KR100404724B1

KR100404724B1 - 세포-분화유발인자,세포증식억제제및항종양제로유용한산화카로티노이드,레티노이드및이와관련된콘쥬게이션된폴리엔,유도분획그리고화합물

Info

Publication number: KR100404724B1
Application number: KR1019960701872A
Authority: KR
Inventors: 벌톤 그래함; 다로쥬스키 자누즈; 핍스 제니; 아랴 프랍핫
Original assignee: 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다
Priority date: 1994-08-10
Filing date: 1995-08-10
Publication date: 2004-04-03
Also published as: GB2297325B; KR960704828A; FI961544A; WO1996005160A1; JP3983800B2; US5475006A; FI961544A0; MX9601175A; ATE201394T1; PT722431E; GB2297325A; EP0722431A1; JPH09504038A; EP0722431B1; ES2160172T3; DE69521020T2; PL184296B1; CA2171625A1; CA2171625C; DE69521020D1

Abstract

대표적인 카로티노이드인 β-카로틴, 리코펜 그리고 칸타산틴, 그리고 보다 적은 정도로 대표적인 레티노이드인 레티노익 에시드는 확대산화를 하여, 산화 β-카로틴이 모델인, 세포증식, 종양 그리고 종양발생 바이러스에 대하여 활성을 갖는 비독성의 시약으로 유용하며 세포 분화의 촉진제로 유용한 성질을 갖는 물질을 생성한다. 이러한 사실은, 다양한 형태의 비타민 A가 전혀 존재하지 않거나 소량으로 존재하는 고도로 산화된 β-카로틴 생성혼합물의 화학분석으로써 분명하게 알 수 있다. 더욱이 비타민 A를 생성할 수 없는 산화 칸타산틴과 리코펜의 생물학적인 활성은 비타민 A와 다른 활성물질이 존재한다는 것을 알 수 있다. 산화 β-카로틴의 세포증식 억제 활성과 분화촉진 활성은 비타민 A 자체와 유사하다고 할지라도 일반적으로 산화 β-카로틴에 대한 그 효과는 다양한 환경에서 더욱 강력하다. 비타민 A와 달리, 본 발명에 있어서의 산화 β-카로틴은 비독성이다. 산화 카로티노이드는 분자량과 극성에 따른 많은 분획으로 분리되는 화합물의 혼합물이다. 분획은 비분획화된 산화 카로티노이드의 활성과 비견할 만하거나 더 높은 항암성을 보여준다.

Description

세포-분화 유발인자, 세포증식, 억제제 및 항종양제로 유용한 산화 카로티노이드, 레티노이드 및 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔, 유도분획 그리고 화합물

산업상 이용 분야

본 발명은 세포-분화-유도성, 세포증식 억제성(cytostatic) 및 항종양성을 가지며 화학요법제와 화학방지제로 유용한 산화 카로티노이드(oxidized carotenoids), 레티노이드(retinoids) 및 이와 관련된 콘쥬게이션(conjugation)된 폴리엔(polyene) 그리고 몇몇의 그 유도체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 카로티노이드, 레티노이드 및 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔의 광범위한 산화와 부가의 공정을 통하여 제조된 상기한 유도체에 관한 것이다.

종래 기술

카로티노이드와 레티노이드는 천연적으로 생성되는 물질로 광범위하게 콘쥬게이션된 폴리엔 사슬을 가지고 있다. 카로티노이드는 탄소-탄소 이중결합을 갖는 가장 광범위한 콘쥬게이션 시스템을 가지고 있어서 다양하고 화려한 색을 띤다. 자연발생 물질인 많은 카로티노이드와 레티노이드는 생물학적 활성을 가지고 있다. 예를 들면 어느 카로티노이드족의 탄화수소(가장 두드러지게는 β-카로틴(β-carotene) 또는 식품 중에 가장 풍부한 카로티노이드인 전비타민 A(pro-vitamin A))는 레티놀(retinol: 비타민 A의 한 형태)의 공급원이다. 카로티노이드는 싱글렛산소(singlet oxygen)를 비활성화시킴으로써 광민성(photosensitized) 산화로 인한 손상으로부터 식물을 보호한다. 역학(疫學)적인 증거는 카로티노이드 흡수가 몇몇 형태의 암의 발생과 역으로 서로 관련되어 있다는 것을 나타낸다(Peto et al, Nature, 1981, 290, 201-208). 카로티노이드와 레티노이드는 실험적으로 유도된 동물 종양의 발생을 지체시키는 것으로 알려져 있다(N. I. Krinsky. Actions of Carotenoids in Biological Systems, Annu. Rev. Nutr, 13, 561-587 (1993); Mattews-Roth, Curr. Top. Nurr. Dis. [New Prot. Roles Select. Nutr.], 1989. 22. 17-38; Pure Appl. Chem., 1985, 57, 717-722). 많은 식이요법 조절 연구가 비독성 그리고 식이요법의 항발암제로서 보충의 β-카로틴의 효력을 결정하기 위하여 실시되어, 효과적으로 암 사망률을 감소시키고 가장 최근에는 β-카로틴이 관상 심장병의 발생을 감소시킨다는 것과 관련된다는 가능성을 조사하기 시작하였다. 관련된 화합물(레티노이드-레티노익 에시드, 레티놀 그리고 레틴아미드(retinamides))의 사용에 대한 최근의 임상 데이터는 항암요법에서 약학제와 방부제(피부암, 머리와 목, 폐와 방광(bladder), 급성 전골수구성 백혈병(acute promyelocytic leukemia), 백반증(leukoplakia) 그리고 골수형성이상(myelodysplastic syndromes; D.L. Hill and C.J. Grubs, Retinoids and Cancer Prevention, Annu. Rev. Nutr. 1992, 12, 161-181)로서의 역할을 논증하여 왔다. 그리고 최종적으로 β-카로틴은 세포 내에서 발견되는 저산소압에서의 항산화성을 가지고 있다(Burton and Ingold, β-Carotene: and unusual type of lipid antioxidant, Science, 1984, 224, 569-573).

카로티노이드, 레티노이드 그리고 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔들은 산소 분자(O₂)에 대하여 반응성이 있으므로 낮은 온도의 보관할 때에 식료품 중에서 산화분해된다. 카로티노이드는 보다 더 크고 광범위하게 콘쥬게이션된 시스템을 갖는 이중결합이 있기 때문에 레티노이드보다 산소에 대하여 보다 더 반응적이다. 그럼에도 불구하고 이러한 카로티노이드 레티노이드 그리고 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔의 산화분해 및 그들의 잠재적인 생리학적 활성도는 비타민 A를 제외하고는 거의 관심을 끌지 못하였는데, 이것은 β-카로틴의 생물학적인 산화의 생성물로서 얻어진다.

몰디 등(Mordi et al.)에 의하여 테트라헤드론 레터(Tetrahedron Letters, 1991, 32(33), 4203-4206)에 게재된 β-카로틴 자동화의 검진상 연구는 β-카로틴 자기-초기 자산화(self-initiated autoxidation) 동안에 형성된 생성물에 대한 것이다. 이 논문은 β-카로틴 자산화의 첫단계에서 확인된 주생성물이 에폭사이드(epoxides), β-이온온(β-ionone), β-아포-13-카로테논(β-apo-13-carotenone)이며 최종 혼합물에서는 단쇄 카르보닐 화합물(short chain carbonyl compound)이 우세한 것으로 결론을 내리고 있다.

테트라헤드론지(Tetrahedron Vol. 49, No. 4, pp. 911-928, January 22, 1993)에 게재된 몰디 등에 의한 또 다른 논문인 "β-카로틴과 β-아포-8'-카로테날(β-apo-8'-carotenal)의 산화분해"은 β-카로틴을 산소 분자로 자기-초기 산화시키면 에폭사이드, 디하이드로퓨란(dihydrofurans), 카르보닐화합물, 이산화탄소(carbon dioxide), 소량의 알코올, 그리고 그 밖의 다른 화합물을 생성한다는 것을 보여준다. 또한 본 발명자 중의 한 사람에 의하여 공저된 논문에서도 용액으로부터, 특히 β-카로틴 산화의 후기 단계에서 흔히 침적되는 몇몇의 폴리머/올리고머 물질(polymeric/oligomeric material)에 대하여 언급하고 있다. 폴리머/올리고머의 성질에 대하여는 이 논문은 개시하고 있지 않다.

본 특허출원은 카로티노이드의 생물학적인 활성도가 카로티노이드 자체에서라기보다 인 비보(in vivo)에서 생성된 그들의 한 가지 이상의 산화 생성물로부터 유래한다는 생각을 발전시킨 것이다. 카로티노이드만큼 용이하지는 않으나 레티노이드도 역시 그것의 산화력으로 인하여 포함된다. 산화된 레티노이드의 생물학적인 활성도는 이미 알려진 레티노이드 자체의 활성도와는 엄격히 차이가 있다.

발명의 요약

적어도 몇몇의 기질(substrate)이 반응하는 조건에서 분자를 기초로 하여 몇배 증가된 양의 산소(O₂)에 의하여 β-카로틴, 칸타산틴(canthaxanthin) 또는 레티노익 에시드(retinoic acid)가 산화(앞으로 이 반응을 확대산화(extensive oxidation)이라고 한다.)될 때 생성된 혼합물이, 세포 배양에서 암-유도(cancer-induced) 그리고 바이러스-형질전환(virally transformed)된 포유류 세포가 정상 세포에 대하여 비독성적인 방식으로, 보다 덜 급속하게 증식되는 것을 유도한다는 것이 본 발명에 대한 연구의 1단계에서 밝혀졌다. 더욱이 세포 분화가 일어나는 처리된 몇 개의 세포주(cell line)에서 결정되었다. 다시 말하면, 암-유사(cancer-like) 세포가 결과적으로 정상 세포의 많은 특성을 갖는다. 확대산화된 β-카로틴에 의하여 얻은 물질의 혼합물은 발육부진(retard) 또는 발육정지가 될 수 있으며 비독성적 방식으로는 마우스의 종양이 성장될 수 있다는 것이 발견되었다.

본 발명은 올리고머 또는 폴리머 성분을 함유한 혼합물을 얻기에 효과적인 조건에서 카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴레엔을 산소로 산화시키기 위하여 제안된 것이다.

카로티노이드, 레티노이드 또는 콘쥬게이션된 폴리엔이 고상 또는 유기 용매에 용해된 상태에서 산소와 함께 실시하여 산화시킬 수 있다.

하기에 기술한 것과 같은 실험적인 테스트를 기초로 하여 β-카로틴, 칸타산틴, 리코펜(lycopene), 레티노익 에시드의 산화에 의하여 얻어진 산화 혼합물(올리고머/폴리머 성분)과 그들의 부분적으로 산화된 혼합물은 모두 항증식제(anti-proliferative agent), 항종양제(anti-tumor agent) 그리고 분화 유발인자(differentiation inducers)로 효과적인 것으로 알려져 있다.

폴리머 성분의 구조식은 연구의 1단계에서는 결정되지 않았다. β-카로틴, 칸타산틴, 또는 레티노익 에시드의 산화에 의하여 형성된 폴리머는 폴리퍼옥사이드(polyperoxide) 구조를 가지고 있으며 산성기(acidic group)를 포함하고 있다는 증거가 있다.

산화가 일어나는 동안에 비분리된(non-isolated) 카로티노이드와 레티노이드는 비타민 E와 같은 항산화제에 의하여 산화되는 것이 방지되는 것처럼 폴리머 성분의 형성이 자연적으로 지체되는 것처럼 보이는 것으로서 자연 발생의 본 발명의물질에 대한 문제 해결에 착수한다. 그러나 용액내 비타민 E가 존재하는 조건에서 β-카로틴을 산화시켜 얻은 (분리 중합된) 극성물질은 인 비트로 세포 배양(in vitro cell culture)테스트를 한 결과 산화가 억제되지 않은 상태에서 얻은 폴리머 물질만큼이나 에서 활성을 가지고 있다.

본 발명의 혼합물에 있어서 폴리머 성분 중 다수의 분자량은 카로티노이드와 레티노이드의 분자량에 비하여 상대적으로 낮다. 이러한 이유로 인하여 이 물질을 폴리머뿐만 아니라 올리고머라고 부를 수 있다. 본 명세서에서는 폴리머, 또는 폴리머릭이라는 용어는 이 물질을 정의하기 위하여 사용할 것이다.

상기에 정의된 확대산화에 의하여 얻은 본 발명의 혼합물은 본 발명에 대한 연구의 2단계에서 분자량에 따라서 분획화(fractionated)할 수 있는 것이 결정되었다. 분획화는 용매 침전화(solvent precipitation) 또는 젤침투 크로마토그래피(gel permeation chromatography: GPC)에 의한 실시예로 실시할 수 있다. 그렇게 하여 얻은 한 분획은 그것의 극성도에 따라서 더 분획화(서브-분획화(sub-fractionated))할 수 있다. 이렇게 하여 많은 분획과 서브-분획들을 얻을 수 있고 그 안에 포함된 어떤 화합물은 연구의 1단계에서 확인된 혼합물 각각의 활성과 비교할 만하거나 또는 더 높은 항종양성, 세포증식 억제성 및/또는 세포 분화 활성(cell-differentiation activity)을 보여준다.

고유한 화합물인 2-메틸-6-옥소-2,4-헵타디엔날(2-methyl-6-oxo-2,4-heptadienal)이 분리되었으며 세포증식 억제성과 항종양성을 보여주었다. 이 화합물은 본 발명(산화 β-카로틴)의 확대산화된 혼합물의 분획화나 종래의 합성법에의하여 얻을 수 있다. 이 화합물은 과거에 오일러 등(Oyler et al.)에 의하여 테트라헤드론지에 개시된 "레티노익 에시드의 자산화 생성물의 특성"에서 트랜스-레티노익 에시드(trans-retinoic acid)의 산화에 의하여 얻은 생성물로 보고되었다("Characterization of autoxidation products of retinoic acid", Tetrahedron Vol. 45, No. 25, pp. 7679-7694, 1989).

도면에서:

제1도는 확대산화된 β-카로틴의 역상 고압 액체 크로마토그래피(reverse phase High Pressure Liquid Chromatography(HPLC)에 의한 분리/분석을 나타낸 도면이다.

제2도는 확대산화된 β-카로틴의 젤침투 크로마토그래피 분석을 나타낸 도면이다.

제3도는 확대산화된 β-카로틴으로부터 얻은 산화 혼합물의 포리어변환 적외선(Fourier Transformed Infrared: FTIR) 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

제4도는 확대산화된 β-카로틴의 산화 혼합물의 프로톤핵자기공명(proton Nuclear Magnetic Resonance: NMR) 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

제5a도는 확대산화된 β-카로틴의 산화 혼합물(분획 1)에서 폴리머 성분의 자외선(UV) 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

제5b도는 β-카로틴의 자외선 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

제6a도 내지 제6b도는 하기와 같은 폴리머 혼합물의 고유 분획(specificfraction)의 젤침투 크로마토그래피의 결과를 나타낸 도면이다.

6a - 분획 1

6b - 분획 2

6c - 분획 3 그리고

6d - 분획 4

제7도는 폴리머 혼합물의 분획 1의 포리어변환 적외선 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

제8도는 고체 β-카로틴의 산화에 의하여 얻은 물질의 포리어변환 적외선 스펙트럼을 나타낸 도면이다.

제9도는 고체 β-카로틴의 산화에 의하여 얻은 폴리머 물질의 젤투과 크로마토그래피 분석의 결과를 나타낸 도면이다.

제10a도 내지 제10f도(사진)는 레티노익 에시드와 확대산화된 β-카로틴이 ES 세포의 분화에 미치는 하기와 같은 효과를 나타낸 도면이다.

제10a도 - ES 세포, 유발인자 없음

제10b도 - 레티노익 에시드

제10c도 - 확대산화된 β-카로틴 3μM

제10d도 - 확대산화된 β-카로틴 7.5μM

제10e도 - 확대산화된 β-카로틴 15μM

제10f도 - 확대산화된 β-카로틴 30μM

제11도는 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 그리고 18일에 10㎎/㎏의 양으로 투여되었을 때의 확대산화된 β-카로틴이 종양 성장에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.

제12도는 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 그리고 18일에 150㎎/㎏의 양으로 투여되었을 때의 확대산화된 β-카로틴이 종양 성장에 미치는 효과를 나타낸 도면이다.

제13a도는 여러 가지의 다른 양으로 처리한 실험용 동물과 대조군(처리하지 않은 동물)에서 종양 크기에 미치는 확대산화된 β-카로틴의 효과를 나타낸 도면이다.

제13b도는 여러 가지의 다른 양으로 처리하여 종양 주위에 출혈(hemorrhaging)이 전개된 실험용 동물과 대조군(처리하지 않은 동물)의 종양 크기에 미치는 확대산화된 β-카로틴의 효과를 나타낸 도면이다.

제14도는 본 발명의 목적에 있어서 주요한 초기 화합물의 구조식을 비교하기 위하여 나타낸 도면이다.

제15도는 본 발명의 주요 분획의 분자량 분할(split)을 나타낸 도면이다.

제16도는 혼합물에서 체계적으로 세 레벨 용매(three-level solvent)로 조절된 분획을 나타낸 도면이다.

제17도는 분획 SG1이 분획 LSG와 MSG으로 예비 젤투과 크로마토그래피 분리되는 젤투과 크로마토그램을 나타낸 도면이다.

제18a도와 제18b도는 LSG 분획을 219nm와 265nm에서 각각 감지하여 F1분획과 F2 분획으로 어떻게 분할되는가를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.

제19a도와 제19b도는 F1 분획을 219nm과 265nm에서 각각 감지하여 F1 분획이 F1.1, F1.2 그리고 F1.3 분획으로 어떻게 분할되는가를 보여주는 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도면이다.

제20a도와 제20b도는 F2 분획을 219nm과 265nm에서 각각 감지한 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도면이다.

제21도는 본 발명에 의한 분획이 확인되는 고유 화합물의 화학식을 나타낸 도면이다.

제22a도는 본 발명의 한 분획이 결장암(colon cancer) 세포주에 미치는 세포증식 억제 효과를 나타낸 도면이다.

제22b도는 본 발명의 한 분획이 백혈병 세포주에 미치는 세포증식 억제 효과를 나타낸 도면이다.

제23a도는 DA-3 세포주의 글루타티온 레벨(glutathione level)에 미치는 산화 β-카로틴(β-car^OX)의 인 비트로 효과를 나타낸 도면이다.

제23b도는 DA-3 세포주의 멜팔란(Melphalan) IC₅₀에 미치는 산화 β-카로틴의 인 비트로 효과를 나타낸 도면이다.

제24도는 난소암(ovarian cancer)에서 β-카로틴과 산화 β-카로틴의 항종양성을 나타낸 도면이다.

제25a도와 제25b도는 본 발명의 다양한 분획이 DA3 마우스 모델에서 종양 성장에 미치는 억제 효과를 나타낸 도면이다.

β-카로틴, 레티노익 에시드 그리고 이와 관련된 화합물은 다양한 형태의암, 곧 폐암 그리고 몇몇 형태의 백혈병의 치료에 있어서 잠재성 항암제(potential anti-cancer agents)로 확인되었고 방부제 및/또는 치료제로도 사용되었다. β-카로틴의 화학예방작용(chemopreventive action)도 역시 비타민 A (레티노익 에시드)의 작용 모드, β-카로틴의 산화 생성물 그 자체와 관련하여 관심을 받았다. 비타민 A는 적어도 부분적으로 증식되고 배와 유사(embryonic-like state)한 상태로부터 정상 세포를 닮아 가게 변환시키는 몇몇 형태의 암세포를 발생시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 비타민 A의 심한 독성으로 인하여 이것이 치료상 활용되는 것이 엄격하게 제한된다.

카로티노이드가 작용하는 메카니즘은 아직 밝혀지지 않고 있다. 세포 성장에 영향을 미치는 비타민 A자체와 이와 관련된 레티노이드의 작용과 분화는 세포핵(cell nucleus)에 위치한 레티노이드 수용체(retinoid receptors)를 거쳐서 조절되는 것으로 보인다.

β-카로틴과 가능한 다른 카로티노이드에 관하여 그것의 항암효과가 여하튼 비타민 A의 형성능에서가 아니라 온전한 분자의 항산화성에서 유래한다는 것이 널리 알려져 있으나 확증된 것은 아니다.

분리 β-카로틴과 다른 카로티노이드는 공기 중에서 산소와 반응하여 용이하게 자동산화(spontaneous oxidation)된다. 레티노이드도 역시 자동산화될 수 있다. 그러나 레티노이드에 존재하는 덜 콘쥬게이션된 올레피닉 결합(olefinic bonds)이 그들의 자동산화 속도와 정도를 감소시킨다는 점을 감안해야 한다.

카로티노이드와 레티노이드가 자동산화되면 생물학적 활성을 지닌 라디칼및/또는 라디칼-유도 생성물(radical-derived products)의 소스(sources)로 작용하는 세포간 전-산화체(pro-oxidants)처럼 인 비보에서 작용할 수 있다. 자유 라디칼과 자유 라디칼의 산화 생성물은 생체 세포의 신호 경로(signaling pathways)에서 중요한 역할을 하는 2차 메신저(secondary messenger)로 작용하는 것으로 인식되어 왔다. 사실, 오랫동안 자유 라디칼의 생성이 호기성의 환경 조건에서는 생명체에 불가피한 결과이며 이것은 일반적으로 세포에 대하여 해로운 것으로 여겨졌으며, 또한 더욱이 최근에는 자유 라디칼, 특히 옥시-라디칼(oxy-radicals)이 세포의 유지, 조절 그리고 발달에 있어서 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌다.

본 연구에서 확대산화된 카로티노이드, 레티노이드 그리고 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 그리고 구조적인 아날로그들(structural analogs)의 생성물은 비-비타민 A(non-vitamin)의 생동성(bioactivity)을 가지고 있다는 것이 관찰되었다. 이 사실은 β-카로틴, 칸타산틴 그리고 레티노익 에시드를 인 비보에서 확대 전-산화(extensively pre-oxidizing)하고, 이 산화 생성물의 혼합물을 생물학적 활성도에 대하여 테스트함으로써 증명하였다. 본 발명의 기초를 이루는 확대산화의 생성물이, β-카로틴의 인 비보 산화 변환에 의한 생성물로 잘 알려진 비타민 A와 다른 비타민 A-수득 카로티노이드(vitamin A-yielding carotenoids)와 다르다는 것을 인식하는 것이 중요하다.

연구의 2단계의 분획화 체계는 앞으로 β-car^OX으로 명명할 확대산화 β-카로틴 혼합물에 대해서 전개하였다. 이 혼합물을 용매 침전법(solvent precipitation)과 젤투과 (크기 배제) 크로마토그래피를 혼합 사용하여 분자량(MW) 분포를 기초로 하여 세 개의 분획으로 분할하였다. 이 생물학적 에세이는 대부분의 활성이 작은 그리고 중간의 분자량 분획에서 감지되었다는 것을 보여준다. 보다 복잡한 중간 분자량의 분획을 연구하는 데에는 더 많은 시간이 요구된다.

저분자량 분획은, 우전 용매 침전법을 사용하고 그 후에 역상고압 액체 크로마토그래피(reverse phase high performance liquid chromatography: RP-HPLC)를 사용하여 더 분획화하였다. 주요부분은 하나 또는 약간의 주요 화합물을 포함하는 몇 분획에 있었다. 이들 화합물 중 몇몇은 확인되었다. 불포화 케토알데히드(ketoaldehyde)인 한 화합물은 독립적인 과정(합성)을 거쳐서 얻었고 강한 세포증식 억제성과 항암성을 나타내었다. 이 화합물은 이전에는 β-카로틴으로부터 형성되는 것으로 확인되지는 않았으나 RA의 자산화의 생성물로 보고되었다. 불포화 콘쥬게이션된 케토알데히드급 화합물의 세포증식 억제성과 항암성은 전에는 알려지지 않았다.

많은 산화 β-카로틴 분획을 세포증식 억제성과 분화-유도 활성(differentiation-inducing activity)에 대하여 에세이하였다. 몇몇의 분획은 산화 β-카로틴보다 좀더 강한 세포증식 억제성을 나타내었다. 분화의 유도는 몇몇의 인간 세포주에서는 테스트되었었다. 가장 강한 효과는 IMR32 신경아 세포주(neuroblastoma line)에서 관찰되었다. 가장 두드러진 결과는 다른 분획으로 처리할 때에 한 세포주의 전구체 세포가 두 개의 다른 표현형(phenotypes: 뉴우런(neurons)과 신경교의 세포(glial cells))를 발생시킨다는 것이다(이러한 성질을 가진 물질은 뇌와 척수(spinal cord) 손상에 대한 신경 재생 요법(neural regeneration therapies)의 응용에서 찾아볼 수 있다).

산화 β-카로틴 항암성은 누드 마우스(nude mouse)의 이종이식편(xenograft)으로 성장한 인간 난소암주(ovarian cancer line)에서 논증하였다. 인간 세포주에서 유래한 누드 마우스 이종이식편은 동물의 세포주에서 유래한 동물 종양보다 인간 종양에 더 근접한 것으로 여겨진다. 첫 특허에 기술된 인 비보 모델(in vivo model)을 이용, 산화 β-카로틴의 많은 분획에 대하여 테스트하여 몇몇의 분획들이 강한 활성을 가지고 있다는 것이 나타났다. 또한 그 활성이 동물에서 두드러진 독성을 나타내지 않는 농도에서 관찰된다는 것은 주목할 만한 것이다.

이제, 연구의 2단계 후에 본 발명자들은 이전에 정의된 것과 같은 산화 혼합물에서 유래한 하나 이상의 화합물은 항암제로서 활성이 있고 하나 이상의 화합물을 포함하는 분획은 한 화합물을 포함하는 분획보다 활성이 크다는 것을 확인하였다.

토마토에서 발견되는 카로티노이드인 리코펜(lycopene: 제14도)도 역시 확대산화 후에는 세포증식 억제성을 가진다. 리코펜은 β-카로틴에 존재하는 두개의 시클로헥실환(cyclohexyl ring)이 부족하다.

본 발명을 확인하기 위하여 인 비보와 인 비트로 생물학적 테스트를 실시하였고 β-카로틴, 칸타산틴 그리고 레티노익 에시드의 산화 혼합물에 대한 합성 방법과 분석 데이터는 이후에 기술한다.

실시예

연구의 1단계.

화학

β-카로틴, 칸타산틴 그리고 레티노익 에시드는 하기에 기술한 것과 같이 산화되었다:

실시예 1: β-카로틴의 산화

산소로 포화된 벤젠에 녹아 있는 β-카로틴 20mM 용액(Fluka)을 대기압의 순수한 산소 분위기 하에서 어두운 곳에 있는 쉐이커 베스(shaker bath)에 두고 30℃에서 방치하였다. 72 시간 후에 산소 6 내지 8 몰랄당량이 소비되었을 때, 용매를 증발시켜 레진과 유사한 노란색의 잔기를 얻었다.

용매의 효과:

β-카로틴의 사염화탄소(carbon tetrachloride)에서의 산화는 벤젠에서의 결과와 본질적으로 동일하였다.

형성된 비타민 A의 양:

β-카로틴의 인 비보 효소산화(enzymatic oxidation)의 두 생성물인 레티놀(retinol)과 레티노익 에시드 모두 산화 혼합물에서 감지되지 않았다. 레티노익 에시드로 산화될 수 있는 레티놀이 생성물로 확인될 지라도 너무 적은 양을 포함하고 있어 산화 β-카로틴 혼합물의 생물학적 활성을 설명할 수 없다. 더욱이 산화 혼합물의 생물학적 활성은 하기에 기술한 것과 같이 비타민 A와 실질적으로 차이가 있다.

폴리머 물질(polymeric materials):

폴리머 물질의 실질적인 양은 산화가 일어나는 동안에 형성된다(하기에 기술함). 다른 올레피닉 화합물의 산화반응과 유사하여, 보다 고분자량을 가진 물질은 산화 β-카로틴으로 구성되어 있는 폴리머에 해당되는 것으로 보인다. β-카로틴의 다양한 농도로 용액내의 β-카로틴의 농도에 대한 폴리머화의 의존성을 결정하였다. 산소가 포화된 벤젠에서의 20 mM, 2mM 그리고 0.2 mM β-카로틴 용액을 순수한 산소 분위기(760 mmHg), 30 ℃의 온도 그리고 어두운 곳에서 방치하였다. 폴리머 성분(polymeric ingredient)은 모든 경우에 있어서 주요한 생성물이다. 더욱이 폴리머 성분은 β-카로틴의 산화 초기에 형성된다.

제1도는 역상고압 액체 크로마토그래피에 의하여 산화 혼합물을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

제2도에서는 성분의 분자량에 따라 산화 혼합물의 조성을 독자적 단위(arbitrary units)로 나타낸 산화 혼합물을 GPC에 의하여 확인한 결과를 나타내었다. 분자량의 범위는 약 600 내지 약 8000달톤(Dalton)으로 넓게 분포되었으며 약 900달톤에서 최대값을 나타내었다(4.9min.에서의 샤프한 피크는 GPC 칼럼의 성질에 의한 인공 산물이고 약 1400 이상의 분자량을 가진 혼합물의 성분은 자동적으로 용출된다).

제3도는 산화 혼합물의 포리어변환 적외선 스펙트럼이다.

제4도는 산화 혼합물의 프로톤핵자기공명 스펙트럼이다.

산화 β-카로틴으로부터의 생성 혼합물의 부분 분획법(partial fractionation):

용액 중 얻은 잔여의 β-카로틴이 포함되지 않는 확대산화 혼합물은 용매 침전법을 연속적으로 행하여 분획화하였다. 그 분획들을 젤투과 크로마토그래피와 원소 분석을 사용하여 확인하였다. 원소 분석 그리고 산과 과산화물의 함량분석 결과를 표 1에 나타내었다:

표 1. 산화 β-카로틴의 연속 용매 침전법에 의한 분획의 성질

분획들은 하기의 방법에 의하여 얻었다: 조혼합물(1.2g)을 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran: THF, 5ml)에서 용해시키고 헥산(hexane, 15ml)을 서서히 첨가하면서 볼텍스-혼합(vortex-mixed)하였다. 시료를 3000rpm에서 3분동안 원심 분리하고 유질의 잔기(oily residue)를 분리하여 THF와 헥산의 혼합물(5:15)로 한 번세정하고 진공하에서 건조하여 분획1을 얻었다. 세정 과정으로 액체와 합쳐진 잔여의 용액을 증발시키고 잔여물을 THF(3ml)에서 용해시켰다. 헥산(15ml)에 의한 침전을 행한 후에 원심분리, 세정(THF/헥산, 3:15)하여 분획2를 얻었다. 상기와 같이하여 세정하여 합쳐진 잔여의 용액을 증발시키고 벤젠(3ml)에서 용해시켰다. 헥산(15ml)으로 침전시킨 후에 세정(벤젠:헥산=3:15)하여 분획3을 얻었다. 상층의 물질을 분획4로 하였다.

각 분획의 중량과 GPC 소량으로부터 폴리머 물질이 산화 β-카로틴의 생성 혼합물의 90 중량%에 근접한다고 설명할 수 있다. 초기 세 개의 분획(곧, 생성물의 주요 부분)에 있는 산소의 퍼센트는 6 내지 8 몰랄 당량의 산소가 β-카로틴에 의하여 받아들여졌으며 생성물의 형성을 수반하는 30 내지 35%의 총 중량증가가 발생한다는 것을 반영한다. 본래 11개의 콘쥬게이션된 이중결합을 포함하는 β-카로틴에 6 내지 8 산소분자를 첨가하는 것은 이중결합의 대부분이 새로운 탄소-산소 결합의 형성에 의하여 분해된 것처럼, 콘쥬게이션된 이중결합 시스템의 대부분을 상실한다는 것을 의미한다. 그리하여 폴리머 물질의 자외선-적외선 흡광 스펙트럼에서는 모체 β-카로틴(parent β-carotene)과 비교하였을 때 훨씬 단파장(280nm에서 쇼울더(shoulder)를 갖는 약 240nm)에서 최대 흡광도를 보여준다(제5a도, 제5b도).

THF, 메탄올, 아세톤 그리고 아세토나이트릴에서 용해된 폴리머 물질은 상온 이하의 온도에서는 매우 안정하나 가열하면 부분적으로 분해되어 기체 크로마토그래피에 의하여 휘발성으로 확인되는 생성물을 형성한다.

산화 혼합물에서 1 내지 4의 특정 분획의 GPC분석(제6a도 내지 제6d도 각각)과 제2도를 비교하여 보면, 분획 3과 4, 특히 분획 4는 보다 저분자량을 갖는 물질을 대량 포함하는 반면에 분획 1과 분획 2는 보다 고분자량을 갖는 화합물을 비교적 많은 양으로 포함한다는 것을 알 수 있다.

항산화제의 존재하에서의 β-카로틴의 산화

β-카로틴(20mM)을 알파-토코페롤(alpha-tocopherol) 또는 2,6-디-테셔리-부틸-4-메톡시페놀(2,6-di-t-butyl-4-methoxyphenol)의 (β-카로틴에 대하여) 0.01 내지 0.10몰랄 당량이 존재하는 조건인 것을 제외하고는 상기와 같은 조건에서 산화시켰다. 상당히 속도를 낮추어 반응을 진행하였다(1몰랄 당량의 산소를 약 6일동안 소비하였다). 산소의 업테이크(oxygen uptake) 곡선은 선형이었다. 이 곡선의 기울기는 억제제의 타입과 농도에 무관하였다. β-카로틴의 소비량은 6일동안에 10%을 넘지 않았다.

자유 라디칼 개시제의 존재하에서의 β-카로틴의 산화

2,2'-아조-비스(2-메틸프로피오나이트릴)(2,2'-Azo-dis(2-methylpropionitrle)은 반응 생성물의 형성을 가속하였다.

β-카로틴의 고체 상태 산화:

유사한 폴리머 물질이 FTIR과 GPC분석에 의하여 나타난 것처럼 순수한 결정성 카로틴이 고체 상태에서 산화되었을 때, 실질적으로 유일한 생성물로 생성되었다. 결정성 β-카로틴을 낮동안에 빛을 차단하지 않은 채 깨끗한 개방유리용기에서 8주까지 공기중에서 방치함으로써 반응을 실시하였다. 반응은 용액중에서 실시된 반응보다 상당히 느리게 진행되었다(40일:3일). 고체 β-카로틴의 산화에 의하여얻은 폴리머의 FTIR 스펙트럼(제8도)과 용액내에서의 산화로 얻은 폴리머 분획1의 FTIR 스펙트럼(제7도)은 흡광피크의 위치와 상대적인 세기에 있어서 매우 유사하다. GPC분석 결과에 대하여도 동일하다(제9도와 제6a도). 더욱이 고체 β-카로틴의 산화와 용액내에서의 부분 그리고 확대산화에 의하여 생성된 물질은 배양, 성장한 암 그리고 형질전환 세포의 증식을 억제하는 생물학적 활성에 있어서 유사한 경향을 나타내었다.

실시예 2: 칸타산틴의 산화

β-카로틴의 산화에서와 동일한 조건에서 칸타산틴을 산화시켰다. 산소로 포화시킨 벤젠내의 칸타산틴 20mM(Fluka) 용액을, 대기압에서 순수한 산소의 존재하에서 어두운 39℃의 쉐이커 베스에서 방치하였다. 190시간 후에 약 7몰랄 당량의 산소가 소비되었을 때에 용매를 증발시켜 레진과 유사한 노란색의 잔기를 얻었다. 반응은 좀 느렸으나 매우 확대된 산소와의 반응이 있었다. 산화 혼합물의 GPC분석(데이타는 나타내지 않음)은 확대산화 β-카로틴과 매우 유사하며, 이것은 반응 생성물들이 주로 폴리머 물질이라는 것을 나타낸다.

실시예 3: 레티노익 에시드의 산화

β-카로틴과 칸타산틴에서의 조건과 동일한 조건하에서 레티노익 에시드는 산소와 매우 느리게 반응하였다. 이 반응은 상승된 압력하에서 가속화하여 실시하였다.

유리로 되어 있는 테스트 튜브에서 벤젠(0.5ml, 20mM)에 용해된 레티노익 에시드(시그마)를 인코넬 600(INCONEL 600)이 장착된 고압 장치에 두었다. 이 장치는산소로 300psi로까지 가압하였으며 42℃로 맞추어져 있는 온도-조절 베스에서 3일동안 방치하였다. 반응 혼합물의 HPLC 분석결과는 반응이 불완전하다는 것을 보여 주었다. 온도를 50℃로 상승시키는 것을 제외하고는 동일한 조건하에서 2일을 더하여 5일을 총반응시간으로 하여 반응을 진행하였다. 산화되지 않은 레티노익 에시드는 거의 남아 있지 않았다(총 생성물의 1% 미만). GPC분석(데이타는 나타내지 않음)으로 좀 더 고분자량의 생성물이 존재한다는 것을 알 수 있는데 총반응 생성물에서 β-카로틴과 칸타산틴에서 발견된 것보다 훨씬 작은 분획을 가리키나, 칼럼의 차단(cut-off)보다 더 고분자량(약 1400 달톤)을 가진 것으로 감지되는 물질이 존재하지 않는다는 것을 가리킨다.

생물학

다양한 배양 세포주에서 세포증식 억제성, 분화 유도 그리고 항종양발생바이러스성에 대한 테스트를 실시하여 인 비트로 생물학적 에세이를 하였다. 대부분의 결과는 산화 β-카로틴에 대하여 얻었으나 확대산화 칸타산틴과 레티오닉 에시드에 대한 몇몇의 결과도 포함하였다.

산화 β-카로틴과 확대산화 칸타산틴에 대하여 하기의 사항에 대하여 인 비보 테스트를 실시하였다:

- 마우스에서 독성;

- 종양 변화의 조직병리학적(histopathological) 검사를 포함한 종양 성장의 억제 작용(조직이식, 화학적으로 유도된 랫 유방암(mammary cancer) 세포주에서 유래한 암)

인 비트로 테스트

본 발명에 의한 혼합물의 생물학적 성질을 결정하기 위하여, 산화 β-카로틴을 인 비트로로 세포증식 억제 효과와 분화 유도에 대하여 테스트하였다. 산화 β-카로틴의 효과에 차이가 나게 하기 위하여 레티노익 에시드 및/또는 β-카로틴을 몇몇 테스트 세포주에서 대조군으로 사용하였다. 세포 사이클(cell cycle)에 대한 산화 β-카로틴의 작용도 관찰하였다. 산화 β-카로틴의 활성도와 관련된 모든 농도는 β-카로틴의 마이크로 몰랄당량으로 나타내었다.

세포 모델: 세포주 및 성질

다양한 세포주를 증식 및/또는 분화에 대한 산화 β-카로틴의 효과를 테스트하기 위하여 사용하였다. 주(line)는 주(established, 株)형질전환된 세포주이거나 암환자의 종양으로부터 분리된 것이다. 더욱이 쥐(murine)의 두개의 세포주를 적당한 단백질 마커로 적절히 정의되는 세포 분화 프로그램(cellular differentiation program)에 사용하였다. 이 두 개의 주에 대하여 인간 유두종 바이러스 타입 16(papilloma virus type 16: HPV16)-경관암(頸管癌, cervical cancer)과 연관있는 바이러스-으로 트랜스펙트된(transfected) 클론의 정합대응(matching)을 특징화하였고 형질전환을 보여 주었다. 형질전환된 표현형 L6-HPV16(L6 세포에서 유래) 그리고 BALB/c/MK-HPV16(BALB/c/MK 세포에서 유래)은 소프트 아가(soft agar)상에서 그들의 호르몬에 대한 독립성과 콜로니(colonies)의 형성능이 확인되었다.

이상증식(neoplasia) 중증환자의 검시에 있어서, 바이러스 단백질의 표현 패턴은 역트랜스크립타제 폴리머라제 연쇄 반응법(reverse transcriptase polymerasechain reaction: RT-PCR)을 이용하여 확인하였다. 검시체의 표현 패턴은 형질전환된 L6 클론과 유사하며, 이것은 테스트 목적에 대한 L6 모델의 연관성과 유효성을 증명하여 준다.

BALB/c/MK 세포주는 Ca²⁺이온의 고농도의 노출에 따라 차이가 나기 때문에 관심의 대상이 된다. 세포가 저칼슘에 노출되면 72 시간 미만에 전-분화 상태(pre-differentiation state)로 변환한다.

산화 β-카로틴의 분화 유도 성질을 마우스 엠브리오닉 간세포(mouse embryonic stem cells: 곧 준(quasi) 정상 세포)와 몇몇의 동물 및 인간의 신경하세포주(neuroblastoma cell line: 곧 암세포)에서 사용한 두 개의 부가의 모델에서 더욱 실험하였다.

엠브리오닉 간(embryonic stem; ES) 세포는 전능(全能, totipotent), 곧 유기체의 어떠한 세포계(cell lineage)도 발생시킨다. 어떤 조건하에서 인 비트로에서 그들은 자동적으로 혼합형으로 분화된다. 분화를 증진시키는 것으로 알려진 물질로 처리하면 ES 세포는 하나의 표현형으로 변환된다. 예를 들면, 레티노익 에시드는 내쇼날 리서치 카운실(National Research Council)에서 확립된 조건하에서 배양된 ES 세포를 자극시켜 뉴우런으로 분화하였다(데이터 공개되지 않음).

쥐 세포 모델

1a. L6 랫 최초 근아세포(primary myoblasts) (L6).

1b. 인간 유두종 바이러스 16(L6-HPV16)으로 트랜스펙트된 L6 세포.

2a. 마우스 BALB/c/MK 각질세포(keratinocytes) (BALB/c/Mk).

2b. 인간 유두종 바이러스 타입 16(BALB/c/MK-HPV16)으로 트랜스펙트된 마우스 BALB/c/MK.

3a. 매트(Mat) B-WT:랫 유방선암(mammary adenocarcinoma).

3b. 멜팔란에 대하여 저항성이 있는 매트 B-MLNr 랫 유방선암.

3c. 아드리아마이신(adriamycin)에 대하여 저항성이 있는 매트 B-DOXr 랫 유방선암.

4. B16 마우스 흑색종(melanoma)

5. DMBA에 의하여 유도된 DA-3 마우스 유방암(mammary carcinoma).

6. FDCP-1 마우스 척수성 백혈병(myeloid leukemia).

두 개의 세포주, 매트 B MLNr과 매트 B-DOXr은 다약제(meltidrug)에 대한 저항성을 보여준다; 매트 B-WT은 야생형(wild type)이다. 그들은 잘 분화되지 않는 세포로서, 에스트로겐(estrogen) 또는 프로게스테론(progesterone) 수용체를 발현시키지 못한다.

인간 세포 모델

7a. MCF7-WT 인간 전흉부암(breast carcinoma).

7b. 아드리아마이신에 대하여 저항성을 갖는 MCF7-ADRr 인간 전흉부암.

세포는 적당하게 분화되며 에스트로겐과 프로게스테론 수용체에 대하여 양성이다.

8a. 유로(Uro) 9 인간 요로상피암(urothelial carcinoma); 잘 분화됨.

8b. 유로 10 인간 요로상피암; 잘 분화되지 않음.

9. L14 인간 폐선암(lung adenocarcinoma); 적당하게 분화됨(모트리얼 쥬이쉬 병원(Montreal Jewish Hospital)의 레이디 데이비스 연구소(Lady Davis Institute)에서 인-하우스 격리(in-house isolated) 종양 환자).

10. NB4 인간 급성 전골수구성 백혈병.

세포증식 억제 효과

표2는 프로메가(Promega, 미토콘드리아 디하이드로게나제(mitochondrial dehydrogenase) 활성을 기초로 한 신진대사 테스트)에서 MTT 생존력(viability)/독성(toxicity) 에세이 결과이다. 생존력은 산화 β-카로틴의 증가한 농도(2.5배)에서 에세이하였다. 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포 집단(cell population)의 성장을 이등분하는 양은 IC₅₀값으로 보고되었다.

표 2. 확대산화 β-카로틴의 세포증식 억제 효과

저밀도(10⁴내지 10⁵cells / 1-5ml)로 배양한, 지수적으로 성장한 세포를 산화 β-카로틴의 다른 농도에서 하나의 양에 대하여 72시간 또는 그 이상을 노출시켰다. 세포성장은 MTT 테스트에 의하여 결정하였다. IC₅₀값(β-카로틴 당량으로 표시)을 생존곡선(산화 β-카로틴의 농도에 대한 세포성장의 곡선)으로부터 도시적으로 결정하였다. 표 2에서의 각각의 값은 적어도 두 개의 독립적인 실험의 평균값에 해당한다. 다른 무리의 확대산화 β-카로틴을 테스트하여 양립하는 결과를 얻었다. NB4 백혈병 세포주의 민감성과 L6 대조세포에 대한 활성 부족에 주위를 기울어야 한다. 몇몇의 세포주에 대하여 대조군으로 사용된 레티노익 에시드와 β-카로틴(각각 3μM)은 레티노익 에시드에 반응하는 NB4 세포를 제외하고는 세포성장 곡선에 아무 효과가 없는 것으로 나타났다.

MTT 테스트의 사용에 대한 교차-검사(cross-check)로서 L6과 L6-HPV16 세포주에 대한 IC₅₀결과를, 표 3에 기술한 것과 같이 쿨터 카운터(Coulter counter)를 사용한 세포 산출법(cell enumeration)을 이용하여 확인하였다.

표 3. MTT 테스트와 쿨터 카운터에 의한 세포 산출법으로 측정한 산화 β-카로틴에서의 세포증식 억제 효과(IC ₅₀ [μM])의 비교

유기용매에 의한 연속침전후에 산화 β-카로틴으로부터 얻은 분획을 MCF7-WT 세포주에서 에세이하였다; 표 4에서 보는 바와 같이, 1 그리고 3의 두 개의 분획이 조혼합물(crude mixture)보다 상당한 활성을 갖는다는 것을 알 수 있다.

표 4. MC7-WT 세포주에 대한 분획의 세포증식 억제 효과(μM)

세포를 표 2의 각주에 기술되어 있는 대로 처리하였다.

정상 세포를 적당하게 억제한 것처럼 보이지만, 장시간에 걸친 배양으로 서서히 그 효과가 없어져 산화 β-카로틴이 철저하게 정상 세포에게 영향을 끼치지 않는다는 것을 보여준다. 이것은 암환자가 제한된 부작용으로 반복하여 처치되는 것을 잠재적으로 허용한다.

세포분화에 미치는 효과

L6 근아세포 모델에 대한 형태학적인(morphological) 관찰:

배양된 랫 근아세포인 L6은 인 비트로에서 분화할 수 있다. 내쇼날 리서치 카운실에서 이들 세포의 분화 프로그램 5단계를 생물형태계측(morphometry), 발생부위 면역형광법(in situ immunofluorescence) 그리고 유량 세포혈구계산 분석(flow cytometry analysis)을 이용하여 수행하였다.

근세포(myocyte) 분화의 기지(旣知) 마커(특성 단백질: characteristic proteins)로 사용된 단백질은 다음과 같다: 피브로넥틴(fibronectin), a-악틴(a-actin), N-캠(N-CAM), 바이멘틴(vimentin) 그리고 아세틸콜린 수용체(acetylcholine receptor)의 발현이다. 더욱이, 전융합 단계(prefusion stage)에 특이한 아세틸콜린 수용체가 L6-HPV16 세포에서 발현되지 않는다는 것이 증명되었다. 5단계가 확인되고 분화의 증가되는 순서의 표현형을 하기와 같이 나타낸다:

1. 엠브리오닉 섬유아세포(embryonic fibroblast)와 유사한 외양을 갖는 세포.

2. 이극성(bipolar) 형태를 획득한 세포.

3. 방향성을 갖게 된 세포.

4. 전융합단계에 들어간 세포.

5. 신시튬(syncitium)과 근관(myotubes)의 형성을 보여준 세포.

HPV16이 트랜스펙트된 세포를 전융합단계에서 형질전환하고 블록(block)하는 것이 밝혀졌다. 곧, HPV16이 트랜스펙트된 세포가 단계 4에서 블록된다는 것이다. 그러나, 산화 β-카로틴으로 처치하면 세포의 더 나은 방향성이 관찰되고 몇몇 신시튬 형성이 개시되며, 이것은 분화의 단계5에 부분적으로 참여한 것에 해당한다.

배지에서 배양하는 것은 그것들의 칼슘 함량에 차이가 있는 것은 배지에 있는 칼슘의 양이 적을 때(0.05 mM), 산화 β-카로틴이 대조군과 트랜스펙트된 세포 모두에 더 효력이 있다는 것을 나타낸다. 더욱이 분화 마커의 발형에 있어서 칼슘과 산화 β-카로틴에서 관찰된 길항작용(antagonism)은 상기에 보고하였다. 이것은 산화 β-카로틴으로 처치된 세포에 대한 칼슘의 효과에 관한 연구 실험에 도움을 주었다. 근아세포와 각질세포 모델을 사용하였다.

간단히 말하면, L6 근세포에서는 세포의 외인성(exogenous) 칼슘의 인플럭스(influx)가 비특정한 양이온성 채널(nonspecific cationic channels)을 통하여 일어난다(본 발명자들이 이전에 확인하였으며 이미 존재한 문헌에서의 결과와 동일함). 세포의 내부에서 내부에 축적(internal stores)된 것으로부터 칼슘 방출(calcium release)이 일어나 칼슘 레벨이 조절된다. 더욱이 L16 분화 프로그램의 전융합단계에서 발현된 아세틸콜린 수용체는 근형질의(sarcoplasmic) 칼슘 채널을 조정한다.

각질세포에서 칼슘의 출입과 축적으로부터의 방출을 조절하는 채널의 성질은아직 밝혀지지 않았다.

실험은 두 개의 기술에 의하여 실시되었다: 전기물리학(electrophysiology)과 퓨라-2(Fura-2)를 이용한 이미지화(imaging). 예비 결과로 산화 β-카로틴이 칼슘 채널 블록제 또는 칼슘 킬레이터(calcium chelator)로 작용한다는 것을 알 수 있다. 이것은 다약제에 대한 저항성을 갖게 처방된 세포주에서 다약제 저항성을 부분적으로 극복하는 능력을 확인시켜 준다. 그러나 이것은 베라파밀(verapamyl)과 같은 종래의 채널 블록제보다 덜 효과적인 것처럼 보인다.

BALB/c/MK 모델에서 마커의 분화 패턴

폴 카탈로그(Poll catalogue)에서 정의된 BALB/c/MK 각질세포, 시토케라틴(cytokeratins) 1, 5 그리고 10은 웨스턴 이뮤노블롯(Westrern immunoblot)에 의하여 처음으로 확인되었다. 시토케라틴 1과 10은 시토케라틴 5가 덜 분화되고 여전히 세포를 증식시키는 동안 좀더 고레벨의 분화와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.

유량 세포혈구계산 분석은 시토케라틴이 일반적으로 미처치된 정합대응 대조군 세포보다 미처치된 HPV16 트랜스펙트된 세포에서 덜 발현된다는 것을 보여주었다.

시토케라틴 5

1.8mM 칼슘에 노출시키면 3일 내에 불가역적 분화를 유도하고 대조군과 형질전환된 세포에 시토케라틴 5의 발현을 증가시켰다. 6일의 노출이 대조군에서의 발현을 유도하기에 충분하다는 것을 제외하고는 산화 β-카로틴에 노출시키는 것도유사한 효과를 보여주었다. 반면에 형질전환 세포에 대하여는 9일이 필요하였다.

동시에 두 유발인자(inducer)에 노출시키는 것은 발현의 강화를 상쇄시켜 두 화합물이 길항적이라는 것을 보여준다.

시토케라틴 1과 10

증가된 칼슘(0.05mM 내지 1.8mM)에 노출시키면 대조군 세포에서는 이 두 시토케라틴 발현의 현저한 증가가 관찰되는 반면에 형질전환된 세포는 어떠한 반응도 보이지 않았다.

이와 대조적으로 산화 β-카로틴은 두 라인에서 두 마커의 발현을 유도하였다. L6 라인에서는 대조군과 비교하여 BALB-HPV16으로부터 반응을 보이기 위하여 보다 장시간의 노출이 요구되었다.

다시 말하면, 칼슘 처리에 대한 길항작용이 관찰되었다. 적어도 각질세포 모델에서 보면 산화 β-카로틴이 HPV16 형질전환 세포에서의 분화를 증가시키는 반면에 전통적인 칼슘 세포 분화 유발인자는 비효과적이라는 것을 증명되기 때문에 이러한 결과를 매우 중요하게 생각할 수 있다.

산화 β-카로틴(형태학적인 기준에 의하여 측정됨)에 의한 분화를 유도하는 것도 역시 NB4 전골수구성 백혈병 세포에서 관찰되었다.

엠브리오닉 간세포 그리고 신경아세포종(neuroblastoma) 세포

엠브리오닉 간세포에서 뉴우런으로의 레티노익 에시드에 의한 분화를 유도하는 것에 대하여 내쇼날 리서치 카운실에서 전개된 것과 유사한 조건하에서 산화 β-카로틴도 역시 엠브리오닉 간세포의 분화를 제 10도에서와 같이 증진시켰으며면역조직화학적(immunohistochemical)인 기술을 이용하여 특이 마커에 의하여 평가하였다. 그러나 엠브리오닉 간세포에 대한 레티노익 에시드와 산화 β-카로틴의 효과에는 두 가지의 중요한 차이점이 있다.

1) 레티오닉 에시드는 엠브리오닉 간세포 분화를 투여량에 독립하는 방식으로 0.1 내지 1μM의 범위에서 양극성 표현형의 80%로 촉진시킨다(제 10b도). 반면에 적정 농도(7.5μM β-카로틴 당량)의 산화 β-카로틴은 펄킨제 세포(Purkinje cells)와 유사한 고도로 가지가 있는(branched) 표현형의 약 90%의 말단 분화를 일으킨다(제 10d도). 고도의 분지(high branching) 메카니즘(mechanism)은 아직 완전하게 밝혀지지는 않았다.

2) 말단 분화의 유도는 역학적으로 두 유발인자에 대하여 다르다: 산화 β-카로틴은 레티노익 에시드보다 훨씬 더 효과적이다(본 실험 조건하에서 각각 15시간:3시간).

신경아 세포주 Neuro2A, IMR32, SK-N-SH 그리고 SK-N-MC에서 산화 β-카로틴은 두드러진 고도의 분화를 유사하게 촉진하였으며 반면에 레티노익 에시드는 부분 분화만을 일으켰다.

엠브리오닉 간세포와 신경아세포종 모델의 결과는 산화 β-카로틴이 강력한 분화 촉진제이며 작용 메카니즘이 레티노익 에시드와 다르다는 것을 보여준다.

종양발생 바이러스 유전자(tumorigenic viral genes)의 발현에 대한 작용

산화 β-카로틴이 종양발생 바이러스 유전자의 발현에 대한 활성을 가지고 있다는 관찰은 세 가지의 독립적인 실험에 의존한다.

시토패티(Cytopathy): 바이러스 감염의 증상은 형질전환된 세포 L6-HPV16과 BALB/c/MK-HPV16의 핵주위에 심한 공포를 형성(空胞形成, vacuolization)하는 것처럼 가시적인 것으로서 산화 β-카로틴의 노출에 매우 감소되거나 없어진다.

메신저 RNA는 산화 β-카로틴에 노출 및 노출하지 않는 트랜스펙트된 세포에서 추출하였다. 바이러스 유전자 생성물의 발현 패턴에 대한 카이네틱스는 RP-PCR에 의하여 분석하였다. 초기의 결과는 바이러스 단백질과 myc 암유전자(oncogene)증식과 관련이 있는 암유전자)의 발현 패턴이 레티노익 에시드 또는 β-카로틴으로 처리한 세포와 비교하였을 때에 산화 β-카로틴으로 처리한 세포와 다르다는 것을 보여주었다.

HPV16의 E6과 E7 암유전자 단백질의 공통인 단편에 대하여 배양한 모노클로날 항체(monoclonal antibody)는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동, 웨스턴 블롯 분석 그리고 유량 세포혈구계산을 이용하여 두 단백질의 발현을 결정하는데에 사용되었다. 바이러스 트랜스펙트 세포를 산화 β-카로틴에 노출시킨 후 9일 내지 12일 후에 E6과 E7 단백질의 발현에 감소가 관찰되었다.

불완전 산화된 산화 β-카로틴의 세포증식 억제 효과, 항산화-억제 β-카로틴 산화 혼합물, 확대산화 칸타산틴 그리고 레티노익 에시드:

표 5는 두 폴리머 산화 생성물과 반응하지 않는 β-카로틴, a-토코페롤(5몰%)에 의하여 억제된 β-카로틴의 산화로 얻은 산화 생성물을 포함하고 있는 불완전 산화된 β-카로틴MC7-WT 세포주에 대한 상대적인 효과는 칸타산틴과 레티노익 에시드를 완전하게 산화시킨다(합성은 상기에 기술). 모든 시료는 적어도 몇몇의 고분자량의 산화물질을 포함하며 상당한 세포증식 억제 활성을 보여주었다.

표 5. 확대산화 칸타산틴과 레티노익 에시드뿐만 아니라 부분 산화 β-카로틴, β-카로틴의 산화억제에서 얻은 생성물의 MC7-WT 세포주에 대한 세포증식 억제 활성

세포는 표 2의 각주에 기술한 대로 처리하였다.

산화 β-카로틴의 독성과 항종양성의 인 비보 연구

독성에 대한 접근: 산화 β-카로틴 그리고 확대산화된 칸타산틴

BALB/c 암컷 마우스의 체중을 모니터를 모니터하며 동물의 일반적인 검사법에 의하여 독성을 검사하였다. 5㎎/㎏과 10㎎/㎏의 양이 복강내로(intraperitoneally) 1, 3 그리고 5일에 투여되었다(표 6). 대조군은 용매만을 투여하였다(20% 에탄올 수용액). 1, 3, 5, 8 그리고 11일에 50 그리고 100㎎/㎏을 투여하여 이와 유사한 실험을 실시하였다. 공개적인 독성 효과는 관찰되지 않았다(데이터 기술하지 않음.).

산화 β-카로틴은 건강한 마우스에 100㎎/㎏의 6번 투여되었을 때에도 비독성이다. 150㎎/㎏까지의(종양 베어링(bearing) 마우스로) 반복된 투여(9회)로도 아무런 역효과가 관찰되지 않는다는 것을 알 수 있다.

이와 유사하게 확대산화된 칸타산틴은 동일한 양/투여 패턴 체제(regime)하에서 공개적인 독성의 신호를 나타내지 않았다(데이타는 기술하지 않음).

표 6. 확대산화된 산화 β-카로틴의 마우스의 체중에 대한 효과

항종양 활성: 종양 모델 시스템

D1-DMBA-3(DA-3) 마우스의 유방선암 모델이 사용되었다. 세포주는 7,12-디메틸벤즈안트라센(7,12-dimethylbenzanthracene, DMBA)으로부터 유래한 면역원성(immunogenic) 비-전이성(non-metastatic) 쥐 유방선암을 베어링한 BALB/c 마우스로부터 유래하였다.

백만 개의 DA-3 세포를 각각의 BALB/c 암컷 마우스의 피하에(subcutaneously) 주사하였다. 종양이 촉지가능(palpable)해지면(직경 0.5㎝, 1 - 2주) 마우스를 무작위로 무리에 넣고 산화 β-카로틴을 5㎎/㎏에서 150㎎/㎏까지의 범위의 양으로 복강내로 투입하였다. 종양 성장을 2 - 3일마다 측정하였다. 알라오우이-자말리 등(Alaoui-Jamali et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993, 264(3) 1299)에 의하여 기술된 방법에 따라 시간의 함수로 종양 부피(tumor volume)를 측정하여 종양의 성장에 대한 억제 정도를 결정, 평가하였다. 대조군은 용매(20% 에탄올 수용액)만을 투입하였다.

제 11도 그리고 제 12도는 종양의 성장에 대한 산화 β-카로틴의 효과를 나타내었다. 제 11도는 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14 16 그리고 18일에 10㎎/㎏의 양을 투여한 것이다. 제 12도는 동일한 방식으로 150㎎/㎏의 양을 투여한 것이다.

조직학적인 검사에서 약간의 무작위로 선택한 마우스가 희생되고 종양을 절단하여 표준 식염수(normal saline)의 10% 포르말린(formalin)에 고정시켰다. 포르말린-고정, 파라핀(paraffin)-포매(包埋, embedded)된 종양의 각각을 준비하고 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색하여 조직학적인 절편(section)을 얻었다.

이 결과는 산화 β-카로틴이 마우스에 이식한 암세포-유도 종양에 성장-지연효과를 준다는 것을 보여준다. 제 11도와 제12도는 10㎎/㎏만큼 낮은 양을 반복적으로 투여한 확대산화 β-카로틴이 종양의 성장을 효과적으로 억제시키고 장기간에 걸쳐서 그것을 안정화시킨다는 것을 보여준다.

제 13a도와 제 13b도는 산화 β-카로틴의 다른 양으로 처리한 희생동물과 대조군(처리하지 않은 동물)의 종양을 비교하여 나타낸 것이다. 몇몇의 동물에서는 종양 주위에 출혈이 발생하였다(제 13b도). 이들의 경우에는 실질적인 종양의 크기는 칼리퍼스(calipers)로 측정했을 때보다 더 작다(이 불일치는 출혈성 종창(hemorrhagic swelling)으로 인하여 외양상의 종양의 크기가 증가했기 때문이다.).

처리된 동물에서 분리한 종양의 조직병리학적인(histopathological) 검사는 하기와 같은 사실을 알려준다:

- 산화 β-카로틴은 DA-3 종양에서 조직사(tissue death)를 반영하는, 분명한 조직학적인 교번(alterlations)을 유도한다.

- 종양조직은 세포/조직 분화의 많은 특징들을 보여준다.

- 출혈성 부위는 모든 처리된 종양에 존재하며 확대된 색소참착(pigmentation)과 괴사(necrosis)와 연관되어 있다.

- 색소는 철이 아닌(프러시안 블루(Prussian blue)를 사용한 철염색은 음성이었다.) 혈철소(hemosiderin)로 출혈의 결과 생기는 것으로 생각된다. 이것은 색소가 멜라닌(melanin)은 아닌 것으로 보인다. 색소침착의 정확한 성질을 확실히 할 여지가 있다.

정상이며 비-종양 조직에서 유사한 조직병리학적인 변화에 대한 증거는 없었다.

산화 β-카로틴의 다수의 복강내 투여는 150㎎/㎏까지의 농도에서도 내성이 있기(tolerated) 때문에 산화 β-카로틴의 치료상의 지수(index)가 매우 높은 것으로 나타나며 이것은 잠재적으로 전통적인 항암제에 대하여 주요한 장점을 제공한다.

본 연구의 1단계를 종합하자면, 대표적인 카로티노이드로 β-카로틴과 칸타산틴 그리고 좀 더 적은 정도로서 대표적인 레티노이드인 레티노익 에시드는 확대산화를 하여, 산화 β-카로틴이 모델인, 비조절된 세포 증식, 종양 그리고 종양발생 바이러스에 대하여 활성인 비독성제로 이용되며 세포 분화의 촉진제로 유용한 물질로 만드는 성질을 논증해 주는 물질을 생성한다.

산화 β-카로틴의 화학적인 분석으로 다양한 형태의 비타민 A가 존재하지 않거나 소량만이 존재한다는 것이 명백함을 알 수 있다. 더욱이, 비타민 A를 형성할 수 없는 산화 칸타산틴과 레티노익 에시드의 생물학적인 활성은 비타민 A와 다른 활성 물질의 존재를 의미한다. 산화 β-카로틴의 세포증식 억제 활성과 분화-증식 활성이 비타민 A 자체의 그것과 유사하다 할지라도 일반적으로 다양한 조건에서의 산화 β-카로틴에 대한 효과는 더 강력하다. 또한 산화 β-카로틴이 비-독성이라는 매우 중요한 차이가 있다.

연구의 2단계

화학

리코펜의 산화

벤젠에 용해된 리코펜(제 14도)을 산소의 분위기에서 본질적으로 연구의 1단계에서 β-카로틴과 같은 방식으로 하여 확대산화하였다. 조생성 혼합물을 산화 β-카로틴과 유사한 방식으로 세포증식 억제 활성을 테스트하였다.

산화 β-카로틴의 분획화

분획화는 3개의 단계를 통하여 전개되었다. 세 개의 분리 체제, 3-4 레벨 디프(levels deep)는 하기에 기술하였다:

산화 β-카로틴은 1단계에서 기술된 것과 매우 유사한 과정을 이용하여 합성하였다. 간단히 말하면, 산화 β-카로틴(30g)은 벤젠(3.0l; 0.02M)에서 용해하여 4일동안 상온에서 산소 가스의 분위기하에서 교반하였다. GPC 크로마토그래피로 주요한 세 성분, 곧 저(< 300Da), 중(300 - 1000Da), 고(> 1000Da) 분자량 분획의 존재를 확인하였다(제 15도).

레벨 1 분리 (단계 1 -3): 용액(3.0l)을 약 200ml로 농축시키고 헥산 약 2l로 희석시켰다. 총 혼합물의 약 65%인 침전 IG1은 대부분의 고분자량 물질(> 1000Da)을 포함하고 있다. 용해성의 분획, 곧 저분자량(<300Da) 그리고 중분자량(300 - 1000Da) 분획을 포함하며 실제적으로 고분자량의 분획은 포함하고 있지 않는 상층액을 건조증발시켜 잔기 SG1을 얻었다.

레벨 2 분리 (단계 1): 분획 SG1(1.2g)을 헥산(120ml)에서 상온하에서 30분동안 교반하였다. 여과시킨 불용성 분획인 IG2는 대부분 중분자량 그리고 약간의 저분자량의 물질을 포함하고 있다(제 15도). 용해성의 분획을 포함하고 있는 상층액을 증발시켜 대부분 저분자량과 약간의 중분자량의 물질을 포함하는 SG2를 얻었다(제 16도).

레벨 2 분리 (단계 2와 3): 테트라하이드로퓨란(10ml)에 용해한 분획 SG1(10g)을 시료를 연속적으로 예비-스케일의 GPC 크로마토그래피 칼럼(19 × 300mm, Waters styragel, 15㎛ 입지크기, 10nm 구멍크기)에 투여하고(250μl)그리고 테트라하이드로퓨란(4ml/min)으로 용출하여 저분자량과 중분자량의 분획인 LSG(40%)와 MSG(55%)로 각각 분리하였다. 두 분자량의 분획으로 확실하게 분리하여 제 17도에 나타내었다.

레벨 3 분리(단계 1): 실리카젤 칼럼에 로드하고 헥산/에켈아세테이트(95:5)로 용출하여 분획 SG2(688g)를 얻었다. 용출된 분획을 합치고 용매를 제거하여 분획 SG3을 얻었다.

레벨 3 분리(단계 2): 분획 LSG(600mg)을 냉각 펜탄(1ml)에서 1분동안 교반하고나서 대부분의 상층액은 버렸다. 이 과정을 4번 반복하였다. 불용성의 분획인 ILSG를 여과시키고 용해성 성분을 포함하는 혼합된 상층의 분획으로부터 용매를 증발시켜 분획 SLSG를 얻었다.

레벨 3 분리(단계 3): 아세토나이트릴(10ml)에 용해된 분획 LSG(4.4g)을 세개의 Waters NovaPak HR C18(역상, 6㎛ 입자크기, 6nm 구멍크기) 프렙팍 카트리지(PrepPak cartridges, 40 × 100mm)가 일렬로 연결되어 장착된 예비-스케일의 HPLC 장치 위에 연속적으로 투여하고(450μl; 총 9.0ml) 아세토나이트릴(40ml/min)로 용출하였다. 분획 F1(80%)과 F2(20%)를 4.0분에서 6.4분까지 그리고 6.4분에서 12분까지의 용출액을 각각 선별하여 얻었다. 제18도에서 분석 고압 액체 크로마토그래피(analytical high performance liquid chromatography: HPLC) 크로마토그램의 중간부에 도시한 수직선은 LSG가 새로운 두 분획인 F1과 F2로 어떻게 분배되는 가를 보여준다(제 18도에서 화합물의 용출 시간과 이에 대응하는 분배 시간이 예비 HPLC에서의 것과 다르다. 왜냐하면 분석적 그리고 예비적인 각각의 조건에서 적정의 분리를 하기 위한 조건이 차이가 있기 때문이다).

레벨 4 분리(단계 3): 아세토나이트릴(1.5ml)에 용해된 분획 F1(700mg)을 이미 기술한 것과 같은 칼럼으로 장착된 예비-스케일의 HPLC에 연속적으로 투여(250μl; 총 1.25ml)하고 물, 아세토나이트릴 그리고 메탄올이 50:45:5의 비율로 혼합된 혼합물로 40ml/min의 속도로 용출시켜 세 개의 분획인 F1.1(11%), F1.2(13%) 그리고 F1.3(5%)으로 분리하였다. 2.0 분에서 6.6분까지 그리고 6.6분에서 12.0분까지의 시간의 용출액을 각각 선별하여 분획을 얻었다. 제19도에서 도시된 수직선은 세 개의 분획을 얻기 위하여 어떻게 절단하는 가를 보여준다.

3 그리고 4 레벨의 분리에서 분획의 화학 성분의 결정

(번호가 매겨진 화합물의 구조는 제 21도에 나타나 있다)

분획 F1.1, F1.2 그리고 F1.3은 각각 제 19도에 나타난 것과 같은 화합물 약간만을 포함하고 있다. F1.2의 주요 성분은 2-메틸-6-옥소-2,4-헵타디엔알(2-methyl-6-oxo-2,4-heptadienal, 화합물 1, 여기 이외의 문헌에서는 케토알데히드(ketoaldehyde)로 함.)이다. 디하이드로악티니디올라이드(dihydroactinidiolide, 화합물 2)는 F1.3의 주요 성분이다. 화합물 3 - 14는 분획 F2에서 확인되었다. 이 화합물은 β-시클로시트랄(β-cyclocitral, 3), β-요논(β-ionone, 4), β-요논-5,6-에폭사이드(β-ionone-5,6-epoxide, 5), 4-옥소-β-요논(4-oxo-β-ionone, 6), β-요닐리덴 아세트알데히드(β-ionylidene acetaldehyde, 7), β-요닐리덴 아세트알데히드 5,6-에폭시드(β-ionylidene acetaldehyde 5,6-epoxide, 8) 그리고 4-옥소-β-요닐리덴 아세트알데히드(4-oxo-β-ionylidene acetaldehyde, 9), β-아포-13-카로티논(β-apo-13-carotenone, 10), β-아포-13-카로티논 5,6-에폭시드(β-apo-13-carotenone 5,6-epoxide, 11), 4-옥소-β-아포-13-카로티논(4-oxo-β-apo-13-carotenone, 12), 레티날(retinal, 13), 레티날 5,6-에폭시드(retinal 5,6-epoxide, 14)이다.

생물학

세포증식 억제 활성, 분화의 유도 그리고 세포 사이클에 대한 효과를 테스트함으로써 인 비트로 생물학적인 에세이를 실시하였다. 인 비보 테스트는 마우스에서 종양 성장의 억제에 대하여 실시하였다.

인 비트로 테스트

분획은 세포증식 억제 성질과 분화를 유도하는 능력에 대하여 테스트하였다. 이 결과를 산화 β-카로틴과 비교하였고, 이것은 분획이 활성이 강화되는 분획으로 유도되는지 아닌지를 가리키는 기준으로 제공되었다(레티노익 에시드 및/혹은 β-카로틴은 몇몇의 세포주에서 산화 β-카로틴과 차이를 두기 위하여 테스트하는 대조군으로 사용되었다.). 많은 분획의 현재 미결정의 성질에서, 모든 시료는 동일한 '중량' 농도에서 테스트하였다. 사용 시료의 중량을 β-카로틴의 분자량(537 Da)으로 나눈 유사 몰랄 스케일(pseudo molarity scale)로 비교하였다.

사용한 세포주:

HCT116 인간 콜론 암

IMR32 인간 신경아세포종

NB4 인간 급성 전골수구성 백혈병

K562 인간 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia)

BALB/c/MK 마우스 각질세포

산화 β-카로틴 분획의 세포증식 억제 효과

각 시료의 6개의 농도(HCT116과 IMR32 세포주의 2.5, 7.5, 15, 22.5, 30, 45μM, 그리고 NB4와 K562 세포주의 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 22.5μM)로 세포를 처리하였다. 3일 후에 세포를 용해시키고(lyse) 훽스트 다이 33258(Hoechst dye 33258)로 방치시키고 용액의 흡광도를 측정하여 존재하는 세포 DNA의 양을 측정하였다. 테스트 물질 각각의 흡광도 데이터를 선별하여 미처리된 세포에서(백그라운드 흡광도에 대하여 보정한 후) 이에 대응하는 값으로 분리하여 각 시료의 농도에 대한 세포증식 억제 효과를 결정하였다. 제 22a도와 제 22b도는 HCT116 인간 결장암과 K562 인간 백혈병 세포주의 각각에서 얻은 결과를 나타낸 것이다.

상대적인 활성도는 선택된 세포주에 따라 많은 영향을 받는 것으로 보인다. 이러한 사실은 특히, HCT116 세포주에서는 활성을 가지나 K562 주에서는 비활성인 분획 MSG에서 잘 나타나 있는 반면에 분획 ISLG는 두 주 모두에서 (산화 β-카로틴보다) 매우 큰 활성을 나타낸다. 이러한 사실은 세포증식 억제 효과는 하나 이상의 화합물의 작용을 통하여 얻어진다는 것을 의미한다.

표 7은 4개의 세포주에 대한 결과를 요약한 것이다. 분획들을 각 시료의 농도에서의 각 성장 억제값을 이에 대응하는 산화 β-카로틴 값으로 나누어 6개의 시료 농도에 대한 경향을 검사, 질적으로 결정하여 산화 β-카로틴에 대하여 순서대로 나열하였다. 분획의 활성도는 "+", "0" 그리고 "-"로 나타내며 이것은 각각 산화 β-카로틴보다 높은, 유사한 그리고 낮은 활성도를 가진다는 것을 가리킨다.

가장 두드러진 결과 중의 하나는 케토알데히드(제 21도에서 화합물 1)에 대하여 얻은 강한 세포성장 억제 효과이며, 이것은 분획 F1.2의 주요한 성분으로 확인되었다. 아마도 분획화(3 그리고 4)가 보다 더 전개되는 레벨에서 더 간단한 활성도의 겉보기 감소가 일어나고 이어서 전레벨(1 그리고 2)에서는 더 복잡한 모분획, 즉 분획 F1, F2, F1.2 그리고 F1.3에서의 활성도가 강화된다는 것은 놀라운 일이다. 후자인 간단한 분획은 이론상 활성 성분이 풍부해서 높은 활성도를 가져야 한다. 초기에 더 복잡한 분획에서 관찰된 더 높은 활성은 하나 이상의 활성 화합물이 존재하는 것 및/또는 둘 또는 그 이상의 화합물 사이의 상승작용의 관계에서 유래한다는 것이 가능하다.

표 7. 몇몇의 세포주에 대한 분획의 세포증식 억제 효과 및 산화 β-카로틴에 대하여 발현된 선택된 화합물

노트: 상기의 데이터는 모든 에세이의 산화 β-카로틴에 대한 평균값을 이용하여 계산한 값이다. 산화 β-카로틴에 대한 값은 정의에 따라 "o"로 한다. RA은 올-트랜스 레티노익 에시드(all-trans retinoic acid)를 가리킨다.

확대산화 리코펜의 세포증식 억제 효과

확대산화 리코펜의 활성을 HCT-116 세포주를 이용하여 산화 β-카로틴의 활성과 비교하였다. 표 8의 결과는 두 개의 물질이 이 세포주에 대하여 유사한 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. 산화 β-카로틴, 칸타산틴 그리고 이제 리코펜이 강한 세포증식 억제성을 갖는 생성물을 생산한다는 것을 알 수 있다. 리코펜은 두 개의 다른 카로티노이드에 존재하는 두 개의 시클로헥실환이 부족하기 때문에(제 14도), 이 분자 성분의 존재가 산화 생성물의 세포증식 억제 활성에 필요한 것이 아닌 것으로 보인다.

표 8. HCT-116 세포주에서 확대산화 리코펜 및 산화 β-카로틴의 세포증식 억제 효과의 비교

세포 분화

분획의 세포 분화-유도 효과는 세포주에서 일어나는 형태학적인 변화를 관찰하고 모노클로날 항체와 유량 세포혈구 계산법을 이용하여 특징적인 단백질 마커의발현을 측정함으로써 질적으로 결정하였다. 표 9에서 활성 분획은 "-"로 표시하고 매우 높은 활성을 나타내는 분획은 "++"으로 표시하였다.

IMR32 인간 신경아세포종 세포주의 분획에서는 광범위한 활성이 나타난다. 예상과는 달리, 세 쌍의 분획(SG1, IG1; SG2, IG2 그리고 LSG, MSG)은 같은 전구체 세포주로부터 두 개의 다른 표현형으로 분화를 유도하는 것에 있어서 (본 발명자들이 알고 있는 한) 유례없는 능력을 나타낸다. 이것은 IMR32 세포주가 신경교의 세포 또는 뉴우런 세포로 향하는 것이 분획의 선택에 따른다는 것이 가능하다는 것을 알 수 있다. 좀 더 간단한 분획(단계 4; 표 9)에서는 뉴우런의 형성을 유도하는 능력이 후에는 사라진다. 이러한 관찰은 나아가서는 산화 β-카로틴이 다른 형태의 활성을 가지고 있는 다수의 활성 화합물을 포함한다는 증거가 된다.

NB4 인간 백혈병 세포주에서 분화의 유도는 초기의 화학적으로 복잡한 IG2와 MSG 분획에 제한되어 있는데, 이 분획들은 매우 활성이 높다. 분획 SG3만이 준-정상 L6 랫 근아세포주에서 분화를 가능하게 한다.

준-정상 L6 주화 비교하여 보았을 때에, 형질전환 세포주, 특히 IMR32에서 나타내는 더 높은 활성은 형질전환 세포가 비-독성 방식으로 하여 대조 암세포 성장으로 선택적인 분화를 하는 것을 이용하는 방법을 뒷받침하고 있다.

표 9. 산화 β-카로틴 분획의 효과를 유도하는 분화

괄호 안의 위첨자^b는 준(glial: g) 또는 뉴우런(neuronal: n) 표현형으로 분화하는 것을 의미한다.

양적 데이터는 마우스 Balb/c/MK 각질세포주에 대한 산화 β-카로틴의 분화-유도 효과에 대한 연구의 1단계에 제공되었다. 표 10과 표 11은 양적 데이터를 지지한다.

표 10. Balb/c/MK 각질세포에서 시토케라틴 1과 10의 발현

노트: 칼럼 A는 이뮤노포지티브(immunopositive) 세포, 곧 표시된(indicated) 시토케라틴이 발현된 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 칼럼 I_A는 세포당 발현의 세기를 나타낸다(독자적 단위). RA = 올-트랜스 레티노익 에시드.

표 11. Balb/c/MK 각질세포에서 시토케라틴 패널(panel)의 발현

시토케라틴 1과 10은 고분자량의 단백질로 분화 프로그램이 전개됨에 따라 증가하여 발현된다. 인 비트로 세포배양에서 분화는 전형적으로 다량의 칼슘을 포함하고 있는 배양배지에 노출됨으로써 유도된다. 저칼슘 배지에서 배양된 세포는 증식의 상태에 있다. 표 10에 기술한 바와 같이, 시토케라틴 1과 10의 발현이 증가시키는 데에 있어서 Ca⁺⁺을 레티노익 에시드로 치환할 수 있다. Balb/c/MK 각질세포 분화를 유도시키는 데에 있어서도 칼슘을 산화 β-카로틴으로 치환할 수 있다. 겉보기에 레티노익 에시드보다 적은 산화 β-카로틴의 효과는 더 낮은 효능(potency)에 기인한 것이 아니라 지연된 작용에 기인한 것이다. 표 11은 유사한 결과가 다른 시토케라틴의 패널을 이용하였을때 나타났다는 것을 보여준다.

a) 산화 β-카로틴의 세포타겟(cellular target)을 확인하고 b) 혼합 치료법(combination therapy)에 대한 산화 β-카로틴, 또는 그 분획과 올-트렌스 레티노익 에시드의 혼합 효과(combined effect)

산화 β-카로틴과 몇몇의 그 분획의 세포 분화-유도성에서, 몇몇의 유방세포형의 분화력을 조절할 수 있는 것으로 잘 알려진 올-트랜스 레티노익 에시드의 효과와 비교하는 것뿐만 아니라, 산화 β-카로틴과 레티노익 에시드가 같이 사용될 때에 세포에 미치는 효과를 결정하는 것도 매우 유익하다. 표 12는 산화 β-카로틴과 레티노익 에시드를 NB4 그리고 IMR32 세포주에서 다양하게 혼합하여 얻은 결과를 나타낸 질적 데이터이다.

산화 β-카로틴의 등위농도(equipotent concentration)가 레티노익 에시드와 혼합될 때 그들의 분화-유도 효과는 없어진다. 그러나, 이들 중의 어느 하나의 농도가 다른 쪽에 대하여 증가하면 분화-유도는 회복된다. 놀랍게도, 두 시약의 농도가 함께 증가하면 분화가 매우 증가한다.

분화 프로그램이 진행되는 동안에 많은 분화 마커가 일시적으로 발현된다.NB4 세포주에서, 단백질 CD33은 분화의 초기단계와 연관이 있으며 이어서 단백질 CD11b, 중간체 마커(intermediate marker) 그리고 결국에는 단백질 CD15, 상급 분화 마커(advanced differentiation marker)가 뒤따른다. 그러므로 증대된 분화는 CD33 마커의 발현과 세기를 감소시키며 CD15 마커의 발현과 세기를 증가시킨다.

표 12. 산화 β-카로틴과 레티노익 에시드의 산화 혼합물의 분화성

노트: L 그리고 H 문자는 각각 저농도와 고농도를 가리킨다. 대시(-)는 지시제(indicated agent)가 존재하지 않는 것을 가리킨다.

표 13은 개개의 분획중 하나 또는 올-트랜스 레티노익 에시드의 다양한 이중 혼합(binary combination)으로 보충된 NB4 세포에서 특이한 분화마커의 발현레벨에 대한 올-트랜스 레티노익 에시드, 산화 β-카로틴 그리고 몇몇의 그 분획의 효과에 대한 양적 데이터를 나타낸 것이다. 그 결과는 산화 β-카로틴이 레티노익 에시드만큼 효과적이지 못하다는 것을 보여준다(산화 β-카로틴은 그 효과를 완전하게 나타내기 위하여 더 많은 시간을 필요로 한다). 레티노익 에시드와 산화 β-카로틴또는 몇몇의 그 분획을 혼합하여 처리하면 이미 산화 β-카로틴에 대하여 상기에서 기술한 바와 같이(표 12) 분화가 억제되나(길항적 효과) 분획 IG2와의 분화는 IG2 또는 레티노익 에시드의 어느 것보다 더 잘 진행된다(상승효과).

산화 β-카로틴과 몇몇의 그 분획들이 레티오닉 에시드의 작용을 방해하거나 또한 증대시킬 수 있다는 사실은 레티노익 에시드가 (레티노이드, 레]티로이드 호르몬, 비타민 D₃그리고 오르판 수용체(orphan receptors)를 포함하는 핵수용체(nuclear receptors)의 상과(superfamily)를 통하여 작용하거나 함께 상호작용을 하기 때문에, 산화 β-카로틴과 몇몇의 그 분획들이 특이적으로 이 수용체들의 과(family)를 타겟팅(targeting)하고 핵 DNA 전사의 레벨에서 세포에 영향을 미친다.

상기에 기재된 일정한 조건하에서 얻은 분화의 증대는 레티노익 에시드와 산화 β-카로틴 또는 분획 IG2의 적절한 혼합은 레티노익 에시드 단독일 때보다 더 효과적인 치료요법이 될 것이라는 전망을 할 수 있게 한다. 이러한 사실은 레티노익 에시드는 단지 5 내지 6달의 진정(remission)이 된 후에 되살아나는 암을 치료하는 데에 비효율적으로 됨에도 불구하고 급성 전골수구성 백혈병의 치료에 즉시 일반적으로 사용할 수 있기 때문에 특별한 연관이 있다. 이 결과는 두 시약, 특히 상기에 기재된 것들을 혼합하는 것이 백혈병 세포를 더욱 완전하게 최후 분화 경로(terminal differentiation pathway)로 이끌어 증식의 단계로 복귀하는 것이 차단된다는 가망을 증가시킨다는 가능성을 지지하여 준다.

표 13. NB4 세포주에서 선택된 마커의 발현에 대한 올-트랜스 레티노익 에시드와 별개로 그리고 혼합된 산화 β-카로틴(G) 또는 그 분획의 효과(5 일후)

노트: 화합 치료는 다음과 같다: 1 μM RA와 7.5 μM G(또는 그 분획). 칼럼 A와 B는 모집단(population)에서 이뮤노포지티브 세포의 백분율을 가리킨다(곧 특별한 단백질 분화 마커를 베어링하는 것을 의미한다). 칼럼 B값은 독특한 세포집단의 출현을 마커 발현의 세기에 의하여 결정된대로 분화의 말에 대응되는 값이다. 칼럼 I_A와 I_B는 하나의 기본세포(cell basis)당에서 분화 마커 발현의 평균 세기에 대응하는 값이다(독자적 단위).

산화 β-카로틴이 핵 DNA 전사레벨에서 상기에 언급된 과(family) 수용체와의 상호작용을 통하여 세포에 영향을 미친다는 가설은 또 다른 세포주, IMR32를 레티노익 에시드와 산화 β-카로틴과의 화합 치료의 결과를 더욱 뒷받침해 준다. NB4의 경우에 있어서처럼, (두 시약의 농도에 따른) 길항작용 또는 상승작용이 관찰될 수 있다(표 7a). 예를 들면 신경필라멘트(neurofilament)인 NF(뉴우런으로 분화된 세포를 지시하는 마커)은 1μM RA와 5μM 산화 β-카로틴 각각이 단독으로 사용되었을 때에 최대로 발현된다. 이 농도에서 같이 사용되었을 때는 서로가 배제되어 NF의 발현이 대조군과 유사하다(길항작용). 그러나 RA의 농도가 2.5μM으로 증가되고 산화 β-카로틴의 농도가 3μM으로 감소될 때, NF의 발현은 그들 중의 하나가 사용될 때보다 상승되어 일어난다(상승작용). 준 원섬유성(fibrilary) 에시딕 단백질, GFAP(준세포에 대한 분화를 지시하는 마커)의 발현은 두 시약에 의하여 증대되는 것은 당연히 복잡한 상호작용을 일으킨다. 예를 들면, 레티노익 에시드 그 자체는 1μM의 저농도에서 가장 효과적인 반면에 산화 β-카로틴이 존재하면 이 적정농도가 산화 β-카로틴의 농도에 따라 10μM까지 증가된다(표 13a).

표 13a. NB4 세포주에서 선택된 마커의 발현에 대한 올-트랜스 레티노익 에시드와 별개로 그리고 혼합된 산화 β-카로틴(G) 또는 그 분획의 효과(48시간후)

세포 사이클에 대한 산화 β-카로틴의 작용

세포 사이클의 3 단계(G1 단계(세포 휴지기(resting cells)), S 단계 DNA 합성단계, 그리고 G2 단계(염색체 배가))에서 산화 β-카로틴이 처리된 세포 집단은 S 단계에서 세포가 축적된다. G1 블록은 일어나지 않는다. 이 작용은 세포 사이클 시간을 연장하는 것에 기인한 것이다. 산화 β-카로틴을 처리한 세포는 36시간 내에 세포 사이클을 완성하는 반면에 대조군과 레티노익 에시드를 처리한 정합대응 시료에서의 세포 사이클 시간은 각각 22시간과 18시간이었다. 동기 집단(synchronized population)에서 개개의 세포내 DNA의 세포 함량의 유량 세포혈구 분석을 사용하여 데이터를 얻었다. 5시간마다 48시간에 걸쳐서 시료를 채취하였다. 두 가지형의 세포가 사용되었다: 현탁액(suspension)에서 성장한 것(NB4 백혈병 세포)과 부착성 세포(adherent cells)로 성장한 것(L6 근아세포)이 그것이다.

다른 생물학적 성질

세포 글루타티온 레벨을 감소시키고 종래의 화학치료제(chemotherapeutic agent)에 대한 암세포주의 민감성(sensitivity)의 증가에 있어서의 산화 β-카로틴의 작용.

흔히 전형적인 항암제의 처치에 대하여 암세포가 저항을 가지기 때문에 비효율적이다. 많은 경우에 있어서, 이러한 현상은 글루타티온(GSH)의 증가된 레벨과 연관되어 있으며 이것은 암세포를 항암제의 활성 성분과 반응하여 세포로부터 암세포를 제거함으로써 보호한다. 표 14에서의 데이터는 산화 β-카로틴이 실질적으로 항종양 활성을 평가하는 데에 동물 모델로 사용되는 동일한 세포주인 DA-3 마우스의 유방암 세포주에서 GSH 레벨을 더 낮출 수 있다는 것을 보여준다. 표 14에서의 데이터를 GSH 생합성의 더 강한 독성억제제로 현재 항암제로 테스트를 하고 있는부티오닌 설폭시민(buthionine sulfoximine: BSO)의 이에 대응하는 작용과 비교하여 좋은 결과를 얻었다.

표 14. DA-3 마우스 유방암 세포선에서 글루타티온 레벨에 미치는 산화 β-카로틴의 효과

분리한 세포 GSH-감소 효과가 전형적인 항암제인 산화 β-카로틴과 멜팔란으로 처리한 DA-3 세포의 생명력에 (MTT 테스트를 이용하여) 대하여 일어나는 현상에 의하여 기술되었다. 표 15의 데이터는 멜팔란의 IC₅₀이 산화 β-카로틴의 저농도의 존재하에서 극적으로 감소된다는 것을 보여준다(이 결과는 제 23a도와 제 23b도에 도시적으로 나타나 있다).

이러한 효과는 멜팔란과 같은 종래의 항암제와 함께 산화 β-카로틴의 공-투여(co-administration)는 항암제에 대한 암세포의 민감성을 증가시킬 것이라는 것을 시사한다. 이것은 두 가지 방식 중의 하나에서 유용할 것이다: a) 동량의 투여는 암세포에서 항암제를 고농도로 이루게 한다; b) 치료효과에 더 적은 양의 투여가 요구되어 멜팔란의 일반적이고 강한 독성으로 인한 달갑지 않은 부작용을 감소시킨다.

표 15. MTT 테스트에 의하여 측정된 DA-3 마우스 유방암 세포주 모델에서 멜팔란의 IC ₅₀ 에 대한 산화 β-카로틴의 효과

인 비보에서 산화 β-카로틴의 독성과 항종양성

다른 동물 모델에서의 산화 β-카로틴의 항종양 효과. 누드 마우스 이종이식편

산화 β-카로틴의 항종양 활성은 누드 마우스로 A2780 인간 난소암세포를 이식하여 발생된 종양 성장에 대한 효과를 연구하는 것을 포함, 확장하여 평가하였다. 제 24도는 산화 β-카로틴의 복강내로 투여하는 것은 (DA-3 모델과 비교하여) 훨씬 더 공격적인 종양(aggressive tumor) 의 성장을 의미있게 억제한다는 것을 보여준다.

산화 β-카로틴 분획 그리고 이와 관련된 물질의 항종양 효과

마우스 D1-DMBA-3 (DA-3)이 유방선암 모델로 사용되었다. 제 25a도와 제 25b도에 기재되어 있는 결과는 몇몇의 분획이 적어도 산화 β-카로틴만큼의 효능이 있으며(분획 SG, F1, F2) 또는 더 효능이 있다(분획 F1.1, F1.2, F1.3; 더 저농도가사용됨)는 것을 보여준다. 케토알데히드(화합물 1, 제8도)의 효능은 현저하다.

표 16은 실험의 28일째에 발현된, 대조군(곧, 부형제(賦形濟, vehicle)만을 수용하는 그룹)에 대한 종양 부피를 측정한 것이다. 산화 β-카로틴에 대하여 이전에 관찰한 것과는 대조적으로 적어도 분획 F1에서 투여량-반응 효과가 존재하는 것을 알 수 있다.

표 16. DA-3 모델에서 산화 β-카로틴과 그 분획의 인 비보 항종양 활성

두 개의 분획, F1과 F2에 대한 선택적인 전달 모드(alternative delivery mode)를 동일한 모델에서 테스트하였다. 표 17의 데이터는 두 분획이 구강 적용(applied orally: p.o.)일 때에는 적어도 복강내 적용(appliedintraperitoneally: i.p.) 때만큼 효과적이라는 것을 보여준다.

표 17. DA-3 모델에서 복강내 적용과 구강 적용으로 전달될 때의 분획 F1과 F2의 인 비보 항종양 활성 비교

Claims

카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 화합물과 산소와의 반응-여기서 산소의 소비량은 카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 화합물의 몰 당 6 내지 8 몰 당량임-에 의하여 형성되며 비독성 세포 분화 유발인자, 세포증식 억제제, 및 항종양제로 유용한 카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 유래 산화 혼합물.
제1항에 있어서,

유기용매 내에서의 산화에 의하여 생성되는 카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 유래 산화 혼합물.
제1항에 있어서,

고체 상태에서의 산화에 의하여 생성되는 카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 유래 산화 혼합물.
제1항에 있어서,

포유류 세포에서 발현된 바이러스 유전자의 증식 및 분화-억제 효과에 유용한, 카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 유래 산화 혼합물.
제1항의 카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 유래 산화 혼합물의 폴리머 성분.
제1항의 카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 유래 산화 혼합물의 제조방법에 있어서,

a) 유기용매 중 또는 고체 상태에서 카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 화합물을 산소와 반응시키는 단계;

b) 카로티노이드, 레티노이드 또는 이와 관련된 콘쥬게이션된 폴리엔 화합물의 몰 당 6 내지 8 몰 당량의 산소를 소비시키는 단계

를 포함하는 제조방법.
제6항에 있어서,

상기 산소와의 반응이 β-카로틴, 리코펜, 또는 칸타산틴과 함께 수행되는 제조방법.
제1항에 따르는 혼합물의 유효량을 포함하는 종양 치료용 조성물.
제8항에 있어서,

종래의 항암제를 추가로 포함하는 종양 치료용 조성물.
2-메틸-6-옥소-2,4-헵타디엔알의 유효량을 포함하는 종양 치료용 조성물.