CN103340903A - 一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法及其应用 - Google Patents

一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103340903A
CN103340903A CN2013102354434A CN201310235443A CN103340903A CN 103340903 A CN103340903 A CN 103340903A CN 2013102354434 A CN2013102354434 A CN 2013102354434A CN 201310235443 A CN201310235443 A CN 201310235443A CN 103340903 A CN103340903 A CN 103340903A
Authority
CN
China
Prior art keywords
exosome
centrifugal
tumor
cell
ultrafiltrate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2013102354434A
Other languages
English (en)
Inventor
曹利平
陈炯煌
阙日升
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN2013102354434A priority Critical patent/CN103340903A/zh
Publication of CN103340903A publication Critical patent/CN103340903A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种肿瘤外切酶体（exosome）疫苗的提取方法，通过从人胆管癌细胞的培养液上清中成功提取了exosome，并且通过超滤裂解的方法提取了不含miRNA的exosome裂解超滤液。本发明获得的不含miRNA的exosome裂解超滤液能够更加明显的刺激免疫细胞产生特异性的肿瘤杀伤作用，能大幅提高免疫细胞对肿瘤产生的特异性免疫应答的杀伤效果以及降低肿瘤细胞的免疫逃逸水平，增强人体免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

Description

一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法及其应用
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种人肿瘤疫苗提取方法，尤其涉及一种肿瘤外切酶体（exosome）疫苗的提取方法以及应用。
背景技术
手术治疗是肿瘤的常规治疗方法，除了手术治疗外，过继性细胞免疫治疗也是目前极有潜力的一种肿瘤治疗方法。相比其他治疗手段，过继性细胞免疫治疗具有特异性高、副作用小、改善临床体征、延长患者生存时间等优点。体外和动物实验研究表明，过继性细胞对肿瘤细胞具有显著的特异性杀伤效果。
exosome是由许多活细胞的多泡体(muhivesicular bodies，MVBs)与细胞膜融合后向细胞外分泌的一种直径50-100nm的小囊泡。肿瘤细胞来源的exosome已经被证实可以表达丰富的免疫相关蛋白和肿瘤相关抗原，可以引起抗肿瘤的生物学效应，可能成为亚细胞结构的肿瘤疫苗，因此具有重要的研究和应用价值。原有提取exosome的方法只是将exosome这种完整的囊泡结构提取出来，但是囊泡内的大量miRNA以及肿瘤相关抗原无法提取。而恰恰是囊泡内的miRNA以及肿瘤相关抗原才是激活免疫细胞的重要成分。所以很有必要发明一种提取exosome囊泡内物质的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤外切酶体（exosome）疫苗的提取方法，通过以下步骤实现：
 1.提取exosome：胎牛血清在4℃条件下，100000×g离心6h，除去内源性exosome，人胆管癌细胞（RBE细胞）在含10％的胎牛血清的1640培养液中，培养约72h，收集培养基上清。按药品生产质量管理规范（GMP）标准提取exosome：上清300×g离心5min、转移至新的离心管800×g离心30min，转移至新的离心管10000×g离心30min，去除细胞碎片；上清液再用millipore公司100 kd超滤管，以1500×g离心30min；将浓缩液移至30 g／L的蔗糖重水垫上，以100000×g超速离心60min。取出蔗糖重水垫，稀释到50ml的PBS中，再用100kd 超滤管，以1500×g离心，直至体积<5 ml，以0.22um的滤器过滤除菌，分装后置于—80℃冰箱备用。
2.提取exosome裂解超滤液：取超速离心后的exosome沉淀，加入去离子水10ml，低渗法使exosome破膜，用millipore公司10kd超滤管4000×g离心30min去除miRNA提纯exosome裂解超滤液。
本发明的另一个目的是提供所述方法在获得不含miRNA的exosome裂解超滤液中应用。
本发明从人胆管癌细胞（RBE细胞株）的培养液（购自中科院上海细胞库）上清中成功提取了exosome，并且通过超滤裂解的方法提取了不含miRNA的exosome裂解超滤液，分别加入到未成熟的树突状细胞(imDC)与细胞毒性T淋巴细胞（CTL细胞）的混合培养体系中，使之产生特异性肿瘤细胞杀伤作用，实验结果证明了通过裂解超滤的方法得到的不含miRNA的exosome裂解超滤液能够更加明显的刺激免疫细胞产生特异性的肿瘤杀伤作用，为基于exosome裂解超滤液的过继性细胞免疫治疗打下实验基础，并为肿瘤免疫治疗提供新的方法与思路。
使用本发明可以在原有exosome提取的基础上，将exosome囊泡内的微小RNA、肿瘤抗原相关蛋白等大量具有肿瘤免疫原性的物质充分释放，同时又不破坏这些内容物（含有大量miRNA以及大量肿瘤相关抗原），从而大大的提高exosome的肿瘤特异性免疫原性，以便于接下来的免疫识别、提呈、反应等，实验证明能大幅提高免疫细胞对肿瘤产生的特异性免疫应答的杀伤效果以及降低肿瘤细胞的免疫逃逸水平，即大大增强人体免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
附图说明
图1是普通DC/CTL细胞（DC/CTL组）、exosome致敏DC/CTL细胞（E-DC/CTL组）、exosome裂解超滤液致敏DC/CTL细胞（EL-DC/CTL组）分别杀伤RBE细胞的杀伤率对比图。
图2是exosome囊泡的电子显微镜图片。     图3是exosome囊泡经过裂解超滤法处理后的电子显微镜图片。
图4是正常生长的人胆管癌细胞（RBE细胞）图片。
图5是用exosome裂解超滤液致敏的DC/CTL细胞（树突状细胞与细胞毒性T淋巴细胞）杀伤RBE细胞后的倒置显微镜图片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
实施例一
胆管癌细胞免疫治疗中exosome的应用
1.提取exosome：胎牛血清在4℃条件下，100000×g离心6h，除去内源性exosome，人胆管癌细胞（RBE细胞）在含10％的胎牛血清的1640培养液中，培养约72h，收集培养基上清。按药品生产质量管理规范（GMP）标准提取exosome：上清300×g离心5min、转移至新的离心管800×g离心30min，转移至新的离心管10000×g离心30min，去除细胞碎片；上清液再用millipore公司100 kd超滤管，以1500×g离心30min；将浓缩液移至30 g／L的蔗糖重水垫上，以100000×g超速离心60min。取出蔗糖重水垫，稀释到50ml的PBS中，再用100kd 超滤管，以1500×g离心，直至体积<5 ml，以0.22um的滤器过滤除菌，分装后置于—80℃冰箱备用。 Exosome提取结果参见图2
 2.提取exosome裂解超滤液：取超速离心后的exosome沉淀，加入去离子水10ml，低渗法使exosome破膜，用millipore公司10kd超滤管4000×g离心30min去除miRNA提纯exosome裂解超滤液。 Exosome裂解超滤液结果参见图3。
3. exosome及exosome裂解超滤液电镜观察：取20ul上述exosome及exosome裂解超滤液悬液滴至直径为2mm的载样铜网上，室温静置1 min，用滤纸从侧面小心吸干液体，白炽灯下烤干约15min，透视电镜下观察、照相。
4. DC/CTL的诱导：取外周血20ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞后，37℃培养箱孵育2h，贴壁的为单核细胞，悬浮的为淋巴细胞，将单核细胞与淋巴细胞分开培养，分为未致敏组（DC/CTL组）、exosome致敏组（E-DC/CTL组）、exosome裂解超滤液致敏组（EL-DC/CTL组）3组，3组中贴壁的单核细胞分别用普通DC培养液、E-DC培养液、EL-DC培养液培养，每两天半量换液。7天后诱导为未成熟DC，倒置显微镜下观察形态。
淋巴细胞计数，调整细胞密度至1×106个/ml， D0加入含rhINF-γ1000U/ml、10％胎牛血清的1640培养液培养，24h后均用普通CTL培养液，每24h半量换液。
5.DC/CTL共培养：第七天（D7）按对应的组别将DC与CTL以1:4的比例共培养，用相应的CTL培养液共培养7天。
6．RBE细胞培养：RBE细胞购自中科院上海细胞库，用含10%胎牛血清的1640培养液培养在普通75ml培养瓶中培养至细胞覆盖瓶底约80%-90%的密度，参见图4。
7. TNF-a和穿孔素浓度检测：前一天分离1×106细胞于新的培养孔，24h后吸取培养基上清，离心去除细胞和细胞碎片；采用双抗体夹心ELISA法（按说明书进行加标准品、加样、温育、配液、洗涤、显色、终止等步骤）检测DC/CTL上清液中TNF-a和穿孔素浓度。
8.DC/CTL杀伤试验：将RBE细胞接种到96孔板中，调整细胞密度至1×104个/孔。将DC/CTL细胞作为效应细胞，RBE细胞作为靶细胞，按效靶比10:1的比例将DC/CTL接种至含有RBE细胞的孔中，每组6个复孔，另接种6孔只含等量RBE细胞作为阴性对照组，每孔液体总量为200ul，37℃，5%CO2培养箱培养24h后清洗未贴壁细胞，每孔加入CCK-8试剂10ul，培养箱孵育3h后显微镜观察,酶标仪检测吸光值，（检测波长450nm，参考波长650nm），杀伤率(％)=[(对照组吸光度—实验组吸光度)/（对照组吸光度－空白组吸光值）]×100％。
实验结果：E-DC/CTL组、DC/CTL组、EL-DC/CTL组对RBE细胞的杀伤率平均分别为33.35±10.05%、 47.35±12.74%、 66.23±16.36%（P<0.01）。可见EL-DC/CTL组对RBE细胞有显著的杀伤作用，且杀伤效能高于DC/CTL组。同时， E-DC/CTL组的杀伤效能比DC/CTL组低，组间差异经统计分析P<0.01，具有统计学意义。杀伤统计数据参见图1，倒置显微镜观察效果参见图5。

Claims (2)

1.一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
 （1）提取：胎牛血清在4℃条件下，离心6h，除去内源性exosome，人胆管癌细胞在含10％的胎牛血清的1640培养液中，培养约72h，收集培养基上清，按药品生产质量管理规范标准提取肿瘤外切酶体，上清液离心5分钟，转移至新的离心管离心30分钟，再转移至新的离心管离心30分钟，去除细胞碎片；上清液再用millipore公司超滤管离心30分钟；将浓缩液移至30 g／L的蔗糖重水垫上，超速离心60分钟，取出蔗糖重水垫，稀释到50ml的PBS中，再用超滤管离心，直至体积<5 ml，以0.22um的滤器过滤除菌，分装后置于-80℃冰箱备用；
（2）提取裂解超滤液：取超速离心后的exosome沉淀，加入去离子水10ml，低渗法使exosome破膜，用millipore公司超滤管离心30分钟去除miRNA提纯exosome裂解超滤液。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法在获得不含miRNA的exosome裂解超滤液中应用。
CN2013102354434A 2013-06-14 2013-06-14 一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法及其应用 Pending CN103340903A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2013102354434A CN103340903A (zh) 2013-06-14 2013-06-14 一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2013102354434A CN103340903A (zh) 2013-06-14 2013-06-14 一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103340903A true CN103340903A (zh) 2013-10-09

Family

ID=49275763

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2013102354434A Pending CN103340903A (zh) 2013-06-14 2013-06-14 一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103340903A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111201320A (zh) * 2017-10-05 2020-05-26 医疗法人社团市川诊所 具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分或组合物的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2559442A1 (en) * 2010-04-13 2013-02-20 Jiangsu Mingma Biotech Co., Ltd Method for regulating microrna content in organisms and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2559442A1 (en) * 2010-04-13 2013-02-20 Jiangsu Mingma Biotech Co., Ltd Method for regulating microrna content in organisms and uses thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HENRY G.LAMPARSKI ETC.: "Production and characterization of clinical grade exosome derived from dendritic cells", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *
JAIME PALMA ETC.: "MicroRNAs are exported from malignant cells in customized particles", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
张尧等: "肾癌细胞来源exosome的制备和免疫相关蛋白组成的初步研究", 《重庆医科大学学报》 *
王辉涛等: "Texosome的研究进展", 《国际泌尿系统杂志》 *
赵晓鸿等: "微小RNA与肿瘤", 《微小RNA与肿瘤》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111201320A (zh) * 2017-10-05 2020-05-26 医疗法人社团市川诊所 具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分或组合物的制备方法
CN111201320B (zh) * 2017-10-05 2023-09-01 医疗法人社团市川诊所 具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分或组合物的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210009948A1 (en) Exosome active formulation for promoting endothelial cell angiogenesis, and preparation method and application
CN110055218A (zh) 一种人工改造自然杀伤性细胞及其制备与应用
CN109825472A (zh) 一种细胞外囊泡的提取方法及试剂盒
CN109998998A (zh) 一种纳米疫苗及其制备方法
CN104498425A (zh) 雪莲干细胞的分离培养方法及在制备抗衰老产品中的应用
CN106148282A (zh) 一种自然杀伤细胞的培养方法
CN106591231A (zh) 促进cik细胞增殖分化的卡介菌多糖核酸、培养基、培养方法和应用
CN103981144B (zh) 自体血清抗原致敏dc‑cik细胞的制备方法
CN105505871B (zh) 一种有效扩增cik且提高其特异性杀瘤能力的方法
CN102747033A (zh) 一种由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法
CN103340903A (zh) 一种肿瘤外切酶体疫苗的提取方法及其应用
CN106811428A (zh) 一种提取细菌外排膜囊泡的方法
WO2024093149A1 (zh) 一种微波制备肿瘤细胞微颗粒的方法
WO2011150726A1 (zh) 一种干细胞过滤筛选富集并快速复合装置
CN103494746A (zh) 檀香的新用途及一种中药复方防晒组合物
US9950020B2 (en) Extracts from fusarium oxysporum and use thereof
CN103920161A (zh) 一种在细胞膜微囊中高效装载药物的方法
CN101263811B (zh) 提高甘草毛状根次生代谢产物合成量的方法
CN106562995A (zh) 天鹅胚胎素制备方法及应用
CN115803428A (zh) 一种利用干细胞规模化培养装置高效制备外泌体的方法
CN107708728A (zh) 一种用于治疗胃癌的肿瘤疫苗及其制备方法
CN107266524B (zh) 双面空心纳米针阵列装置及其制备方法
CN111265550A (zh) 一种修复损伤组织的干细胞因子脂质体及其制备方法
CN1244691C (zh) 自体胸水上清培养til细胞的方法
CN104293734A (zh) 一种人γδT细胞的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20131009