，默克株式会社(Millipore))过滤，去除Na2SO4，然后进行减压干燥，将得到的干燥物保存在-80℃。
(3)离子交换色谱
将在上述实施例3(2)中获得的干燥物溶解于0.15M Na2SO4 200μL中而成的溶液作为样品，在以下的装置和条件下进行离子交换色谱，在强阳离子交换树脂中使用Na2SO4的线性浓度梯度法来分离活性组分。
送液泵：880PU(日本分光株式会社)
检测器：825UV(日本分光株式会社)
混合器：HG-980-31(日本分光株式会社)
注射器：Rheodyne8125(Rheodyne公司)
色谱柱：ResourceTMS；1ml(GE Healthcare公司)2只直接连接而使用。
洗脱通过如表3所示的线性浓度梯度法进行。
流速：0.25ml/分钟
分离体积：0.75ml(3分钟)
流动相：A；H2O B；0.3M Na2SO4
检测：230nm；灵敏度：0.16aufs
[表3]
向预先用0.15M Na2SO4平衡的色谱柱注入样品后，用该溶液洗涤30分钟，然后通过从0.15M到0.24M的Na2SO4的线性浓度梯度法进行洗脱。
离子交换色谱的结果如图6所示。通过MTT分析测定各组分的细胞杀伤活性，结果仅在Na2SO4浓度为165～170mM的组分18～21中检测到细胞杀伤活性。予以说明，此处的MTT分析与上述实施例3(2)同样地进行。
向回收的Na2SO4浓度为165～170mM的组分中加入等量的甲醇，用0.22μm膜滤器(Millex(注册商标)GV，默克株式会社(Millipore))过滤，去除Na2SO4，然后进行减压干燥，将得到的干燥物保存在-80℃。
(4)再次凝胶过滤色谱
将在上述实施例3(3)中获得的干燥物溶解于300μL的50mM Na2SO4中的溶液作为样品，在以下的装置和条件下再次进行凝胶过滤色谱。
送液泵：880PU(日本分光株式会社)
检测器：825UV(日本分光株式会社)
混合器：HG-980-31(日本分光株式会社)
注射器：Rheodyne8125(Rheodyne公司)
色谱柱：Superformance(26mm×600mm)(默克株式会社)
载体：HP-Cellulofine sf(Chisso株式会社)
流动相：50mM Na2SO4
流速：0.6ml/分钟
分离体积：1.2ml(2分钟)
检测：205nm；灵敏度：0.16aufs
凝胶过滤色谱的结果如图7所示。通过MTT分析测定各组分的细胞杀伤活性，结果在前面的吸收峰中的组分57(洗脱时间112～114分钟)、组分58(洗脱时间114～116)和组分59(洗脱时间116～118分钟)的3个组分中检测到细胞杀伤活性，特别是在组分58中被明显确认到。予以说明，此处的MTT分析与上述实施例3(2)同样地进行。
向回收的上述3个组分中加入等量的甲醇，用0.22μm膜滤器(Millex(注册商标)GV，默克株式会社(Millipore))过滤，去除Na2SO4，然后进行减压干燥，以获得干燥物。
(5)质量分析法(TOF-MS)
将在上述实施例3(3)中获得的干燥物在10μL由乙腈：水：TFA(50:50:1)中的5mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA)构成的缓冲液中再悬浮而成的溶液作为样品，在以下的装置和条件下通过质量分析法进行分析。
按照肽分析程序使用如下条件进行分析：
分析仪器：Voyager System 6366(Applied Biosystem)
施加电压：+20000V
样品引入：手动；MALDI板
基质：α-氰基-4-羟基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)(a-CHCA)(东京化成株式会社)。
将由3个组分(57、58和59)获得的结果分别示于图8～10，m/z值为100～1500。此外，由仅基质获得的结果示于图11，m/z值为100～1000。
在3个组分(57、58和59)的质谱的每一个中，在m/z值600和714处观察到信号。特别地，在组分58的谱图中，在m/z值600.16和714.04处观察到强信号，但在组分59的谱图中，没有显示出如组分57或组分58那样明确的信号。此外，在组分58的谱图中，在m/z值114.09处明确地观察到信号(放大图显示为图12)。
另一方面，未观察到m/z值大于m/z值1000的信号。因此，表明具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分具有1kD以下的分子量。这与表明分子量为1kDa以下的组分中确认到细胞杀伤活性的图2和3的结果一致。
但是，在如以上所描述获得的质谱中，还存在m/z值为300以下的很多信号，认为对于具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分的鉴定，需要包括与该成分的稳定性相关的研究在内的进一步详细的研究。
[实施例4：对各种癌细胞的细胞杀伤活性的测定]
将在上述实施例3(2)中获得的干燥物用HRC23、MKN74、LK2、VMRC-JCP、SKN和LLC的培养中使用的各培养基进行2倍的连续稀释，制作测试样品的连续稀释系列。将HRC23、MKN74、LK2、VMRC-JCP、SKN和LLC分别各自地以在96孔微孔板中培养3天达到约80％汇合的量进行接种，在各规定的培养基中，在37℃、5％CO2下培养24小时。将培养基更换为170μL的测试样品，孵育2天，然后向各孔中加入200μL的二甲基亚砜，用酶标仪(Model 550，Bio-RadLaboratories)测定在570nm波长下的吸光度，进行MTT分析(n＝3)。
将通过MTT分析测定的各癌细胞的细胞生存率的图示于图13。横轴以常用对数标度将显示HRC23的生存率为0％的测试样品的最小浓度表示为任意单位(arbitrary unit)1。由该结果可知，从HRC23获得的具有细胞杀伤活性的测试样品对于HRC23以外的癌症也有效，共同地显示出浓度依赖性的细胞杀伤作用，而不管癌症种类、组织学分型如何。
[实施例5：在来自LLC或SKN的样品中的细胞杀伤活性的测定]
(1)样品原液的制作
作为材料的LLC和SKN，用含10％FBS的Eagle's MEM与HRC23同样地进行培养。使用的Eagle's MEM是不含抗生素和酚红的培养基。在烧瓶内将LLC和SKN分别培养至细胞的增殖达到汇合的状态，并且再培养1天。用不含抗生素和葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液洗涤，然后以5mL该汉克氏平衡盐溶液/烧瓶在37℃、5％CO2下孵育。在从LLC和SKN的形态学上观察到细胞死亡后，回收汉克氏平衡盐溶液，以1,500×g持续10分钟离心分离，以获得的上清液，将用0.1μm膜滤器(Millex(注册商标)VV，默克株式会社(Millipore))对这些上清液进行过滤后的溶液分别作为样品原液。
另外，对该样品原液进行超滤，收集分子量为1kDa以下的组分(具备Ultracel(注册商标)Amicon(注册商标)YM1、Ultracel(注册商标)超滤膜PLAC04310的Stirred CellModel 8050、Merck株式会社(millipore))。
(2)通过MTT分析的细胞生存率的测定
向在上述实施例5(1)中制作的样品原液加入10％FBS、Eagle's MEM用的氨基酸、维生素的配合液和葡萄糖至Eagle's MEM的规定量，用7.5％NaHCO3调节pH后，制成测试样品。将该测试样品用对照用的溶液(在汉克氏平衡盐溶液中添加Eagle's MEM用的50倍浓度氨基酸、100倍浓度维生素的配合液)进行2倍的连续稀释，制作测试样品的连续稀释系列。此外，对于由样品原液通过超滤收集分子量为1kDa以下的组分而成的溶液，也同样制作了连续稀释系列。
按照上述实施例2(2)中记载的方法进行MTT分析，测定HRC23的细胞生存率(n＝3)。结果如图14和15所示。
来自LLC的样品、来自SKN的样品与来自HRC23的样品同样地显示出对HRC23的细胞杀伤活性。来自LLC的样品显示出对HRC23的细胞杀伤活性的结果，以及实施例4中的结果(来自HRC23的样品显示出对LLC的细胞杀伤活性)意味着可确认到跨越种类的交叉反应。此外，SKN是罕见的非上皮性恶性肿瘤细胞，并且确认到即使在SKN这样的非上皮性恶性肿瘤细胞中也产生具有细胞杀伤活性的物质。予以说明，对于来自SKN的样品，观察到低于来自LLC的样品或来自HRC23的样品的细胞杀伤活性，认为这是因为培养后的SKN细胞数远低于LLC或HRC23而导致的。
[实施例6：当使用各种生理缓冲盐溶液时的细胞杀伤活性的测定]
向在上述实施例1(3)中制作的样品原液(HBSS-、Earle、PBS(+))加入10％FBS、Eagle's MEM用的50倍浓度氨基酸、100倍浓度维生素的配合液和葡萄糖至Eagle's MEM的规定量，用7.5％NaHCO3调节pH后，制成测试样品。将该测试样品用对照用的溶液(在HBSS-、Earle或PBS(+)中添加Eagle's MEM用的50倍浓度氨基酸、100倍浓度维生素的配合液)进行2倍的连续稀释，制作测试样品的连续稀释系列。
按照上述实施例2(2)中记载的方法进行MTT分析，测定HRC23的细胞生存率(n＝3)。结果如图16所示。
在使用HBSS-的情况、使用Earle的情况、使用PBS(+)的情况的任一情况下，虽然强度不同，但均可观察到细胞杀伤活性。
[实施例7：细胞的培养状态对细胞杀伤活性的影响的评价]
在使用通常培养基的情况下，由于增殖期的细胞继续增殖，在培养基中难以进行细胞密度不同的测试，但通过使用不含营养源的汉克氏平衡盐溶液(无葡萄糖)，则能够调查在增殖期阶段的具有细胞杀伤活性的成分的产生。
在25cm2的传代培养用烧瓶中，将HRC23以不同细胞数进行接种，并用含10％FBS的Eagle's MEM进行培养。使用的Eagle's MEM是不含抗生素和酚红的培养基。在接种细胞数较多的烧瓶中，培养至细胞的增殖达到汇合的状态，并再培养1天。在该时间点，在接种细胞数较少的烧瓶中，尽管细胞的密度为不会妨碍传代的密度，但仍处于增殖期的状态，细胞密度与汇合状态相比为约72％。在接种细胞数较多的情况、接种细胞数较少的情况的任一情况下，在该时间点，用不含抗生素和葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液洗涤，然后在5mL该汉克氏平衡盐溶液/烧瓶中，在37℃、5％CO2下孵育。在从HRC23的形态学上观察到细胞死亡之后，回收汉克氏平衡盐溶液，以1,500×g持续10分钟离心分离，以获得上清液，将用0.1μm膜滤器(Millex(注册商标)VV，默克株式会社(Millipore))对该上清液过滤后的溶液作为样品原液。
按照上述实施例2(2)中记载的方法进行MTT分析(在25cm2的传代培养用烧瓶中)，测定HRC23的细胞生存率(n＝3)。结果如图17所示。
在接种细胞数较多和细胞数较少的情况下，虽然强度不同但均可观察到细胞杀伤活性。因此，显示出在增殖期的细胞就产生出具有细胞杀伤活性的成分。由此表明，细胞能够有意地产生具有细胞杀伤效果的成分，而不管细胞处于什么时期。
[实施例8：来自LK-2的样品对LK-2和HRC23的细胞杀伤活性的测定]
(1)样品原液的制作
作为材料的LK-2与传代同样地用含10％FBS的RPMI1640(默克株式会社(Sigma-Aldrich日本合同会社)，R883)进行培养。在烧瓶内将LK-2培养至细胞的增殖达到完全汇合(fully confluent)的状态，然后，用5mL的含10％FBS的RPMI1640进行最终的培养基更换。此外，除了其中用含10％FBS的RPMI1640进行培养基更换的上述实例，在烧瓶内将LK-2培养至细胞的增殖达到完全汇合(fully confluent)的状态，用30mL不含抗生素和葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液洗涤4次，然后，将5mL该汉克氏平衡盐溶液加入烧瓶中，浸没细胞。
将上述2种培养液在37℃、5％CO2下孵育，培养至从LK-2的形态学上观察到细胞死亡。然后，将培养基和汉克氏平衡盐溶液分别进行回收，以1,500×g持续10分钟离心分离，分别获得的上清液，将用0.1μm膜滤器(Millex(注册商标)VV，默克株式会社(Millipore))对这些上清液过滤后的溶液分别作为样品原液。此外，对使用汉克氏平衡盐溶液获得的样品原液进行超滤并收集分子量为1kDa以下的组分(具备Ultracel(注册商标)Amicon(注册商标)YM1或Ultracel(注册商标)超滤膜PLAC04310的Stirred Cell Model 8050，默克株式会社(Millipore))。
(2)测试样品的连续稀释系列的制作
向在上述实施例8(1)中制作的各样品原液中添加RPMI1640用的氨基酸(50倍浓缩)(默克株式会社(Sigma-Aldrich日本合同会社)，M5550)、维生素(100倍浓缩)(默克株式会社(Sigma-Aldrich日本合同会社)，R7256)的配合液，用乙酸调节pH至7.2～7.3，然后，添加10％FBS、10％葡萄糖和0.1体积的200mM谷氨酰胺，制成测试样品。将该测试样品用对照用的培养基(含10％FBS的RPMI1640)进行2倍的连续稀释，制作测试样品的连续稀释系列A。此外，对于由样品原液通过超滤收集分子量为1kDa以下的组分而成的溶液，也同样制作连续稀释系列A(<1kDa)。
另外，向上述实施例8(1)中制作的各样品原液中添加Eagle's MEM用的氨基酸(50倍浓缩)(与上述相同)、维生素(100倍浓缩)(与上述相同)的配合液，用乙酸调节pH至7.2～7.3，然后，添加10％FBS、10％葡萄糖和0.1体积的200mM谷氨酰胺，制成测试样品。将该测试样品用对照用的培养基(含10％FBS的Eagle's MEM)进行2倍的连续稀释，制作测试样品的连续稀释系列B。此外，对于由样品原液通过超滤收集分子量为1kDa以下的组分而成的溶液，也同样制作连续稀释系列B(<1kDa)。
(3)通过MTT分析的细胞生存率的测定
将LK-2以用于通常传代的稀释率进行稀释，分注到96孔微孔板中，在37℃、5％CO2下在含10％FBS的RPMI1640中培养24小时，然后，将各培养基更换为170μL的连续稀释系列A的各稀释液。在连续稀释系列A的各稀释液中培养24小时，然后，将各稀释液更换为与其相同稀释倍率的连续稀释系列A的新鲜的各稀释液，进一步培养24小时。对于使用连续稀释系列A(<1kDa)的情况，也与使用连续稀释系列A的情况同样地进行LK-2的培养。
按照上述实施例2(2)中记载的方法进行MTT分析，测定LK-2的细胞生存率(n＝3)。结果如图18所示。
另外，将HRC23以用于通常传代的稀释率进行稀释，分注到96孔微孔板中，在37℃、5％CO2下在含10％FBS的Eagle's MEM中培养24小时，然后，将各培养基更换为170μL的连续稀释系列B的各稀释液。在连续稀释系列B的各稀释液中培养24小时，然后，将各稀释液更换为与其相同稀释倍率的连续稀释系列B的新鲜的各稀释液，进一步培养24小时。对于使用连续稀释系列B(<1kDa)的情况，也与使用连续稀释系列B的情况同样地进行HRC23的培养。
按照上述实施例2(2)中记载的方法进行MTT分析，测定HRC23的细胞生存率(n＝3)。结果如图19所示。
来自LK-2的样品显示出对LK-2和HRC23的细胞杀伤活性。此外，与基于用RPMI1640进行最终的培养基更换而获得的样品原液的样品相比，基于使用汉克氏平衡盐溶液而获得的样品原液的样品显示出更强的细胞杀伤活性。这表明，通过使用汉克氏平衡盐溶液等生理缓冲盐溶液，获得从恶性肿瘤来源的细胞提取的具有细胞杀伤活性的成分，与通过使用培养基获得该成分相比，能够实现高收率，或者能够在不降低具有细胞杀伤活性的靶成分的细胞杀伤活性的情况下获得该成分。
[实施例9：对小鼠的体内细胞杀伤活性]
向4只小鼠(C57BL/6NcrSIc，雄，5周龄)腹腔内接种300μL LLC的悬浮液(2×106细胞)，用于移植LLC。1周后，将换算成原液为1L份的上述[4](2)中获得的干燥物溶解于300μL的无FBS的Eagle’s MEM中，并将所得的溶液向作为处理组的2只小鼠每天1次、腹腔内给予6天。未进行这样处理的对照组的2只小鼠在LLC移植后第25天死亡，而对于处理组，1只小鼠在LLC移植后第35日天死亡，另外1只小鼠在LLC移植后第48天死亡。与对照组相比，处理组中确认到明显的寿命延长效果。予以说明，在处理组中，未确认到被认为是副作用的症状。

Claims (8)

1.具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法，包括：
将恶性肿瘤细胞在培养基中培养至细胞的密度达到60％-100％汇合，
在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，其中所述生理缓冲盐溶液不含有葡萄糖，以及
在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述生理缓冲盐溶液选自由汉克氏平衡盐溶液、厄尔氏平衡盐溶液和磷酸盐缓冲生理盐水组成的组。
3.根据权利要求1所述的制造方法，还包括：
获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物。
4.根据权利要求2所述的制造方法，还包括：
获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物。
5.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述具有细胞杀伤活性的组合物包含来自所述恶性肿瘤细胞的细胞提取物成分。
6.根据权利要求2所述的制造方法，其中，所述具有细胞杀伤活性的组合物包含来自所述恶性肿瘤细胞的细胞提取物成分。
7.细胞提取物成分的制备方法，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤细胞，其中，所述细胞提取物成分具有细胞杀伤活性，该方法包括：
将恶性肿瘤细胞在培养基中培养至细胞的密度达到60％-100％汇合，
在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，其中所述生理缓冲盐溶液不含有葡萄糖，
在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液，
获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物，
使用含有碳原子数为1～3的醇的溶剂提取所述干燥物，对得到的溶液进行干燥，
将所述溶液的干燥物溶解于水中，向得到的水溶液中添加非极性有机溶剂以形成水层和有机层，并提取所述水层，以及
通过色谱从所述水层分离来自所述恶性肿瘤细胞的细胞提取物成分。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述色谱包括凝胶过滤色谱和/或阳离子交换色谱。
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