JPH0265790A

JPH0265790A - 免疫賦活作用を有する粗糖蛋白質画分及びその製造法

Info

Publication number: JPH0265790A
Application number: JP63215069A
Authority: JP
Inventors: Hifumi Oishi; 一二三大石; Toshiaki Hori; 俊明堀; Akemi Miyauchi; 宮内　朱; Iwao Sakauchi; 岩雄坂内
Original assignee: KYODO NYUGYO KK
Current assignee: KYODO NYUGYO KK
Priority date: 1988-08-31
Filing date: 1988-08-31
Publication date: 1990-03-06
Anticipated expiration: 2013-08-20
Also published as: JP2788987B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は免疫賦活作用を有するｔ４Ｉ糖蛋白質画分及
びその製造法に関するものである。

〔従来の技術〕

古来、ケフィアは消化機能の７Ｃ進、腎臓病、循環器病
などに対する効果が高いと伝えられてきたが、近年ケフ
ィア粒由来多糖体の抗腫瘍作用が報告されて以来、最近
の研究は主に免ＦｌｉＫ活に関するものである６免疫賦
活作用に関する報告はケフィア粒由来多糖体や７ケフイ
ア粒を構成する乳酸菌の　膜性多糖体及びケフィアヨー
グルトなどを対象としたものであり２それ以外のもので
は行なわれていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

発明者等はケフィア粒由来多糖体の免疫賦活作用につい
て、マクロファージにより生体外の実験及びマウスを用
いた抗腫瘍活性による生体内の実験などにより間尺た結
果、その作用を認めたが、再現性が悪く、−Ｓ糖体のロ
フトや精製度が変わると著しい活性のぶれを生じた。ま
たこの多糖体の免疫賦活作用も。

そｔｂ程強くないことか確認され、上記のＩ！１ｆｆＬ
性の低さの而からも、免疫賦活剤としてこの物質を利用
することには難かしい課題点が残されている。

発明者等は、免疫賦活作用がケフィア粒由来多糖体の主
体以外にあると考え、種々研究！！：虫ねた結果、ケフ
ィア酸に含まれ、多糖体と何んらかの会合をし、常法に
よる多糖体の精製過程を経ても多糖体画分に残存してい
る分子１ｔｌｎ、０００〜２ｏｎ、ｏｏｏ、窒素量５．
５〜６．５％、糖質３５〜５５％の粗糖蛋白質画分を得
５この物質が免疫賦活作用を示す本体であり、またその
作用も非常に強いことを見出した。この発明はこの物質
自体及びその製造法により、上記の課題を解決しようと
するものである。

［Ｂ題を解決するための手段］発明者等は上記のＡＩ題点を解決するために。

種々研究を重ねた結果、この発明を完成するに到った。

すなわちこの発明はケフィア酸を構成する多糖体及び菌
体に含まれる分子ｊｉｌｏ、００（１〜２００　、００
０　、窒素量５．５〜６．５％、Ｍ竹３５〜５５％の粗
糖蛋白質画分、並びにケフィア酸の多糖体を主とする水
溶性成分をアルコール類により沈殿させ、得られた沈殿
物から変性剤或いは塩析などにより、前記糖蛋白質画分
を採取することを特徴とする前記糖蛋白質画分の製造法
である。

〔構成〕

この発明の免疫賦活作用を有する粗糖蛋白質画分を得る
に当り、ますケフィア酸から多糖体を調製する。ケフィ
ア酸はパンセン社。

ウィズビー社などのものが市販されており、培養のため
の培地は、牛乳、脱脂乳、或いはホエーなどの乳性培地
を通常使用する。

上記培地を常法いより殺菌し、ケフィア酸を３〜２０％
の割合で無菌的に加え、１５〜２５°Ｃで１％数日間、
乳が凝固或いは培地ｐＨか４．５〜４．０以下になるま
で培養する９次いでケフィア酸を殺菌した網などで；濾
過分５１１　Ｌ、　、新しい培地へ同様の割合で移す、
この操作を何度も繰り返えすことにより、ケフィア酸は
活性化し、増殖する。このようにして増殖させるか、或
いは市販のものを大量に購入して得たケフィア酸を水で
よく洗い、多糖体の精製に用いる。以下多糖の精製につ
いて説明する。

ケフィア酸の重量の約１０〜３０倍の精製水を加え、ミ
キサーなどの細断力のある装置を用い、ケフィア酸を破
砕し水に分散させる７次いで、４０〜７０°Ｃの浴槽中
で０．５〜２時間攪拌しながら多糖体を溶出させる。こ
の過程で溶出液は著しく粘性をもち、糸を引くようにな
る６Ｉ８出液中の大きな不溶物を除くため、３．０００
ｒ、ｐ、ｍ、で１０〜２０分間遠心分離し、上清を得る
。この上２清中にも多敏の不溶物や菌体などがきまれて
おり、史に７　、０００〜１５．ｎ０ｆｌｒ、ｐ、ｍ程
度の高速遠心分離を操り返えして。

それらを除去する。遠心分離後前Ｊ〕れたに清にはまだ
若干の菌体或いは不溶性粒子などが含まれているため、
望ましくは中程度の除蛋白操作を行なう。除蛋白する場
合は通常トリクロロ酢酸などを用いるのがよい。上清を
５〜１０℃に冷却後、２〜５％濃度にトリクロロ酢酸を
加え攪拌後、直ちに低温下において。

７．０００〜１５．０００ｒ、ｐ、ｍ、で５〜２０分間
遠心分離し、上清を得る。多糖の析出沈殿には通常エタ
ノールを用いるが、（也のアルコールよい。菌体や不溶
物を除去したト清或いは除蛋白まで行なった上清に対し
、約１．５〜２倍量のエタノールを加え，多糖体を析出
沈殿させる。２．０００−３．００Ｏｒ．ｐ．ｍ．で５
　−１０分間遠心分離し、沈殿物を得る。この沈殿物を
水に再溶解させ．再度約１，５〜２倍量のエタノールを
加え、再沈殿させた後、２，０００〜３　、　０００ｒ
　、　ｐ　。

ｍ．で５〜１０分間遠心分離し，沈殿物を回収する。こ
の操作を３〜５回程度繰り返えし、得られた沈殿物を凍
結乾燥させたものを，絹多糖体ＫＧＰ（以下ＫＧＰと記
載）とする。次にこのＫＧＰから免疫賦活作用を何する
ｍ糖蛋白質画分Ｆ−３５　ｆ以下Ｆ−ｔｉ５と記載）を
ｔ？Ｉ製する方法について説明する。

ＫＧＰには未だ不純物が多く含まれているため、更に精
製度を高めるためゲルＳ濾過を行なう、ゲルはアカロー
スやポリビニール系の分画分子ｔ′！ｉｌｉ囲が数万〜
数百万のものを用い。

溶、す１液にはｐＨ６〜７５の中性の緩？＃液や、食塩
水、水などが適当である６例えばゲルとしてセファロー
ス６Ｂ　（ファルマシア］やトヨバールＨＷ−ｆｉ５（
東洋曹達）など、溶出液にはｐＨ７，０トリス塩酸緩尚
液や０．２ＭＮａＣＱなどを用いる。ゲルを充填するカ
ラムは負荷する試料の量によって異なるが１通常内径の
３０〜６０倍程度の長さのカラムを用い１分離を良くす
るためには、６０ａ＋＋以上の長さのカラムが望ましい
、負荷する試料の多糖濃度は！Ｉ過ぎると粘度が高まり
、また負荷する試料の量が多いと。

テーリングを起こし易いので、試料濃度は０．５％以下
、試料容量はカラム容積の６％以下で１斤なうのが望ま
しい。通常はＫＧＰを溶出液でＯ１〜０．５％１度に溶
解させ、カラム容積の１〜３％量を負荷する。流速は自
然流下やポンプを用いて調整してもよいが、通常−背当
たりカラム容積の０．１〜０．５％の流量で行なう。以
上のような条件でＫＧＰをケル；濾過するとボイドボリ
ューム（カラム容積の３０〜４０％前後）の部位にＫＧ
Ｐの主体力に？容量され。

テキストランを分子量標準とするとほぼ１００万以上の
分子量と推定される。Ｆ−＃５はこのＫＧＰの高分子部
分と何んらかの会合をしており、多糖体と共に溶出され
る。このＫ　ＧＰの高分子部分のみを採取し、脱塩の後
凍結乾燥し、精製多糖体Ｐ−ＫＧＰ（以下Ｐ−ＫＧＰと
記載）を得る。脱塩方法は透析、脱塩カラムによるゲル
）濾過、限外；濾過などいずれでもよい。次にこのＰ−
ＫＧＰからＦ−ｔｔ５を取り出す操作を行なう。

Ｆ−ｔｔ５を取り出すためには、多糖体との会合を何ら
かの方法で切り離さなければならない、そのためには尿
素や塩酸グアニジンなどの変性剤を用いるか、硫酸アン
モニウムなどによる塩析を行なう。

変性剤を用いる場合は、３〜６モルの尿素或いは１〜３
モルの塩酸グアニジンを含む中性のＩＦＩＪｆ液を用い
たゲル濾過が望ましい。ゲルＳ濾過の条件は、先に記載
した方法と同様で。

分画分子量範囲数万〜数百万のアガロースやポリビニー
ル系のゲルを用い、内径の３０〜６０倍程度の長さのカ
ラムに充填し７溶出液は３〜６モルの尿素或いは１〜３
モルの塩酸グアニジンなどを含むｐ）１６〜７．５の中
性域の緩衝ＭとＬ、ＥｆｌハＰ　−Ｋ　Ｇ　Ｐｒ１．ｌ
−０，５％ｉｌｌ［（７）ものを、カラム容積の１〜５
％量で負荷し。

−分出リカラム容積０．１〜０．６％量の流速で行なう
。以上のような条件下でゲル；濾過すると。

Ｐ−ＫＧＰは多糖体画分がカラム容積の３０〜５０％溶
出部位に、粗性のＦ−＃５がＵＶ吸収２８０ｎｍで検出
すると、６５〜９５％の溶出部位に分離されるにのよう
にして得られた粗性のＦ−ｔｔ５は１分子量数千から数
十万のかなりクルードな蛋白質であり、低分子画分の除
去と脱塩が必要である０分子ｆｌｏ、Ｏｎ［］以下の低
分子画分を除くためには、ゲルＳ濾過や限外；濾過が適
している。

ゲルＳ濾過で除去する場合は、テキストランやポリビニ
ール系のゲルなどで、分画分子量範囲が１００〜ｔｏ、
ｏｏｏ程度のものを用い、例を挙げわば、セファテック
ス０２５〜５０（ファルマシア）、トヨバールＨＷ４０
（東洋曹達）などである。溶出液はｐＨ６〜７．５の中
性域の緩衝液が適しているが、後の脱塩工程を省略する
ために純水を用いてもよい。カラム長は内径の２５〜３
０倍とし、流速は１分出た１１カラム容積の０．５〜２
％、負荷する試料の量はカラム容積の５〜１５％が適当
である。この条件下でゲル５濾過を行なうと１分子量ｉ
ｏ、ｏｏｏ以Ｈの画分は、カラム容積の３０〜４５％の
部分に１つの画分として得られる。溶出液に緩衝液を用
いた場合は、透析、脱塩カラムによるゲル３濾過、限外
シ濾過などの方法により、脱塩した後凍結乾燥する。純
水で溶出させた場合はそのまま凍結乾燥する。

限外シ濾過て低分子画分を除去する場合は。

分子ｊｔｌＯ，ｏｏＯＭ、Ｗ、カットのフ、イルタを用
い。

純水を適宜加えながら、脱塩を兼ねて低分子画分をシ濾
過する。通常最初の塩濃度が１千〜１万分の１となるま
で限外ｓ濾過を行なう、得られた限外Ｓ濾過濃縮部に、
フィルタの目詰まりなどのため残存するｔｏ、ｏｇｏ以
下の低分子画分を除くため、再度再生したフィルタによ
るＩ！艮外門濾過を行なうか、ゲル５濾過する。ゲルＳ
ｒ”過する場合は、先に、￥８ａした低分子画分を除く
方法と同様に行なう。最後に凍結￥ｉ燥してＦ−か５を
得る。

透析で脱塩を先に行なう場合は、透過粒子径が１０　、
０００Ｍ　、　Ｗ　、以下の透析１摸を用い、塩濃度が
１千〜１万分の１となるまで、純水に対して透析する。

次いで先に記載した低分子画分を除去するゲルｓ濾過を
行ない、凍結乾燥物としてＦ−＃５を得る。

塩析でＦ−ｔｔ５を得る場合は１通常の硫酸アンモニウ
ムを最終濃度５０〜６０％飽和で処理する方法による。

まずＰ−ＫＧＰを純水に十分溶解させ、　８．０００−
１０．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で５〜１０分子ｆＪ］遠心分
離して沈殿物を除いた上清を調製する。次に硫酸アンモ
ニウムを加工、５０〜６０％飽和する。この方法により
得られた沈殿物は粗性のため、先に記載した１０，００
０以下の低分子画分の除去と脱塩の操作を同様に行ない
、凍結乾燥物としてＦ−＃５を得る。

以上に記載した方法により得られるＦ−ａ５は、ＳＤＳ
アクリルアミド電気泳動法とゲルシ濾過法によって推定
した結果１分子量約３０　、０００の糖蛋白質を主体と
し、その他に分子量１０．０００〜２００，０００の範
囲４〜５分画の蛋白質を少量含む画分である。Ｆ−３５
は窒素含量５．５〜６．２％、糖含量３５〜５５％１分
子量１０．０００〜２００．０００の糖蛋白質の様相を
呈する。

〔作用〕

次に実験例によってＦ−＃５の免疫賦活作用について詳
細に説明する。

この発明のＦ−１ｔ、５は顕著な免疫賦活作用を有する
。

以下に免疫賦活作用に関する生体外、生体内の実験結果
を示す。

１、実験例１〈生体外での免疫賦活作用のチエツク〉ケフィア粒由来多糖体の免疫賦活作用の一機序として、
マクロファージの活性化の系を介することか示唆されて
いることから、生体外の実験ではマクロファージの活性
化の度合いを調べることにより、免疫賦活作用をチエツ
クした。指標としてマクロファージの形態変化と組識プ
ラスミノーケンアクティベーター（以後ｔ−ＰＡと記載
）産生能及び、腫痛繍胞傷害能を用いた。

ｄ　ｄ　’／マウス（５週令、雌）の腹腔に、１％カゼ
、イン／リン酸ｉ１衝液加生理食塩水ｌ隣りを、１人し
、４日後に腹！Ｆ２浸出綱胞を２０γ、牛脂児血清加Ｒ
ＰＭＴ１６４０培地（ＧＩＩＯ２で採取する。

次いでプライマリアティッシュ（ファルコン）にＭ胞を
移し、５％ＣＯ，下３７℃１時開培１［軽いピペッティ
ングで非付着細胞を除去し。

更にｌＯ％牛脂児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地で同じ条
件で一夜培養し、軽い洗浄の後、得られた付着性細胞を
マクロファージとして用いた。この方法により得られた
マクロファージを形態変化とｔ−ＰＡ産生能、腫１１Ｓ
細胞傷害能蒐アシアロＧＭＩＭｋ性率）のチエツクに用
いた。

またＦ−＃５のルイス肺癌に対する腫瘍細胞傷害活性の
チエツクには、カゼインの代りに１％Ｆ−ｔｔ５／リン
酸緩衝液加生理食塩水１ＩＩＱにより誘導した腹ｔ２浸
出細胞を、上記と同様の方法で調整したものを用いた。

試料の感作法はマクロファージをハイブリティーｌ培地
（無血清２三光純薬）で洗浄後２同じ培地に試料を各濃
度に溶解させ、一定量ずつ圧加し、５％Ｃｏｔ下で１８
時間培養する方法によった。試料はＦ−ｔＪ５．　にＧ
Ｐ、及び比較対照としてＬＰＳ（ＳＩＧ河＾）を用いた
。

形態変化は倒立顕微鏡下でシャーレの１０ｇ４所につい
て、Ｉｍｍ’あたりの付ｆｌｉ４１１胞総数と。

伸展又は大型化している細胞数を測定し、形態変化率（
％）で表わした。ｔ−ＰＡ産生能については、培地内の
ｔ−ＰＡ濃度をフールら（ＷＨＵＲ，Ｐ、ｅｔ　ａｌ、
Ｂｒ、Ｊ、ｃａｎｃｅｒ、４２．３０５．１９８０１の
方法にしたがって測定した。

腫瘍細胞傷害能についてはアカガヮ等（Ａｋａｇａｗａ、に、５　ａｎｄ　Ｔｏｋｕｎａｇａ
、Ｔ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、２６．８３１．１９８２）によれ
ば、マグロファージがアシアロＧＭＩＨ性となることを
報告していることから、抗アシアロＧＭＩ抗体（和光）
を用い、酵素抗体法ｆＡＢＣ法）により、陽性率ヲ測定
した。またＦ−ｔｔ５についてはルイス肺癌細胞を標的
細胞とした腫瘍細胞傷害活性も同時に測定した。この場
合はＦ−Ｎ５により誘導したマクロファージとルイス＃
癌ｍ胞を混合培養した後、標的Ｎ１胞数を測定した。コ
ントロ−ルにはカゼイン誘導マクロファージを用いた。

以上の実験結果を第１〜３表に示す。

第１表、マクロファージの形態変（ＩＺ率（変化率：％
）第２表、マクロファージのｔ−ＰＡ生産ｆｔ　（４０
５ｎｍ吸光度）第３表　マクロファージのアシアロＧＭ
Ｉ陽性率（陽性率；％）表１〜３に示したようにマクロ
ファージの形態変化率、ｔ−ＰＡ生産量、腫瘍細胞傷害
性（アシアロＧＭＩ陽性率）のいずれにおいても、Ｆ−
Ｎ５はＫＧＰの１／８〜１／１６の使用鼠で約２倍の活
性値であった。またマクロファージ活性化作用が強いＬ
ＰＳよりも強い活性化作用をもつこともわかる。ルイス
肺癌を欅的細胞とした時、カゼイン誘導マクロファージ
が何んら傷害活性をもたなかったのに対し、Ｆ−１５誘
導マクロフアージが何んら傷害活性をもたなかったのに
対し、Ｆ−Ｎ５誘導マクロフアージは４２．９％の高い
活性値を示した。このことからもＦ−Ｎ５がマクロファ
ージの腫瘍細胞障害活性を高めることが示唆された。

２、実験例２〈生体内での免疫賦活作用のチエツク〉生体内実験では、マウス血液中の線溶活性を測定するこ
とにより、ｔ−ＰＡ生産量のチエツクを、また腫瘍細胞
ザルコーマ１８０のマウスへの移植後の細胞増殖度を調
べることにより抗腫瘍活性を測定して、生体内での免疫
賦活の効果を調べた。

〈実験方法〉（１）線溶活性実験動物：　ＤＤ’ｌ’マウス（４週令、雄）。

群１０匹とする。

試料投与法；生理食塩水に溶かし、腹腔的投与試料処置時間；２３時間線溶活性測定法；血漿中のプラスミン（線７８素）活性
を測定し、コトロール群を１００％として増加率を求める。

（２）抗腫瘍活性実験動物：　ｄｄＹマウス（４週令、維）。

群１０匹とし通常の飼育方法による。

腫瘍；ザルコーマ１８０移植法：右Ｍ部皮下移殖（１０ケ細胞数）試料投与方法
；生理食塩水に試料を溶解させ、腹腔的投与。

投与期間：腫瘍移Ｍ７日前から、移殖後１４日目まで１
日１回隔日没与した。

１ｌｌｉＬ瘍増殖度の測定：移植後、　１５日Ｉｎ腫瘍
を摘出し重量を測定し。

コントロール群に対する増殖抑制率を下式のように求める。

第５表　Ｆ−４５とＫＧＰの抗腫瘍活性コントロール群
の腫瘍重量−処置群の腫瘍重量抑ルｌ率＝コントロール群の腫瘍重量実験結果を第４．５表に示す。

第１１表　Ｆ−＃５とＫＧＰの線溶活性への影響＠４表
に示したようにＦ−＃５は５　Ｂ／ｋｇでコントロール
群（１００％）に対し１８７％に線溶活性を上昇させ、
にＧＰの１／ｌＯの投与域で約２倍の高い活性値を得た
。

第５表の抗腫瘍活性ではＦ　−ｔｔ　５　１ｆ）ｍｇ／
ｋｇの投与量でザルコーマ１８０の増殖を８５．８％抑
制し、ＫＧＰの１７５の投与量で約２倍の強い抑制効果
があった。

以上の生体外、生体内の実験結果から、Ｆ−４５はＫＧ
Ｐに比べて極めて少量で、しかもより強い免疫賦活活性
をもつことが認められた。また発明者らの実験によれば
、ＫＧＰからＦ−ｔｔ５を除いた画分にはほとんど免疫
賦活活性を認めなかったことから、Ｆ−ｔｔ５はケフィ
ア粒由東物質のもつ免疫賦活作用の本体と推定され、こ
の発明は有用な発明である。

［実施例〕以下実施例により、この発明の詳細な説明する。

実施例１パンセン社ケフィア粒２０ｇ！ｚ　９０°Ｃ，５分間殺
菌した脱脂乳培地に、　１０％の割合いで接種し、２５
℃、２４時間培養後、このケフィア粒を炉別して新しい
培地に１０％比となるように接種した。この操作を繰り
返えして約ＩＯ陣のケフィア粒に増加させた後、水でよ
く洗浄し。

８０ｇのケフィア粒を得た。次に、このケフィア粒８０
ｇに対し、　１２００ｍ１１の精製水を加えブレンダを
用い、　１０．（１００ｒ、ｐ、ｉ、で１５分間破砕し
た後、５５”Ｃの温浴槽中で攪拌しながら、１時間呆持
した。この溶解液を２．０００ｒ、ｐ、ｍ、で１５分間
遠心分離し、大きな不溶性物を除去後５上清を更に１５
，０ＯＯｒ、ｐ、＋１．で３０分間の遠心骨Ｍ操作を２
回行ない、不溶物や菌体などをほぼ完全に除去した。得
られた上清９１０ｖａ　Ｑを５°Ｃに冷却し、トリクロ
ロ酢酸２９．１ｇを加え、よく攪拌した後、直ちにＩＯ
，００Ｏｒ、ｐ、＋ｏ、　５分間遠心分離を行ない、上
清を回収した。この上清９５抛Ｑに対し、１，９００＋
ａ（ｌのエタノールを加え、多糖を析出させた後、３．
００Ｏｒ、ｐ、ｍ、　１０分間遠心分離して、多糖の沈
殿物を得た。この沈殿物に対し、５００＋ａＱの精製水
を加え、よく攪拌して溶解させ、エタノールを１，００
０ｍ１！加えて多糖を再沈殿させた。この操作を３回行
なった後、得た多糖沈殿物を凍結乾燥し、粗多糖。

体ＫＧＰ２．２ｇを得た。

次にこのＫＧＰｌｇを精製水３００ａ＋　Ｑに溶解させ
、トヨバールＨ１ｆ６５Ｆ　Ｃ東洋曹達）を用い。

下記の条件下でゲルシ濾過を行なった。

（条件）カラム：　３．６ｃ＋ｎ　Ｘ　ＩＩＯｃＩＩ溶出液：精
製水流ｄ　：　１．６ｍ　Ｑ　／ｍｉｎ試ｆ’ｊ　：　４０＋ｏ　Ｑ検出：フェノール硫酸法この条件でゲルｓ濾過をくり返えし、凍結乾燥して多糖
体Ｐ　−Ｋ　Ｇ　Ｐｏ、６ｇを得た。このＰ−Ｋ　ａ　
Ｐｏ、６ｇを３　Ｍ尿素、０．１Ｍ１−リス塩酸ｆ！衡
液２００ＩＩＱに溶解し、以下の条件でゲルｓ濾過を行
なった。

ゲル：セファロース４Ｂ＋フアルマシア）。

カラム：　３．６ＣＩＩ　Ｘ　１１０印溶出Ｉｅｉ：３
Ｍ尿素０．１Ｍ１−リス塩酸緩衝液（ｐＨ６，９）、流
速１．ｌｉ＋＋！／ｌｌ１ｉｎ試料：　３０ｍ　Ｑ検出：　Ｕ　Ｖ２８０ｎｍ以上のゲルｓ濾過で７００ａ　Ｑ〜８５０ｍρの溶出部
に粗性のＦ−３５のピークを検出し、この部分を集めて
、　ｔｏ、ｏｏｏカットのＵＦ［により。

脱塩を兼ねて低分子画分を除去し　、＊縮液２００ｍ　
Ｑを得た。この濃縮液から１０．０００以下の低分子画
分を完全に除くため、虹に以下の条件でゲルｓ濾過を行
なった。

ゲル；セルファナックスＧ−５０カラム；１．８ｃｍＸ８０印溶出液：純水流速；　０．８ｎ　Ｑ　／１Ｗ１ｎ。

試料：２０ｍ１１検出；　Ｕ　Ｖ　２８０ａｍ以上の条件でゲル５？ａすると、５５ｍＱ〜７０ＩＩＩ
Ｑの溶出部にＦ−１５のピークを検出し。

このピーク部分を集めて凍結乾燥し、３．２１のＦ−＃
５を得た。

このＦ−＃５のＳＤＳアクリルアシド電気泳動法を行な
った結果１分子量約３０．０００の濃いバンドを得、　
ｔｏ、ｏｏｏ〜３０．０００に３本、３０．０００以上
に２本の淡いバンドを検出した。

窒素量は５．８８％、糖質は３７．６０％であった。

このＦ−ｔｔ５の抗腫瘍活性を、ウィスター系ラット２
５０ｇ４ｉ　（−群１０匹）を用い、下記の条件で調べ
た結果を示す。

腫瘍：ザルコーマ１８０移殖法：右・ν部皮下移Ｎ（１０’細胞数）投与法：生
理食塩水に試料を溶解させ、腹腔内投与投与Ｉｔｌ１間：！Ｉｌ瘍移殖７日前から１０隔日投与腫瘍増殖度の測定：移殖後、１５日目に腫瘍と抑制率の
算出　　を摘出し重量を測定し。

コン１ヘロール群の腫ｆＩＳ車量−処置群の腫瘍重量抑
制率＝コントロール群の腫瘍重量試験結果：抑制＄７１．２％実施例２ウィズビー社ケフィア粒１００．を、精製水でよく洗浄
し、１，６５０ＩＩ＋Ｉ！の精製水を加え、ブレンタを
用い、１２．０ｎＯｒ、ｐ、ｍ、で１０分間破砕した後
、６５”Ｃの温浴槽中で、攪拌しながら１時間保持した
。この溶解液を３．０００ｒ、ｐ＝ｍ、で１５分間遠心
分離し、大きな不溶性物を除去後、上清を更に１５．０
００ｒ、ｐ、ｎ＋、で３０分間の遠心分離操作を２回行
ない、不溶物や菌体などをほぼ完全に除去した６得られ
た」二清１４８０ｍ　Ｑを５℃に冷却し、トリクロロ＃
酸５］、８ｇを加え、よく攪拌した後、直ちにｌｏ、０
０ｏｒ、ｐ、ｍ、で５分間遠心分離を行ない、上清を回
収した。この上清９５０ｍ　Ｑに対し、　１．９００＋
ａＱのエタノールを加え多糖を析出させた後、　３．０
０Ｏｒ、ｐ、ｉ、で１０分間遠心分離して、多糖の沈殿
物を得た。この沈殿物に対し５５０ＩＩＩＱの精製水を
加え、良く攪拌して溶解させ、エタノールをＩ　、　０
００ｎ＋　Ｑ加えて多糖を再沈殿させた。この操作を３
回行なった陽、得た多糖沈殿物を凍結乾燥し、ｍ多糖体
ＫＧＰ２．３ｇを得た。次にこのＫＧＰ２ｇを精製水５
００ｍ　１！に１容解させ、セファロースＣＬ４Ｂ　＋
ファルマシア）を用い、下記の条件でゲｌし５戸覇した
。

（条件）カラム：　３．６ＣＩｌｌ　Ｘ　ｌｌ０ＣＩＩ＋溶出液
：純水流速：２．Ｏ＋ｍＱ／分試料：３５ＩＩＩＱゆ出：フェノール硫酸法この条件でゲル；濾過を繰り返えし、凍結乾燥して多糖
体Ｐ　−ＫＧ　Ｐｌ、４４ｇを得た。このＰ　−Ｋ　Ｇ
　Ｐ　１．４４ｇを５００＋ａ　Ｑの精製水によく溶解
させ、　８，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離を
行なった。この上清４９７ｍ　Ｑを別の容器に移し。

硫酸アンモニウム５５０ｇを攪拌しながら徐々に加え、
　７．００Ｏｒ、ｐ、ｍ−で１０分間遠心分離を行ない
、上清を捨て沈殿物を回収した。この沈殿物５３ｍ　ｇ
を純水２００ｍ　Ｑに溶解させた後９次の条例二でゲル
５濾過を行なった。

セファデックスＧ−５０力うム：　１．８ｃＩＩ　Ｘ　８０ｃ＋ｗ溶出液：純水流速：　０．８ｍ　Ｑ　／ｗｉｎ。

試料：　２ｆｌ＋＋　Ｑ検出：　Ｕ　Ｖ　２８０ｎｎ＋以上の条件でゲルシ濾過し、５５ｍＱ〜７０ｍ　Ｑに１
８出されたＦ−４５のピークを検出し、この部分を集め
て凍結乾燥し、４．８１のＦ−３５を得た。このＦ−１
ｔ　５のＳＤＳアクリルアミド電気泳動法を行なった結
果、分子量的３０　、０００の最も、１１いバンドを得
、その他に前後に淡いバンド２本ずつを検出した。窒素
量は５．５８％、糖質は３８．２５％であった。

このＦ−ｔｔ５を用い下記条件で抗腫瘍活性を調べた。

実験動物：　ＩＣＲマウス４週令雄、−群１０匹腫瘍：
ザルコーマ１８０移殖法：右臂部皮下８殖（ｔｏ’細胞数）投与法：生理
食塩水に試料を溶解させ、腹腔内投与投与期間：腫瘍移殖７日前から１日１回隔日没与腫瘍増殖度の測定：移ｗｉ後、１５日目に腫瘍を摘出し
１重量を測定し、コントロール群に対する増殖抑制率を下式のように求める。

抑制率＝コントロール群の腫瘍重量−処置群の腫瘍重量コントロ
ール群の腫ｆＩ重量上記の条件で試験した結果、抑制率は８０．３％であっ
た。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ケフイア粒を構成する多糖体及び菌体に含まれる
分子量１０，０００〜２００，０００、窒素量５．５〜
６．２％、糖質３５〜５５％の粗糖蛋白質画分。
（２）ケフイア粒の多糖体を主とする水溶性成分をアル
コール類により沈殿させ、得られた沈殿物から変性剤或
いは塩析などにより前記粗糖蛋白質画分を採取すること
を特徴とする前記粗糖蛋白質画分の製造法。
（３）変性剤として尿素或いは塩酸グアニジンなど、又
、塩析として硫酸アンモニウムなどを用いた請求項２記
載の粗糖蛋白質画分の製造法。