CN101081225A - 一种通过调节表观遗传修饰防治胃肠肿瘤的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域，涉及一种通过调节表观遗传修饰防治胃肠肿瘤的药物组合物，由有效成分叶酸与丁酸钠与药用载体及赋形剂组成，本发明从表观遗传修饰的角度，观察本发明药物对肿瘤干预的作用，通过体外肿瘤细胞、体内动物实验和胃肠道癌前病变患者临床前期实验研究，结果显示本药物组合物可影响表观遗传修饰DNA甲基化和乙酰化，进而影响胃癌和/或大肠癌细胞系的基因表达乃至改变细胞周期；可减少化学致癌剂诱发小鼠大肠癌的发生，并抑制肿瘤的进展，具有显著的防治肿瘤效果，对机体无明显的毒副作用，且价格低廉。

Description

一种通过调节表观遗传修饰防治胃肠肿瘤的药物组合物

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及一种通过调节表观遗传修饰防治胃肠肿瘤的药物组合物，具体涉及一种含叶酸和短链脂肪酸的药物组合物及其在防治胃肠肿瘤中的应用。

背景技术

肿瘤的发生是多步骤的过程，过去人们一直认为基因突变参与肿瘤的形成，近年来更多的证据表明表观遗传修饰在肿瘤进展中同样具有非常重要的作用。有关研究报道，表观遗传修饰影响基因转录活性而不涉及DNA序列的改变。在胃肠肿瘤发生过程中常出现表观遗传修饰的异常，如总基因组DNA甲基化水平降低、癌基因启动子区的低甲基化或抑癌基因的高甲基化，上述结果常导致基因表达失衡、细胞增殖过度和凋亡减少。基因表达调控有遗传学修饰(如基因突变和缺失)和表观遗传修饰(Epigenetic modification)两种形式，后者包括针对DNA本身的甲基化修饰和对组蛋白的修饰如乙酰化、甲基化和磷酸化等。美国NIH/NCI实验室认为DNA甲基化酶(DNA methyltransferase，Dnmt)是基因表达调控的靶点。我们实验室曾以反义Dnmt 1转染大肠癌细胞，发现可降低错配修复基因hMSH2启动子区甲基化水平和提高其转录。

有研究发现，调整膳食中的某些成分有助于预防胃肠肿瘤的发生。叶酸是B族维生素之一，通过提供或接受一碳单位，提供甲基基团而维持或从头甲基化，参与DNA的合成和修复，并参与染色体的修饰。叶酸以5’-甲基四氢叶酸(THF)形式存在于体内。食物中的叶酸摄入量不足可以引起DNA甲基化紊乱，进而促进肿瘤的发生发展。丁酸盐是人类结肠中细菌发酵碳水化合物产生的短链脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)，多系粗纤维食物在肠道中分解而成，丁酸盐进入细胞经部分β-氧化后，可引起细胞核中高度乙酰化组蛋白的积聚，是组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂，进而上调p21^WAF1转录，阻滞细胞周期于G0/G1期，抑制细胞增殖，并上调Bak和降低Bcl-XL基因表达，诱导细胞凋亡促进分化和凋亡。

在表观遗传修饰的研究领域，国际上有较多的有关人胃肠肿瘤的报导，但多局限于单独的癌基因或抑癌基因的甲基化或乙酰化研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过调节表观遗传修饰防治胃肠肿瘤的药物组合物，特别涉及一种含叶酸和短链脂肪酸的药物组合物。

本发明的进一步目的是提供上述药物组合物在防治胃肠肿瘤中的应用。

本发明从表观遗传修饰的角度，采用维生素和食物纤维素制备药物组合物，尤其涉及叶酸和短链脂肪酸丁酸钠制备的药物组合物。

所述的叶酸(Folic acid)：淡黄色粉剂，微溶于水，分子式C₁₉H₁₉N₇O₆，

结构式为：

所述的丁酸钠(Sodium butyrate，NaBu)属短链脂肪酸(Short chain fatty acid，SCFA)：白色粉剂，易溶于水，分子式：CH₃CH₂CH₂COONa，

结构式为：

本发明药物组合物由叶酸与丁酸钠为有效成分，与药用载体及赋形剂组成，其中叶酸与丁酸钠的重量配比为1∶10～1000。优选重量配比为1∶200。

本发明可将上述有效成分与药用载体及赋形剂混合，制成各种口服制剂或非肠道应用剂型，包括粉术剂、颗粒剂、片剂及胶囊剂或静脉注射针剂。每天的剂量为1～20g或每公斤体重0.02～0.4g，优选每人每天2～10g，其中，叶酸的有效剂量为0.1～10mg/kg，丁酸钠的有效剂量为20～400mg/kg，每天的剂量可一次服用或分2到4次服用。

本发明所述的制剂的制备，可以包含药理学上被容许的各种制剂用物质作为辅料。制剂用物质可以根据制剂的剂型适当选择，可以举出例如赋形剂、稀释剂、添加剂、崩解剂、结合剂、包衣剂、润滑剂、劝流剂、滑润剂、调味剂、味剂、助溶剂等。作为制剂用物质具体的例子，可以举出碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇以及其他的糖类、滑石粉、牛奶蛋白、明胶、淀粉、微晶纤维素以及它的衍生物、动物及植物油、聚乙二醇、以及溶剂、例如无菌水以及一元或多级醇，如甘油。

本发明使用的有效成分不必包含在同一个制剂之中，各个成分或多个成分可以包含在一个或多个适当的制剂之中，此时，可以制备成已知的或将来被开发出的各种各样的药物制剂的形式，例如口服给药、腹腔内给药、透皮给药、吸入给药等各种给药形式。可以采用已知的或将来被开发出的方法将在本发明中使用的药物成分制备成上述种种的制剂形式。

作为这些各种药物制剂类型，可以制备成固体或液体制剂，如颗粒、粉剂、包衣片、片剂、(微型)胶囊、栓剂、糖浆、液体、混悬剂、乳浊剂、滴剂、注射用溶液、缓释制剂等。

在以上例示出的制剂类型的本发明的药物中，为了发挥抗肿瘤的药效，至少应含有有效剂量的上述成分。

本发明药物组合物从表观遗传修饰的角度，采用维生素如叶酸和食物纤维素如短链脂肪酸制备药物组合物，不仅可补充膳食中的营养元素，还可调节表观遗传修饰对基因表达的凋控，提高抗肿瘤效果，为胃肠肿瘤的防治提供一种安全有效的治疗药物。本发明通过体外肿瘤细胞、体内动物实验和胃肠道癌前病变患者临床前期对胃癌和大肠癌发病和防治中的表观遗传修饰理论进行实验研究，分析叶酸和短链脂肪酸对总基因组DNA和癌基因甲基化变化及其对肿瘤形成和发展中的防治作用。结果显示，本发明药物组合物能影响表观遗传修饰DNA甲基化和乙酰化，进而影响胃癌和/或大肠癌细胞系的基因表达乃至改变细胞周期；能减少化学致癌剂诱发小鼠大肠癌的发生，并能缓解患者临床症状，逆转胃肠道粘膜萎缩、化生和不典型增生，具有显著的防治肿瘤效果和副作用小、安全、有效、经济的特点。

附图说明

图1是FA，NaBu，药物组合物对SW1116细胞p21^WAF1基因表达的影响，

其中M：PCR分子量Marker(100bp DNA ladder)；

1：对照；2：FA 2mg/L，24h；3：NaBu 550mg/L，24h；

4：本发明药物(NaBu 550mg/L+FA2mg/L)，24h。

图2是对照组SW1116细胞形态。

图3是药物组合物干预后SW1116细胞形态。

图4是造模组DMH诱发小鼠大肠癌肉眼大体观察，

其中，A为在体图，B为离体图。

图5是为本发明药物干预细小鼠大肠癌肉眼大体观察，

其中，A为在体图，B为离体图。

具体实施方式

实施例1

采用RPMI1640培养液常规培养大肠癌细胞系SW1116、Colo-320与胃癌细胞系MKN45。丁酸钠(NaBu 1×PBS稀释，550mg/L)、叶酸(FA2mg/L)、本发明药物组(含有NaBu 550mg/L、FA2mg/L)处理24 h。对照组为未经任何处理组，同步化处理后，流式细胞仪检测细胞周期，RT-PCR检测抑癌基因p21^WAF1mRAN表达，免疫共沉淀分析p21^WAF1基因相关染色质乙酰化组蛋白H3和H4的水平。结果，FA处理的MKN45细胞的凋亡指数均较对照组有所增加，但对细胞周期无明显影响。NaBu组可通过升高SW1116、Colo-320细胞乙酰化水平而上调p21^WAF1表达，诱导乙酰化组蛋白H3和H4聚集。本发明药物组24h后的各组细胞可见染色质凝集、出现嗜碱性凋亡小体等现象。细胞形态明显改变，细胞明显伸长，并有丝状突出，排列整齐，大部分细胞阻滞于G1/G0期。实验结果表明本发明药物组合物对肿瘤细胞具有促进肿瘤细胞凋亡和抑制增殖的作用。

表1 NaBu和FA对SW1116细胞周期分布的影响

组别	G0/G1	S	G2/M
				空白对照组NaBu 550mg/LFA 2mg/L本药物组合NaBu550mg/L，FA 2mg/L，	34.6±4.888.6±1.8*30.3±4.689.6±1.8*	37.2±1.75.0±0.5*38.8±2.84.6±0.5*	28.2±6.66.4±1.4*31.0±6.35.8±1.9*

注：与未处理对照组比较^*P＜0.01

实施例2

1.制备大肠癌动物模型

从上海中国科学院购置近交系ICR清洁级、体重为18～20g的雌性小鼠，致癌剂二甲肼(DMH)，白色粉状结晶。诱发小鼠大肠癌模型，造模过程中分别以FA、NaBu、FA与NaBu药物组合物进行干预。

2.小鼠分组和药物干预

1)空白对照组

2)FA对照组

3)NaBu对照组

4)药物组合物对照组

5)DMH组：DMH颈部皮下注射造模，每次临注射前以无菌生理盐水配成0.4％溶液，并用NaHCO₃将其pH调至6.5～7.0，每周1次颈部皮下注射20mg/kg，连续20周。

6)DMH+FA：FA按0.02％浓度溶于小鼠饮用水中；连续20周。

7)DMH+NaBu：NaBu按1.5％浓度溶于小鼠饮用水中，连续20周。

8)DMH+本发明药物：按不同配伍溶于饮用水中，共分4组，连续20周。

①低FA+低NaBu组；饮用水中含有0.01％的FA和0.5％的NaBu

②低FA+高NaBu组；饮用水中含有0.01％的FA和1.5％的NaBu

③高FA+低NaBu组；饮用水中含有0.02％的FA和0.5％的NaBu

④高FA+高NaBu组：饮用水中含有0.02％的FA和1.5％的NaBu

以上小鼠随机分组，每组为20只，常规饲养。于注射日起24周末处死动物，检查小鼠大肠肿瘤。

3.结果显示：在给予安慰剂的小鼠DMH对照组中，80％的小鼠产生大肠癌，诱发的大肠肿瘤均系恶性肿瘤，肿瘤发生在距肛门6.5cm范围内，以距肛门3～4cm处最密集，在肠壁的粘膜面，凸向肠内，表面光滑，少数有糜烂有血迹。肿瘤的组织学检查，多数为腺癌。实验中还诱发了一定数量的肛门肿瘤，切片检查均为鳞癌。本发明药物干扰组肿瘤发生率仅为20％，显著低于DMH对照组和单独用药干预组。表明本发明药物可明显减少DMH诱发的小鼠大肠癌，并可以显著减小肿瘤体积和数目，且没有毒副作用。

表2是各药物组对化学致癌剂诱导的小鼠肿瘤干预效果，包括药物对小鼠肿瘤生成的形态、数目、大小的影响和试验结束时存活率。。

表3是本发明药物不同配伍对肿瘤干预的作用。

表2

组别	肿瘤发生率	肿瘤大小	肿瘤数目	24周存活率
					空白对照	0	0	0	100％
FA对照组	0	0	0	100％
					NaBu对照组	0	0	0	100％
药物组合对照组DMH造模组DMH+FA干预组DMH+NaBu干预组DMH+FA与NaBu药物组合	080％55％45％20％a	02～5mm1～3mmb0～3mmb0～2mmb，c	09.53±7.874.63±3.29b5.50±5.20b4.20±3.70b	100％90％100％100％100％

其中a：与DMH组、FA组和NaBu组相比较P＜0.05；

b：与DMH组比较P＜0.05；

c：与FA组比较P＜0.05。

表3

本发明药物不同配伍组别	肿瘤发生率	肿瘤大小	肿瘤数目	24周存活率
					低FA+低NaBu组低FA+高NaBu组高FA+低NaBu组高FA+高NaBu组	30％15％20％15％	0～3mm0～2mm0～3mm0～1mm	5.06±4.373.95±3.544.16±3.193.64±2.79	100％100％100％100％

实施例3

临床患者试用研究中，对消化道粘膜萎缩患者给于本发明药物治疗，并进行跟踪随访，监测患者血清叶酸浓度和相关基因的甲基化水平，并定期对粘膜组织进行病理检查，初步观察发现经本发明药物干预后患者胃肠道症状缓解，粘膜萎缩可得以改善，部分不典型增生得以逆转，并且未发现明显的毒副反应。

Claims (4)

1、一种通过调节表观遗传修饰防治胃肠肿瘤的药物组合物，由有效成分与药用载体及赋形剂组成，其特征在于所述的有效成分为叶酸与丁酸钠，其重量配比为1∶10～1000。

2、按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的叶酸与丁酸钠的重量配比为1∶200。

3、按权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的有效成分与药用载体及赋形剂混合，制成各口服制剂或非肠道应用剂型，包括粉末剂、颗粒剂、片剂及胶囊剂或静脉注射针剂。

4、按权利要求1所述的防治胃肠肿瘤的药物组合物，其特征在于所述的口服制剂或非肠道应用剂型，其中，叶酸的有效剂量为0.1～10mg/kg，丁酸钠的有效剂量为20～400mg/kg。

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