CN104854235B - 源自人参的新型udp‑糖基转移酶和其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型尿苷二磷酸(UDP)‑糖基转移酶，并且具体地涉及源自人参的新型UDP‑糖基转移酶和其应用，通过利用UDP‑糖基转移酶转化原人参二醇(PPD)型人参皂苷制备糖基化人参皂苷的方法，包括UDP‑糖基转移酶、转化体或其培养物作为有效成分的将PPD型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷的组合物，利用MeJA(甲基茉莉酮酸酯)提高UDP‑糖基转移酶表达的方法，以及包括MeJA作为有效成分的提高UDP‑糖基转移酶表达的组合物。

Description

源自人参的新型UDP-糖基转移酶和其应用
技术领域
本发明涉及新型尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶，并且具体地涉及源自人参的新型UDP-糖基转移酶和其应用、通过利用UDP-糖基转移酶转化原人参二醇(PPD)型人参皂苷而制备糖基化人参皂苷的方法、将PPD型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷的组合物——其包括UDP-糖基转移酶、转化体或其培养物作为有效成分、利用MeJA(甲基茉莉酮酸酯)提高UDP-糖基转移酶表达的方法以及提高UDP-糖基转移酶表达的组合物——其包括MeJA作为有效成分。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A meyer)是广泛用于增进健康的最流行的医用草药之一。人参的根在传统医学中作为药草茶被消费，当前它已被包括在许多种产品中，包括糖果、速溶茶和滋补饮料。人参皂苷——其是人参中含有的糖基化三萜——对健康具有积极的作用。具体地，人参皂苷已知具有多种药理学作用如免疫系统增强和身体功能恢复。而且，超过40种不同的人参皂苷已在人参根中被鉴定。然而，由于每种人参皂苷的大量生产是困难的，所以它依旧是作为研究某个人参皂苷的有效性，例如，它对特定疾病的疗效的主要障碍。
人参皂苷是糖基化达玛烯型四环三萜类，并可基于它们的苷元结构分成三个不同的组:原人参二醇(PPD)型人参皂苷、原人参三醇(PPT)型人参皂苷和齐墩果酸型人参皂苷。这三组可基于通过化学结构中的糖苷键与环的C-3、C-6和C-20位置连接的糖部分(苷元)的位置和数目被进一步分类。PPD和PPT还具有不同的羟化模式。PPD在C-3、C-12和C-20位置具有-OH基团，而PPT在C-3、C-6、C-12和C-20位置具有-OH基团。PPD和PPT可用葡萄糖和/或其它类型的糖而糖基化，以转化成多种人参皂苷。代表性的PPD型人参皂苷包括人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3、化合物K(C-K)、人参皂苷F2和人参皂苷Rd。代表性的PPT型人参皂苷包括人参皂苷F1、Rg1、Re、Rh1和Rg2。
人参皂苷的生物合成途径只被部分鉴定。已知人参皂苷生物合成与其它三萜类共享生物合成途径，直到氧化鲨烯通过IPP异构酶(IPI)、GPP合酶(GPS)、FPP合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)和鲨烯环氧酶(SE)的作用由异戊烯基二磷酸和DMADP(二甲基烯丙基二磷酸)的一系列缩合反应而合成(Ajikumar等.Science,330,70-74.2010；Ro等.Nature,440,940-943.2006；Sun等.BMC genomics,11,262,2010)。氧化鲨烯通过DS(达玛烯二醇-II合酶)——其是三萜环化酶——被环化成达玛烯二醇-II。达玛烯二醇-II在C-3和C-20位置具有羟基，并通过由p450酶、PPDS(原人参二醇合酶)引起的C-12位置的羟化而转化成PPD。PPDS还可通过由另一种p450酶、PPTS(原人参三醇合酶)引起的在C-6位置的羟化而转化成PPT。PPD可通过在C-3和/或C-20位置的糖基化而转化成PPD型人参皂苷，而PPT可通过在C-6和/或C-20位置的糖基化而转化成PPT型人参皂苷。UDP(尿苷二磷酸)-糖基转移酶(UGT)被认为通过O-、β1,2-或β1,6-糖苷键的形成而参与多种人参皂苷的合成途径。DS、PPDS和PPTS已被报道为参与人参皂苷生物合成的酶，但是UGT是否参与人参皂苷的生物合成尚未被鉴定。
UDP-糖基转移酶是催化糖部分从UDP-糖转移到宽范围的代谢产物如激素和次级代谢产物的酶。一般而言，UGT在生物合成途径的最终步骤中起作用以增加代谢产物的溶解度、稳定性、储存、生物活性或生物利用度。如由植物中代谢产物的显著多样性所认识到的，植物基因组具有数百种不同的UGT。例如，植物模型，拟南芥含有107种UGT，其基于氨基酸序列属于14个不同的组(组A至组N)。不同的UGT对糖供体和糖受体显示底物特异性。例如，UGT78D2将葡萄糖从UDP-葡萄糖转移到黄酮醇(山柰酚、槲皮素)和花色素苷(花青定)的C-3位置以便分别产生黄酮醇3-O-葡糖苷和花青定3-O-葡糖苷。似乎这样的糖基化对化合物的体内稳定性和储存是必要的。另一方面，UGT89C1将鼠李糖(rhanmnose)从UDP-鼠李糖转移到黄酮醇-3-O-葡糖苷的C-7位置以便产生黄酮醇-3-O-葡糖苷-7-O-鼠李糖苷。同样，UGT89C1不利用UDP-葡萄糖和花色素苷-3-O-葡糖苷作为底物。并且，它对UDP-糖和来自UGT78D2的UDP-糖的受体具有不同的特异性。因此，存在研究针对不同类型UGT的底物特异性的需要。
发明的公开内容
技术问题
本发明人对要用于特定人参皂苷生物合成的具有底物特异性和区域选择性的新型UDP-糖基转移酶的发展付诸了大量努力。结果，本发明人鉴定了来自人参的称作PgUGT74A1的新型糖基转移酶，并且他们发现PgUGT74A1具有通过特异地作用于PPD型人参皂苷、PPD和C-K以催化在C-3位置的O-糖基化而将PPD和C-K分别转化成人参皂苷Rh2和人参皂苷F2的活性。由于具有该活性，PgUGT74A1可用于某种糖基化人参皂苷的生产。
问题的解决方案
本发明的一个目的是提供源自人参的新型尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶蛋白质。
本发明的另一个目的是提供编码UDP-糖基转移酶蛋白质的多核苷酸、包括多核苷酸的表达载体和导入有表达载体的转化体。
本发明的又一个目的是提供制备UDP-糖基转移酶蛋白质的方法。
本发明的又一个目的是提供通过利用UDP-糖基转移酶蛋白质、转化体或其培养物转化原人参二醇(PPD)型人参皂苷而制备糖基化人参皂苷的方法。
本发明的又一个目的是提供将PPD型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷的组合物，其包括UDP-糖基转移酶蛋白质、转化体或其培养物作为有效成分。
本发明的又一个目的是提供利用MeJA(甲基茉莉酮酸酯)提高UDP-糖基转移酶表达的方法。
本发明的又一个目的是提供提高UDP-糖基转移酶表达的组合物，其包括MeJA作为有效成分。
发明的有益效果
本发明的新型UDP-糖基转移酶具有底物特异性和区域选择性，因此能够将糖部分特异地转移至PPD型人参皂苷的C-3位置。因此它用于特定的人参皂苷如人参皂苷Rh2、F2、Rg3或Rd的大量生产。
附图简述
图1显示PPD型和PPT型人参皂苷的化学结构；
图2显示UDP-糖基转移酶，PgUGT74A1和PgUGT74A1中的每个分别与UGT74和UGT94之间聚类(clustering)的示意图。UGT的氨基酸序列利用MEGA5软件比对，并且比对展示为邻接树(neighbor-jointing tree)。除PgUGTs(人参，高丽参(Panax ginseng))、SiUGT94B1(芝麻(Sesamumindicum L.))、BpUGT94B1(雏菊(Bellis perennis))、Cm1,2RhaT(柚子(Citrus maxima))和CaUGT3(长春花(Catharanthus roseus))外的所有的UST源自拟南芥；
图3显示薄层色谱法(TLC)的结果，其展示UDP-糖基转移酶，PgUGT74A1具有将PPD转化成人参皂苷Rh2和将化合物K转化成人参皂苷F2的活性。图3a显示本发明的PgUGT74A1和10种不同人参皂苷的TLC分析结果(右图：用PgUGT74A1处理，左图：未处理)，并且将10种不同人参皂苷中的每种在UDP-葡萄糖(UDP-Glc)的存在下与PgUGT74A1反应。如图3a所示，PgUGT74A1只将10种人参皂苷中的PPD和C-K分别转化成Rh2和F2，(三角形)。图3b显示来自PPD(左)和C-K(右)与本发明的PgUGT74A1反应的产物的高效液相色谱(HLPC)结果。分别从PPD和C-K转化的Rh2和F2被标记为三角形；
图4显示TLC和HPLC分析结果，其展示UDP-糖基转移酶，PgUGT74A1具有将人参皂苷Rh2和人参皂苷F2分别转化成人参皂苷Rg3和Rd的活性。图4a显示本发明的PgUGT74A1和10种不同人参皂苷的TLC分析结果(右图：用PgUGT74A1处理，左图：未处理)。将10种不同人参皂苷中的每种在UDP-葡萄糖(UDP-Glc)的存在下与PgUGT74A1反应。如图4a所示，PgUGT74A1只将10种人参皂苷中的人参皂苷Rh2和人参皂苷F2分别转化成人参皂苷Rg3和人参皂苷Rd(三角形)。图4b是来自人参皂苷Rh2(左)和人参皂苷F2(右)与本发明的PgUGT74A1反应的产物的HLPC分析结果。分别从人参皂苷Rh2和人参皂苷F2转化的人参皂苷Rg3和人参皂苷Rd被标记为三角形；
图5显示HPLC分析结果，其展示如果使用PgUGT74A1和PgUGT74A1两者，则PPD和C-K被分别转化成人参皂苷Rg3和Rd。将PPD(上图)或C-K(下图)在UDP-Glc的存在下与PgUGT74A1和PgUGT74A1两者温育。然后将反应混合物通过HPLC分析。结果显示PPD和C-K分别转化成Rg3和Rd。将由以上两种酶转化的Rg3和Rd标记为黑色三角形；
图6显示PgUGT74A1和PgUGT74A1的相对表达水平。图6a显示人参的叶和根中人参皂苷生物合成基因的表达水平，而图6b显示用MeJA(甲基茉莉酮酸酯)处理之后叶中人参皂苷生物合成基因表达水平的变化。将MeJA每天喷在叶上持续总共5天，并且在处理开始之后的第6天，收集样品用于表达分析。图6c显示用MeJA处理之后人参皂苷表达水平的变化。误差棒显示三次生物学重复的标准偏差(SD)；和
图7是涉及本发明的UDP-糖基转移酶的Rg3和Rd的人参皂苷生物合成途径的示意图。
实施发明的最佳方式
作为一方面，本发明提供从源自人参的新型尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶(UGT)。
如本文所用，术语“尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶”是催化单糖部分从糖基供体转移至糖基受体分子的酶，并且具体地，它指利用UDP-糖作为糖基供体的酶。在本发明中，UDP-糖基转移酶可与UGT可互换地使用。认为UDP-糖基转移酶催化原人参二醇(PPD)和原人参三醇(PPT)的多种糖基化，以产生宽范围的人参皂苷。然而，甚至具有UDP-糖基转移酶活性的那些酶也取决于酶的类型而具有不同的底物特异性和区域选择性。因此，需要确定酶是否是特异性地作用于人参皂苷(其为人参皂素(ginseng saponin))的UDP-糖基转移酶。关于源自人参的UDP-糖基转移酶尚未有报道，该源自人参的UDP-糖基转移酶特异地作用于PPD型人参皂苷C-3位置并转移糖部分以便从PPD或化合物K(C-K)产生人参皂苷Rh2或F2。UDP-糖基转移酶由本发明人首次鉴定。
为了本发明的目的，UDP-糖基转移酶可以是源自人参的UDP-糖基转移酶，优选源自高丽参的UDP-糖基转移酶，更优选由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶，但不限于此。在本发明的一个实施例中，将由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶指定为PgUGT74A1。
UDP-糖基转移酶可指具备SEQ ID NO.1的氨基酸序列，但还具备与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高、甚至还优选98％或更高和最优选99％或更高序列同源性的氨基酸序列的蛋白质。然而，任何蛋白质可没有限制地使用，只要它具有能基本上将糖转移至人参人参皂苷的UDP-糖基转移酶活性。此外，如果具有以上序列同源性的蛋白质具有与UDP-糖基转移酶基本上相同或相应的生物活性，则甚至具有部分氨基酸序列缺失、修饰、取代或添加的蛋白质变体也可包括在本发明的范围内。
如本文所用，术语“同源性”意欲指示与野生型蛋白质的氨基酸序列或编码其的核苷酸序列的相似性程度，并包括与本发明的氨基酸序列或碱基序列具有以上百分比或更高同源性的序列。同源性比较可通过视力或通过容易获得的序列比较程序进行。
优选，本发明的UDP-糖基转移酶指具有将PPD型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷的活性的蛋白质，但不限于此。
如本文所用，术语“PPD型人参皂苷”是达玛烷型皂素，并且它指在其非糖组分(苷元)具有两个羟基(-OH)的人参皂苷，其实例包括PPD(原人参二醇)、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Ra3、Rg3、Rh2、Rs1、C-O、C-Y、C-Mc1、C-Mc、F2、C-K、绞股蓝皂苷XVII、绞股蓝皂苷LXXV和Rs2。为了本发明的目的，PPD型人参皂苷可以没有限制地是任何人参皂苷，只要它是可由本发明的UDP-糖基转移酶糖基化的人参皂苷。优选人参皂苷将被O-糖基化，更优选人参皂苷将在它的C-3位置被糖基化，还更优选PPD和化合物K，但不限于此。在本发明的一个实施例中，PPD和化合物K用作可由本发明的UDP-糖基转移酶，PgUGT74A1糖基化的PPD型人参皂苷。人参皂苷结构的示意图显示在图1中。
如本文所用，术语“糖基化人参皂苷”指具有与构成人参皂苷的非糖组分(苷元)的羟基连接的单糖或更大的糖分子的人参皂苷，并被示例为人参皂苷Rh2、Rg3、F2或Rd，但不限于此。为了本发明的目的，糖基化人参皂苷没有限制地包括任何糖基化人参皂苷，只要它是由本发明的UDP-糖基转移酶糖基化的人参皂苷。糖基化人参皂苷优选指具有O-糖苷键的人参皂苷，更优选在它的C-3位置具有单糖或更高的糖的糖的人参皂苷，但不限于此。在本发明的一个实施例中，PPD和化合物K(C-K)通过PgUGT74A1的活性分别转化成糖基化人参皂苷，人参皂苷Rh2和F2。
特别地，本发明中SEQ ID NO.1的UDP-糖基转移酶将葡萄糖从UDP-葡萄糖转移至PPD型人参皂苷在C-3位置的羟基(-OH)，形成O-糖苷键，从而产生糖基化人参皂苷。
具体地，UDP-糖基转移酶将葡萄糖部分从UDP-葡萄糖转移至PPD在C-3位置的羟基，形成O-糖苷键，从而将PPD转化成人参皂苷Rh2。UDP-糖基转移酶将葡萄糖部分从UDP-葡萄糖转移至C-K在C-3位置的羟基，形成O-糖苷键，从而将C-K转化成人参皂苷F2。另一方面，UDP-糖基转移酶不作用于PPD型人参皂苷在C-12或C-20位置的羟基，但是特异地将糖转移至在C-3位置的羟基。此外，即使PPT型人参皂苷在C-3位置具有羟基，本发明的UDP-糖基转移酶也不作用于PPT型人参皂苷。因此，由于本发明的UDP-糖基转移酶具有针对PPD型人参皂苷，特别地PPD和C-K在C-3位置的羟基的底物特异性和区域选择性，所以它可用于特定人参皂苷的转化，优选PPD和C-K分别转化成Rh2和F2。
在本发明的一个实施例中，新型UDP-糖基转移酶，PgUGT74A1是从人参新分离的(实施例1)，并且序列分析的结果显示糖基转移酶聚类在UGT74家族中，但是不聚类在拟南芥UGT74亚族中(实验实施例1和图2)。此外，糖基转移酶区域选择性地作用于PPD型人参皂苷并将一个葡萄糖转移至C-3位置的羟基，从而产生糖基化人参皂苷(实验实施例2和4；和图3和5)。PgUGT74A1蛋白质的酶活性显示在图7中。
作为另一方面，本发明提供编码UDP-糖基转移酶的多核苷酸、包括多核苷酸的表达载体和其中包括表达载体的转化体。
UDP-糖基转移酶与上面所描述的相同。
编码UDP-糖基转移酶的多核苷酸可以优选是SEQ ID NO.2的核苷酸序列表示的多核苷酸，并且还没有限制地包括与SEQ ID NO.2的核苷酸序列具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、还更优选95％或更高和最优选98％或更高的序列同源性的任何核苷酸序列，只要它能基本上编码具有UDP-糖基转移酶活性的蛋白质。
包括本发明的多核苷酸的表达载体是能在合适的宿主细胞中表达靶蛋白质的表达载体，并指DNA构建体，其包括可操作地连接以表达核酸插入物的必要调控元件。靶蛋白质可通过将制备的重组载体转化或转染进宿主细胞而获得。
包括本发明中提供的多核苷酸的表达载体包括，但不限于，源自大肠杆菌(E.coli)的质粒(pYG601BR322、pBR32、pUC118和pUC119)、源自枯草杆菌(Bacillussubtilis)的质粒(pUB110和pTP5)、源自酵母的质粒(YEp13、YEp24和YCp50)和土壤杆菌属(Agrobacterium)-介导的转化中使用的Ti-质粒。噬菌体DNA的具体实例包括λ-噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11和λZAP)。进一步，可使用动物病毒如反转录病毒、腺病毒或牛痘病毒，昆虫病毒如杆状病毒、双链植物病毒(例如，CaMV)、单链病毒或源于双生病毒的病毒载体。
而且，作为本发明的载体，可使用转录激活因子，如B42-连接的融合质粒(例如，pJG4-5)。为了促进本发明中获得的靶蛋白质的纯化，需要时质粒载体可进一步包括其它序列。融合质粒可包括标签如GST、GFP、His-标签Myc-标签等，但是本发明的融合质粒不限于这些实例。在本发明的一个实施例中，pGEX4T-1——其是GST基因融合的载体——用于包括编码UDP-糖基转移酶的多核苷酸的表达载体的构建。
此外，包括融合序列的载体表达的融合蛋白质可通过亲和色谱来纯化。例如，如果谷胱甘肽-S-转移酶将与其它序列融合，则可使用作为该酶底物的谷胱甘肽。如果六聚组氨酸用作靶蛋白质标签，则靶蛋白质可通过利用Ni-NTA His-结合树脂柱(Novagen,USA)被容易地纯化。
为了将本发明的多核苷酸插入载体，纯化的DNA可利用合适的限制酶切割，并插入合适的载体DNA的限制位点或克隆位点。
编码本发明的UDP-糖基转移酶的多核苷酸可以可操作地连接于载体。除了启动子和本发明的核酸，本发明的载体可进一步包括顺式元件如增强子、剪接信号、多聚腺苷酸添加信号、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)。作为选择标记的实例，可使用氯霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因、二氢叶酸还原酶、新霉素抗性基因等，但是将可操作地连接的另外元件的类型不限于这些实例。
如本文所用，术语“转化”指将DNA导入宿主细胞以便DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合被复制。即，转化指通过将外源DNA导入细胞引起的基因的合成改变。
本发明的转化可通过任何转化方法进行，并可遵循本领域已知的通常方法而容易地进行。一般而言，转化方法的实例包括CaCl2沉淀、Hanahan方法——其是通过利用DMSO(二甲基亚砜)作为还原物质的改进的CaCl2方法、电穿孔、磷酸钙沉淀、原生质体融合、利用碳化硅纤维的振荡、土壤杆菌属-介导的转化、PEG-介导的转化、硫酸葡聚糖-介导的转化、阳离子脂质体-介导的转化和脱水/抑制-介导的转化。包括编码本发明的UDP-糖基转移酶的多核苷酸的载体的转化方法不限于这些实例，并且可没有限制地使用本领域通常使用的转化或转染方法。
在本发明中，宿主细胞的种类没有特别地限制，只要它能表达本发明的多核苷酸。将用于本发明的宿主细胞的具体实例包括属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌如大肠杆菌；属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌如枯草杆菌；属于假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；酵母如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；动物细胞、植物细胞和昆虫细胞。将用于本发明的大肠杆菌菌株的具体实例包括CL41(DE3)、BL21和HB101，并且枯草杆菌菌株的具体实例包括WB700和LKS87。导入有包括本发明的多核苷酸的表达载体的植物转化体没有特别地限制，只要它能表达本发明的糖基转移酶。其实例包括烟草、拟南芥、马铃薯、人参、芝麻、枸橼、雏菊属(Bellis)等，但不限于此。
任何启动子可用作本发明的启动子，只要它能在宿主细胞中驱动本发明的核酸表达。例如，可使用源自大肠杆菌或噬菌体的启动子如trp启动子、lac启动子、PL启动子和PR启动子；源自大肠杆菌感染噬菌体的启动子如T7启动子、CaMV35S、MAS或组蛋白质启动子。还可使用合成修饰的启动子如tac启动子。
通过以上方方法导入有包括编码本发明的UDP-糖基转移酶蛋白质的多核苷酸的表达载体的转化体具有通过在PPD型人参皂苷C-3位置的O-糖苷键的形成而转移葡萄糖的生物活性。优选，转化体指具有能将人参皂苷PPD转化成人参皂苷Rh2，或将C-K转化成人参皂苷F2能力的转化体，但不限于此。
作为另一方面，本发明提供制备UDP-糖基转移酶蛋白质的方法。
UDP-糖基转移酶与上面所描述的相同。
优选，制备方法包括(a)培养导入有包括编码UDP-糖基转移酶的多核苷酸的载体的转化体；(b)从培养的转化体产生UDP-糖基转移酶；和(c)回收产生的UDP-糖基转移酶。
转化体的培养可通过遵循本领域使用的通常方法来进行。用于转化体的生长培养基中包括的碳源可根据转化体的类型由本领域技术人员选择。可采用合适的培养条件以便调节培养时间和量。
作为另一方面，本发明提供通过利用UDP-糖基转移酶、转化体或其培养物而转化PPD(原人参二醇)型人参皂苷来制备糖基化人参皂苷的方法。
UDP-糖基转移酶、转化体、PPD型人参皂苷和糖基化人参皂苷与上面所描述的相同。
更具体地，该方法包括在UDP-糖的存在下使PPD型人参皂苷与SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶蛋白质、导入有包括编码该蛋白质的多核苷酸的表达载体的转化体或转化体的培养物反应的步骤。
如本文所用，术语“转化体的培养物”指根据已知的培养微生物的方法通过培养转化体而获得的产物。培养物包括本发明的SEQ ID NO.1的UDP-糖基转移酶，因此它能将PPD型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷，例如，将人参皂苷PPD转化成人参皂苷Rh2，或将化合物K转化成人参皂苷F2。
作为在本发明中用作起始材料的PPD型人参皂苷，可使用分离和纯化的人参皂苷、或包括在人参粉末或提取物中的人参皂苷。即，包括人参皂苷的人参粉末或提取物可直接用作起始材料来进行本发明的方法。用于本发明的人参包括已知的多种类型的人参，如高丽参、西洋参(P.quiquefolius)、三七参(P.notoginseng)、竹节参(P.japonicus)、三叶参(P.trifolium)、假人参(P.pseudoginseng)和越南人参(P.vietnamensis)，但不限于此。
优选，转化可通过由本发明的UDP-糖基转移酶、导入有包括编码UDP-糖基转移酶的多核苷酸的表达载体的转化体、或转化体的培养物引起的PPD型人参皂苷(生物转化成糖基化人参皂苷而发生，并且它可通过将糖转移至在人参皂苷的C-3位置的羟基(-OH)而实现。本发明的SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的蛋白质能将在C-3位置具有羟基的PPD型人参皂苷，优选PPD或C-K，转化成糖基化人参皂苷。本发明的SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的蛋白质进行的生物转化包括将PPD转化成Rh2，和将C-K转化成F2。因此，本发明的方法可用于需要糖基化人参皂苷，特别是人参皂苷Rh2或F2的领域。
制备糖基化人参皂苷的方法可进一步包括在使PPD型人参皂苷与SEQ ID NO.1的UDP-糖基转移酶蛋白质、导入有包括编码SEQ ID NO.1的UDP-糖基转移酶的多核苷酸的载体的转化体、或转化体的培养物反应的步骤中使PPD型人参皂苷与SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶蛋白质、导入有包括编码该蛋白质的多核苷酸的载体的转化体、或转化体的培养物反应的步骤。
如本文所用，术语“SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶”指能通过形成β1,2-糖苷键将糖部分从UDP-糖转移至人参皂苷的酶。SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶具有能将糖部分从糖供体如UDP-糖转移至糖受体如3-O-糖基化人参皂苷以引起β1,2糖苷键形成的能力。因此，它将3-O-糖基化人参皂苷转化成糖基化人参皂苷。SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶是源自人参的糖基转移酶，其由本发明人首次分离，并在本发明中可以与PgUGT94B1可互换地使用。
SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶的糖受体是3-O-糖基化人参皂苷，优选人参皂苷Rh2或F2，但不限于此。因此，由于糖基转移酶具有通过与在人参皂苷Rh2的C-3位置的O-葡糖苷形成β1,2糖苷键而转移糖部分的活性，所以它能将人参皂苷Rh2转化成Rg3。同样，由于糖基转移酶具有通过与在人参皂苷F2的C-3位置的O-葡糖苷形成β1,2糖苷键而转移糖部分的活性，所以它能将人参皂苷F2转化成Rd。
因此，如果使用特异地作用于在PPD型人参皂苷C-3位置的羟基的UDP-糖基转移酶和SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶，则PPD可被转化成人参皂苷Rh2，其进而可被转化成Rg3。通过该过程，PPD可被转化成人参皂苷Rg3。如果C-K用作起始材料，则C-K通过本发明的糖基转移酶被转化成人参皂苷F2，其进而被转化成人参皂苷Rd。通过该过程，C-K被转化成人参皂苷Rd。在本发明的一个实施例中，将PgUGT74A1和PgUGT94B1用于将PPD转化成人参皂苷Rg3和将C-K转化成人参皂苷Rd。因此，证实了以上两种酶均可用于以高产率生产人参皂苷Rg3和Rd(图5)。
作为另一方面，本发明提供将PPD(原人参二醇)型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷的组合物，其包括SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶蛋白、转化体或其培养物作为有效成分。
UDP-糖基转移酶、转化体和其培养物；以及PPD型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷与上面所描述的相同。组合物可进一步包括由SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶、转染有包括编码SEQ ID NO.3的UDP-糖基转移酶的多核苷酸的载体的转化体、或转化体的培养物。
本发明的SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶将一个糖部分选择性地转移至在PPD型人参皂苷C-3位置的羟基，因此它可用于生产在C-3位置糖基化的人参皂苷如人参皂苷Rh2或F2。
作为另一方面，本发明提供提高人参中UDP-糖基转移酶表达的方法，其包括用称作甲基茉莉酮酸酯(MeJA)的化合物处理人参。
UDP-糖基转移酶与上面所描述的相同。
如本文所用，术语“MeJA(甲基茉莉酮酸酯)”是参与植物防御和多种生长途径如根生长的挥发性有机化合物。MeJA可以与甲基(1R,2R)-3-氧代-2-(2Z)-2-戊烯基-环戊烷乙酸酯可互换地使用，并具有以下化学结构。
化学图1
为了本发明的目的，MeJA指能提高PgUGT74A1表达的化合物。当将MeJA喷到人参叶上时，PgUGT74A1表达提高。因此，由于通过利用MeJA在人参中增加本发明的PgUGT74A1的表达，所以MeJA在人参皂苷的生产中是有用的。在本发明的一个实施例中，发现PgUGT74A1表达可通过用MeJA处理而显著增加(图6B)。
作为另一方面，本发明提供提高UDP-糖基转移酶表达的组合物，其包括MeJA作为有效成分。
MeJA和UDP-糖基转移酶与上面所描述的相同。
此外，MeJA能增加本发明的PgUGT74A1的表达，因此本发明的包括MeJA作为有效成分的组合物可用于提高PgUGT74A1表达，并优选应用于人参以便增加人参中PgUGT74A1表达。
发明的方式
本发明通过提供下面的实施例而被更详细地描述。然而这些实施例只意欲说明，但决不限制要求保护的发明。
实施例1：人参UDP-糖基转移酶(PgUGT)的克隆和纯化
利用下面的表1中列出的引物组(SEQ ID NOs.5和6、SEQ ID NOs.7和8)将从人参EST文库鉴定的两种类型的UGT基因克隆进pGEX4T-1载体，并被分别命名为PgUGT74A1和PgUGT94B1。
表1
将转染有重组体蛋白质，PgUGT74A1和PgUGT94B1的大肠杆菌细胞(大肠杆菌BL21-密码子加(DE3)-RIL)在补充有50μg/ml氨苄西林和34μg/ml氯霉素的LB培养基中培养。然后将蛋白质从细胞培养物纯化。
靶基因的表达通过利用0.1mM IPTG诱导。然后细胞沉淀物通过在4℃以2,500g离心细胞培养物15分钟而分离。将收集的细胞沉淀物重悬在10mM PBS缓冲液(pH 7.0)中，并将细胞通过超声处理(Vibra-cell,Sonics&Matreials,CT)而破裂。将未破裂细胞和细胞碎片通过在4℃以10,000g离心样品15分钟而去除，并将所得的上清液通过具有0.45μm孔径的注射器式滤器而进一步纯化。重组蛋白质通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和色谱(GE Healthcare)从无细胞提取物纯化。
实施例2：体外酶测定
糖基转移酶测定在含有纯化的PgUGT74A1或PgUGT94B1(30μg)、人参皂苷化合物(5mM)和UDP-葡萄糖(50mM)的反应缓冲液(10mM PBS缓冲液，pH 7)中进行。为了该测定，使用10种不同类型的人参皂苷，包括PPD(原人参二醇)、PPT(原人参三醇)、化合物K(C-K)、人参皂苷Rg3、Rh2、F2、Rd、Rg2、Rh1和F1，并且人参皂苷的结构显示在图1中。
将反应混合物在35℃温育12小时，然后将产物通过薄层色谱(TLC)或高效液相色谱(HPLC)分析。
TLC分析利用流动相(丙酮:甲醇:DDW＝65:35:10vol/vol)和60F254硅胶板(Merck,Germany)进行。TLC板上分离的产物通过用10％(vol/vol)硫酸(H2SO4)喷板和将它在110℃加热5分钟来检测。
HPLC分析利用ODS(2)C18柱(Phenomenex,USA)进行。水和乙腈梯度应用时间；以及组分比如下：1ml每分钟的流速0分钟，68％水和32％乙腈；8分钟，35％水和65％乙腈；12分钟，0％水和100％乙腈；20分钟，0％水和100％乙腈；20.1分钟，68％水和32％乙腈；和28分钟，68％水和32％乙腈。
人参皂苷通过利用UV-检测器(Younglin,Korea)在203nm的波长来检测。
实施例3：RNA分离和实时PCR分析
将总RNA利用光谱植物总RNA试剂盒(Sigma-Aldrich)从15个月龄的人参的叶或根分离。将200μM甲基茉莉酮酸酯(MeJA)每天喷到人参叶上总共持续5天，将样品在第六天收集。将1μg总RNA用于cDNA合成。
不同基因的表达水平通过定量RT-PCR利用下面表2中列出的引物组来检测，并将结果归一化到微管蛋白的表达水平。
表2
实验实施例1：UDP-糖基转移酶PgUGT74A1和PgUGT94B1的序列分析
为了研究参与人参皂苷生物合成的UDP-糖基转移酶(UGT)的作用，首先进行EST数据库分析以通过实施例1中描述的方法从高丽参克隆UGT基因。它们之中，研究命名为PgUGT74A1和PgUGT94B1的两种类型的UGT以测定它们的作用。
序列分析结果显示它们不能由与源自其它植物的UGT——包括源自拟南芥(A.thaliana)的UGT——的序列同源性具体说明(图2)。更具体地，PgUGT74A1与拟南芥UGT74家族形成聚簇。拟南芥UGT74家族由7种类型的UGT组成，其可分成5个亚族(UGT74B、C、D、E1和F)。虽然PgUGT74A1与拟南芥UGT74家族形成聚簇，但是它不属于5个亚族中的任何一个，从而指示本发明的PgUGT74A1落入与拟南芥其它亚族不同的新型UGT74亚族。拟南芥UGT74家族之中，UGT74B1通过形成糖基硫酯键使苯乙酰硫代羟肟酸酯(phenylacetothiohydroximate)——其是硫代葡萄糖酸酯(glucosinolate)的前体——糖基化，而UGT74E2通过形成糖基酯键使吲哚丁酸酯糖基化。同样，UGT74F1和UGT4F2也通过形成糖基酯键分别使水杨酸酯(salicyclate)和邻氨基苯甲酸酯糖基化。另一方面，UGT74家族成员还可形成除糖基酯键外的O-糖苷键。已知UGT74F1通过形成2-O-糖苷键使水杨酸酯糖基化。此外，UGT74F1和UGT74F2通过形成O-糖苷键使水杨酸酯和邻氨基苯甲酸酯糖基化。
因此，即使属于拟南芥UGT74家族的那些UGT也需要被研究以鉴定它们的底物类型和它们针对糖基化形成的键。
此外，分析结果证明PgUGT94B1不与拟南芥UGT94家族形成聚簇，但是与BpUGT94B1(雏菊)、SiUGT94D1(芝麻)、CaUGT3(长春花)和Cm1,2RhaT(柚子)的UGT94亚族形成聚簇。它们之中，BpUGT94B1形成β1,6键以将葡萄糖醛酸基(glucuronosyl)部分添加到花青定的3-O-葡糖苷，而SiUGT94D1形成β1,6键以将葡萄糖添加到芝麻素酚(sesaminol)的2-O-葡糖苷。CaUGT3形成β1,6键以将葡萄糖分子转移至槲皮素-3-O-葡糖苷，而Cm1,2RhaT形成β1,6键以将鼠李糖添加到黄酮7-O-葡糖苷。
总体上，结果证明属于PgUGT94B1的所有UGT94家族成员催化糖基化，其将第二糖分子添加到O-糖基化受体，而不论糖供体和受体的类型。
这些结果指示PgUGT74A1可形成O-糖苷键或糖基酯键以催化人参皂苷的糖基化，而PgUGT94B1形成β-糖苷键以将第二糖添加到糖基化人参皂苷，从而催化糖基化。如图1的人参皂苷结构所指示的，PPD型人参皂苷可在它的C-3或C-20位置，或在这两个位置经由O-键而被糖基化，而PPT型人参皂苷可在它的C-6或C-20位置，或在这两个位置经由O-键而被糖基化。此外，具有一个或多个糖基团的人参皂苷——包括人参皂苷Rb1、化合物Y和化合物O——可经由β-1,6键被进一步糖基化。
基于这些序列分析结果，PgUGT74A1和PgUGT94B1的实际活性通过下面的实施例来测定。
实验实施例2：PgUGT74A1引起的PPD和C-K转化成人参皂苷Rh2和人参皂苷F2
基于实验实施例1的序列分析结果，PgUGT74A1和PgUGT94B1的底物特异性和区域选择性如下测定。
首先，将实施例1的重组体PgUGT，PgUGT74A1，与10种不同类型的人参皂苷(PPD、C-K、Rh2、F2、Rg3、Rd、Rg2、Rh1、F1和PPT)在UDP-葡萄糖的存在下温育，并将重组体PgUGT转化的产物通过TLC分析。结果显示在图3a中。
结果显示PgUGT74A1不转化除PPD和C-K以外的人参皂苷，这指示PgUGT74A1具有高受体特异性(图3a)。以上结果通过在TLC板上迁移点证实。结果，PgUGT74A1分别将PPD和C-K转化成人参皂苷Rh2和人参皂苷F2。
该结果进一步通过高效液相色谱(HPLC)证实，如图3b所示。来自HPLC的结果显示本发明的PgUGT74A1分别将PPD和C-K转化成人参皂苷Rh2和F2，如在TLC分析结果中那样。与PgUGT74A1不同，实施例1的PgUGT94B1没有将PPD和C-K转化成其它人参皂苷(图3b)。
如TLC和HPLC的结果所示，PgUGT74A1只将PPD型人参皂苷如PPD和C-K分别转化成人参皂苷Rh2和人参皂苷F2，这证明示它的底物特异性。此外，当将被糖基化的碳数被确定时，存在经由O-键在PPD型人参皂苷C-3位置的特异性糖基化，而其它位置如在PPD的C-12和C-20位置的羟基(-OH)和在PPT的C-3、C-6、C-12和C-20位置的羟基(-OH)不被糖基化，这指示PgUGT74A1对PPD型人参皂苷C-3位置具有区域选择性。该结果提示本发明的PgUGT74A1形成O-糖苷键以引起糖基化。
总体上，以上结果证明PgUGT74A1特异地作用于PPD型人参皂苷，并具有针对PPD和C-K的强底物特异性和针对在C-3位置糖基化的区域选择性。
实验实施例3：PgUGT94B1引起的人参皂苷Rh2和F2转化成人参皂苷Rg3和人参皂苷Rd
还考查了实施例1中克隆的PgUGT94B1是否与PgUGT74A1一样具有底物特异性和区域选择性。
首先，将实施例1的重组PgUGT，PgUGT94B1，与10种不同类型的人参皂苷(PPD、C-K、Rh2、F2、Rg3、Rd、Rg2、Rh1、F1和PPT)在UDP-葡萄糖的存在下温育，然后将重组PgUGT转化的产物通过TLC分析。结果显示在图4a中。
结果，PgUGT94B1不转化除人参皂苷Rh2和F2以外的人参皂苷，这指示PgUGT94B1具有高受体特异性(图4a)。该结果通过在TLC板上的迁移点证实。结果，PgUGT94B1分别将人参皂苷Rh2和人参皂苷F2转化成人参皂苷Rg3和人参皂苷Rd。
该结果进一步通过高效液相色谱法(HPLC)证实，如图4b所示。HPLC结果证明PgUGT94B1分别将人参皂苷Rh2和F2转化成人参皂苷Rg3和Rd，如在TLC分析结果中那样。另一方面，本发明的PgUGT74A1不转化人参皂苷Rh2和F2，如在实验实施例2中的结果中那样(图4b)。
根据这些结果，PgUGT94B1通过形成β-1,2键使在Rh2和F2的C-3位置的O-葡糖苷特异地糖基化，而不使在C-K和F2的C-20位置的O-葡糖苷特异地糖基化。以上结果提示PgUGT94B1具有针对Rh2和F2的底物特异性和针对在C-3位置的O-葡糖苷的区域选择性。
实验实施例4：PgUGT74A1和PgUGT94B1引起的PPD和C-K转化成人参皂苷Rg3和Rd
基于实验实施例2和3的结果，认为当两种类型的PgUGTs同时使用时，人参PPD可转化成人参皂苷Rh2，其进而可转化成Rg3，从而从PPD连续地产生Rg3。同样，当使用两种酶时，C-K可转化成人参皂苷F2，其进而可转化成人参皂苷Rd，从而从C-K连续地产生Rd。
为了证实这，将以上两种酶与作为底物的PPD在单个反应管中反应。结果显示PPD成功地转化成Rg3(图5的上图)。此外，将两种酶与作为底物的C-K在单个反应管中反应。结果显示C-K也成功地转化成Rd(图5的下图)。
以上结果证明PPD和C-K可通过利用本发明的PgUGT74A1和PgUGT94B1的组合在单个反应管中在体外分别转化成Rg3和Rd。因此，PgUGT74A1和PgUGT94B1可用于Rg3和Rd的有效生产。
实验实施例5：MeJA(甲基茉莉酮酸酯)引起的PgUGT74A1和PgUGT94B1表达的增加
研究了本发明的PgUGT74A1和PgUGT94B1是否主要在已传统上用于医学目的人参的根中表达。并且，考查了本发明的两种类型的PgUGT连同三种不同的人参皂苷生物合成基因如PgDS(达玛烯二醇-II合酶)、PgPPDS(原人参二醇合酶)和PgPPTS(原人参三醇合酶)的器官特异性表达模式。15个月龄的人参的叶和根用于表达分析。
结果证明所有的以上人参皂苷生物合成基因都在人参的叶和根中，特别地在葡糖基化活化的根中表达(图6a)。
如图6a所示，所有的5个目标基因都在人参的叶和根中表达，但是它们的表达水平有差异。本发明的PgUGT74A1和PgUGT94B1的表达在根中高于在叶中。参与人参皂苷生物合成的PgDS和PgPPDS基因显示在人参叶中更高的表达水平，而PgPPTS显示在人参的根和叶中相似的表达水平。这些结果提示人参皂苷在人参的叶和根中合成，但是与叶相比，葡糖基化在根中发生的更活跃。
甲基茉莉酮酸酯(MeJA)已被报道提高须根(hairy root)培养物中人参皂苷生物合成基因的表达。知道MeJA的作用后，考查是否本发明的UDP-糖基转移酶的表达可由MeJA增加。
收集在LD条件下在生长室中生长的15个月龄的人参，并且将MeJA每天喷到它的叶上持续总共5天。为了分析人参皂苷生物合成基因的表达水平，将样品在第6天收集。本发明的两种类型的PgUGT在用MeJA处理的人参叶中显示更高的表达水平，这提示MeJA能促进本发明的UGT的表达(图6b)。除了以上的PgUGT，MeJA还提高PgDS和PgPPDS的表达。然而，PgPPTS的表达在本发明的条件下没有由MeJA诱导。
总体上，表达分析结果证明人参皂苷浓度可随着MeJA的添加而增加。从这一点上，在将MeJA喷到人参叶上之后测量4个主要人参皂苷的浓度。MeJA的处理分别增加两个PPD型人参皂苷，Rd和Rb1的浓度1.55和1.14倍(图6c)。此外，MeJA的处理分别增加两个PPT型人参皂苷，Rg1和Re的浓度2.61和1.45倍。
这些结果提示MeJA添加到人参植物上促进多种人参皂苷生物合成基因的表达和增加人参中人参皂苷的产生。该结果还提示由于MeJA提高PgUGT74A1和PgUGT94B1——其是本发明代表性的糖基转移酶——的表达，所以它可用于提高PgUGT74A1和PgUGT94B1的表达。
对本领域技术人员明显的是，可作出多种修改和变化而不背离本发明的范围和精神。因此，应当理解，以上实施方式不是限制性的，而在所有方面都是说明性的。发明的范围由所附权利要求而不是由在它们之前的描述来限定，因此落入权利要求的边界和范围内的所有变化和修改，或这样的边界和范围的等同物意欲被权利要求所包含。

Claims (17)

1.分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质，其由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示。
2.根据权利要求1所述的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质，其中所述蛋白质源自人参。
3.多核苷酸，其编码权利要求1所述的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质。
4.表达载体，其包括权利要求3所述的多核苷酸。
5.除植物之外的转化体，其中包括权利要求4所述的表达载体。
6.通过转化原人参二醇型人参皂苷制备糖基化人参皂苷的方法，其包括使所述原人参二醇型人参皂苷与SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质、导入有包括编码所述蛋白质的多核苷酸的表达载体的转化体、或所述转化体的培养物在尿苷二磷酸-糖的存在下反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述原人参二醇型人参皂苷是原人参二醇或化合物K(C-K)。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述糖基化人参皂苷是人参皂苷Rh2或F2。
9.根据权利要求6所述的方法，其中糖基化人参皂苷的所述制备包括原人参二醇转化成人参皂苷Rh2或化合物K转化成人参皂苷F2。
10.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括使所述原人参二醇型人参皂苷与SEQ IDNO.3的氨基酸序列表示的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质、导入有包括编码所述蛋白质的多核苷酸的载体的转化体、或所述转化体的培养物反应。
11.根据权利要求10所述的方法，其包括通过SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的所述分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质，将人参皂苷Rh2转化成人参皂苷Rg3或将人参皂苷F2转化成人参皂苷Rd。
12.将原人参二醇型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷的组合物，其包括SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质、导入有包括编码所述蛋白质的多核苷酸的载体的转化体、或所述转化体的培养物作为有效成分。
13.根据权利要求12所述的组合物，其进一步包括SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质、导入有包括编码所述蛋白质的多核苷酸的载体的转化体、或所述转化体的培养物。
14.在人参中提高权利要求1所述的尿苷二磷酸-糖基转移酶表达的方法，其包括用甲基茉莉酮酸酯(MeJA)处理人参。
15.甲基茉莉酮酸酯(MeJA)用于提高权利要求1所述尿苷二磷酸-糖基转移酶的表达的应用。
16.组合物，其包括权利要求1所述的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质。
17.权利要求1所述的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质通过转化原人参二醇型人参皂苷制备糖基化人参皂苷的应用。
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