CN104324022A - 一种治疗和/或预防肿瘤的药物 - Google Patents

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CN104324022A CN201410599272.8A CN201410599272A CN104324022A CN 104324022 A CN104324022 A CN 104324022A CN 201410599272 A CN201410599272 A CN 201410599272A CN 104324022 A CN104324022 A CN 104324022A
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林坚
黄裕兵
田永路
钟武
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Abstract

本发明公开了一种治疗和/或预防肿瘤的药物。本发明所提供的治疗和/或预防肿瘤的药物，其活性成分由组分A和组分B组成，所述组分A为抗坏血酸可溶性盐或抗坏血酸，所述组分B为戒酒硫。由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合药物可有效地抑制体内外癌细胞的生长，具有协同增效作用，对于肿瘤细胞还具有选择性杀伤作用，可以作为低毒有效的组合药物用于治疗和/或预防肿瘤。

Description

一种治疗和/或预防肿瘤的药物
技术领域
本发明涉及生物医药领域中一种治疗和/或预防肿瘤的药物。
背景技术
恶性肿瘤(又称癌)，是由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统转移到身体其它部分，癌症已成为世界范围内导致人死亡的主要原因之一，严重威胁着人类的健康。肝癌即肝脏恶性肿瘤，是外科疾病中的常见病和多发病，肝脏恶性肿瘤可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较为少见。喉癌分为原发性和继发性两种，原发性喉癌指原发部位在喉部的肿瘤，以鳞状细胞癌最为常见；继发性喉癌指来自其它部位的恶性肿瘤转移至喉部，较为少见。白血病是造血干/祖细胞在分化不同阶段发生凋亡障碍、分化受阻及恶性增殖而引发的造血系统恶性疾病，该疾病是儿童时期最常见的恶性肿瘤和最常见的死亡原因。乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，乳腺癌中99％发生在女性，男性仅占1％。神经胶质瘤简称胶质瘤，也称为胶质细胞瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发性肿瘤的一半，广义是指所有神经上皮来源的肿瘤，狭义是指源于各类胶质细胞的肿瘤。
癌症的预防和治疗是当今世界性的难题之一。多年来，各国科学家都致力于研究开发安全有效而副作用小的癌症治疗手段来取代目前普遍采用的化学疗法或放射疗法。由于化疗或放疗在杀伤癌细胞的同时，正常细胞也会受到不同程度的损伤，从而引起较大的副作用，降低了病人的生活质量，也不利于康复。尽管癌症治疗技术在不断进步，但是低毒有效以及普惠地治疗方案还是比较少见的，目前对于癌症治疗采用多药联用是一种治疗趋势。但是多药联用由于用药品种偏多，使得药物间的相互作用发生频率增加，不仅影响了药物疗效，而且还会增加药物的毒性，产生严重的毒副作用，危害患者的生命安全。因此，研发低毒有效的药物组合对于肿瘤的治疗是迫切需要的。
L-抗坏血酸钠(分子式：C6H7NaO6,分子量：198.11，CAS：134-03-2)，又称维生素C钠盐。在生物体内，L-抗坏血酸钠是一种抗氧化剂，保护身体免于自由基的威胁。
戒酒硫(双(二乙基硫代氨基甲酰)二硫化物)分子式：C10H20N2S4，分子量：296.54，CAS：97-77-8)是一种戒酒药物，服用该药后即使饮用少量的酒，身体也会产生严重不适，从而达到戒酒的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制肿瘤细胞增殖和/或肿瘤生长。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种治疗和/或预防肿瘤的药物。
本发明所提供的治疗和/或预防肿瘤的药物，其活性成分由组分A和组分B组成，所述组分A为抗坏血酸可溶性盐或抗坏血酸，所述组分B为戒酒硫。
上述治疗和/或预防肿瘤的药物中，所述抗坏血酸可溶性盐可为L-抗坏血酸钠(简称抗坏血酸钠)。
上述药物中，所述活性成分中所述组分A和所述组分B的摩尔比可为(100-150):1，如100:1或150:1。
上述药物中，所述肿瘤可为恶性肿瘤。所述恶性肿瘤可为肝癌、喉癌、白血病、肺癌、乳腺癌和神经胶质瘤中任一种。
上述药物中，所述治疗和/或预防肿瘤可体现为抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。所述抑制肿瘤细胞增殖可体现为降低肿瘤细胞的存活率。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂和稳定剂等。
本发明的药物可以制成注射液、干粉针剂、片剂或粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围；所述组合物由组分A和组分B组成，所述组分A为抗坏血酸可溶性盐或抗坏血酸，所述组分B为戒酒硫。
上述应用中，所述组合物中，所述组分A和所述组分B的摩尔比可为(100-150):1，如100:1或150:1。
上述应用中，所述肿瘤可为恶性肿瘤。
上述应用中，所述恶性肿瘤为肝癌、喉癌、白血病、肺癌、乳腺癌和神经胶质瘤中任一种。
上述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤可体现为抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。所述抑制肿瘤细胞增殖可体现为降低肿瘤细胞的存活率。
实验证明，由抗坏血酸可溶性盐或抗坏血酸和戒酒硫组成的组合药物可有效地抑制体内外癌细胞的生长，具有协同增效作用，对于肿瘤细胞还具有选择性杀伤作用，对于正常细胞没有损害，可以作为低毒有效的组合药物用于治疗和/或预防肿瘤。在通过MTT实验测定抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物作用于肿瘤细胞后细胞存活率的实验中，数据显示该组合物具有很强的肿瘤细胞杀伤力，相同实验条件下，单用抗坏血酸钠组作用于肝癌细胞HCC-9204的抗坏血酸钠的IC50值(IC50是指细胞增殖被抑制一半时抑制剂的浓度)为3.25mM；单用戒酒硫组作用于肝癌细胞HCC-9204的戒酒硫的IC50值为34.6μM；使用抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组(抗坏血酸钠和戒酒硫的摩尔比为100:1)作用于肝癌细胞HCC-9204的抗坏血酸钠的IC50值为1.13mM，作用于肝癌细胞HCC-9204的戒酒硫的IC50值为11.3μM，说明抗坏血酸钠和戒酒硫在肿瘤治疗中具有协同增效作用。由抗坏血酸可溶性盐或抗坏血酸和戒酒硫组成的组合药物对于肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，从而使得正常细胞免受影响，具有安全性。裸鼠体内实验结果表明，注射了由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物溶液组的荷瘤BalB/C雌性裸鼠处理结束后的肿瘤瘤重为注射PBS缓冲溶液组的荷瘤BalB/C雌性裸鼠肿瘤瘤重的0.61倍，而单用抗坏血酸钠组和单用戒酒硫组的荷瘤BalB/C雌性裸鼠肿瘤瘤重和注射PBS缓冲溶液组的荷瘤BalB/C雌性裸鼠肿瘤瘤重无统计学差异(PBS缓冲溶液组的荷瘤BalB/C雌性裸鼠肿瘤瘤重为0.642±0.029g,单用抗坏血酸钠组的荷瘤BalB/C雌性裸鼠肿瘤瘤重为0.649±0.038g,单用戒酒硫组的荷瘤BalB/C雌性裸鼠肿瘤瘤重为0.714±0.069g,抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组的荷瘤BalB/C雌性裸鼠肿瘤瘤重为0.394±0.055g)，说明由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物能够有效抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长，由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物中抗坏血酸钠和戒酒硫产生了协同增效作用。
附图说明
图1为抗坏血酸钠和戒酒硫在肿瘤治疗中的协同增效作用：其中Control为对照组，VC为抗坏血酸钠组，DSF为戒酒硫组，VC+DSF为抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组。
图2为由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物的选择性杀伤作用：A为不含药物的细胞培养液、抗坏血酸钠和戒酒硫分别作用于HCC-9204细胞和L-O2细胞12h后的细胞存活状况明场图片以及由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物作用于HCC-9204细胞和L-O2细胞后6h、12h和24h的细胞存活状况明场图片；B为不含药物的细胞培养液、抗坏血酸钠、戒酒硫和由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物分别作用于HCC-9204细胞和L-O2细胞24h后的细胞存活率柱状图，其中左图为HCC-9204细胞的细胞存活率柱状图，右图为L-O2细胞的细胞存活率柱状图；A和B中Control为不含药物的细胞培养液对照组，1mM VC为抗坏血酸钠组，10μM DSF为戒酒硫组，VC+DSF为抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组。
图3为不同处理组处理荷瘤BalB/C雌性裸鼠结束后的肿瘤瘤重柱状图：其中Control为PBS缓冲溶液对照组，VC为抗坏血酸钠组，DSF为戒酒硫组，VC+DSF为抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的HCC-9204细胞(人肝癌细胞,ATCC)、BEL-7402细胞(人肝癌细胞，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，3131C0001000700010)、Hep-2细胞(人喉癌细胞,ATCC,CCL-23)、HepG2(人肝癌细胞，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，3111C0001CCC000035)、K562(人慢性髓系白血病细胞，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，3111C0001CCC000039)、A549(人肺癌细胞，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，3111C0001CCC000002)、MCF-7(人乳腺癌细胞，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，3111C0001CCC000013)和U87(神经胶质瘤细胞,ATCC,HTB-14)、L-O2细胞(人肝细胞，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，3131C0001000200006)公众可从北京大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的裸鼠(BALB/c-Nude，SPF级，雌性，4-5W，维通利华实验动物技术有限公司)，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用材料与试剂的型号与公司如表1所示。
表1、实验材料与试剂
药品名称 公司
RPMI 1640培养基 美国Hyclone公司
胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS) 美国Gibco公司
MTT Sigma(M2128-5G)
L-抗坏血酸钠(简称抗坏血酸钠) Sigma(A7631-25G)
戒酒硫(DSF) Sigma(86720)
下述实施例中的PBS缓冲液均为0.1mM、pH为7.4的PBS缓冲溶液。
实施例1、由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物体外选择性抑制肿瘤细胞生长的能力
一、抗坏血酸钠和戒酒硫在肿瘤治疗中的协同增效作用
1、细胞成像实验
1)细胞培养：将对数生长期的HCC-9204细胞采用0.05％胰酶消化并用含10％FBS的RMPI 1640培养基收集重悬细胞，接种到10cm培养皿中(细胞液体积为10mL,细胞密度为2×104/mL)，共接种4皿，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中培养24h。
2)药物配置：抗坏血酸钠采用PBS缓冲液配置成100mM储备液，戒酒硫采用DMSO配制而成100mM储备液。采用RMPI 1640培养基将100mM抗坏血酸钠储备液稀释成1mM抗坏血酸钠溶液；采用RMPI 1640培养基将100mM戒酒硫储备液稀释成0.01mM戒酒硫溶液；向RMPI 1640培养基中加入100mM抗坏血酸钠储备液和100mM戒酒硫储备液，配置成抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中抗坏血酸钠的浓度为1mM,戒酒硫的浓度为0.01mM，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中抗坏血酸钠和戒酒硫的摩尔比为100:1。
3)药物孵育：细胞培养结束后，吸除培养皿中的细胞培养液，将细胞分为四组，对照组、抗坏血酸钠组、戒酒硫组及抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组，向抗坏血酸钠组培养皿中加入10mL 1mM抗坏血酸钠溶液，向戒酒硫组培养皿中加入10mL 0.01mM戒酒硫溶液，向抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组培养皿中加入10mL抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液(抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中抗坏血酸钠的浓度为1mM，戒酒硫的浓度为0.01mM)，向对照组培养皿中加入相同体积的含10％FBS的RMPI 1640培养基，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中孵育12h，药物孵育结束。
4)细胞成像：药物孵育结束后，吸除含有药物的细胞培养液，采用新鲜的细胞培养液将细胞洗两遍，加入新鲜的RMPI 1640培养基，采用Olympus DP80显微镜拍摄细胞明场图片，拍摄放大倍数为400倍。
结果如图1所示，实验结果表明，与对照组相比，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组的HCC-9204细胞全部死亡，抗坏血酸钠组和戒酒硫组的HCC-9204细胞的细胞存活状态则不受影响，细胞生长良好。
2、MTT细胞存活率实验
1)细胞培养：将对数生长期的HCC-9204细胞采用0.05％胰酶消化并用含10％FBS的RMPI 1640培养基收集重悬细胞并计数，细胞密度为2×104/mL，接种到96孔板中，每孔100μL含细胞的培养基，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中培养24h。BEL-7402细胞、Hep-2细胞、HepG2细胞、K562细胞、A549细胞、MCF-7细胞和U87细胞的细胞培养方法同HCC-9204细胞的培养方法。
2)药物配置：抗坏血酸钠采用PBS缓冲溶液配置成100mM抗坏血酸钠储备液，戒酒硫采用DMSO配制而成100mM戒酒硫储备液。采用RMPI 1640培养基将100mM抗坏血酸钠储备液稀释成0.5、1、2、5和10mM抗坏血酸钠溶液；采用RMPI 1640培养基将100mM戒酒硫储备液稀释成5、10、20、50和100μM戒酒硫溶液；将100mM抗坏血酸钠储备液和100mM戒酒硫储备液进行混合得到不同浓度梯度的抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液，命名为抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液1-5：抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液1中抗坏血酸钠的浓度为0.5mM，戒酒硫的浓度为5μM；抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液2中抗坏血酸钠的浓度为1mM，戒酒硫的浓度为10μM；抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液3中抗坏血酸钠的浓度为2mM，戒酒硫的浓度为20μM；抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液4中抗坏血酸钠的浓度为5mM，戒酒硫的浓度为50μM；抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液5中抗坏血酸钠的浓度为10mM，戒酒硫的浓度为100μM。
3)药物孵育：细胞培养结束后，吸除96孔板中的细胞培养液，将细胞分为四组：对照组、抗坏血酸钠组、戒酒硫组、抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组，将步骤2)中的每个浓度的溶液各取100μL加入相应组的细胞培养孔中(抗坏血酸钠组中只加入抗坏血酸钠溶液，戒酒硫组只加入戒酒硫溶液、抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组只加入抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液)，对照组加入100μL含10％FBS RMPI 1640培养基，每个处理组3个复孔，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中孵育12h，药物孵育结束。
4)MTT检测：药物孵育结束后，将含有药物的培养基吸除，每孔加入100μL 1640培养基和20μL 5mg/mL MTT溶液，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中孵育4h。孵育结束后，吸除每孔中的培养液，每孔加入150μL DMSO溶液，在酶标仪(Thermo MK3)上震荡10min，然后使用酶标仪(Thermo MK3)测定每孔的OD490值。
5)计算各组药物的生长抑制率和IC50值(IC50是指细胞增殖被抑制一半时抑制剂的浓度)。其中，各药物浓度组的生长抑制率(％)＝(1-实验孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100％。IC50＝lg-1{Xm-I[ΣP-(3-Pm-Pn)/4]}，其中Xm：设计的最大浓度的对数值；I：最大剂量比相临剂量的对数值；ΣP：各组生长抑制率之和；Pm:最大阳性反应率；Pn：最小阳性反应率。
结果如表2所示，在相同实验条件下，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液作用于8株不同的肿瘤细胞，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中的抗坏血酸钠的IC50值均低于抗坏血酸钠溶液中的抗坏血酸钠的IC50值，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中的戒酒硫的IC50值均低于戒酒硫溶液中的戒酒硫的IC50值，表明抗坏血酸钠和戒酒硫在肿瘤治疗中具有协同增效作用。
表2、不同药物作用于8株肿瘤细胞后的IC50值
注：抗坏血酸钠和戒酒硫组合物由抗坏血酸钠和戒酒硫组成，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物中抗坏血酸钠和戒酒硫的摩尔比为100:1。
二、抗坏血酸钠和戒酒硫在肿瘤治疗中具有选择性杀伤作用
1、细胞成像实验
1)细胞培养：将对数生长期的HCC-9204细胞采用0.05％胰酶消化并用含10％FBS的RMPI 1640培养基收集重悬细胞，接种到10cm培养皿中(细胞液体积为10mL,细胞密度为2×104/mL)，共接种6皿，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中培养24h。将对数生长期的L-O2细胞采用0.05％胰酶消化并用含10％FBS RMPI 1640培养基收集重悬计数，接种步骤同HCC-9204细胞。
2)药物配置：抗坏血酸钠采用PBS缓冲溶液配置成100mM储备液，戒酒硫采用DMSO配制而成100mM储备液。采用RMPI 1640培养基将100mM抗坏血酸钠储备液稀释成1mM抗坏血酸钠溶液；采用RMPI 1640培养基将100mM戒酒硫储备液稀释成0.01mM戒酒硫溶液；向RMPI 1640培养基中加入100mM抗坏血酸钠储备液和100mM戒酒硫储备液，配置成抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中抗坏血酸钠的浓度为1mM,戒酒硫的浓度为0.01mM，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中抗坏血酸钠和戒酒硫的摩尔比为100:1。
3)药物孵育：HCC-9204细胞和L-O2细胞药物孵育步骤相同,所用培养基也相同。细胞培养结束后，吸除培养皿中的细胞培养液，将细胞分为四组：对照组、抗坏血酸钠组、戒酒硫组及抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组，向抗坏血酸钠组培养皿中加入10mL1mM抗坏血酸钠溶液，向戒酒硫组培养皿中加入10mL 0.01mM戒酒硫溶液，向对照组培养皿中加入相同体积的RMPI 1640培养基，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中孵育12h，药物孵育结束。向抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组培养皿中加入10mL抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液(抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中抗坏血酸钠的浓度为1mM，戒酒硫的浓度为0.01mM)，共三皿，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中分别孵育6h、12h和24h，药物孵育结束。
4)细胞成像：HCC-9204细胞和L-O2细胞的细胞成像步骤相同，所用培养基也相同。药物孵育结束后，吸除含有药物的细胞培养液，采用新鲜的细胞培养液将细胞洗两遍，加入新鲜的RMPI 1640培养基，采用Olympus DP80显微镜拍摄细胞明场图片，拍摄放大倍数为400倍。
图2中A的明场图片显示随着抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组作用于细胞时间的延长，HCC-9204细胞死亡数逐渐增多，而L-O2细胞的细胞存活状态并不受影响，表明抗坏血酸钠和戒酒硫组合物在肿瘤治疗中对肿瘤细胞具有杀伤力而对于正常细胞没有毒性，具有选择性杀伤作用。
2、细胞存活实验
1)细胞培养：将对数生长期的HCC-9204细胞采用0.05％胰酶消化并用含10％FBS的RMPI 1640培养基收集重悬细胞并计数，细胞密度为2×104/mL，接种到96孔板中，每孔100μL含细胞的培养基，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中培养24h，药物孵育结束。L-O2细胞的细胞培养方法同HCC-9204细胞的培养方法。
2)药物配置：
抗坏血酸钠采用PBS缓冲液配置成100mM储备液，戒酒硫采用DMSO配制而成100mM储备液。采用RMPI 1640培养基将100mM抗坏血酸钠储备液稀释成1mM抗坏血酸钠溶液；采用RMPI 1640培养基将100mM戒酒硫储备液稀释成10μM戒酒硫溶液；向RMPI 1640培养基中加入100mM抗坏血酸钠储备液和100mM戒酒硫储备液，配置成抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中抗坏血酸钠的浓度为1mM,戒酒硫的浓度为10μM，抗坏血酸钠和戒酒硫的摩尔比为100:1。
3)药物孵育：HCC-9204细胞和L-O2细胞的药物处理方式相同,培养基也相同。细胞培养结束后，吸除培养皿中的细胞培养液，将细胞分为四组：对照组、抗坏血酸钠组、戒酒硫组及抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组，将步骤2)中的每个浓度的溶液取100μL加入相应组的细胞培养孔中(抗坏血酸钠组中只加入抗坏血酸钠溶液，戒酒硫组只加入戒酒硫溶液、抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组只加入抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液)，对照组加入100μL含10％FBS的RPMI1640培养基，每个处理组3个复孔，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中孵育24h，药物孵育结束。
4)MTT检测：药物孵育结束后，将含有药物的培养基吸除，每孔加入100μL 1640培养基和20μL 5mg/mL MTT溶液，置于37℃,5％CO2恒温培养箱中孵育4h。孵育结束后，吸除每孔中的培养液，每孔加入150μL DMSO溶液，在酶标仪(Thermo MK3)上震荡10min，然后使用酶标仪(Thermo MK3)测定每孔的OD490值。
5)细胞存活率计算：各药物浓度组的细胞存活率(％)＝实验孔平均OD值/对照组孔平均OD值×100％，对照组的存活率为100％。
结果如图2中B所示，实验结果表明，抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物溶液(抗坏血酸钠的浓度为1mM，戒酒硫的浓度为10μM)处理的HCC-9204细胞的相对存活率为35％；抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物溶液(抗坏血酸钠的浓度为1mM，戒酒硫的浓度为10μM)处理的L-O2细胞的相对存活率为95％，抗坏血酸钠和戒酒硫单独作用于HCC-9204细胞和L-O2细胞时对于细胞的存活率均无影响，而当抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物作用于细胞时，对HCC-9204细胞具有杀伤力，对L-O2细胞无杀伤作用。
实施例2、由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物体内选择性抑制肿瘤细胞生长的能力
将0.6g抗坏血酸钠溶解于2mL PBS缓冲溶液中，配置成浓度为0.3g/mL的抗坏血酸钠溶液；将6mg戒酒硫溶解于500μL DMSO溶液中并加入1.5mL PBS缓冲溶液稀释，配置成浓度为3mg/mL的戒酒硫溶液；将1.2g抗坏血酸钠溶解于2mL PBS缓冲溶液中，配置成浓度为0.6g/mL的抗坏血酸钠溶液；将12mg戒酒硫溶解于500μL DMSO溶液中并加入1.5mL PBS缓冲溶液稀释，配置成浓度为6mg/mL的戒酒硫溶液，将1mL浓度为0.6g/mL的抗坏血酸钠溶液和1mL浓度为6mg/mL的戒酒硫溶液混合，配置成抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液，该抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中，抗坏血酸钠的浓度为0.3g/mL，戒酒硫的浓度为3mg/mL，抗坏血酸钠和戒酒硫的摩尔比为150:1。
取40只5-6周龄BalB/C雌性裸鼠，体重相差不超过2g。培养HCC-9204细胞，通过皮下移植肿瘤的方式建立移植瘤模型，得到荷瘤BalB/C雌性裸鼠。每周两次测量肿瘤长径和短径，根据公式TV＝1/2×a×b2计算肿瘤体积(其中a为长径，b为短径)。待肿瘤平均体积长至60mm3时，将体重为20g的荷瘤BalB/C雌性裸鼠随机分为四组：抗坏血酸钠组、戒酒硫组、抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组及对照组，每组10只，而后对每组的每只荷瘤BalB/C雌性裸鼠注射不同的药物溶液或PBS缓冲溶液进行治疗(抗坏血酸钠组注射0.3g/mL的抗坏血酸钠溶液，戒酒硫组注射3mg/mL的戒酒硫溶液，抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组注射抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液(抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液中抗坏血酸钠的浓度为0.3g/mL，戒酒硫的浓度为3mg/mL)，对照组注射PBS缓冲溶液)，将第一次注射不同的药物溶液或PBS缓冲溶液记为处理第1天，分别在处理第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31天注射，每次对每只荷瘤裸鼠都注射与第一次相同的药物溶液或PBS缓冲溶液，每次注射的体积均为200μL。每次注射的具体方法如下：在第一组的每只BalB/C雌性裸鼠的皮下注射200μL上述浓度为0.3g/mL的抗坏血酸钠溶液，在第二组的每只BalB/C雌性裸鼠的皮下注射200μL上述浓度为3mg/mL的戒酒硫溶液，在第三组的每只BalB/C雌性裸鼠的皮下注射200μL上述抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液，在第四组的每只BalB/C雌性裸鼠的皮下注射200μLPBS缓冲溶液。在第31天药物注射结束后2天将BalB/C雌性裸鼠处死，取出BalB/C雌性裸鼠体内的肿瘤，进行肿瘤瘤重称量。
实验结果显示，在用不同药物组和PBS缓冲液对荷HCC-9204细胞的BalB/C雌性裸鼠处理结束后，注射PBS缓冲溶液的BalB/C雌性裸鼠的瘤重为0.642±0.029g；注射0.3g/mL的抗坏血酸钠溶液的BalB/C雌性裸鼠的瘤重为0.649±0.038g；注射浓度为3mg/mL的戒酒硫溶液的BalB/C雌性裸鼠的瘤重为0.714±0.069g；注射上述抗坏血酸钠和戒酒硫组合物溶液的BalB/C雌性裸鼠的瘤重为0.394±0.055g(图3)，注射抗坏血酸钠和戒酒硫组合物组的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤瘤重是注射PBS缓冲溶液组的BalB/C雌性裸鼠的肿瘤瘤重的0.61倍。实验结果表明由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物能够在体内选择性抑制肿瘤细胞的生长，由抗坏血酸钠和戒酒硫组成的组合物中抗坏血酸钠和戒酒硫产生了协同增效作用。

Claims (10)

1.治疗和/或预防肿瘤的药物，其活性成分由组分A和组分B组成，所述组分A为抗坏血酸可溶性盐或抗坏血酸，所述组分B为戒酒硫。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于：所述活性成分中所述组分A和所述组分B的摩尔比为(100-150):1。
3.根据权利要求1或2所述的药物，其特征在于：所述肿瘤为恶性肿瘤。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：所述恶性肿瘤为肝癌、喉癌、白血病、肺癌、乳腺癌和神经胶质瘤中任一种。
5.根据权利要求1至4中任一所述的药物，其特征在于：所述治疗和/或预防肿瘤体现为抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。
6.组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用，所述组合物由组分A和组分B组成，所述组分A为抗坏血酸可溶性盐或抗坏血酸，所述组分B为戒酒硫。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述组合物中，所述组分A和所述组分B的摩尔比为(100-150):1。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为恶性肿瘤。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述恶性肿瘤为肝癌、喉癌、白血病、肺癌、乳腺癌和神经胶质瘤中任一种。
10.根据权利要求6至9中任一所述的应用，其特征在于：所述治疗和/或预防肿瘤体现为抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。
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