CN115992108A

CN115992108A - 热带盐水孢菌cnb-440重组糖基转移酶及其在新型人参皂苷转化中的应用

Info

Publication number: CN115992108A
Application number: CN202210974371.4A
Authority: CN
Inventors: 王丹丹; 王洪涛; 卢波; 申京宇; 柯海菁
Original assignee: Yantai University
Current assignee: Yantai University
Priority date: 2022-08-15
Filing date: 2022-08-15
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明公开了一种糖基转移酶，用于催化人参皂苷Rh2糖基化合成新型人参皂苷Rh2—12‑O‑葡萄糖基人参皂苷。通过将来自热带盐水孢菌CNB‑440的糖基转移酶基因在大肠杆菌中异源表达，获得重组糖基转移酶SGT。再利用所述重组糖基转移酶对人参皂苷Rh2进行糖基化，制得一种新型人参皂苷Rh2—12‑O‑葡萄糖基人参皂苷。同时，新型人参皂苷对AGS胃癌细胞系、Hela宫颈癌细胞系、U87MG胶质瘤细胞系和B16F10黑色素瘤细胞系具有较强的抗癌活性。本发明利用生物转化法制备新型人参皂苷，具有转化率高、高选择性、反应条件温和且副产物少等优点，对上述癌细胞表现出良好抑制效果，可以应用于生物医药领域。

Description

热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶及其在新型人参皂苷转化中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶及其在新型人参皂苷转化中的应用。

背景技术

人参(Panaxginseng Meyer)作为一种最重要的传统药物和膳食补充剂，在亚洲使用了数千年，是世界上著名的滋补传统草药。人参皂苷是人参中重要的药理活性成分。从人参属植物中鉴定出159多种天然人参皂苷。根据糖苷配基的结构分为原人参二醇组(PPD)和原人参三醇组(PPT)。PPD和PPT可以通过葡萄糖和其他糖基进一步转化为各种人参皂苷。据报道，不同的人参皂苷具有不同的药理作用。人参皂苷具有多种生物活性，包括增强免疫力、抗癌、抗炎、抗氧化和抗衰老作用。此外，人参皂苷Rh2是红参中具有达马烷骨架的一种特征成分，具有多种潜在的生物活性，尤其在抗癌作用中发挥着重要作用。自2006年，人参皂苷Rh2被批准为中国的食品补充剂。此外，与人参皂苷的物理和化学转化方法相比，酶法生物转化具有更高的特异性和选择性，且无环境污染。因此，基于其高选择性和高转化率，生物转化被认为是最有前景的方法。

糖基转移酶(Glycosyltransferases，GTs)是自然界中普遍存在的酶，广泛用于低聚糖、多糖、糖缀合物和新型衍生物的合成。UDP葡萄糖-甾醇葡糖基转移酶(SGT)是一种典型的参与各种生物体甾醇糖苷生成的酶。GTs是一种典型的将活性糖供体转移到各种特定受体分子上的酶。同时它在植物的化合物转化、信号识别和次生代谢过程中起着重要作用，并可改善天然产物的水溶性和吸收能力。甾醇葡萄糖基转移酶(SGT)将糖基部分转移到甾醇和相关化合物中，以在各种生物和药理学活动中产生糖基衍生物和甾基糖苷。SGT属于糖基转移酶家族1，该家族目前描述了90多种GTs。相关的糖基转移酶是催化人参皂苷生物合成的最后重要步骤的关键酶。通过糖基转移酶对人参皂苷苷元进行修饰，产生的复杂多样的人参皂苷具有更广泛的药理活性。根据这些药理学研究，不同类型的人参皂苷发挥不同甚至相反药理作用的根本原因在于其不同的糖基化修饰。因此，近年来研究者对人参皂苷苷元的糖基化进行了深入的研究。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶及其在新型人参皂苷转化的应用。本发明通过克隆热带盐水孢菌CNB-440的糖基转移酶基因，并在大肠杆菌中异源表达，获得热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶。进一步利用所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶对人参皂苷Rh2进行糖基化修饰，制备得到一种新型人参皂苷Rh2，该新型人参皂苷Rh2具有较强的抑制癌细胞的细胞活力。

本发明所采用的技术方案为：

一种热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶，其目的基因氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，目的基因核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶的生产纯化方法，包括如下步骤：

(1)将热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶的编码基因序列连接到载体上，得到重组表达载体；

(2)将步骤(1)所述重组表达载体转化到大肠杆菌中，构建得到重组工程菌；

(3)将所述重组工程菌进行培养，诱导蛋白表达后，经离心、纯化，即得所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶。

步骤(1)中，具体操作为：

采用引物对克隆编码所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶的目的片段，PCR扩增后进行双酶切，之后将得到的编码热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶的基因序列连接到载体上，即完成重组表达载体的构建。

所述引物的序列设计为：

SGTF：5′-GCT GGATCC TTG ATG ATG GTG-3'；

SGTR：5′-AAT CCC GCC GGG CTA CGG AAGCTT AGG-3'。

步骤(1)中，所述载体为pET32a(+)。

步骤(3)的具体操作为：

将所述重组工程菌接种到LB-氨苄西林培养基中进行培养后，添加诱导剂进行诱导蛋白表达，冷冻离心后，收集菌体；将菌体重新悬浮在缓冲液中，培养一段时间后，超声处理，并于冰水中冷却，离心去除不溶物，上清液经纯化处理后，得到所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶。

一种新型人参皂苷Rh2的生产方法，包括如下步骤：

以原人参二醇为底物、UDP-葡萄糖为糖基供体，利用所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶对所述原人参二醇进行糖基化，获得的糖基化产物(代谢产物)即为新型人参皂苷Rh2。

所述糖基化的反应条件为：温度为30-37℃，时间为12-18h，pH为7.5-8.5。

所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶在金属盐离子和/或铵离子存在下进行催化反应，所述金属离子包括Co²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Cu²⁺、K⁺、Ca²⁺、Zn²⁺中的一种或几种。

本发明的第一个方面是克隆了热带盐水孢菌CNB-440的SGT基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。通过使用聚合酶链反应(PCR)和以下引物以粗体显示BamH1和HindIII限制性位点，从基因组DNA中扩增靶基因SGT作为模板：SGTF(5′-GCT GGATCC TTGATG ATG GTG-3')和SGTR(5′-AAT CCC GCC GGG CTA CGG AAGCTT AGG-3')。用上述引物消化扩增的DNA片段，然后插入Pgem-T-Easy载体中，并检查序列是否存在PCR错误。我们将扩增的基因SGT(含BamHI/HindIII的基因片段)重新克隆到pET32a(+)载体的同一位点以构建重组表达载体-pSGT。

本发明的第二个方面在代谢物的合成中对温度、pH和金属离子的影响进行了优化。与不含任何金属离子的对照相比，NH₄ ⁺、Ca²⁺对酶活性有显著刺激。合成的最佳温度为30℃，比其他温度(20℃，37℃，50℃和60℃)更强。SGT的最佳pH值为8，磷酸钠缓冲液为20mM，比其他pH值更有效。

本发明的第三个方面是成功制备了一种新的糖苷衍生物。将人参皂苷Rh2、UDP葡萄糖和添加了NH₄ ⁺的SGT酶(pH 8，0.1mg/mL)添加到混合物中，并在摇动培养箱中培养。此外，使用溶剂体系CHCl₃：CH₃OH：H₂O通过开放式硅胶柱色谱分离和纯化产物，并使用Nova-pak C18柱(3.9mm×300mm)通过重复Waters prep HPLC实现进一步分离和纯化，以进一步表征。

本发明的第四个方面是与人参皂苷Rh2对AGS、B16F10、Hela和U87MG细胞的抗癌性能进行了比较，评估了新衍生物和母体衍生物的抗癌性能。使用MTT比色法测定了Rh2和12-O-葡萄糖基人参皂苷Rh2对6.25μM至200μM排列的B16F10，AGS，Hela和U87MG的各种癌细胞系进行了测定。细胞活力数据表明，新型化合物12-O-葡萄糖基人参皂苷Rh2以剂量依赖性方式降低了四种细胞系的细胞活力。此外，12-O-葡萄糖基人参皂苷Rh2在200μM浓度下对四种癌细胞系表现出显着的细胞毒性。

本发明的有益效果为：

本发明提供的热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶，通过先克隆热带盐水孢菌CNB-440的SGT基因，并在大肠杆菌中异源表达，获得热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶。进一步利用所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶对人参皂苷Rh2进行糖基化，制备得到一种新型人参皂苷Rh2—12-O-葡萄糖基人参皂苷。数据显示：在AGS胃癌细胞系、Hela宫颈癌细胞系、U87MG胶质瘤细胞系和B16F10黑色素瘤细胞系中测定所述新型人参皂苷Rh2的细胞活性，结果表明，12-O-葡萄糖基人参皂苷具有较强的抗癌活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1以及对比例1-4添加不同混合物的代谢产物的TLC分析；

图2A为温度对代谢产物合成中重组SGT活性的影响；

图2B为pH对代谢产物合成中重组SGT活性的影响；

图2C为金属离子对代谢产物合成中重组SGT活性的影响；

图3A为HPLC分析重组SGT转化人参皂苷Rh2的时间过程；

图3B为重组SGT的lineweaver-Burk图；

图4为重组SGT转化后的质谱代谢物；

图5为SGT法将人参皂苷Rh2转化为12-O-葡萄糖基人参皂苷Rh2；

图6A-6D分别为人参皂苷Rh2及其代谢物对AGS(胃癌)、Hela宫颈癌细胞、U87MG脑胶质母细胞瘤、B16F10(皮肤黑色素血症)不同癌细胞增殖试验的细胞活力百分比。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶，其中，目的基因氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.2)：MRILVITVGSRGDVQPYVALGKGLQSAGHDVTLATCARFRSFVTDQGLAYGQLSDDILQLLDSAAGRAAMEDTTGVLGAVRTNIRLARQANPINRRLLADAWATARQAKPDLVVYHPKVLAGPHIAEKLGVPVVLALPVPVSVPTGDFPLVGLPELPLGRWYNRLTYRLAGAGYRMYDGMVNTFRRDTLGLAKTSGAALTTRLPDGRPIPVLHGISEHVLPRPADWPGHAHLTGYWFLDDAARWQPPAGLVDFIEAGDPPVYVGFGSMAGRDPHRLTRLVGEALRRAGVRGIVATGWGGLAETEPSDTIWHLTQAPHDWLFPRMSAVVHHGGAGTTAAALRAGKPSVICPFLLDQFVWGRQVFALGVGSAPIPQRKLTPQRLATAIRTVTTNADIRAAALKLGRSLAAEDGVANAVARIDTLLRPAG。

目的基因核苷酸编码序列如下所示(SEQ ID NO.1)：

ATGCGAATTCTGGTGATCACCGTAGGGTCGCGAGGGGATGTCCAGCCGTACGTGGCCCTCGGCAAAGGCCTCCAGTCGGCCGGCCATGACGTCACGCTGGCCACCTGCGCCCGGTTCCGGTCGTTCGTTACCGACCAAGGTTTGGCGTACGGCCAGCTCAGTGACGACATATTGCAGCTGCTGGATTCGGCGGCGGGCCGGGCCGCGATGGAGGACACCACCGGGGTGCTCGGCGCAGTCAGGACCAACATCAGGCTCGCCCGTCAGGCGAATCCGATCAACCGGAGGCTGCTGGCCGATGCCTGGGCGACAGCCAGGCAGGCCAAGCCAGATCTGGTCGTCTACCACCCCAAGGTGCTGGCCGGTCCGCACATCGCCGAGAAACTCGGCGTACCGGTGGTACTGGCGCTGCCCGTGCCGGTCTCCGTACCAACCGGTGACTTCCCCCTCGTCGGGCTGCCCGAACTGCCGCTCGGCCGTTGGTACAACCGACTGACCTACCGCCTGGCCGGTGCCGGATACCGGATGTACGACGGAATGGTGAACACGTTTCGTCGCGACACGCTCGGACTCGCGAAGACCAGCGGTGCCGCGCTGACCACCCGGCTACCTGACGGGCGGCCAATCCCGGTGCTGCATGGCATCAGCGAGCACGTCCTGCCACGCCCCGCCGACTGGCCCGGGCACGCGCACCTCACCGGCTACTGGTTCCTTGACGACGCCGCCCGCTGGCAGCCCCCGGCCGGCCTGGTCGACTTTATCGAGGCGGGCGACCCACCGGTGTACGTCGGCTTCGGCAGTATGGCCGGGCGCGACCCGCACCGACTCACCCGTCTCGTGGGCGAGGCACTGCGCCGGGCCGGCGTCCGCGGCATCGTCGCCACCGGCTGGGGTGGCCTGGCGGAGACCGAGCCGTCAGACACCATCTGGCACCTCACGCAGGCCCCACACGACTGGCTCTTCCCTCGGATGTCCGCCGTTGTGCACCACGGTGGGGCCGGCACCACCGCGGCGGCGCTACGCGCCGGCAAGCCCTCGGTGATCTGTCCGTTCCTCCTGGACCAGTTCGTCTGGGGTCGGCAGGTATTCGCGCTCGGCGTGGGCAGTGCACCCATACCGCAGCGGAAGCTCACTCCGCAGCGGCTGGCCACCGCGATCCGTACGGTGACCACCAACGCCGACATCCGGGCCGCCGCGCTCAAGCTGGGGAGGAGCCTCGCGGCCGAGGATGGTGTCGCGAACGCGGTTGCCAGGATCGACACTCTCCTCCGCCCGGCGGGTTAG。

通过使用聚合酶链反应(PCR)和BamH1和HindIII作为限制性位点，从基因组DNA中扩增靶基因SGT作为模板：SGTF(5′-GCT GGATCC TTG ATG ATG GTG-3')和SGTR(5′-AAT CCCGCC GGG CTA CGG AAGCTT AGG-3')。用上述引物消化扩增的DNA片段，然后插入Pgem-T-Easy载体中，并检查序列是否存在PCR错误。将扩增的基因SGT(含BamHI/HindIII的基因片段)重新克隆到pET32a(+)载体的同一位点以构建重组表达载体-pSGT。

将重组的大肠杆菌BL21(DE3)在LB-氨苄西林培养基中37℃条件下培养到OD为0.6(600nm)，加入0.3mM的IPTG诱导蛋白表达(16℃，9h)。通过冷冻离心(5000×g，15min，4℃)获得菌体。将菌体细胞重新悬浮在20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中，并在4℃下培养5min。细胞以1-s的间隔进行3min的超声波处理，在80％输出的超声波处理器上重复5次，并在冰上冷却，通过12000×g的离心去除不溶物，在4℃下保持20min。用试剂盒(Takara Bio,Shiga,Japan)及TALON钴亲和层析树脂对含His-tag标记的重组蛋白质进行纯化，即得所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶。

实施例2

本实施例提供一种新型人参皂苷Rh2的转化方法，包括如下步骤：

以人参皂苷Rh2为底物、UDP-葡萄糖为糖基供体，利用所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶(SGT酶)对Rh2进行糖基化转化；混合物中SGT酶的最终浓度为0.1mg/mL，UDP-葡萄糖的浓度为2.5mM，Rh2的浓度为0.5mM；混合物在30℃下进行糖基化反应12h，反应结束后用水饱和正丁醇终止反应，充分混匀，以保证充分萃取反应产物，离心取上清，旋转蒸发后，再使用甲醇充分溶解，经分离纯化后获得的代谢产物即为新型人参皂苷Rh2。

如图5显示SGT法将人参皂苷Rh2转化为12-O-葡萄糖基人参皂苷Rh2。

所述原人参二醇为人参皂苷Rh2的结构式为：

对代谢产物进行检测，具体操作如下：

TLC检测：展开剂(V(氯仿)：V(甲醇)：V(水)＝65:35:10)，显色剂：10％(体积比)H₂SO₄，110℃下加热1min显色。

HPLC检测：HPLC检测所用仪器为安捷伦1290超高效液相色谱，液相色谱柱为安捷伦公司的C18柱(250×4.6mm，粒径5μm)，流动相为乙腈(溶剂A)和蒸馏水(溶剂B)。梯度洗脱程序如下：5％B流动相5min，79％B流动相20min，42％B流动相55min，10％B流动相12min，85％B流动相18min，流速1.6ml/min，柱温30℃，吸收波长为203nm。

HR/MS检测：芬尼根LCQAdvantage质谱仪上进行分析(离子模式：FAB-；元素：C 43/0，H 72/0，O 14/0；质量公差：1000ppm，m/z<10时为10mMu，m/z>20时为20mMu；不饱和度：-0.5-50.0)，如图4所示为重组SGT转化后的质谱代谢物。通过质子和碳核磁共振对代谢产物的结构进行了鉴定。在Bruker Av 600NMR光谱仪上，以吡啶-d5为溶剂，在100MHz下获得了1H-NMR和13C-NMR谱，分析结果见表1。

表1-新型人参皂苷1H-(600MHz)and 13C-NMR(150MHz)化学位移和结构归属

经验证，所述代谢产物为12-O-葡萄糖基人参皂苷，结构式为：

进一步，还检测了动力学参数Vmax(μmol/L*min)和Michaelis-Menten常数Km(mol/L)。通过使用0.5mM至5mM范围内不同浓度的UDP葡萄糖的比活性Michaelis-Menten图进行测量。反应混合物在30℃下，磷酸钠缓冲液pH值为7.0。采用高效液相色谱法对产物进行分析。通过Lineweaver-Burk图(见图3B)确定Vmax和Km值。

对比例1

本对比例与实施例2的区别仅在于：反应体系仅添加SGT酶，糖基化条件设置与实施例2相同。

对比例2

本对比例与实施例2的区别仅在于：反应体系添加SGT酶和UDP-葡萄糖，糖基化条件设置与实施例2相同。

对比例3

本对比例与实施例2的区别仅在于：反应体系仅添加UDP-葡萄糖，糖基化条件设置与实施例2相同。

对比例4

本对比例与实施例2的区别仅在于：反应体系添加人参皂苷Rh2和UDP-葡萄糖，糖基化条件设置与实施例2相同。

使用硅胶板和展开剂(V(氯仿)：V(甲醇)：V(水)＝65:35:10)对实施例2、对比例1-4的代谢产物进行TLC(薄层色谱)分析，如图1所示，图1中C1、C2、C3、C4分别显示对比例1、对比例2、对比例3、对比例4所得代谢产物的TLC图。图1中的R显示实施例2所得代谢产物。从图1中可以看出，除了实施例2所得代谢产物的TLC中形成一个新的明显斑点，对比例1-4所得混合物并没有产生新的斑点。

实施例3

本实施例检测金属离子、pH值和温度对SGT酶活性的影响，具体操作如下：

确定1mL含有0.5mM人参皂苷Rh2和2.5mM UDP葡萄糖作为底物的反应混合物用于初始合成实验。在10mM(最终浓度)的Co²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Cu²⁺、K⁺、Ca²⁺、Zn²⁺存在下测试金属离子及NH₄ ⁺对酶活性的研究，然后与没有金属离子及NH₄ ⁺的对照进行比较。在最佳离子条件下，在20-60℃，pH值为7.0的磷酸钠缓冲液中测定了温度对SGT酶活性的影响。以类似的方式，在pH范围为3-10的缓冲液中，在最佳金属离子和温度下培养20mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 3.0)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0-5.0)、磷酸钠缓冲液(pH 6.0-7.0)、Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)后，研究了pH值对分离酶活性的影响。定期提取样品。向每个样品中添加等体积的水饱和正丁醇以停止反应；随后，将正丁醇部分蒸发至干燥并溶解于HPLC甲醇中，以通过TLC、HPLC和HR/MS(高分辨率质谱)进行分析。

金属离子、pH值和温度对SGT酶活性的影响分别如图2A、图2B和图2C所示。从图中可以看出，SGR酶的最佳温度为30℃，比其他温度(20℃、37℃、50℃和60℃)活性更高；SGT酶的最佳pH值是在pH值为8的20mM磷酸钠缓冲液中；与没有任何金属离子的对照组相比，NH₄ ⁺、Ca²⁺显著刺激SGT酶的酶活性。

实施例4

本实施例检测了代谢产物的体外抗癌活性，具体操作为：

使用B16F10(皮肤黑色素血症)、AGS(胃癌)、Hela宫颈癌细胞和U87MG脑胶质母细胞瘤测定代谢产物对不同癌细胞增殖和细胞活力的影响。细胞生长在Dulbecco改良的Eagle培养基中，含有10％胎牛血清。所有细胞均在加湿的5％CO₂培养箱中保持在37℃。对于细胞生长测定，用不同浓度的代谢物(6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM)处理96孔板中2000个细胞/孔的细胞72h。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴(MTT)比色法测定细胞生长。如图6A-6D分别显示为：人参皂苷Rh2及其代谢产物对AGS(胃癌)、Hela宫颈癌细胞、U87MG脑胶质母细胞瘤、B16F10(皮肤黑色素血症)不同癌细胞增殖试验的细胞活力百分比。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶，其特征在于，目的基因氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，目的基因核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶的生产纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶的生产纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，具体操作为：

4.根据权利要求3所述的热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶的生产纯化方法，所述引物的序列设计为：

SGTF：5′-GCT GGATCC TTGATGATG GTG-3'；

SGTR：5′-AAT CCC GCC GGG CTACGGAAGCTTAGG-3'。

5.根据权利要求1所述的热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶的生产纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述载体为pET32a(+)。

6.根据权利要求1所述的热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶的生产纯化方法，其特征在于，步骤(3)的具体操作为：

7.一种新型人参皂苷Rh2的转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

以原人参皂苷Rh2为底物、UDP-葡萄糖为糖基供体，利用所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶对所述原人参二醇进行糖基化，获得的糖基化产物即为新型人参皂苷Rh2。

8.根据权利要求7所述的新型人参皂苷Rh2的转化方法，其特征在于，所述糖基化的反应条件为：温度为30-37℃，时间为12-18h，pH为7.5-8.5。

9.根据权利要求7所述的新型人参皂苷Rh2的转化方法，其特征在于，所述热带盐水孢菌CNB-440重组糖基转移酶在金属盐离子和/或铵离子存在下进行催化反应；

所述金属盐离子包括Co²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Na⁺、Cu²⁺、K⁺、Ca²⁺、Zn²⁺中的一种或几种。

10.根据权利要求7所述的新型人参皂苷Rh2的转化方法，其特征在于，所述原人参二醇为人参皂苷Rh2，所述新型人参皂苷Rh2为12-O-葡萄糖基人参皂苷。