CN104854236B9 - 源自人参的新型udp‑糖基转移酶和其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶，并且具体地涉及源自人参的新型UDP-糖基转移酶和其应用，通过利用UDP-糖基转移酶转化原人参二醇(PPD)型人参皂苷制备糖基化人参皂苷的方法，包括UDP-糖基转移酶、转化体或其培养物作为有效成分的将PPD型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷的组合物，利用MeJA(甲基茉莉酮酸酯)提高UDP-糖基转移酶表达的方法，以及包括MeJA作为有效成分的提高UDP-糖基转移酶表达的组合物。

Description

源自人参的新型UDP-糖基转移酶和其应用
技术领域
本发明涉及新型尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶，并且具体地涉及源 自人参的新型UDP-糖基转移酶和其应用、通过利用UDP-糖基转移酶转 化原人参二醇(PPD)型人参皂苷而制备糖基化人参皂苷的方法、将PPD型 人参皂苷转化成糖基化人参皂苷的组合物——其包括UDP-糖基转移酶、 转化体或其培养物作为有效成分、利用MeJA(甲基茉莉酮酸酯)提高UDP- 糖基转移酶表达的方法以及提高UDP-糖基转移酶表达的组合物——其 包括MeJA作为有效成分。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A meyer)是广泛用于增进健康的最流行的医用 草药之一。人参的根在传统医学中作为药草茶被消费，当前它已被包括 在许多种产品中，包括糖果、速溶茶和滋补饮料。人参皂苷——其是人 参中含有的糖基化三萜——对健康具有积极的作用。具体地，人参皂苷 已知具有多种药理学作用如免疫系统增强和身体功能恢复。而且，超过 40种不同的人参皂苷已在人参根中被鉴定。然而，由于每种人参皂苷的 大量生产是困难的，所以它依旧是作为研究某个人参皂苷的有效性，例 如，它对特定疾病的疗效的主要障碍。
人参皂苷是糖基化达玛烯型四环三萜类，并可基于它们的苷元结构 分成三个不同的组:原人参二醇(PPD)型人参皂苷、原人参三醇(PPT)型人 参皂苷和齐墩果酸型人参皂苷。这三组可基于通过化学结构中的糖苷键 与环的C-3、C-6和C-20位置连接的糖部分(苷元)的位置和数目被进一步 分类。PPD和PPT还具有不同的羟化模式。PPD在C-3、C-12和C-20 位置具有-OH基团，而PPT在C-3、C-6、C-12和C-20位置具有-OH基 团。PPD和PPT可用葡萄糖和/或其它类型的糖而糖基化，以转化成多种 人参皂苷。代表性的PPD型人参皂苷包括人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3、 化合物K(C-K)、人参皂苷F2和人参皂苷Rd。代表性的PPT型人参皂苷 包括人参皂苷F1、Rg1、Re、Rh1和Rg2。
人参皂苷的生物合成途径仅被部分鉴定。已知人参皂苷生物合成与 其它三萜类共享生物合成途径，直到氧化鲨烯通过IPP异构酶(IPI)、GPP 合酶(GPS)、FPP合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)和鲨烯环氧酶(SE)的作用由异 戊烯基二磷酸和DMADP(二甲基烯丙基二磷酸)的一系列缩合反应而合 成(Ajikumar等.Science,330,70-74.2010；Ro等.Nature,440,940-943. 2006；Sun等.BMC genomics,11,262,2010)。氧化鲨烯通过DS(达玛烯二 醇-II合酶)——其是三萜环化酶——被环化成达玛烯二醇-II。达玛烯二醇 -II在C-3和C-20位置具有羟基，并通过由p450酶、PPDS(原人参二醇 合酶)引起的C-12位置的羟化而转化成PPD。PPDS还可通过由另一种 p450酶、PPTS(原人参三醇合酶)引起的在C-6位置的羟化而转化成PPT。 PPD可通过在C-3和/或C-20位置的糖基化而转化成PPD型人参皂苷， 而PPT可通过在C-6和/或C-20位置的糖基化而转化成PPT型人参皂苷。 UDP(尿苷二磷酸)-糖基转移酶(UGT)被认为通过O-、β1,2-或β1,6-糖苷键 的形成而参与多种人参皂苷的合成途径。DS、PPDS和PPTS已被报道为 参与人参皂苷生物合成的酶，但是UGT是否参与人参皂苷的生物合成尚 未被鉴定。
UDP-糖基转移酶是催化糖部分从UDP-糖转移到宽范围的代谢产物 如激素和次级代谢产物的酶。一般而言，UGT在生物合成途径的最终步 骤中起作用以增加代谢产物的溶解度、稳定性、储存、生物活性或生物 利用度。如由植物中代谢产物的显著多样性所认识到的，植物基因组具 有数百种不同的UGT。例如，植物模型，拟南芥含有107种UGT，其基 于氨基酸序列属于14个不同的组(组A至组N)。不同的UGT对糖供体 和糖受体显示底物特异性。例如，UGT78D2将葡萄糖从UDP-葡萄糖转 移到黄酮醇(山柰酚、槲皮素)和花色素苷(花青定)的C-3位置以便分别产 生黄酮醇3-O-葡糖苷和花青定3-O-葡糖苷。似乎这样的糖基化对化合物 的体内稳定性和储存是必要的。另一方面，UGT89C1将鼠李糖 (rhanmnose)从UDP-鼠李糖转移到黄酮醇-3-O-葡糖苷的C-7位置以便 产生黄酮醇-3-O-葡糖苷-7-O-鼠李糖苷。同样，UGT89C1不利用UDP-葡 萄糖和花色素苷-3-O-葡糖苷作为底物。并且，它对UDP-糖和来自 UGT78D2的UDP-糖的受体具有不同的特异性。因此，存在研究针对不 同类型UGT的底物特异性的需要。
发明的公开内容
技术问题
本发明人已对要用于特定人参皂苷生物合成的具有底物特异性和区 域选择性的新型UDP-糖基转移酶的发展付诸了大量努力。结果，本发明 人鉴定了来自人参的称作PgUGT94B1的新型糖基转移酶，并且他们发现 PgUGT94B1具有通过特异地作用于PPD型人参皂苷、人参皂苷Rh2和 F2以催化在C-3位置的O-葡糖苷的β-1,2糖基化而将人参皂苷Rh2和F2 分别转化成人参皂苷Rg3和人参皂苷Rd的活性。由于具有该活性， PgUGT94B1可用于某种糖基化人参皂苷的生产。
问题的解决方案
本发明的一个目的是提供源自人参的新型尿苷二磷酸(UDP)-糖基转 移酶蛋白质。
本发明的另一个目的是提供编码UDP-糖基转移酶蛋白质的多核苷 酸、包括多核苷酸的表达载体和导入有表达载体的转化体。
本发明的又一个目的是提供制备UDP-糖基转移酶蛋白质的方法。
本发明的又一个目的是提供通过利用UDP-糖基转移酶蛋白质、转化 体或其培养物转化原人参二醇(PPD)型人参皂苷而制备糖基化人参皂苷 的方法。
本发明的又一个目的是提供将PPD型人参皂苷转化成糖基化人参皂 苷的组合物，其包括UDP-糖基转移酶蛋白质、转化体或其培养物作为有 效成分。
本发明的又一个目的是提供利用MeJA(甲基茉莉酮酸酯)提高UDP- 糖基转移酶表达的方法。
本发明的又一个目的是提供提高UDP-糖基转移酶表达的组合物，其 包括MeJA作为有效成分。
发明的有益效果
本发明的新型UDP-糖基转移酶具有底物特异性和区域选择性，因此 能够将糖部分特异地转移至PPD型人参皂苷的C-3位置。因此它用于特 定的人参皂苷如人参皂苷Rg3或Rd的大量生产。
附图简述
图1显示PPD型和PPT型人参皂苷的化学结构；
图2显示UDP-糖基转移酶，PgUGT74A1和PgUGT94B1中的每个 分别与UGT74和UGT94之间聚类(clustering)的示意图。UGT的氨基 酸序列利用MEGA5软件比对，并且比对展示为邻接树(neighbor-jointing tree)。除PgUGTs(人参，高丽参(Panax ginseng))、SiUGT94B1(芝麻 (Sesamumindicum L.))、BpUGT94B1(雏菊(Bellis perennis))、Cm1, 2RhaT(柚子(Citrus maxima))和CaUGT3(长春花(Catharanthus roseus)) 外的所有的UST源自拟南芥；
图3显示薄层色谱法(TLC)的结果，其展示UDP-糖基转移酶， PgUGT74A1具有将PPD转化成人参皂苷Rh2和将化合物K转化成人参 皂苷F2的活性。图3a显示本发明的PgUGT74A1和10种不同人参皂苷 的TLC分析结果(右图：用PgUGT74A1处理，左图：未处理)，并且将 10种不同人参皂苷中的每种在UDP-葡萄糖(UDP-Glc)的存在下与 PgUGT74A1反应。如图3a所示，PgUGT74A1只将10种人参皂苷中的 PPD和C-K分别转化成Rh2和F2，(三角形)。图3b显示来自PPD(左) 和C-K(右)与本发明的PgUGT74A1反应的产物的高效液相色谱(HLPC) 结果。分别从PPD和C-K转化的Rh2和F2被标记为三角形；
图4显示TLC和HPLC分析结果，其展示UDP-糖基转移酶， PgUGT94B1具有将人参皂苷Rh2和人参皂苷F2分别转化成人参皂苷 Rg3和Rd的活性。图4a显示本发明的PgUGT94B1和10种不同人参皂 苷的TLC分析结果(右图：用PgUGT94B1处理，左图：未处理)。将10 种不同人参皂苷中的每种在UDP-葡萄糖(UDP-Glc)的存在下与 PgUGT94B1反应。如图4a所示，PgUGT94B1只将10种人参皂苷中的 人参皂苷Rh2和人参皂苷F2分别转化成人参皂苷Rg3和人参皂苷Rd(三 角形)。图4b是来自人参皂苷Rh2(左)和人参皂苷F2(右)与本发明的 PgUGT94B1反应的产物的HLPC分析结果。分别从人参皂苷Rh2和人参 皂苷F2转化的人参皂苷Rg3和人参皂苷Rd被标记为三角形；
图5显示HPLC分析结果，其展示如果使用PgUGT74A1和 PgUGT94B1两者，则PPD和C-K被分别转化成人参皂苷Rg3和Rd。将 PPD(上图)或C-K(下图)在UDP-Glc的存在下与PgUGT74A1和 PgUGT94B1两者温育。然后将反应混合物通过HPLC分析。结果显示 PPD和C-K分别转化成Rg3和Rd。将由以上两种酶转化的Rg3和Rd标 记为黑色三角形；
图6显示PgUGT74A1和PgUGT94B1的相对表达水平。图6a显示 人参的叶和根中人参皂苷生物合成基因的表达水平，而图6b显示用 MeJA(甲基茉莉酮酸酯)处理之后叶中人参皂苷生物合成基因表达水平的 变化。将MeJA每天喷在叶上持续总共5天，并且在处理开始之后的第6 天，收集样品用于表达分析。图6c显示用MeJA处理之后人参皂苷表达 水平的变化。误差棒显示三次生物学重复的标准偏差(SD)；和
图7是涉及本发明的UDP-糖基转移酶的Rg3和Rd的人参皂苷生物 合成途径的示意图。
实施发明的最佳方式
作为一方面，本发明提供从人参提取的新型尿苷二磷酸(UDP)-糖基 转移酶(UGT)。
如本文所用，术语“UDP(尿苷二磷酸)-糖基转移酶”是催化单糖部分 从糖基供体转移至糖基受体分子的酶，并且具体地，它指利用UDP-糖作 为糖基供体的酶。在本发明中，UDP-糖基转移酶可与UGT可互换地使 用。认为UDP-糖基转移酶催化原人参二醇(PPD)和原人参三醇(PPT)的多 种糖基化，以产生宽范围的人参皂苷。然而，甚至具有UDP-糖基转移酶 活性的那些酶也取决于酶的类型而具有不同的底物特异性和区域选择 性。因此，需要确定酶是否是特异性地作用于人参皂苷(其为人参皂素 (ginseng saponin))的UDP-糖基转移酶。关于源自人参的UDP-糖基转 移酶尚未有报道，该源自人参的UDP-糖基转移酶特异地作用于PPD型 人参皂苷C-3位置的O-葡糖苷并转移糖部分以便从人参皂苷Rh2或F2 产生人参皂苷Rg3或Rd。UDP-糖基转移酶由本发明人首次鉴定。
为了本发明的目的，UDP-糖基转移酶可以是源自人参的UDP-糖基 转移酶，优选源自高丽参的UDP-糖基转移酶，更优选由SEQ ID NO.1 的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶，但不限于此。在本发明的一个实 施例中，将由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶确定 为PgUGT94B1。
UDP-糖基转移酶可指具备SEQ ID NO.1的氨基酸序列，但还具备与 SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有70％或更高、优选80％或更高、更优选 90％或更高、甚至更优选95％或更高、甚至还优选98％或更高和最优选 99％或更高序列同源性的氨基酸序列的蛋白质。然而，任何蛋白质可没有 限制地使用，只要它具有能基本上将糖转移至人参人参皂苷的UDP-糖基 转移酶活性。此外，如果具有以上序列同源性的蛋白质具有与UDP-糖基 转移酶基本上相同或相应的生物活性，则甚至具有部分氨基酸序列缺失、 修饰、取代或添加的蛋白质变体也可包括在本发明的范围内。
如本文所用，术语“同源性”意欲指示与野生型蛋白质的氨基酸序列 或编码其的核苷酸序列的相似性程度，并包括与本发明的氨基酸序列或 碱基序列具有以上百分比或更高同源性的序列。同源性比较可通过视力 或通过容易获得的序列比较程序进行。
优选，本发明的UDP-糖基转移酶指具有将PPD型人参皂苷转化成 糖基化人参皂苷的活性的蛋白质，但不限于此。
如本文所用，术语“PPD型人参皂苷”是达玛烷型皂素，并且它指在 其非糖组分(苷元)具有两个羟基(-OH)的人参皂苷，其实例包括PPD(原人 参二醇)、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Ra3、Rg3、Rh2、Rs1、C-O、C-Y、 C-Mc1、C-Mc、F2、C-K、绞股蓝皂苷XVII、绞股蓝皂苷LXXV和Rs2。 为了本发明的目的，PPD型人参皂苷可以没有限制地是任何人参皂苷， 只要它是可由本发明的UDP-糖基转移酶糖基化的人参皂苷。PPD型人参 皂苷优选是将被β1,2-糖基化的人参皂苷，更优选是将在C-3位置的O- 葡糖苷处糖基化的人参皂苷，还更优选人参皂苷Rh2或F2，但不限于此。 在本发明的一个实施例中，人参皂苷Rh2和人参皂苷F2用作可由本发明 的UDP-糖基转移酶，PgUGT94B1糖基化的代表性PPD型人参皂苷。人 参皂苷结构的示意图显示在图1中。
如本文所用，术语“糖基化人参皂苷”指具有与构成人参皂苷的非糖 组分(苷元)的羟基连接的单糖或更大的糖分子的人参皂苷，并被示例为人 参皂苷Rg3或Rd，但不限于此。为了本发明的目的，糖基化人参皂苷没 有限制地包括任何糖基化人参皂苷，只要它是由本发明的UDP-糖基转移 酶糖基化的人参皂苷。糖基化人参皂苷优选指具有β1,2-糖苷键的人参皂 苷，更优选在它的C-3位置具有二糖或更高的糖的糖的人参皂苷，但不 限于此。在本发明的一个实施例中，人参皂苷Rh2和F2由PgUGT94B1 的活性分别转化成糖基化人参皂苷，Rg3和Rd。
特别地，本发明的UDP-糖基转移酶具有将糖部分从糖供体，即UDP- 糖转移至糖受体，即3-O-糖基化人参皂苷以形成β1,2糖苷键，从而将3-O- 糖基化人参皂苷转化成糖基化人参皂苷的活性。
具体地，UDP-糖基转移酶的糖受体是3-O-糖基化人参皂苷，并且糖 受体优选是人参皂苷Rh2或F2，但不限于此。即，由于糖基转移酶具有 通过在人参皂苷Rh2的C-3位置形成O-葡糖苷的β1,2糖苷键的糖转移 活性，所以它能将人参皂苷Rh2转化成人参皂苷Rg3。此外，由于糖基 转移酶具有通过在人参皂苷F2的C-3位置形成O-葡糖苷的β1,2糖苷键 的糖转移活性，所以它能将人参皂苷F2转化成Rd。
UDP-糖基转移酶作用于C-3位置的O-葡糖苷以催化糖基化，但是不 催化在C-K或人参皂苷F2的C-20位置的O-葡糖苷的葡糖基化。由于本 发明的UDP-糖基转移酶具有针对PPD型人参皂苷，特别地，在人参皂 苷Rh2或F2的C-3位置的O-葡糖苷的底物特异性和区域选择性，所以 它可用于将特定人参皂苷，优选人参皂苷Rh2转化成人参皂苷Rg3，或 将人参皂苷F2转化成人参皂苷Rd。
在本发明的一个实施例中，新型UDP-糖基转移酶，PgUGT94B1是 从人参新分离的(实施例1)，并且序列分析的结果显示糖基转移酶聚类在 UGT94家族中(实验实施例1和图2)。此外，糖基转移酶区域选择性地作 用于PPD型人参皂苷并将一个葡萄糖转移至C-3位置的O-葡糖苷，从而 产生糖基化人参皂苷(实验实施例3和4；和图4和5)。PgUGT94B1蛋白 质的酶活性显示在图7中。
作为另一方面，本发明提供编码UDP-糖基转移酶的多核苷酸、包括 多核苷酸的表达载体和其中包括表达载体的转化体。
UDP-糖基转移酶与上面所描述的相同。
编码UDP-糖基转移酶的多核苷酸可以优选是SEQ ID NO.2的核苷 酸序列表示的多核苷酸，并且也没有限制地包括与SEQ ID NO.2的核苷 酸序列具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、还更优 选95％或更高和最优选98％或更高同源性的序列同源性的任何核苷酸序 列，只要它能基本上编码具有UDP-糖基转移酶活性的蛋白质。
包括本发明的多核苷酸的表达载体是能在合适的宿主细胞中表达靶 蛋白质的表达载体，并指DNA构建体，其包括可操作地连接以表达核酸 插入物的必要调控元件。靶蛋白质可通过将制备的重组载体转化或转染 进宿主细胞而获得。
包括本发明中提供的多核苷酸的表达载体包括，但不限于，源自大 肠杆菌(E.coli)的质粒(pYG601BR322、pBR32、pUC118和pUC119)、 源自枯草杆菌(Bacillus subtilis)的质粒(pUB110和pTP5)、源自酵母的 质粒(YEp13、YEp24和YCp50)和土壤杆菌属(Agrobacterium)-介导的 转化中使用的Ti-质粒。噬菌体DNA的具体实例包括λ-噬菌体(Charon4A、 Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11和λZAP)。进一步，可使 用动物病毒如反转录病毒、腺病毒或牛痘病毒，昆虫病毒如杆状病毒、 双链植物病毒(例如，CaMV)、单链病毒或源于双生病毒的病毒载体。
而且，作为本发明的载体，可使用转录激活因子，如B42-连接的融 合质粒(例如，pJG4-5)。为了促进本发明中获得的靶蛋白质的纯化，需要 时质粒载体可进一步包括其它序列。融合质粒可包括标签如GST、GFP、 His-标签Myc-标签等，但是本发明的融合质粒不限于这些实例。在本发 明的一个实施例中，pGEX4T-1——其是GST基因融合的载体——用于包 括编码UDP-糖基转移酶的多核苷酸的表达载体的构建。
此外，包括融合序列的载体表达的融合蛋白质可通过亲和色谱来纯 化。例如，如果谷胱甘肽-S-转移酶将与其它序列融合，则可使用作为该 酶底物的谷胱甘肽。如果六聚组氨酸用作靶蛋白质标签，则靶蛋白质可 通过利用Ni-NTA His-结合树脂柱(Novagen,USA)被容易地纯化。
为了将本发明的多核苷酸插入载体，纯化的DNA可利用合适的限制 酶切割，并插入合适的载体DNA的限制位点或克隆位点。
编码本发明的UDP-糖基转移酶的多核苷酸可以可操作地连接于载 体。除了启动子和本发明的核酸，本发明的载体可进一步包括顺式元件 如增强子、剪接信号、多聚腺苷酸添加信号、选择标记、核糖体结合序 列(SD序列)。作为选择标记的实例，可使用氯霉素抗性基因、氨苄西林 抗性基因、二氢叶酸还原酶、新霉素抗性基因等，但是将可操作地连接 的另外元件的类型不限于这些实例。
如本文所用，术语“转化”指将DNA导入宿主细胞以便DNA可作为 染色体外元件或通过染色体整合被复制。即，转化指通过将外源DNA导 入细胞引起的基因的合成改变。
本发明的转化可通过任何转化方法进行，并可遵循本领域已知的通 常方法而容易地进行。一般而言，转化方法的实例包括CaCl2沉淀、 Hanahan方法——其是通过利用DMSO(二甲基亚砜)作为还原物质的改进 的CaCl2方法、电穿孔、磷酸钙沉淀、原生质体融合、利用碳化硅纤维 的振荡、土壤杆菌属-介导的转化、PEG-介导的转化、硫酸葡聚糖-介导 的转化、阳离子脂质体-介导的转化和脱水/抑制-介导的转化。包括编码 本发明的UDP-糖基转移酶的多核苷酸的载体的转化方法不限于这些实 例，并且可没有限制地使用本领域通常使用的转化或转染方法。
在本发明中，宿主细胞的种类没有特别地限制，只要它能表达本发 明的多核苷酸。将用于本发明的宿主细胞的具体实例包括属于埃希氏菌 属(Escherichia)的细菌如大肠杆菌；属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细 菌如枯草杆菌；属于假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌如恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)；酵母如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；动物细胞、植物细胞和昆 虫细胞。将用于本发明的大肠杆菌菌株的具体实例包括CL41(DE3)、BL21 和HB101，并且枯草杆菌菌株的具体实例包括WB700和LKS87。导入 有包括本发明的多核苷酸的表达载体的植物转化体没有特别地限制，只 要它能表达本发明的糖基转移酶。其实例包括烟草、拟南芥、马铃薯、 人参、芝麻、枸橼、雏菊属(Bellis)等，但不限于此。
任何启动子可用作本发明的启动子，只要它能在宿主细胞中驱动本 发明的核酸表达。例如，可使用源自大肠杆菌或噬菌体的启动子如trp启 动子、lac启动子、PL启动子和PR启动子；源自大肠杆菌感染噬菌体的 启动子如T7启动子、CaMV35S、MAS或组蛋白质启动子。还可使用合 成修饰的启动子如tac启动子。
通过以上方法转染有包括编码本发明的UDP-糖基转移酶蛋白质的 多核苷酸的表达载体的转化体具有通过在PPD型人参皂苷C-3位置形成 β1,2-糖苷键而转移葡萄糖的生物活性。优选，转化体指具有将人参皂苷 Rh2转化成人参皂苷Rg3，或将人参皂苷F2转化成人参皂苷Rd能力的 转化体，但不限于此。
作为另一方面，本发明提供制备UDP-糖基转移酶蛋白质的方法。
UDP-糖基转移酶与上面所描述的相同。
优选，制备方法包括(a)培养导入有包括编码UDP-糖基转移酶的多核 苷酸的载体的转化体；(b)从培养的转化体产生UDP-糖基转移酶；和(c) 回收产生的UDP-糖基转移酶。
转化体的培养可通过遵循本领域使用的通常方法来进行。用于转化 体的生长培养基中包括的碳源可根据转化体的类型由本领域技术人员选 择。可采用合适的培养条件以便调节培养时间和量。
作为另一方面，本发明提供通过利用UDP-糖基转移酶、转化体或其 培养物而转化PPD(原人参二醇)型人参皂苷来制备糖基化人参皂苷的方 法。
UDP-糖基转移酶、转化体、PPD型人参皂苷和糖基化人参皂苷与上 面所描述的相同。
更具体地，该方法包括在UDP-糖的存在下使PPD型人参皂苷与SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶蛋白质、导入有包括编码 该蛋白质的多核苷酸的表达载体的转化体或转化体的培养物反应的步 骤。
如本文所用，术语“转化体的培养物”指根据已知的培养微生物的方 法通过培养转化体而获得的产物。培养物包括本发明的SEQ ID NO.1的 UDP-糖基转移酶，因此它能将PPD型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷， 例如，将人参皂苷Rh2转化成Rg3，或将人参皂苷F2转化成Rd。
作为在本发明中用作起始材料的PPD型人参皂苷，可使用分离和纯 化的人参皂苷、或包括在人参粉末或提取物中的人参皂苷。即，包括人 参皂苷的人参粉末或提取物可直接用作起始材料来进行本发明的方法。 用于本发明的人参包括已知的多种类型的人参，如高丽参、西洋参(P. quiquefolius)、三七参(P.notoginseng)、竹节参(P.japonicus)、三叶参 (P.trifolium)、假人参(P.pseudoginseng)和越南人参(P.vietnamensis)， 但不限于此。
优选，转化可通过由本发明的UDP-糖基转移酶、导入有包括编码 UDP-糖基转移酶的多核苷酸的表达载体的转化体、或转化体的培养物引 起的PPD型人参皂苷生物转化成糖基化人参皂苷而发生，并且它可通过 将糖转移至在人参皂苷的C-3位置的O-葡糖苷而实现。本发明的SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的蛋白质能将在C-3位置具有O-葡糖苷的PPD 型人参皂苷，优选人参皂苷Rh2或Rd，转化成糖基化人参皂苷。本发明 的SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的蛋白质进行的生物转化包括将人参 皂苷Rh2转化成Rg3，和将人参皂苷F2转化成Rd。因此，本发明的方 法可用于需要糖基化人参皂苷，特别是人参皂苷Rg3或Rd的领域。
制备糖基化人参皂苷的方法可进一步包括在使PPD型人参皂苷与 SEQ ID NO.1的UDP-糖基转移酶、导入有包括编码UDP-糖基转移酶的 多核苷酸的载体的转化体、或转化体的培养物反应的步骤中使PPD型人 参皂苷与SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶蛋白质、 导入有包括编码该蛋白质的多核苷酸的载体的转化体、或转化体的培养 物反应的步骤。
如本文所用，术语“SEQ ID NO.3的氨基酸序列确定的UDP-糖基转 移酶”指能通过形成O-糖苷键将糖部分从UDP-糖转移至在C-3位置具有 羟基的人参皂苷的酶。SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移 酶具有将糖部分从糖供体如UDP-糖转移至糖受体如在C-3位置具有羟基 的人参皂苷以引起O-糖苷键形成的能力。因此，它将在C-3位置具有羟 基的人参皂苷转化成具有3-O-葡糖苷的人参皂苷。SEQ ID NO.3的氨基 酸序列表示的UDP-糖基转移酶是源自人参的糖基转移酶，其由本发明人 首次分离，并在本发明中可以与PgUGT74A1可互换地使用。
SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶的糖受体是在 人参皂苷，优选PPD或C-K的C-3位置的羟基，但不限于此。因此，由 于糖基转移酶具有通过与在PPD的C-3位置的羟基形成O-糖苷键而转移 糖部分的活性，所以它能将PPD转化成人参皂苷Rh2。同样，由于糖基 转移酶具有通过与在C-K的C-3位置的羟基形成O-糖苷键而转移糖部分 的活性，所以它能将C-K转化成人参皂苷F2。
因此，如果使用特异性地作用于在PPD型人参皂苷C-3位置的O- 葡糖苷的UDP-糖基转移酶和SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP- 糖基转移酶，则PPD可被转化成人参皂苷Rh2，其进而可被转化成Rg3。 通过该过程，PPD可被转化成人参皂苷Rg3。如果C-K用作起始材料， 则C-K通过本发明的糖基转移酶被转化成人参皂苷F2，其进而被转化成 人参皂苷Rd。通过该过程，C-K被转化成人参皂苷Rd。在本发明的一个 实施例中，PgUGT74A1和PgUGT94B1被用于将PPD转化成人参皂苷 Rg3和将C-K转化成人参皂苷Rd。因此，证实了以上两种酶均可用于以 高产率生产人参皂苷Rg3和Rd(图5)。
作为另一方面，本发明提供将PPD(原人参二醇)型人参皂苷转化成糖 基化人参皂苷的组合物，其包括SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的UDP- 糖基转移酶、转化体或其培养物作为有效成分。
UDP-糖基转移酶、转化体和其培养物；以及PPD型人参皂苷转化成 糖基化人参皂苷与上面所描述的相同。组合物可进一步包括由SEQ ID NO.3的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶、转染有包括编码UDP-糖基 转移酶的多核苷酸的载体的转化体、或转化体的培养物。
本发明的SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的UDP-糖基转移酶将一 个糖部分选择性地转移至在PPD型人参皂苷C-3位置的O-葡糖苷，因此 它可用于生产在C-3位置糖基化的人参皂苷如人参皂苷Rg3或Rd。
作为另一方面，本发明提供提高人参植物中UDP-糖基转移酶表达的 方法，其包括用称作MeJA(甲基茉莉酮酸酯)的化合物处理人参。
UDP-糖基转移酶与上面所描述的相同。
如本文所用，术语“MeJA(甲基茉莉酮酸酯)”是参与植物防御和多种 生长途径如根生长的挥发性有机化合物。MeJA可以与甲基(1R,2R)-3-氧 代-2-(2Z)-2-戊烯基-环戊烷乙酸酯可互换地使用，并具有以下化学结构。
化学图1
为了本发明的目的，MeJA指能提高PgUGT94B1表达的化合物。当 将MeJA喷到人参叶上时，PgUGT94B1表达提高。因此，由于通过利用 MeJA在人参中增加本发明的PgUGT94B1的表达，所以MeJA在人参皂 苷的生产中是有用的。在本发明的一个实施例中，发现PgUGT94B1表达 可通过用MeJA处理而显著增加(图6B)。
作为另一方面，本发明提供提高UDP-糖基转移酶表达的组合物，其 包括MeJA作为有效成分。
MeJA和UDP-糖基转移酶与上面所描述的相同。
此外，MeJA能增加本发明的PgUGT94B1的表达，因此本发明的包 括MeJA作为有效成分的组合物可用于提高PgUGT94B1表达，并优选应 用于人参以便增加人参中PgUGT94B1表达。
发明的方式
本发明通过提供下面的实施例而被更详细地描述。然而这些实施例 只意欲说明，但决不限制要求保护的发明。
实施例1：人参UDP-糖基转移酶(PgUGT)的克隆和纯化
利用下面的表1中列出的引物组(SEQ ID NOs.5和6、SEQ ID NOs.7 和8)将从人参EST文库鉴定的两种类型的UGT基因克隆进pGEX4T-1 载体，并被分别命名为PgUGT74A1和PgUGT94B1。
表1
将转染有重组体蛋白质，PgUGT74A1和PgUGT94B1的大肠杆菌细 胞(大肠杆菌BL21-密码子加(DE3)-RIL)在补充有50μg/Ml氨苄西林和34 μg/Ml氯霉素的LB培养基中培养。然后将蛋白质从细胞培养物纯化。
靶基因的表达通过利用0.1mM IPTG诱导。然后细胞沉淀物通过在 4℃以2,500g离心细胞培养物15分钟而分离。将收集的细胞沉淀物重悬 在10mM PBS缓冲液(pH 7.0)中，并将细胞通过超声处理(Vibra-cell, Sonics&Matreials,CT)而破裂。将未破裂细胞和细胞碎片通过在4℃以 10,000g离心样品15分钟而去除，并将所得的上清液通过具有0.45μm孔 径的注射器式滤器而进一步纯化。重组蛋白质通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和 色谱(GE Healthcare)从无细胞提取物纯化。
实施例2：体外酶测定
糖基转移酶测定在含有纯化的PgUGT74A1或PgUGT94B1(30μg)、 人参皂苷化合物(5mM)和UDP-葡萄糖(50mM)的反应缓冲液(10mM PBS缓冲液，pH 7)中进行。为了该测定，使用10种不同类型的人参皂苷， 包括PPD(原人参二醇)、PPT(原人参三醇)、化合物K(C-K)、人参皂苷 Rg3、Rh2、F2、Rd、Rg2、Rh1和F1，并且人参皂苷的结构显示在图1 中。
将反应混合物在35℃温育12小时，然后将产物通过薄层色谱(TLC) 或高效液相色谱(HPLC)分析。
TLC分析利用流动相(丙酮:甲醇:DDW＝65:35:10体积/体积)和60F254 硅胶板(Merck,Germany)进行。TLC板上分离的产物通过用10％(体积/ 体积)硫酸(H2SO4)喷板和将它在110℃加热5分钟来检测。
HPLC分析利用ODS(2)C18柱(Phenomenex,USA)进行。水和乙腈 梯度应用时间；以及组分比如下：1ml每分钟的流速0分钟，68％水和 32％乙腈；8分钟，35％水和65％乙腈；12分钟，0％水和100％乙腈； 20分钟，0％水和100％乙腈；20.1分钟，68％水和32％乙腈；和28分 钟，68％水和32％乙腈。
人参皂苷通过利用UV-检测器(Younglin,Korea)在203nm的波长来检 测。
实施例3：RNA分离和实时PCR分析
利用光谱植物总RNA试剂盒(Sigma-Aldrich)从15个月龄的人参的叶 或根分离总RNA。将200μM甲基茉莉酮酸酯(MeJA)每天喷到人参叶上 总共持续5天，在第六天收集样品。将1μg总RNA用于cDNA合成。
不同基因的表达水平通过定量RT-PCR利用下面表2中列出的引物组 来检测，并将结果归一化到微管蛋白的表达水平。
表2
实验实施例1：UDP-糖基转移酶PgUGT74A1和PgUGT94B1的序列 分析
为了研究参与人参皂苷生物合成的UDP-糖基转移酶(UGT)的作用， 首先进行EST数据库分析以通过实施例1中描述的方法从高丽参克隆 UGT基因。它们之中，研究命名为PgUGT74A1和PgUGT94B1的两种 类型的UGT以测定它们的作用。
序列分析结果显示它们不能由与源自其它植物的UGT——包括源自 拟南芥(A.thaliana)的UGT——的序列同源性具体说明(图2)。更具体地， PgUGT74A1与拟南芥UGT74家族形成聚簇。拟南芥UGT74家族由7种 类型的UGT组成，其可分成5个亚族(UGT74B、C、D、E1和F)。虽然 PgUGT74A1与拟南芥UGT74家族形成聚簇，但是它不属于5个亚族中 的任何一个，从而指示本发明的PgUGT74A1落入与拟南芥其它亚族不同 的新型UGT74亚族。拟南芥UGT74家族之中，UGT74B1通过形成糖基 硫酯键使苯乙酰硫代羟肟酸酯(phenylacetothiohydroximate)——其是硫 代葡萄糖酸酯(glucosinolate)的前体——糖基化，而UGT74E2通过形 成糖基酯键使吲哚丁酸酯糖基化。同样，UGT74F1和UGT4F2也通过形 成糖基酯键分别使水杨酸酯(salicyclate)和邻氨基苯甲酸酯糖基化。另 一方面，UGT74家族成员还可形成除糖基酯键外的O-糖苷键。已知 UGT74F1通过形成2-O-糖苷键使水杨酸酯糖基化。此外，UGT74F1和 UGT74F2通过形成O-糖苷键使水杨酸酯和邻氨基苯甲酸酯糖基化。
因此，即使属于拟南芥UGT74家族的那些UGT也需要被研究以鉴 定它们的底物类型和它们针对糖基化形成的键。
此外，分析结果证明PgUGT94B1不与拟南芥UGT94家族形成聚簇， 但是与BpUGT94B1(雏菊)、SiUGT94D1(芝麻)、CaUGT3(长春花)和 Cm1,2RhaT(柚子)的UGT94亚族形成聚簇。它们之中，BpUGT94B1形成 β1,6键以将葡萄糖醛酸基(glucuronosyl)部分添加到花青定的3-O-葡糖 苷，而SiUGT94D1形成β1,6键以将葡萄糖添加到芝麻素酚(sesaminol) 的2-O-葡糖苷。CaUGT3形成β1,6键以将葡萄糖分子转移至槲皮素-3-O- 葡糖苷，而Cm1,2RhaT形成β1,6键以将鼠李糖添加到黄酮7-O-葡糖苷。
总体上，结果证明属于PgUGT94B1的所有UGT94家族成员催化糖 基化，其将第二糖分子添加到O-糖基化受体，而不论糖供体和受体的类 型。
这些结果指示PgUGT74A1可形成O-糖苷键或糖基酯键以催化人参 皂苷的糖基化，而PgUGT94B1形成β-糖苷键以将第二糖添加到糖基化人 参皂苷，从而催化糖基化。如图1的人参皂苷结构所指示的，PPD型人 参皂苷可在它的C-3或C-20位置，或在这两个位置经由O-键而被糖基化， 而PPT型人参皂苷可在它的C-6或C-20位置，或在这两个位置经由O- 键而被糖基化。此外，具有一个或多个糖基团的人参皂苷——包括人参 皂苷Rb1、化合物Y和化合物O——可经由β-1,6键被进一步糖基化。
基于这些序列分析结果，PgUGT74A1和PgUGT94B1的实际活性通 过下面的实施例来测定。
实验实施例2：PgUGT74A1引起的PPD和C-K转化成人参皂苷Rh2 和人参皂苷F2
基于实验实施例1的序列分析结果，PgUGT74A1和PgUGT94B1的 底物特异性和区域选择性如下测定。
首先，将实施例1的重组体PgUGT，PgUGT74A1，与10种不同类 型的人参皂苷(PPD、C-K、Rh2、F2、Rg3、Rd、Rg2、Rh1、F1和PPT) 在UDP-葡萄糖的存在下温育，并将重组体PgUGT转化的产物通过TLC 分析。结果显示在图3a中。
结果显示PgUGT74A1不转化除PPD和C-K以外的人参皂苷，这指 示PgUGT74A1具有高受体特异性(图3a)。以上结果由在TLC板上的迁 移点证实。结果，PgUGT74A1分别将PPD和C-K转化成人参皂苷Rh2 和人参皂苷F2。
该结果进一步通过高效液相色谱(HPLC)证实，如图3b所示。来自 HPLC的结果显示PgUGT74A1分别将PPD和C-K转化成人参皂苷Rh2 和F2，如在TLC分析结果中那样。与PgUGT74A1不同，实施例1的 PgUGT94B1没有将PPD和C-K转化成其它人参皂苷(图3b)。
如TLC和HPLC的结果所示，PgUGT74A1只将PPD型人参皂苷如 PPD和C-K分别转化成人参皂苷Rh2和人参皂苷F2，这证明示它的底物 特异性。此外，当将被糖基化的碳数被确定时，存在经由O-键在PPD型 人参皂苷C-3位置的特异性糖基化，而其它位置如在PPD的C-12和C-20 位置的羟基(-OH)和在PPT的C-3、C-6、C-12和C-20位置的羟基(-OH) 不被糖基化，这指示PgUGT74A1对PPD型人参皂苷C-3位置具有区域 选择性。该结果提示PgUGT74A1形成O-糖苷键以引起糖基化。
总体上，以上结果证明PgUGT74A1特异地作用于PPD型人参皂苷， 并具有针对PPD和C-K的强底物特异性和针对在C-3位置糖基化的区域 选择性。
实验实施例3：PgUGT94B1引起的人参皂苷Rh2和F2转化成人参 皂苷Rg3和Rd
还考查了实施例1中克隆的本发明的PgUGT94B1是否与 PgUGT74A1一样具有底物特异性和区域选择性。
首先，将实施例1的重组PgUGT，PgUGT94B1，与10种不同类型 的人参皂苷(PPD、C-K、Rh2、F2、Rg3、Rd、Rg2、Rh1、F1和PPT) 在UDP-葡萄糖的存在下温育，然后将重组PgUGT转化的产物通过TLC 分析。结果显示在图4a中。
结果，本发明的PgUGT94B1不转化除人参皂苷Rh2和F2以外的人 参皂苷，这指示PgUGT94B1具有高受体特异性(图4a)。该结果通过在 TLC板上的迁移点证实。结果，PgUGT94B1分别将人参皂苷Rh2和人参 皂苷F2转化成人参皂苷Rg3和人参皂苷Rd。
该结果进一步通过高效液相色谱法(HPLC)证实，如图4b所示。HPLC 结果证明PgUGT94B1分别将人参皂苷Rh2和F2转化成人参皂苷Rg3和 Rd，如在TLC分析结果中那样。另一方面，PgUGT74A1不转化人参皂 苷Rh2和F2，如在实验实施例2中的结果中那样(图4b)。
根据这些结果，PgUGT94B1通过形成β-1,2键使在Rh2和F2的C-3 位置的O-葡糖苷特异地糖基化，而不使在C-K和F2的C-20位置的O- 葡糖苷特异地糖基化。以上结果提示本发明的PgUGT94B1具有针对Rh2 和F2的底物特异性和针对在C-3位置的O-葡糖苷的区域选择性。
实验实施例4：PgUGT74A1和PgUGT94B1引起的PPD和C-K转化 成人参皂苷Rg3和Rd
基于实验实施例2和3的结果，认为当两种类型的PgUGTs同时使 用时，人参PPD可转化成人参皂苷Rh2，其进而可转化成Rg3，从而从 PPD连续地产生Rg3。同样，当使用两种酶时，C-K可转化成人参皂苷 F2，其进而可转化成人参皂苷Rd，从而从C-K连续地产生Rd。
为了证实这，将以上两种酶与作为底物的PPD在单个反应管中反应。 结果显示PPD成功地转化成Rg3(图5的上图)。此外，将两种酶与作为 底物的C-K在单个反应管中反应。结果显示C-K也成功地转化成Rd(图 5的下图)。
以上结果证明PPD和C-K可通过利用本发明的PgUGT74A1和 PgUGT94B1的组合在单个反应管中在体外分别转化成Rg3和Rd。因此， PgUGT74A1和PgUGT94B1可用于Rg3和Rd的有效生产。
实验实施例5：MeJA(甲基茉莉酮酸酯)引起的PgUGT74A1和 PgUGT94B1表达的增加
研究了本发明的PgUGT74A1和PgUGT94B1是否主要在已传统上用 于医学目的人参的根中表达。并且，考查了本发明的两种类型的PgUGT 连同三种不同的人参皂苷生物合成基因如PgDS(达玛烯二醇-II合酶)、 PgPPDS(原人参二醇合酶)和PgPPTS(原人参三醇合酶)的器官特异性表达 模式。15个月龄的人参的叶和根用于表达分析。
结果证明所有的以上人参皂苷生物合成基因都在人参的叶和根中， 特别地在葡糖基化活化的根中表达(图6a)。
如图6a所示，所有的5个目标基因都在人参的叶和根中表达，但是 它们的表达水平有差异。本发明的PgUGT74A1和PgUGT94B1的表达在 根中高于在叶中。参与人参皂苷生物合成的PgDS和PgPPDS基因显示在 人参叶中更高的表达水平，而PgPPTS显示在人参的根和叶中相似的表达 水平。这些结果提示人参皂苷在人参的叶和根中合成，但是与叶相比， 葡糖基化在根中发生的更活跃。
甲基茉莉酮酸酯(MeJA)已被报道提高须根(hairy root)培养物中人 参皂苷生物合成基因的表达。知道MeJA的作用后，考查是否本发明的 UDP-糖基转移酶的表达可由MeJA增加。
收集在LD条件下在生长室中生长的15个月龄的人参，并且将MeJA 每天喷到它的叶上持续总共5天。为了分析人参皂苷生物合成基因的表 达水平，将样品在第6天收集。本发明的两种类型的PgUGT在用MeJA 处理的人参叶中显示更高的表达水平，这提示MeJA能促进本发明的UGT 的表达(图6b)。除了以上的PgUGT，MeJA还提高PgDS和PgPPDS的表 达。然而，PgPPTS的表达在本发明的条件下没有由MeJA诱导。
总体上，表达分析结果证明人参皂苷浓度可随着MeJA的添加而增 加。从这一点上，在将MeJA喷到人参叶上之后测量4个主要人参皂苷 的浓度。MeJA的处理分别增加两个PPD型人参皂苷，Rd和Rb1的浓度 1.55和1.14倍(图6c)。此外，MeJA的处理分别增加两个PPT型人参皂 苷，Rg1和Re的浓度2.61和1.45倍。
这些结果提示MeJA添加到人参植物上促进多种人参皂苷生物合成 基因的表达和增加人参中人参皂苷的产生。该结果还提示由于MeJA提 高PgUGT74A1和PgUGT94B1——其是本发明代表性的糖基转移酶—— 的表达，所以它可用于提高PgUGT74A1和PgUGT94B1的表达。
明显的是，基于本发明以上描述，本领域技术人员可理解本发明实 施方式的多种替代可在实施本发明中利用，而不背离本发明的精神和范 围。从这一点上，以上描述的实施例仅意欲在所有方面进行说明，但决 不限制要求保护的发明。发明的范围由以下权利要求的含义和范围而不 是由发明的详细描述来限定，并且源自与本发明等同原理的所有变化或 修改的实施方式包括在本发明的范围内。

Claims (14)

1.分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质，其由SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示。
2.根据权利要求1所述的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质，其中所述蛋白质 源自人参。
3.多核苷酸，其编码权利要求1所述的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质。
4.表达载体，其包括权利要求3所述的多核苷酸。
5.除植物之外的转化体，其中包括权利要求4所述的表达载体。
6.通过转化原人参二醇型人参皂苷制备糖基化人参皂苷的方法，其包括使所述原 人参二醇型人参皂苷与SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的分离的尿苷二磷酸-糖基转 移酶蛋白质、导入有包括编码所述蛋白质的多核苷酸的表达载体的转化体、或所述转 化体的培养物在尿苷二磷酸-糖的存在下反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述原人参二醇型人参皂苷是人参皂苷Rh2 或F2。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述糖基化人参皂苷是人参皂苷Rg3或Rd。
9.根据权利要求6所述的方法，其中糖基化人参皂苷的所述制备包括人参皂苷Rh2 转化成人参皂苷Rg3或人参皂苷F2转化成人参皂苷Rd。
10.将原人参二醇型人参皂苷转化成糖基化人参皂苷的组合物，其包括SEQ ID NO. 1的氨基酸序列表示的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质、导入有包括编码所述蛋 白质的多核苷酸的载体的转化体、或所述转化体的培养物作为有效成分。
11.在人参中提高权利要求1所述的尿苷二磷酸-糖基转移酶表达的方法，其包括 用甲基茉莉酮酸酯(MeJA)处理人参。
12.甲基茉莉酮酸酯(MeJA)用于提高权利要求1所述尿苷二磷酸-糖基转移酶的表 达的应用。
13.组合物，其包括权利要求1所述的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质。
14.权利要求1所述的分离的尿苷二磷酸-糖基转移酶蛋白质通过转化原人参二醇 型人参皂苷制备糖基化人参皂苷的应用。
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