CN107266524B - 双面空心纳米针阵列装置及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞间蛋白质传输技术领域，具体公开双面空心纳米针阵列装置，包括上下两层均安装有若干空心纳米针头排布形成的空心纳米针头阵列，该上下空心纳米针头阵列的各空心纳米针头对应，且所述上空心纳米针头阵列的各空心纳米针头上连通有微流管道，所述下空心纳米针头阵列的各空心纳米针头也与所述微流管道连通，所述微流管道的两端部都设有小孔。本发明所述的阵列装置可以在不破坏细胞活性的前提下微创式将大量供体细胞内的特定蛋白提取出来，并输送到受体细胞中，保持细胞的完整性和活性，避免干扰细胞正常功能；能持续为受体细胞提供蛋白质达到细胞治疗的目的。

Description

双面空心纳米针阵列装置及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞间蛋白质传输技术领域，特别涉及一种双面空心纳米针阵列装置及其制备方法。

背景技术

随着生物医学技术的发展，研究细胞间物质传输的方法多种多样。细胞内的蛋白分子是生物电子和生物信息领域的主要研究对象之一，它在调节细胞活动，维持细胞或机体功能等方面起着关键作用，对细胞的行为例如细胞分化、细胞分裂、细胞病变和衰老等都是至关重要的，细胞内任意一种蛋白分子的缺失都会对细胞的正常生命活动造成极大影响，因此研究将特定细胞向异常细胞内输送缺失蛋白，并保持供体细胞活性的方法对生物和医疗方面有极大的意义。

目前已有一系列成熟的技术用于补充所缺失的蛋白以修复细胞缺陷，例如细胞融合、DNA转染、直接蛋白转移等方法。这些方法都需要两种细胞参与，在最理想状态下，为异常细胞输送所缺失的蛋白需要满足以下几点：(1)能特异性地提取和输送某种蛋白；(2)转移中供体细胞和异常细胞的生命活性不受影响；(3)供体细胞可持续为异常细胞提供所需要的缺失蛋白；(4)能进行大批量细胞之间的蛋白输送；(5)能在提取供体细胞内的蛋白同时将蛋白输送到异常细胞内。

目前细胞内蛋白的提取和细胞间蛋白的输送技术已经取得重要发展，但尚缺失同时满足以上要求的微创式细胞蛋白提取和输送技术。细胞间蛋白质转移被应用得最广泛的方法是细胞融合法。该方法是在外力作用下，将供体细胞和异常细胞相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和和融合并形成杂种细胞。在细胞融合中供体细胞内的蛋白质直接进入异常细胞，达到为异常细胞提供所需蛋白质的目的。

另一种使异常细胞获得所缺失蛋白的方法是DNA转染法。这种方法是将阳离子聚合物或脂质体等通过静电作用压缩从供体细胞中提取出来的DNA形成纳米复合物，然后将复合物溶液加入到细胞培养基中，该纳米复合物凭借重力作用沉降到贴壁细胞的表面，进而通过胞吞作用进入靶细胞；或者将DNA复合物固定在细胞培养板的表面，然后再接种细胞，细胞贴壁生长于基因修饰的细胞培养板表面，进而胞吞DNA达到转染目的。此方法可使异常细胞能够自主生产缺失的蛋白质，达到治疗效果。

为了能够特异性地为异常细胞输送某种蛋白，可以将供体细胞的特定蛋白抽取出来，经过特异性分离提纯后输送入异常细胞，从而满足研究需求。

但上述方法均对应存在以下缺点：

第一、细胞融合法后获得的杂种细胞具有染色体异倍性，致使细胞株的遗传性不稳定，无法选择性使受体细胞得到所需蛋白，而是将供体细胞许多其他蛋白一起吸收，融合过程中所需要的介质有细胞毒性，对细胞损伤大，影响细胞的生命活动，并且融合后供体细胞无法再次提供蛋白。

第二、DNA转染法的缺点在于制备DNA转染质粒的步骤繁琐，需要先将细胞内的DNA转染到细菌，让细菌表达大量的DNA转染质粒，再进一步进行提取和提纯，得到DNA质粒。DNA纳米复合物粒径不稳定，并且为了获得较高转染效率往往需要较高的DNA浓度，而较高载体/DNA复合物浓度常常会引起一定的细胞毒性，影响细胞的正常生命活动。

第三、直接蛋白转移法需要将供体细胞的蛋白通过细胞裂解或通过微针装置提取出来后分离提纯再输送到异常细胞内，耗时长过程繁琐，且无法大批量提取和输送，在分离提纯的过程中可能会造成蛋白质污染或变性，在没有微创提取和输送装置的条件下还易对细胞造成较大损伤。

综上所述，生物医学和细胞治疗的研究发展有赖于对细胞间物质特异性传输的研究，但现有细胞内物质传输和转移面临的巨大挑战是难以在不破坏细胞活性的前提下对蛋白进行同时提取和转移。多种提取和转移输送技术正在被研发出来并取得乐观进展，但尚未能同时解决(1)—(5)存在的问题。目前尚缺乏一种有效技术可以非破坏性地同时将批量供体细胞的某种特定蛋白提取并输送到受体细胞中。

因此，研发一种在不破坏细胞活性的前提下微创式将大量供体细胞内的特定蛋白提取出来并输送到受体细胞中的双面空心纳米针阵列装置迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，公开一种双面空心纳米针阵列装置，该阵列装置可以在不破坏细胞活性的前提下微创式将大量供体细胞内的特定蛋白提取出来，并输送到受体细胞中，保持细胞的完整性和活性，避免干扰细胞正常功能；能持续为受体细胞提供蛋白质达到细胞治疗的目的。

为了达到上述技术目的，本发明是按以下技术方案实现的：

本发明所述的双面空心纳米针阵列装置，包括上下两层均安装有若干空心纳米针头排布形成的空心纳米针头阵列，所述上空心纳米针头阵列的各空心纳米针头与下空心纳米针头阵列中的各空心纳米针头对应，且所述上空心纳米针头阵列的各空心纳米针头上连通有微流管道，所述下空心纳米针头阵列的各空心纳米针头也与所述微流管道连通，所述微流管道的两端部都设有小孔。

作为上述技术的进一步改进，所述空心纳米针头为氧化硅管状空心纳米针头，其孔径范围值是在200-400nm，空心纳米针头的长度是2-4um。

作为上述技术的更进一步改进，所述微流管道长度为100-120um。

4.根据权利要求1所述的双面空心纳米针阵列装置的制备方法，其具体步骤是：

(1)制备上空心纳米针头阵列、下空心纳米针头阵列；

(2)将上空心纳米针头阵列及下空心纳米针头阵列均与微流管道连通。

5.根据权利要求4所述的双面空心纳米针阵列装置的制作步骤，其特征在于：

上述步骤(1)所述的制备上空心纳米针头阵列或下空心纳米针头阵列的步骤如下：

使用具有均匀纳米孔径的聚碳酸酯衬底膜作为模板

a、首先使用原子层沉积技术，用气相的三或二甲胺基或硅烷作为前驱体与水蒸汽脉冲交替地通入反应器，在模板基体的所有表面包含内孔壁沉积上均匀的氧化硅层；

b、然后利用等离子体刻蚀法，用SF₆和CF₄气体将上表面的氧化硅刻蚀掉；

c、接着进一步利用O₂等离子体刻蚀将部分的衬底膜刻蚀掉，形成氧化硅管状空心纳米针头结构。

6.根据权利要求4所述的双面空心纳米针阵列装置的制作步骤，其特征在于：

上述步骤(2)所述的空心纳米针头阵列与微流管道整合的步骤如下：

a、使用光刻技术在硅片上制作SU-8光刻胶微流管道模具，并用此模具复制制作聚二甲基硅氧烷微流管道(PDMS)模块；

b、所述聚二甲基硅氧烷微流管道的两末端各钻小孔，用于连接导管输送溶液，且PDMS模块使用未固化的PDMS胶，将空心纳米针头阵列的衬底与PDMS粘合，形成双面空心纳米针阵列。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明所述的双面空心纳米针阵列装置，其充分利用纳米针头插破细胞膜，使细胞膜长时间处于被纳米针头插破状态，但又不影响细胞的正常功能。在不破坏细胞活性的前提下微创式地将大量细胞的蛋白传输到另外一批大量细胞中，保持双方细胞的生命活性，达到治疗异常细胞蛋白缺失的目的，便于进行细胞研究。

(2)本发明所述的双面空心纳米针阵列装置，由于纳米针阵列具有大量数目的纳米针，能够同时间作用于大批量的细胞，通过对纳米针尺寸以及电场条件的优化，有望延长纳米针插破细胞膜接触细胞液的时间，使得细胞内蛋白分子有足够时间扩散进纳米针的内管道并流

入下方细胞。

(3)现有的细胞内蛋白提取的研究需要将细胞裂解，或使用操作复杂的仪器系统对单一细胞进行提取。而本发明利用空心纳米针头阵列穿透细胞膜，提取供体细胞内蛋白并送入异常细胞，为微创式细胞治疗提供新思路，可无损或微创性地提取细胞内蛋白并输送到另一种细胞中，保持细胞的完整性和活性，避免干扰细胞正常功能；能持续为受体细胞提供蛋白质达到细胞治疗的目的。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明：

图1是本发明所述的双面空心纳米针阵列装置结构示意图。

具体实施方式

如图1所示，本发明所述的双面空心纳米针阵列装置，包括上下两层均安装有若干空心纳米针头排布形成的空心纳米针头阵列，所述上空心纳米针头阵1列的各空心纳米针头11与下空心纳米针头阵列3中的各空心纳米针头31对应，且所述上空心纳米针头阵列1的各空心纳米针头11上连通有微流管道2，所述下空心纳米针头阵列3的各空心纳米针头31也与所述微流管道2连通，所述微流管道2的两端部都设有小孔。所述空心纳米针头11/41为氧化硅管状空心纳米针头，其孔径范围值是在200-400nm，空心纳米针头11/41的长度是2-4um；所述微流管道2长度为100-120um。

本发明还公开了上述双面空心纳米针阵列装置的制备方法，其具体步骤是：

(1)制备上空心纳米针头阵列1、下空心纳米针头阵列2；

(2)将上空心纳米针头阵列1及下空心纳米针头阵列3均与微流管道连通2。

上述步骤(1)所述的制备上空心纳米针头阵列或下空心纳米针头阵列的步骤如下：

使用具有均匀纳米孔径的聚碳酸酯衬底膜作为模板

a、首先使用原子层沉积技术，用气相的三或二甲胺基或硅烷作为前驱体与水蒸汽脉冲交替地通入反应器，在模板基体的所有表面包含内孔壁沉积上均匀的氧化硅层；

b、然后利用等离子体刻蚀法，用SF₆和CF₄气体将上表面的氧化硅刻蚀掉；

c、接着进一步利用O₂等离子体刻蚀将部分的衬底膜刻蚀掉，形成氧化硅管状空心纳米针头结构。

上述步骤(2)所述的空心纳米针头阵列与微流管道整合的步骤如下：

a、使用光刻技术在硅片上制作SU-8光刻胶微流管道模具，并用此模具复制制作聚二甲基硅氧烷微流管道(PDMS)模块；

b、所述聚二甲基硅氧烷微流管道的两末端各钻小孔，用于连接导管输送溶液，且PDMS模块使用未固化的PDMS胶，将空心纳米针头阵列的衬底与PDMS粘合，形成双面空心纳米针阵列。

本发明所述的双面空心纳米针装置使用时探索此系统对细胞的微创性，可以在提取蛋白之后隔两天，检查细胞的活性，以及检查细胞在提取蛋白前以及提取蛋白后的RNA表达情况，判定细胞功能被改变的情况。将蛋白提取液直接从微流管道里抽出来，用标准ELISA试验对多种蛋白组分进行定量和分析。每隔12小时对同批细胞分别进行蛋白提取，检测此系统是否可持续将正常细胞的蛋白传送入异常细胞。

以下具体对本发明所述的双面空心纳米针装置进行说明：

(1)首先，可利用外加电场协助纳米针头插破细胞膜，通过优化电场条件，使细胞膜长时间处于被纳米针头插破状态，但又不影响细胞的正常功能。

(2)在培养孔底部铺放氧化铟锡导电玻璃(简称ITO)作为负极，ITO导电玻璃事先涂附多聚赖氨酸用于增加细胞粘附，并用导线连接外部电源及函数发生器，细胞使用细胞培养基培养于ITO导电玻璃之上。培养24小时后，细胞贴壁铺展生长，调整纳米针头及微留管道的高度，并利用光学显微镜在细胞培养孔的底部观察纳米针头的位置，使其紧贴在细胞的上表面，通过函数发生器调整电脉冲参数(电压，脉冲时长，脉冲间隔，脉冲数)，施加电场在空心纳米针下方的细胞膜，使得细胞膜局部破裂。验证细胞膜被纳米针插破的情况，可以通过纳米针头输送自身难于透过细胞膜的荧光分子(例如碘化吡啶)进入到细胞内来判定。

(3)对于细胞的存活，可以通过活细胞/死细胞双染试剂进行判定；对于判定细胞膜的愈合情况，可以在施加电场后，等待间隔时间t分钟，然后通过微流管道输送碘化吡啶；如果能够观察到碘化吡啶进入细胞内发出红色荧光，则证明纳米针下方和上方的细胞膜在施加电场后t分钟里仍能保持破裂状态。通过调节电脉冲的脉冲间隔，使得纳米针下方的细胞膜在临近愈合阶段被电场重新击破，从而保持长时间的破裂状态，允许细胞内蛋白有更多时间扩散进纳米针的管道内并进入下方细胞。空心纳米针结合电场作用，在选取合适电场条件下，已被证明能够有效打破细胞膜，同时能维持细胞的活性。纳米针阵列具有大量数目的纳米针，能够同时间作用于大批量的细胞。

(4)电场条件的优化：施加电场的强度、时间长短关系到细胞膜被纳米针插穿的状况，以及细胞存活性，通过优化电场条件，使得细胞膜长时间处于被纳米针头插破状态,但又不影响细胞的正常功能。

本发明所述的双面空心纳米针装置使用时探索此系统对细胞的微创性，可以在提取蛋白之后隔两天，检查细胞的活性，以及检查细胞在提取蛋白前以及提取蛋白后的RNA表达情况，判定细胞功能被改变的情况。将蛋白提取液直接从微流管道里抽出来，用标准ELISA试验对多种蛋白组分进行定量和分析。每隔12小时对同批细胞分别进行蛋白提取，检测此系统是否可持续将正常细胞的蛋白传送入异常细胞。

以下通过两种实施例对本发明进行详细的说明：

实施例一：

在Hela细胞间传输绿色荧光蛋白：

将若干Hela细胞置于双面纳米针阵列装置的上层，下层放置带有绿色荧光蛋白的变异型Hela细胞，提供适宜细胞正常生活的环境，用上层空心纳米针11插破Hela细胞膜，使细胞液流入微流管道2内，下层细胞20内的绿色荧光蛋白30流入上层细胞10内，每隔12小时分别对同批上方和下方的Hela细胞内的绿色荧光蛋白利用共聚焦荧光显微镜进行观察，可发现多次提取下大部分Hela细胞仍正常生活，且上方原来不带绿色荧光蛋白的Hela细胞中检测出绿色荧光蛋白，两种细胞存活率高，证明该双面空心纳米针装置可无损或微创性地提取细胞内蛋白并输送到另一种细胞中，保持细胞的完整性和活性，避免干扰细胞正常功能；能持续为受体细胞提供蛋白质达到细胞治疗的目的。

实施例二：

在Hela细胞间传输绿色和红色荧光蛋白：

将若干表达绿色荧光蛋白的Hela细胞置于双面纳米针阵列装置上层，下层放置带有红色荧光蛋白的变异型Hela细胞，提供适宜细胞正常生活的环境，用上层空心纳米针11插破Hela细胞膜，使细胞液流入微流管道2内，下层细胞20内的红色荧光蛋白30流入上层细胞10内。每隔12小时分别对同批上方和下方的Hela细胞内的红色和绿色荧光蛋白利用共聚焦荧光显微镜进行观察。可发现多次提取下大部分Hela细胞仍正常生活，且上方和下方的Hela细胞中同时检测出红色和绿色荧光蛋白，两种细胞存活率高，证明该双面空心纳米针装置可无损或微创性地提取细胞内蛋白并输送到另一种细胞中，保持细胞的完整性和活性，避免干扰细胞正常功能；能持续为受体细胞提供蛋白质达到细胞治疗的目的。

本发明并不局限于上述实施方式，凡是对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意味着包含这些改动和变型。

Claims (6)

1.一种双面空心纳米针阵列装置，其特征在于：包括上下两层均安装有若干空心纳米针头排布形成的空心纳米针头阵列，所述上空心纳米针头阵列的各空心纳米针头与下空心纳米针头阵列中的各空心纳米针头对应，且所述上空心纳米针头阵列的各空心纳米针头上连通有微流管道，所述下空心纳米针头阵列的各空心纳米针头也与所述微流管道连通，所述微流管道的两端部都设有小孔。

2.根据权利要求1所述的双面空心纳米针阵列装置，其特征在于：所述空心纳米针头为氧化硅管状空心纳米针头，其孔径范围值是在200-400nm之间，空心纳米针头的长度是2-4um。

3.根据权利1所述的双面空心纳米针阵列装置，其特征在于：所述微流管道长度为100-120um。

4.根据权利要求1所述的双面空心纳米针阵列装置的制备方法，其具体步骤是：

(1)制备上空心纳米针头阵列、下空心纳米针头阵列；

(2)将上空心纳米针头阵列及下空心纳米针头阵列均与微流管道连通。

5.根据权利要求4所述的双面空心纳米针阵列装置的制备方法，其特征在于：

上述步骤(1)所述的制备上空心纳米针头阵列或下空心纳米针头阵列的步骤如下：

使用具有均匀纳米孔径的聚碳酸酯衬底膜作为模板

a、首先使用原子层沉积技术，用气相的三或二甲胺基或硅烷作为前驱体与水蒸汽脉冲交替地通入反应器，在模板基体的所有表面包含内孔壁沉积上均匀的氧化硅层；

b、然后利用等离子体刻蚀法，用SF₆和CF₄气体将上表面的氧化硅刻蚀掉；

c、接着进一步利用O₂等离子体刻蚀将部分的衬底膜刻蚀掉，形成氧化硅管状空心纳米针头结构。

6.根据权利要求4所述的双面空心纳米针阵列装置的制备方法，其特征在于：

上述步骤(2)所述的空心纳米针头阵列与微流管道整合的步骤如下：

a、使用光刻技术在硅片上制作SU-8光刻胶微流管道模具，并用此模具复制制作聚二甲基硅氧烷微流管道模块；

b、所述聚二甲基硅氧烷微流管道的两末端各钻小孔，用于连接导管输送溶液，且PDMS模块使用未固化的PDMS胶，将空心纳米针头阵列的衬底与PDMS粘合，形成双面空心纳米针阵列。