JP2788987B2

JP2788987B2 - 免疫賦活作用を有する粗糖蛋白質画分及びその製造法

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Publication number: JP2788987B2
Application number: JP63215069A
Authority: JP
Inventors: 一二三大石; 俊明堀; 朱宮内; 岩雄坂内
Original assignee: KYODO NYUGYO KK; NIPPON KEFUIA KK
Current assignee: KYODO NYUGYO KK; NIPPON KEFUIA KK
Priority date: 1988-08-31
Filing date: 1988-08-31
Publication date: 1998-08-20
Anticipated expiration: 2013-08-20
Also published as: JPH0265790A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は免疫賦活作用を有する粗糖蛋白質画分及び
その製造法に関するものである。

〔従来の技術〕

古来、ケフイアは消化機能の亢進、腎臓病、循環器病
などに対する効果が高いと伝えられてきたが、近年ケフ
イア粒由来多糖体の抗腫瘍作用が報告されて以来、最近
の研究は主に免疫賦活に関するものである。免疫賦活作
用に関する報告はケフイア粒由来多糖体や、ケフイア粒
を構成する乳酸菌の膜性多糖体及びケフイアヨーグルト
などを対象としたものであり、それ以外のものでは行な
われていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

発明者等はケフイア粒由来多糖体の免疫賦活作用につ
いて、マクロフアージにより生体外の実験及びマウスを
用いた抗腫瘍活性による生体内の実験などにより調べた
結果、その作用を認めたが、再現性が悪く、多糖体のロ
ツトや精製度が変わると著しい活性のぶれを生じた。ま
たこの多糖体の免疫賦活作用も、それ程強くないことが
確認され、上記の再現性の低さの面からも、免疫賦活剤
としてこの物質を利用することには難かしい課題点が残
されている。

発明者等は、免疫賦活作用がケフイア粒由来多糖体の
主体以外にあると考え、種々研究を重ねた結果、ケフイ
ア粒に含まれ、多糖体と何んらかの会合をし、常法によ
る多糖体の精製過程を経ても多糖体画分に残存している
分子量10,000〜200,000、窒素量5.5〜6.5％、糖質35〜5
5％の粗糖蛋白質画分を得、この物質が免疫賦活作用を
示す本体であり、またその作用も非常に強いことを見出
した。この発明はこの物質自体及びその製造法により、
上記の課題を解決しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

発明者等は上記の課題点を解決するために、種々研究
を重ねた結果、この発明を完成するに到つた。

すなわちこの発明はケフイア粒を構成する多糖体及び
菌体に含まれる分子量10,000〜200,000、窒素量5.5〜6.
5％、糖質35〜55％の粗糖蛋白質画分、並びにケフイア
粒の多糖体を主とする水溶性成分をアルコール類により
沈殿させ、得られた沈殿物から変成剤或いは塩析によ
り、前記糖蛋白質画分を採取することを特徴とする前記
糖蛋白質画分の製造法である。

〔構成〕

この発明の免疫賦活作用を有する粗糖蛋白質画分を得
るに当り、まずケフイア粒から多糖体を調製する。ケフ
イア粒はハンセン社、ウイズビー社などのものが市販さ
れており、培養のための培地は、牛乳、脱脂乳、或いは
ホエーなどの乳性培地を通常使用する。

上記培地を常法により殺菌し、ケフイア粒を３〜20％
の割合で無菌的に加え、15〜25℃で１〜数日間、乳が凝
固或いは培地pHが4.5〜4.0以下になるまで培養する。次
いでケフイア粒を殺菌した網などで過分別し、新しい
培地へ同様の割合で移す。この操作を何度も繰り返えす
ことにより、ケフイア粒は活性化し、増殖する。このよ
うにして増殖させるか、或いは市販のものを大量に購入
して得たケフイア粒を水でよく洗い、多糖体の精製に用
いる。以下多糖の精製について説明する。

ケフイア粒の重量の約10〜30倍の精製水を加え、ミキ
サーなどの細断力のある装置を用い、ケフイア粒を破砕
し水に分散させる。次いで、40〜70℃の浴槽中で0.5〜
２時間撹拌しながら多糖体を溶出させる。この過程で溶
出液は著しく粘性をもち、糸を引くようになる。溶出液
中の大きな不溶物を除くため、3,000r.p.m.で10〜20分
間遠心分離し、上清を得る。この上清中にも多量の不溶
物や菌体などが含まれており、更に7,000〜15,000r.p.
m.程度の高速遠心分離を繰り返えして、それらを除去す
る。遠心分離後得られた上清にはまだ若干の菌体或いは
不溶性粒子などが含まれているため、望ましくは中程度
の除蛋白操作を行なう。除蛋白する場合は通常トリクロ
ロ酢酸などを用いるのがよい。上清を５〜10℃に冷却
後、２〜５％濃度にトリクロロ酢酸を加え撹拌後、直ち
に低温下において、7,000〜15,000r.p.m.で５〜20分間
遠心分離し、上清を得る。多糖の析出沈殿には通常エタ
ノールを用いるが、他のアルコール類でもよい。菌体や
不溶物を除去した上清或いは除蛋白まで行なつた上清に
対し、約1.5〜２倍量のエタノールを加え、多糖体を析
出沈殿させる。2,000〜3,000r.p.m.で５〜10分間遠心分
離し、沈殿物を得る。この沈殿物を水に再溶解させ、再
度約1.5〜２倍量のエタノールを加え、再沈殿させた
後、2,000〜3,000r.p.m.で５〜10分間遠心分離し、沈殿
物を回収する。この操作を３〜５回程度繰り返えし、得
られた沈殿物を凍結乾燥させたものを、粗多糖体KGP
（以下KGPと記載）とする。次にこのKGPから免疫賦活作
用を有する粗糖蛋白質画分Ｆ−＃５（以下Ｆ−＃５と記
載）を精製する方法について説明する。

KGPには未だ不純物が多く含まれているため、更に精
製度を高めるためゲル過を行なう。ゲルはアガロース
やポリビニール系の分画分子量範囲が数万〜数百万のも
のを用い、溶出液にはpH6〜7.5の中性の緩衝液や、食塩
水、水などが適当である。例えばゲルとしてセフアロー
ス6B「登録商標」（フアルマシア）やトヨパールHW−65
「登録商標」（東洋曹達）など、溶出液にはpH7.0トリ
ス塩酸緩衝液や0.2MNaClなどを用いる。ゲルを充填する
カラムは負荷する試料の量によつて異なるが、通常内径
の30〜60倍程度の長さのカラムを用い、分離を良くする
ためには、60cm以上の長さのカラムが望ましい。負荷す
る試料の多糖濃度は濃過ぎると粘度が高まり、また負荷
する試料の量が多いと、テーリングを起こし易いので、
試料濃度は0.5％以下、試料容量はカラム容積の６％以
下で行なうのが望ましい。通常はKGPを溶出液で0.1〜0.
5％濃度に溶解させ、カラム容積の１〜３％量を負荷す
る。流速は自然流下やポンプを用いて調整してもよい
が、通常一分当たりカラム容積の0.1〜0.5％の流量で行
なう。以上のような条件でKGPをゲル過するとボイド
ボリユーム（カラム容積の30〜40％前後）の部位にKGP
の主体が溶出され、デキストランを分子量標準とすると
ほぼ100万以上の分子量と推定される。Ｆ−＃５はこのK
GPの高分子部分と何んらかの会合をしており、多糖体と
共に溶出される。このKGPの高分子部分のみを採取し、
脱塩の後凍結乾燥し、精製多糖体Ｐ−KGP（以下Ｐ−KGP
と記載）を得る。脱塩方法は透析、脱塩カラムによるゲ
ル過、限外過などいずれでもよい。次にこのＰ−KG
PからＦ−＃５を取り出す操作を行なう。

Ｆ−＃５を取り出すためには、多糖体との会合を何ら
かの方法で切り離さなければならない。そのためには尿
素や塩酸グアニジンなどの変性剤を用いるか、硫酸アン
モニウムなどによる塩析を行なう。

変性剤を用いる場合は、３〜６モルの尿素或いは１〜
３モルの塩酸グアニジンを含む中性の緩衝液を用いたゲ
ル過が望ましい。ゲル過の条件は、先に記載した方
法と同様で、分画分子量範囲数万〜数百万のアガロース
やポリビニール系のゲルを用い、内径の30〜60倍程度の
長さのカラムに充填し、溶出液は３〜６モルの尿素或い
は１〜３モルの塩酸グアニジンなどを含むpH6〜7.5の中
性域の緩衝液とし、試料はＰ−KGP0.1〜0.5％濃度のも
のを、カラム容積の１〜５％量で負荷し、一分当りカラ
ム容積0.1〜0.6％量の流速で行なう。以上のような条件
下でゲル過すると、Ｐ−KGPは多糖体画分がカラム容
積の30〜50％溶出部位に、粗性のＦ−＃５がUV吸収280n
mで検出すると、65〜95％の溶出部位に分離される。こ
のようにして得られた粗性のＦ−＃５は、分子量数千か
ら数十万のかなりクルードな蛋白質であり、低分子画分
の除去と脱塩が必要である。分子量10,000以下の低分子
画分を除くためには、ゲル過や限外過が適してい
る。

ゲル過で除去する場合は、デキストランやポリビニ
ール系のゲルなどで、分画分子量範囲が100〜10,000程
度のものを用い、例を挙げれば、セフアデツクスG25−5
0「登録商標」（フアルマシア）、トヨパールHW40「登
録商標」（東洋曹達）などである。溶出液はpH6〜7.5の
中性域の緩衝液が適しているが、後の脱塩工程を省略す
るために純水を用いてもよい。カラム長は内径の25〜30
倍とし、流速は１分当たりカラム容積の0.5〜２％、負
荷する試料の量はカラム容積の５〜15％が適当である。
この条件下でゲル過を行なうと、分子量10,000以上の
画分は、カラム容積の30〜45％の部分に１つの画分とし
て得られる。溶出液に緩衝液を用いた場合は、透析、脱
塩カラムによるゲル過、限外過などの方法により、
脱塩した後凍結乾燥する。純水で溶出させた場合はその
まま凍結乾燥する。

限外過で低分子画分を除去する場合は、分子量10,0
00M.W.カツトのフイルタを用い、純水を適宜加えなが
ら、脱塩を兼ねて低分子画分を過する。通常最初の塩
濃度が１千〜１万分の１となるまで限外過を行なう。
得られた限外過濃縮部に、フイルタの目詰まりなどの
ため残存する10,000以下の低分子画分を除くため、再度
再生したフイルタによる限外過を行なうか、ゲル過
する。ゲル過する場合は、先に記載した低分子画分を
除く方法と同様に行なう。最後に凍結乾燥してＦ−＃５
を得る。

透析で脱塩を先に行なう場合は、透過粒子径が10,000
M.W.以下の透析膜を用い、塩濃度が１千〜１万分の１と
なるまで、純水に対して透析する。次いで先に記載した
低分子画分を除去するゲル過を行ない、凍結乾燥物と
してＦ−＃５を得る。

塩析でＦ−＃５を得る場合は、通常の硫酸アンモニウ
ムを最終濃度50〜60％飽和で処理する方法による。まず
Ｐ−KGPを純粋に十分溶解させ、8,000〜10,000r.p.m.で
５〜10分間遠心分離して沈殿物を除いた上清を調製す
る。次に硫酸アンモニウムを加え、50〜60％飽和する。
この方法により得られた沈殿物は粗性のため、先に記載
した10,000以下の低分子画分の除去と脱塩の操作を同様
に行ない、凍結乾燥物としてＦ−＃５を得る。

以上に記載した方法により得られるＦ−＃５は、SDS
アクリルアミド電気泳動法とゲル過法によつて推定し
た結果、分子量約30,000の糖蛋白質を主体とし、その他
に分子量10,000〜200,000の範囲４〜５分画の蛋白質を
少量含む画分である。Ｆ−＃５は窒素含量5.5〜6.2％、
糖含量35〜55％、分子量10,000〜200,000の糖蛋白質の
様相を呈する。

〔作用〕

次に実験例によつてＦ−＃５の免疫賦活作用について
詳細に説明する。

この発明のＦ−＃５は顕著な免疫賦活作用を有する。

以下に免疫賦活作用に関する生体外、生体内の実験結
果を示す。

1.実験例１＜生体外での免疫賦活作用のチエツク＞ケフイア粒由来多糖体の免疫賦活作用の一機序とし
て、マクロフアージの活性化の系を介することが示唆さ
れていることから、生体外の実験ではマクロフアージの
活性化の度合いを調べることにより、免疫賦活作用をチ
エツクした。指標としてマクロフアージの形態変化と組
織プラスミノーゲンアクテイベーター（以後ｔ−PAと記
載）産生能及び、腫瘍細胞傷害能を用いた。

ddYマウス（５週令、雌）の腹腔に、１％カゼイン／
リン酸緩衝液加生理食塩水1mlを注入し、４日後に腹腔
浸出細胞を20％牛胎児血清加RPMI1640培地（GIBCO）で
採取する。次いでプライマリアデイツシユ（フアルコ
ン）に細胞を移し、５％CO₂下37℃１時間培養後、軽い
ピペツテイングで非付着細胞を除去し、更に10％牛胎児
血清加RPMI1640培地で同じ条件で一夜培養し、軽い洗浄
の後、得られた付着性細胞をマクロフアージとして用い
た。この方法により得られたマクロフアージを形態変化
とｔ−PA産生能、腫瘍細胞傷害能（アシアロGM1陽性
率）のチエツクに用いた。またＦ−＃５のルイス肺癌に
対する腫瘍細胞傷害活性のチエツクには、カゼインの代
りに１％Ｆ−＃5/リン酸緩衝液加生理食塩水1mlにより
誘導した腹腔浸出細胞を、上記と同様の方法で調整した
ものを用いた。

試料の感作法はマクロフアージをハイブリテイー１培
地（無血清、三光純薬）で洗浄後、同じ培地に試料を各
濃度に溶解させ、一定量ずつ注加し、５％CO₂下で18時
間培養する方法によつた。試料はＦ−＃５、KGP、及び
比較対照としてLPS（SIGMA）を用いた。

形態変化は倒立顕微鏡下でシヤーレの10箇所につい
て、1mm²あたりの付着細胞総数と、伸展又は大型化して
いる細胞数を測定し、形態変化率（％）で表わした。ｔ
−PA産生能については、培地内のｔ−PA濃度をフールら
（WHUR,P.et al.Br.J.Cancer,42,305,1980）の方法にし
たがつて測定した。

腫瘍細胞傷害能についてはアカガワ等（Akagawa,K.S
and Tokunaga,T.Microbiol,Immunol.,26,831,1982）に
よれば、マクロフアージがアシアロGM1陽性となること
を報告していることから、抗アシアロGM1抗体（和光）
を用い、酵素抗体法（ABC法）により、陽性率を測定し
た。またＦ−＃５についてはルイス肺癌細胞を標的細胞
とした腫瘍細胞傷害活性も同時に測定した。この場合は
Ｆ−＃５により誘導したマクロフアージとルイス肺癌細
胞を混合培養した後、標的細胞数を測定した。コントロ
ールにはカゼイン誘導マクロフアージを用いた。

以上の実験結果を第１〜３表に示す。

表１〜３に示したようにマクロフアージの形態変化
率、ｔ−PA生産量、腫瘍細胞傷活性（アシアロGM1陽性
率）のいずれにおいても、Ｆ−＃５はKGPの1/8〜1/16の
使用量で約２倍の活性値であつた。またマクロフアージ
活性化作用が強いLSPよりも強い活性化作用をもつこと
もわかる。ルイス肺癌を標的細胞とした時、カゼイン誘
導マクロフアージが何んら傷害活性をもたなかつたのに
対し、Ｆ−＃５誘導マクロフアージが何んら傷害活性を
もたなかつたのに対し、Ｆ−＃５誘導マクロフアージは
42.9％の高い活性値を示した。このことからもＦ−＃５
がマクロフアージの腫瘍細胞障害活性を高めることが示
唆された。

2.実験例２＜生体内での免疫賦活作用のチエツク＞生体内実験では、マウス血液中の線溶活性を測定する
ことにより、ｔ−PA生産量のチエツクを、また腫瘍細胞
ザルコーマ180のマウスへの移殖後の細胞増殖度を調べ
ることにより抗腫瘍活性を測定して、生体内での免疫賦
活の効果を調べた。

＜実験方法＞（１）線溶活性実験動物;DDYマウス（４週令、雄）、一群10匹とする。

試料投与法；生理食塩水に溶かし、腹腔内投与試料処置時間;23時間線溶活性測定法；血漿中のプラスミン（線溶素）活性を
測定し、コトロール群を100％として増加率を求める。

（２）抗腫瘍活性実験動物;ddYマウス（４週令、雄）、一群10匹とし通常
の飼育方法による。

腫瘍；ザルコーマ180 移殖法；右臀部皮下移殖（10ケ細胞数）試料投与方法；生理食塩水に試料を溶解させ、腹腔内投
与。

投与期間；腫瘍移殖７日前から、移殖後14日目まで１日
１回隔日投与した。

腫瘍増殖度の測定；移殖後、15日目に腫瘍を摘出し重量
を測定し、コントロール群に対する増殖抑制率を下式の
ように求める。

実験結果を第4,5表に示す。

第４表に示したようにＦ−＃５は5mg/kgでコントロー
ル群（100％）に対して187％に線溶活性を上昇させ、KG
Pの1/10の投与量で約２倍の高い活性値を得た。

第５表の抗腫瘍活性ではＦ−＃5 10mg/kgの投与量で
ザルコーマ180の増殖を85.8％抑制し、KGPの1/5の投与
量で約２倍の強い抑制効果があつた。

以上の生体外、生体内の実験結果から、Ｆ−＃５はKG
Pに比べて極めて少量で、しかもより強い免疫賦活活性
をもつことが認められた。また発明者らの実験によれ
ば、KGPからＦ−＃５を除いた画分にはほとんど免疫賦
活活性を認めなかつたことから、Ｆ−＃５はケフイア粒
由来物質のもつ免疫賦活作用の本体と推定され、この発
明は有用な発明である。

〔実施例〕

以下実施例により、この発明を詳細に説明する。

実施例１ハンセン社ケフイア粒20gを90℃、５分間殺菌した脱
脂乳培地に、10％の割合いで接種し、25℃、24時間培養
後、このケフイア粒を別して新しい培地に10％比とな
るように接種した。この操作を繰り返えして約100gのケ
フイア粒に増加させた後、水でよく洗浄し、80gのケフ
イア粒を得た。次に、このケフイア粒80gに対し、1200m
lの精製水を加えブレンダを用い、10,000r.p.m.で15分
間破砕した後、55℃の温浴槽中で撹拌しながら、１時間
保持した。この溶解液を2,000r.p.m.で15分間遠心分離
し、大きな不溶性物を除去後、上清を更に15,000r.p.m.
で30分間の遠心分離操作を２回行ない、不溶物や菌体な
どをほぼ完全に除去した。得られた上清970mlを５℃に
冷却し、トリクロロ酢酸29.1gを加え、よく撹拌した
後、直ちに10,000r.p.m.5分間遠心分離を行ない、上清
を回収した。この上清950mlに対し、1,900mlのエタノー
ルを加え、多糖を析出させた後、3,000r.p.m.10分間遠
心分離して、多糖の沈殿物を得た。この沈殿物に対し、
500mlの精製水を加え、よく撹拌して溶解させ、エタノ
ールを1,000ml加えて多糖を再沈殿させた。この操作を
３回行なつた後、得た多糖沈殿物を凍結乾燥し、粗多糖
体KGP2.2gを得た。

次にこのKGP1gを精製水300mlに溶解させ、トヨパール
HW65F（東洋曹達）を用い、下記の条件下でゲル過を
行なつた。

（条件）カラム:3.6cm×110cm 溶出液：精製水流速:1.6ml/min. 試料:40ml 検出：フエノール硫酸法この条件でゲル過をくり返えし、凍結乾燥して多糖
体Ｐ−KGP0.6gを得た。このＰ−KGP0.6gを3M尿素、0.1M
トリス塩酸緩衝液200mlに溶解し、以下の条件でゲル
過を行なつた。

ゲル；セフアロース4B「登録商標」（フアルマシア）、カラム;3.6cm×110cm 溶出液;3M尿素0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH6.9）、流速1.
1ml/min. 試料:30ml 検出:UV280nm 以上のゲル過で700ml〜850mlの溶出部に粗性のＦ−
＃５のピークを検出し、この部分を集めて、10,000カツ
トのUF膜により、脱塩を兼ねて低分子画分を除去し、濃
縮液200mlを得た。この濃縮液から10,000以下の低分子
画分を完全に除くため、更に以下の条件でゲル過を行
なつた。

ゲル；セルフアデツクスＧ−50 カラム;1.8cm×80cm 溶出液；純水流速;0.8ml/min. 試料;20ml 検出;UV280nm 以上の条件でゲル過すると、55ml〜70mlの溶出部に
Ｆ−＃５のピークを検出し、このピーク部分を集めて凍
結乾燥し、3.2mgのＦ−＃５を得た。

このＦ−＃５のSDSアクリルアシド電気泳動法を行な
つた結果、分子量約30,000の濃いバンドを得、10,000〜
30,000に３本、30,000以上に２本の淡いバンドを検出し
た。窒素量は5.88％、糖質は37.60％であつた。

このＦ−＃５の抗腫瘍活性を、ウイスター系ラツト25
0g雄（一群10匹）を用い、下記の条件で調べた結果を示
す。

腫瘍：ザルコーマ180 移殖法：右臀部皮下移殖（10′細胞数）投与法：生理食塩水に試料を溶解させ、腹腔内投与投与期間：腫瘍移殖７日前から１日隔日投与腫瘍増殖度の測定：移殖後、15日目に腫瘍と抑制率の算
出を摘出し重量を測定し、コントロール群に対する増殖
抑制率を下式のように求める。

試験結果：抑制率71.2％実施例２ウイズビー社ケフイア粒100gを、精製水でよく洗浄
し、1,650mlの精製水を加え、ブレンダを用い、12,000
r.p.m.で10分間破砕した後、65℃の温浴槽中で、撹拌し
ながら１時間保持した。この溶解液を3.000r.p.m.で15
分間遠心分離し、大きな不溶性物を除去後、上清を更に
15,000r.p.m.で30分間の遠心分離操作を２回行ない、不
溶物や菌体などをほぼ完全に除去した。得られた上清14
80mlを５℃に冷却し、トリクロロ酢酸51.8gを加え、よ
く撹拌した後、直ちに10,000r.p.m.で５分間遠心分離を
行ない、上清を回収した。この上清950mlに対し、1,900
mlのエタノールを加え多糖を析出させた後、3,000r.p.
m.で10分間遠心分離して、多糖の沈殿物を得た。この沈
殿物に対し550mlの精製水を加え、良く撹拌して溶解さ
せ、エタノールを1,000ml加えて多糖を再沈殿させた。
この操作を３回行なつた後、得た多糖沈殿物を凍結乾燥
し、粗多糖体KGP2.3gを得た。次にこのKGP2gを精製水50
0mlに溶解させ、セフアロースCL4B「登録商標」（フア
ルマシア）を用い、下記の条件でゲル過した。

（条件）カラム:3.6cm×110cm 溶出液：純水流速:2.0ml/分試料:35ml 検出：フエーノル硫酸法この条件でゲル過を繰り返えし、凍結乾燥して多糖
体Ｐ−KGP1.44gを得た。このＰ−KGP1.44gを500mlの精
製水によく溶解させ、8,000r.p.m.で10分間遠心分離を
行なつた。この上清497mlを別の容器に移し、硫酸アン
モニウム550gを撹拌しながら徐々に加え、7,000r.p.m.
で10分間遠心分離を行ない、上清を捨て沈殿物を回収し
た。この沈殿物53mgを純水200mlに溶解させた後、次の
条件でゲル過を行なつた。

セフアデツクスＧ−50 カラム:1.8cm×80cm 溶出液：純水流速:0.8ml/min. 試料:20ml 検出:UV280nm 以上の条件でゲル過し、55ml〜70mlに溶出されたＦ
−＃５のピークを検出し、この部分を集めて凍結乾燥
し、4.8mgのＦ−＃５を得た。このＦ−＃５のSDSアクリ
ルアミド電気泳動法を行なつた結果、分子量約30,000の
最も濃いバンドを得、その他に前後に淡いバンド２本ず
つを検出した。窒素量は5.58％、糖質は38.25％であつ
た。

このＦ−＃５を用い下記条件で抗腫瘍活性を調べた。

実験動物:ICRマウス４週令雄、一群10匹腫瘍：ザルコーマ180 移殖法：右臀部皮下移植（10⁷細胞数）投与法：生理食塩水に試料を溶解させ、腹腔内投与投与期間：腫瘍移殖７日前から１日１回隔日投与腫瘍増殖度の測定：移殖後、15日目に腫瘍を摘出し、重
量を測定し、コントロール群に対する増殖抑制率を下式
のように求める。

上記の条件で試験した結果、抑制率は80.3％であつ
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者坂内岩雄東京都東村山市恩多町３―８―１ (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 21/00 C07K 2/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ケフィア粒を構成する多糖体及び菌体に含
まれる分子量10,000〜200,000、窒素量5,5〜6,2％、糖
質35〜55％の粗糖蛋白質画分。
【請求項２】ケフィア粒の多糖体を主とする水溶性成分
をアルコール類により沈殿させ。得られた沈殿物から変
性剤或いは塩析により前記粗糖蛋白質画分を採取するこ
とを特徴とする前記粗糖蛋白質画分の製造法。
【請求項３】変成剤として尿素或いは塩酸グアニジン、
又、塩析として硫酸アンモニウムを用いた請求項２記載
の粗糖蛋白質画分の製造法。