JP6067862B2 - チョウセンニンジン由来の新規udp−糖転移酵素及びその用途 - Google Patents
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Description
リン酸及びDMADP(ジメチル
アリル二リン酸)の一連の縮合反応が生じてオキシドスクアレン(oxidosqualene)が合成されるまで、他のトリテルペンの生合成経路を共有することが知られている(非特許文献1、2及び3)。オキシドスクアレンは、トリテルペン環化酵素(triterpene cyclase)であるDS(ダンマレンジオール-II合成酵素)によってダンマレンジオール-IIに環化される。ダンマレンジオールIIは、C-3及びC-20番位置にヒドロキシ基を持ち、p450酵素であるPPDS(プロトパナキサジオール合成酵素)によるC-12番位置のヒドロキシル化によってPPDに転換される。PPDSは、他のp450酵素であるPPTS(プロトパナキサトリオール合成酵素)によるC-6番位置のヒドロキシ化によってさらにPPTに転換され得る。PPDは、C-3及び/又はC-20番位置のグリコシル化によってPPD-タイプのギンセノシドに転換され、PPTは、C-6及び/又はC-20番位置のグリコシル化によってPPT-タイプのギンセノシドに転換され得る。UDP(ウリジン二リン酸)-糖転移酵素(UGT)は、O-、β1,2-又はβ1,6-グリコシド結合を形成することで、様々なギンセノシドの合成経路に関与することが考えられる。DS、PPDS及びPPTSは、ギンセノシド生合成に関与する酵素として報告されているが、UGTがギンセノシド生合成に関与するか否かは確認されていない。
因子を使用してもよい。本発明で獲得した目的のタンパク質の精製を容易にするために、前記プラスミドベクターは、必要に応じてさらに他の配列を含んでもよい。前記融合プラスミドは、GST、GFP、 Hisタグ(His-tag)、Mycタグ(Myc-tag)などのタグを含んでもよいが、本発明の融合プラスミドは、これらの実施例に制限されるものではない。本発明の一実施例において、GST遺伝子が融合されたベクターであるpGEX4T-1が、UDP-糖転移酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターのコンストラクションとして使用された。
〔化学式1〕
チョウセンニンジンのESTライブラリーから同定した2種類のUGT遺伝子は、以下の表1(配列番号5及び6、配列番号7及び8)で表したプライマーセットを用いてpGEX4T-1ベクターにクローニングし、それぞれをPgUGT74A1及びPgUGT94B1と命名した。
糖転移酵素アッセイは、精製したPgUGT74A1又はPgUGT94B1(30μg)、ギンセノシド化合物(5mM)及びUDP-グルコース(50mM)を含む反応緩衝溶液(10mMのPBS緩衝溶液、pH 7)で行った。これらのアッセイのために、PPD(プロトパナキサジオール)、PPT(プロトパナキサトリオール)、化合物K(C-K)、ギンセノシドRg3、Rh2、F2、Rd、Rg2、Rh1及びF1を含む異なる10種類のギンセノシドを使用した。前記ギンセノシドの構造を図1に示す。
グラフィー(HPLC)により分析した。
全RNAは、スペクトラム植物の全RNAキット(シグマアルドリッチ)を用いて15ヶ月齢のチョウセンニンジンの葉又は根から分離した。200μMのジャスモン酸メチル(MeJA)を5日間毎日チョウセンニンジンの葉に噴射し、サンプルを6日目に回収した。全RNAの1μgをcDNA合成に用いた。
した。
ギンセノシドの生合成に関与するUDP-糖転移酵素(UGT)の役割を解明するために、まず、ESTデータベースの分析を行い、実験例1に記述した方法によりコウライニンジン(Panax ginseng)からUGT遺伝子をクローニングした。その中で、PgUGT74A1及びPgUGT94B1と命名した2種類のUGTの機能を解明するために調査した。
チオヒドロキシム酸(phenylacetothiohydroximate)をグリコシル化するが、それに対して、UGT74E2は、グリコシルエステル連結を形成して、
インドールブチレート(indole butylate)をグリコシル化する。同様に、UGT74F1及びUGT74F2もグリコシルエステル連結を形成して、サリチラー(salicyclate)及びアントラニレート(anthranilate)をそれぞれグリコシル化する。一方で、UGT74ファミリーのメンバーは、グリコシルエステル連結以外にも、O-グリコシド結合も形成することができる。UGT74F1は、2-O-グリコシド結合を形成して、サリチラート(glycosylate)をグリコシル化することが知られている。さらに、UGT74F1及びUGT74F2は、O-グリコシド結合を形成して、サリチラート及びアントラニレートの両方をグリコシル化することが知られている。
実験例1の分析結果に基づいて、PgUGT74A1及びPgUGT94B1の基質特異性及び位置選択性が、以下のように確認された。
液体クロマトグラフィー(HPLC)によりさらに確認した。HPLCの結果は、TLC分析の結果で示すように、本発明のPgUGT74A1が、PPD及びC-KをそれぞれギンセノシドRh2及びF2に転換したことを示した。実施例1のPgUGT94B1は、PgUGT74A1と違って、PPD及びC-Kを他のギンセノシドに転換しなかった(図3b)。
実施例1でクローニングされたPgUGT94B1もPgUGT74A1のような基質特異性及び位置選択性を持つか否かを検討した。
実験例2及び3の結果に基づいて、2種類のPgUGTを同時に使用する場合、チョウセンニンジンのPPDは、ギンセノシドRh2に転換されて、その次にRg3に転換されるため、結果的にPPDからRg3を生産することができる。同様に、両方の酵素を使用する場合、C-Kは、ギンセノシドF2に転換され、その次にRdに転換されるため、結果的にC-KからRdを生産することができる。
本発明のPgUGT74A1及びPgUGT94B1が、伝統的に治療目的で使用されてきたチョウセンニンジンの根で主に発現するか否かを検討した。また、PgDS(dammarenediol-II synthase)、PgPPDS(protopanaxadiol synthase)及びPgPPTS(protopanaxatriol synthase)などの異なる3種類のギンセノシドの生合成遺伝子に加えて、本発明の2種類のPgUGTの器官特異的な発現パターンを測定した。15ヶ月齢のチョウセンニンジンの葉と根を発現分析に使用した。
Claims (11)
- 配列番号1のアミノ酸配列で表される単離されたウリジン二リン酸(UDP)-糖転移酵素タンパク質(PgUGT94B1)。
- 前記タンパク質が、チョウセンニンジン(ginseng)由来の請求項1に記載の単離されたUDP-糖転移酵素タンパク質。
- 前記タンパク質が、プロトパナキサジオール(PPD)-タイプのギンセノシドのC-3番位置に糖転移活性を持つ請求項1に記載の単離されたUDP-糖転移酵素タンパク質。
- 請求項1の単離されたUDP-糖転移酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項4の前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項5の前記発現ベクターを含む形質転換体。
- UDP-糖の存在下で、PPD-タイプのギンセノシドと、配列番号1のアミノ酸配列で表される単離されたウリジン二リン酸(UDP)-糖転移酵素タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換体又は前記形質転換体の培養物とを反応させる工程を含む、プロトパナキサジオール(PPD)-タイプのギンセノシドを転換することによる、グリコシル化されたギンセノシドの製造方法。
- 前記単離されたUDP-糖転移酵素タンパク質が、PPD-タイプのギンセノシドのC-3番位置に対して糖転移活性を持つ請求項7に記載の方法。
- 前記PPD-タイプのギンセノシドが、ギンセノシドRh2又はF2である請求項7に記載の方法。
- 前記グリコシル化されたギンセノシドが、ギンセノシドRg3又はRdである請求項7に記載の方法。
- 前期グリコシル化されたギンセノシドの製造が、ギンセノシドRh2からギンセノシドRg3への転換又はギンセノシドF2からギンセノシドRdへの転換を含む請求項7に記載の方法。
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