CN109293571B - 一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针及其应用，其属于生物医药技术领域。该探针具有4‑羟基萘酰亚胺结构母核，为比率型荧光探针，其经葡萄糖基转移酶催化后的糖基化产物仍然具有荧光属性，根据探针底物及其葡萄糖基化产物的荧光强度比率，用于测定体系内葡萄糖基转移酶的活力。所发明探针可以用于重组表达的葡萄糖基转酶的活力分析，亦可用于检测不同种属、不同个体来源的生物样本中的葡萄糖基转移酶的活性测定。特别是，以糖苷类成分为主要药效物质的植物类药材，应用本探针测定分析其中的葡萄糖基转移酶的表达情况对于药材的种植采收以及质量控制具有重要的指导作用。

Description

一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针及其应用。
背景技术
糖基转移酶(Glycosyltransferases, GT; EC 2.4.x.y)是高度分歧的多源基因家族，广泛存在于所有有机体中，催化糖基从活化的供体分子转移到受体分子上。糖基的供体分子是多种多样的，除了常见的糖类、磷酸糖、核苷磷酸糖和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸外，尿苷二磷酸-木糖、尿苷二磷酸-鼠李糖、尿苷二磷酸-半乳糖等也可作为糖基供体。在植物中，一般用尿苷二磷酸-葡萄糖来提供糖基分子。糖基的受体分子有葡萄糖、果糖、核糖等单糖，蔗糖、乳糖等2-10个糖苷键链接而成的寡糖，淀粉、糖原、纤维素等10个以上糖苷键相连的多糖。此外，还有一些非糖类的化合物(如脂类, 甾醇, 萜类化合物, 酚类, 蛋白质, 抗生素, 激素类)和农药等非生物体物质。通常糖基分子结合在受体分子的羟基(-OH)和羧基(-COOH)氧原子、氨基(-NH2)氮原子、巯基(-SH)硫原子和碳(C-C)等原子上。糖基化反应的产物有双糖、寡糖、苷类和次生代谢产物的小分子化合物等。由于糖基化修饰在调节植物激素平衡、内外源物质的解毒以及防御反应和次生代谢产物的修饰方面发挥着重要作用，糖基转移酶被认为是植物中最为重要的生物合成酶之一。
葡萄糖基转移酶(glucosyltransferases, GT, EC 2.4.1)能够催化活性葡萄糖供体，例如尿苷二磷酸-葡萄糖，与其他受体分子结合生成糖苷类成分或者多糖类成分。上述含糖基的成分往往是植物中的具有重要生物活性的物质，亦是天然产物来源的重要药用物质，对人类健康发挥着重要作用。例如，我国传统常用中药人参中的人参皂苷类成分均含有糖基，具有多种重要的药理活性。目前有关人参皂苷Rg3的研究都表明，人参皂苷Rg3具有确切的抗肿瘤作用，具有诱导肿瘤细胞分化与凋亡、减少肿瘤细胞增殖、降低肿瘤细胞侵袭与转移、抑制肿瘤血管生成及提高机体免疫力等作用。葡萄糖基转移酶作为植物糖苷类物质生物合成的关键功能酶，其表达情况及生物活力与植物中的糖苷类成分的含量密切相关。通过有效手段检测分析植物中的葡萄糖基转移酶活力，有助于监测植物中的糖苷类成分生成量，能够有效指导药用植物的采收，亦能够反映药用植物的质量优劣。
本发明设计开发了用于检测葡萄糖基转移酶活力的小分子荧光探针，具有比率型探针的特点，更利于准确分析酶的活性。应用该探针可有效检测不同来源的人参样本中的葡萄糖基转移酶的活力，并且与其中的人参皂苷类成分含量具有较高的相关性，表明了检测药用植物中葡萄糖基转移酶活力对于药材质量控制具有重要的指导作用。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测葡萄糖基转移酶的特异性荧光探针，该探针可用于检测不同形式来源的生物样本中葡萄糖基转移酶的含量、活力。
本发明所提供的小分子荧光探针具有萘酰亚胺母核，如结构式（1）所示，其4位羟基可与葡萄糖结合，生成4-葡萄糖苷化产物，如结构式（2）所示。探针底物，结构式（1）与其葡萄糖苷化产物，结构式（2）具有不同的荧光属性，其吸收与荧光发射光谱，如附图1所示；结构式（1）和结构式（2）的化合物最优激发波长分别为450 nm，360 nm；最优发射波长分别为550 nm，440 nm。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
本发明所提供的荧光探针底物，在活性葡萄糖供体存在的情况下，特别是尿苷二磷酸-葡萄糖（UDPG），经葡萄糖基转移酶的催化作用，可生成4-葡萄糖苷化产物，反应过程如附图2所示。
本发明所提供的荧光探针底物及其葡萄糖苷化产物用于葡萄糖基转移酶的检测，具有比率型荧光探针的特征，可有效排除样本的背景干扰。根据其葡萄糖基化产物在440nm的荧光强度与剩余底物在550nm的荧光强度比值（R = I440/I550），用于测定葡萄糖基转移酶的活力。
本发明所提供的荧光探针底物及其葡萄糖苷化产物用于葡萄糖基转移酶的检测，其共孵育温度范围为15℃~45℃，优选35℃为最佳孵育温度（附图3）；孵育体系的pH适用范围为5~8，优选pH 7为最佳孵育条件（附图4）。
本发明所提供的荧光探针底物可以用于重组表达的葡萄糖基转移酶的活力测定。其比率值与酶浓度（0 – 18 μg/mL）呈现良好的线性关系，如附图5所示，可以用于葡萄糖基转移酶的活力标定。探针底物表现出了较好的葡萄糖基转移酶专一性，不受到其他类型生物酶的干扰（附图6）。葡萄糖基转移酶催化探针底物的糖基化反应符合双向动力学模型，动力参数：V max1 2.541 μmol/min/mg，K m1 0.6472 μM，V max2 36.88 μmol/min/mg，K m2 156.6 μM（附图7）。
本发明所提供的荧光探针底物，用于植物器官、组织、细胞中的葡萄糖基转移酶活力测定。特别是以糖苷类化学成分为主要药效物质的药用植物，其葡萄糖基转移酶的表达情况与其中的糖苷类药效物质的含量密切相关。应用本发明涉及的荧光探针底物，可以快速、准确测定药物植物器官、组织或者细胞中的葡萄糖基转移酶活力。如附图8所示，应用本发明提供的探针测定了20株不同来源的人参根中的葡萄糖基转移酶活力。测定结果与人参根中的总皂苷含量呈现了较好的相关性。应用本发明提供的荧光探针测定药用植物中的葡萄糖基转移酶活力测定，可规范药用植物的采收标准，建立药用植物的质量控制方法。
本发明的有益效果为：探针具有4-羟基萘酰亚胺结构母核，为比率型荧光探针，其经葡萄糖基转移酶催化后的糖基化产物仍然具有荧光属性，根据探针底物及其葡萄糖基化产物的荧光强度比率，用于测定体系内葡萄糖基转移酶的活力。所发明探针可以用于重组表达的葡萄糖基转酶的活力分析，亦可用于检测不同种属、不同个体来源的生物样本中的葡萄糖基转移酶的活性测定。特别是，以糖苷类成分为主要药效物质的植物类药材，应用本探针测定分析其中的葡萄糖基转移酶的表达情况对于药材的种植采收以及质量控制具有重要的指导作用。
附图说明
图1.用于检测葡萄糖基转移酶的小分子荧光探针及其葡萄糖苷化产物的吸收与荧光光谱图。
图2.葡萄糖基转移酶催化探针底物发生葡萄糖基化反应过程。
图3.孵育温度对探针底物葡萄糖基化的影响。
图4.孵育体系pH对针底物葡萄糖基化的影响。
图5.荧光探针比率值与酶浓度的线性相关图。
图6.探针底物与葡萄糖基转移酶的选择性筛选结果。
图7.葡萄糖基转移酶催化探针底物发生葡萄糖基化的反应动力学。
图8.（8-1）探针底物测定20株人参根中的葡萄糖基转移酶活力；（8-2）20株人参根中的总皂苷含量；（8-3）20株人参中葡萄糖基转移酶活力与总皂苷含量的相关性分析。
图9. 荧光探针合成过程。
具体实施方式
以下实施例将对本发明进一步进行说明，但并不限于本发明。
实施例1. 荧光探针（1）的合成
本发明所提供的小分子荧光探针通过如下过程合成得到，合成路线如附图9所示。
化合物A的合成
4-溴-1,8-奈酐（1g, 3.62 mmol）与4-氟苯乙氨(0.553 g，3.98 mmol)溶解于50mL乙醇中，回流搅拌反应8小时。之后，冷却至室温，将反应液倾入冰水中，过滤，洗涤，得到沉淀，干燥后得到黄色粉末，即为化合物A（产率91.1%）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.57(t, J = 7.0 Hz, 2H), 8.34 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.01(t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 7.9, 5.8 Hz, 2H), 7.11 (t, J = 8.7 Hz,2H), 4.32 – 4.14 (m, 2H), 3.00 – 2.83 (m, 2H)。13C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ162.75, 162.72, 160.89, 134.82, 132.68, 131.61, 131.39, 130.99, 130.44,129.81, 129.17, 128.85, 128.29, 122.72, 121.93, 115.13, 41.08, 32.51. HRMSC20H14BrFNO2 + ([M+H]+) m/z398.0184。
化合物B的合成
化合物A (0.8 g，2.0 mmol)和K2CO3(2.54 g，18.4 mmol)溶解于30 mL甲醇中，回流搅拌反应10小时。反应结束后，冷却至室温，减压蒸发除去甲醇，得到固体产物，经水洗后，干燥，即为化合物B （产率86.2%）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.60 (d, J = 7.2 Hz,1H), 8.59 – 8.48 (m, 2H), 7.71 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.36 – 7.27 (m, 2H), 7.06(d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.98 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 4.45 – 4.27 (m, 2H), 4.14 (s,3H), 3.07 – 2.91 (m, 2H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 159.01, 158.40, 156.36,155.54, 129.34, 128.12, 126.19, 125.17, 123.97, 123.38, 120.63, 118.13,116.92, 109.96, 109.60, 99.92, 50.93, 36.35, 28.24. HRMSC21H17FNO3 + ([M+H]+) m/ z350.1187。
化合物1的合成
化合物B（0.3 g，0.86 mmol）与10 mL HI (55 - 58%)回流搅拌反应14小时，反应液倾入冰水中，得到沉淀，经水洗后，进行干燥，即得到黄色固体，为化合物1 （产率84.3%）。1HNMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 11.90 (s, 1H), 8.53 (d, J =7.8 Hz, 1H), 8.46 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.34 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.76 (t, J =7.8 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 8.3, 5.7 Hz, 2H), 7.16 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.11(t, J = 8.8 Hz, 2H), 4.34 – 4.07 (m, 2H), 3.00 – 2.80 (m, 2H)。13C NMR (125MHz, DMSO-d 6 ) δ 164.03, 163.33, 161.36, 160.84, 135.48, 134.06, 131.61,130.89, 129.65, 129.44, 126.07, 122.87, 122.19, 115.59, 112.94, 110.46,41.20, 33.21。 HRMS C20H13FNO3 - ([M-H]-) m/z334.0886。
实施例2. 荧光探针用于葡萄糖基转移酶活力测定
200 μL的荧光孵育体系：100 mM磷酸钾缓冲液（pH=7），20 μL MgCl2（50 mM），30 μg/mL 的GT，10 μM探针1以及辅因子UDP-Glc（0.3mM）。其中为提高底物的溶解性以及保护GT的酶活不受有机试剂影响，DMSO所溶解的底物在加入到孵育体系内时，保证有机试剂的体积<1%。于37℃条件下孵育30 min，100 μL的乙腈终止此酶促反应。通过BioTek Synergy H1的酶标仪对反应液进行荧光光谱测定（激发与发射波长分别为：λex 360/λem 440 nm 和λex450/λem 550 nm）。
实施例3.孵育体系 pH对GT检测体系的影响
于200 μL孵育体系：100 mM磷酸钾缓冲液（pH 2-11），20 μL的MgCl2（50 mM），30 μg/mL的葡萄糖基转移酶，10 μM的探针1以及辅因子UDP-Glc（0.3mM）中通过HPLC检测不同pH下葡萄糖苷产物的产率来研究pH对GT活性的影响。。
实施例4. 不同浓度葡萄糖基转移酶与荧光探针比率的线性相关分析
葡萄糖基转移酶的浓度梯度分别为0，10，20，30，40，50，60，70，80，90 μg/mL，于200 μL孵育体系：100 mM磷酸钾缓冲液，20 μL的MgCl2（50 mM），10 μM的探针1以及辅因子UDP-Glc（0.3mM）中孵育30 min，测定其荧光强度（λex 350/λem 446 nm，λex 450/λem 556 nm，增益为80%）。以荧光强度比值为Y值分析其线性关系。
实施例5.单酶选择性
单酶选择性实验在酶量（30 μg/mL）一致的前提下，根据多种单酶不同的催化条件于200 μL孵育体系（KH2PO4-K2HPO4 buffer-乙腈）中反应。其中包括：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（GT1A4、GT2B7），N-乙酰基转移酶（NAT1、NAT2），磺基转移酶（SULT2A1、SULT1B1），儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT、S-COMT），羧酸酯酶（CES1b、CES1c、CES2），亮氨酸氨基肽酶LAP。分别在λex 350/λem 446 nm，λex 450/λem 556 nm波长下测定荧光强度，其结果以荧光强度比值（I446/I556）呈现出来。
实施例6. 葡萄糖基转移酶催化探针底物的动力学研究
为了获得探针1与葡萄糖基转移酶反应的动力学参数，进行了葡萄糖基转移酶的反应动力学实验。在底物转化率小于20%，糖苷化产物生成速率与葡萄糖基转移酶的浓度梯度以及孵育时间梯度分别呈线性关系前提下，不同浓度的探针1（0-60 μM）于200 μL孵育体系（KH2PO4-K2HPO4 buffer--UDP-Glc--乙腈）下，在37℃孵育30 min。所有孵育实验均是平行三组操作，确保实验数据的SD< 10%。动力学实验中探针1的母液浓度为10 mM，以此保证在葡萄糖基转移酶的反应体系中有机溶剂DMSO < 1%。根据米氏动力学方程，从实验数据的非线性回归分析计算出Vmax和Km。
V=
Figure DEST_PATH_IMAGE004
V max 表示最大反应速率，Km指反应速率达最大反应速率一半时的底物浓度。动力学参数及其模型分析在操作软件Origin 7.5(origin Lap Corp. Northampton. MA.USA)中完成。
实施例7. 人参根中葡萄糖基转移酶的活力测定
购买于吉林通化，吉林延边珲春，吉林吉安三个产地的20个新鲜人参冲洗干净后，全部切成0.5毫米左右的小块，混合均匀。每棵人参都取1g用于粗酶提取。
用于粗酶提取的1g人参小块放于液氮预制冷的研钵中，加液氮研磨，至全部磨成粉末为止。将整个研钵放置于4℃冰箱，分三次加10ml磷酸Buffer（100mM，PH=7.4，5mMEDTA）转移到50ml离心管中，在冰浴下，细胞破碎仪破碎5min（40%功率，超5s停5s）。破碎后10000g离心30min，取上清过超滤膜（30@），9000g离心，浓缩到1ml时，加三倍体积磷酸Buffer（100mM，PH=7.4）混悬，再9000g离心，循环往复混悬离心三次至浓缩液到300μl，吸出转移到EP管中，分两次加入200μl磷酸Buffer（PH=7.4）清洗超滤管，同样转移到EP管中，-80度保存，即得粗酶液。按照上述葡萄糖基转移酶与探针底物的反应条件，对人参粗酶液中的葡萄糖基转移酶进行活力测定。

Claims (7)

1.一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针非疾病诊断和治疗目的的应用，其特征在于：
该探针具有结构式（1）所示的化学结构，可用于葡萄糖基转移酶的活力检测与分析；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
该探针在葡萄糖基转移酶的催化作用下，接受活性葡萄糖供体尿苷二磷酸-葡萄糖，生成葡萄糖基化产物，如结构式（2）所示；
Figure 791439DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述的一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针非疾病诊断和治疗目的的应用，其特征在于：结构式（1）探针的荧光属性为：激发波长450 nm, 发射波长550nm；结构式（2）葡萄糖苷化产物的荧光属性为：激发波长360 nm, 发射波长440nm；根据结构式（2）葡萄糖基化产物在440nm的荧光强度与剩余探针在550nm的荧光强度比值R =I440/I550，测定葡萄糖基转移酶的活力。
3.根据权利要求1所述的一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针非疾病诊断和治疗目的的应用，其特征在于：用于葡萄糖基转移酶活力测定时，其孵育温度范围为15℃~45℃，其孵育体系的pH适用范围为5~8。
4.根据权利要求1所述的一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针非疾病诊断和治疗目的的应用，其特征在于：用于葡萄糖基转移酶活力测定时，其孵育温度为35℃，其孵育体系的pH为7。
5.根据权利要求1所述的一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针非疾病诊断和治疗目的的应用，其特征在于：该探针用于重组葡萄糖基转移酶活力测定。
6.根据权利要求1所述的一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针非疾病诊断和治疗目的的应用，其特征在于：该探针用于植物器官、组织、细胞中的葡萄糖基转移酶活力测定。
7.根据权利要求1所述的一种检测葡萄糖基转移酶的比率型荧光探针非疾病诊断和治疗目的的应用，其特征在于：该探针用于药用植物中的葡萄糖基转移酶活力测定。
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