EP2137207A2 - Isoflavon-peptid konjugate und deren verwendung - Google Patents

Isoflavon-peptid konjugate und deren verwendung

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EP2137207A2
EP2137207A2 EP08706741A EP08706741A EP2137207A2 EP 2137207 A2 EP2137207 A2 EP 2137207A2 EP 08706741 A EP08706741 A EP 08706741A EP 08706741 A EP08706741 A EP 08706741A EP 2137207 A2 EP2137207 A2 EP 2137207A2
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EP
European Patent Office
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peptide
acid
isoflavone
genistein
compound according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08706741A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Herbert GÖRNE
Lutz MÜLLER-KUHRT
Christian Mang
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Trojanon & Co KG GmbH
Original Assignee
Trojanon & Co KG GmbH
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Filing date
Publication date
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to pharmaceutically active compounds of an isoflavone or isoflavone glycoside and, covalently linked thereto, an amino acid, a peptide or peptide derivative having 2 to 5 amino acids, as well as pharmaceutically acceptable salts or solvates of these compounds, as well as uses of such substances for the production of pharmaceutical compositions, in particular for the treatment of platelet aggregation and for tumor therapy.
  • Applications of the invention are therefore the medicine and the pharmaceutical industry.
  • Isoflavones sometimes also called isoflavonoids, form a group of mostly yellowish-colored plant dyes derived from isoflavone. In the context of this invention, the glycosides of the isoflavones are also counted.
  • the more known isoflavones include, in particular, isoflavone, daidzein, genistein, prunetin, biochanin A, orobol, santal, glycitein, pratense, formononetin, genistin, 6 "-O-malonylgenistin, 6" -O-acetylgenistin, daidzin, 6 "-O- Malonyldaidzin, 6 "-O-acetyldaidine, glycitin, ononine and sissotrine, and also genistin, daidzin, 6" -O-malonylglycitin and 6 "-O-acetylglycitin.
  • the malonyl glucosides of genistein make up the majority of isoflavones in soybeans.
  • the isoflavones are mainly present in their respective aglycone form genistein, daidzein and glycitein.
  • isoflavones are known to show estrogenic effects on grazing animals, for example. Other isoflavones are thought to have antioxidant activity in humans or other mammals, evidence of such an effect has not yet been achieved. It is also controversial whether and if so which isoflavones have an anti-carcinogenic, anti-atherogenic, anti-osteoporotic and / or hypolipidemic effect. In many cases, it has not hitherto been possible to reproduce the effects attributed to isoflavones by administering the pure isoflavone, if appropriate with customary pharmaceutical carriers and excipients.
  • genistein inhibits platelet aggregation by modulating intracellular metabolic processes: inhibition of tyrosine kinase in the metabolism of cyclooxygenase (5), modulation of cAMP by inhibition of phosphodiesterase (6), reduction of intracellular availability of peroxide as an important agent of phospholipase C and arachidonic acid metabolism (7, 8) ,
  • Genistein is an isoflavone derived from soy.
  • malignant cells such as those of hematopoietic tumors such as leukemias and lymphomas, melanomas and epithelial tumors such as mammary, lung, prostate and head and neck squamous cell carcinomas (7-5 )
  • the growth inhibitory activity of genistein is due to its antiproliferative and pro-apoptotic activity (6).
  • compositions isoflavones / short chain peptides superior inhibition of
  • Platelet aggregation or improved anti-tumor activity should be achieved. As far as possible, other areas of application of isoflavones should also be developed.
  • X is an isoflavone or isoflavone glycoside and Pep is an amino acid or a peptide or peptide derivative having 2 to 5 amino acids, and wherein there is a covalent bond between X and Pep or the linkage by a suitable linker system (such as ethylene glycol, ethanolamine, higher homologs thereof or the corresponding polyethylene glycol derivatives), as well as pharmaceutically acceptable salts or solvates of these compounds, which enhance the effects of the isoflavone component of the compound on organisms, especially mammals, or even develop biological effects in the first place.
  • a suitable linker system such as ethylene glycol, ethanolamine, higher homologs thereof or the corresponding polyethylene glycol derivatives
  • the constituent X of the compound I is formed from an isoflavone or isoflavone glycoside of a substance of the general formula (II) or from a pharmaceutically acceptable salt or solvate of such a substance:
  • radicals R 1, R 2, R 3, R 4, R 5 and R 6 may each independently be hydrogen, hydroxy, methoxy or glycoside (GIc), where one of the radicals 1-6 in the compound I is represented by the radical Pep (meaning see above ) is replaced.
  • Preferred linkages are R2 and R5.
  • glycoside in formula II has the general formula III
  • R is independently of R1, R2, R3, R4, R5 and R6 selected from the group consisting of hydrogen, acetyl and malonyl.
  • Particularly preferred compounds of the invention are those in which the constituent X is isoflavone, daidzein, genistein, prunetin, biochanin A, orobol, santal, glycitein, pratense, formononetin, genistin, 6 "-O-malonylgenistin, 6" -O-acetylgenistin, Daidzin, 6 "-O-malonyldaidzin, 6" -O-acetyldaidzin, glycitin, ononine or sissotrine is formed.
  • the constituent X contains two to three OH groups which are free or mixed wholly or partly with monosaccharides, incl.
  • acetic acid, malonic acid, cinnamic acid, coumaric acid, caffeic acid, ferulic acid acylated monosaccharides or disaccharides including in part with acetic acid, Malonic acid, cinnamic acid, coumaric acid, caffeic acid, ferulic acid, acylated disaccharides, methyl or sulfate are substituted.
  • X is formed from genistein, genistin, daidzein or daidzin, preferably genistein.
  • the ingredient Pep is formed from a dipeptide selected from the group of peptides having the sequences DD, EE, DE, ED; wherein D is aspartic acid and E is glutamic acid.
  • a dipeptide selected from the group of peptides having the sequences DD, EE, DE, ED; wherein D is aspartic acid and E is glutamic acid.
  • glutamic acid dipeptide (peptide of the sequence EE) is particularly preferred.
  • Glutamic acid dipeptide in conjunction with genistein could be a particularly striking
  • the ingredient Pep is formed from a peptide selected from the group of peptides having the sequences
  • D is aspartic acid and E is glutamic acid.
  • E glutamic acid
  • the covalent linkage between X and Pep can be formed within the compound according to the invention in any desired manner, preferably via a carbamate, ether or ester bond.
  • a carbamate, ether or ester bond has proven particularly useful when the peptide via its N-terminal amino group or via its C-terminal carboxyl group or the reduction obtainable by primary hydroxyl directly with a hydroxyl group of X, which is located at one of the positions R1-R6, to form a covalent carbamate, ether, or ester bond, or via a suitable linker system that combines both functionalities.
  • Suitable as a linker system are ethylene glycol, ethanolamine, higher homologs thereof or the corresponding polyethylene glycol derivatives.
  • the covalent linkage is formed via an amide, an ether or a carboxylic acid ester, preferably when the linkage via R 2 or R 5 is made by X.
  • the present invention further encompasses the use of these compounds or pharmaceutically acceptable salts or solvates thereof for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment and / or protection against medical indications of the human or other mammalian organism.
  • Preferred medical indications include the prophylaxis and therapy of thrombembolic diseases, cardiovascular diseases, vascular diseases and vascular anomalies, diseases associated with increased platelet count and / or platelet aggregation, metabolic diseases and cancers
  • Particularly preferred medical indications include prophylaxis and therapy of: hypertension, hypercholesterolemia, myocardial infarction and reinfarction, infarcts and reinfarts of other organs, stroke, pulmonary embolism, leg vein thrombosis, atherosclerotic vascular diseases, increased platelet count and or aggregation, diabetes mellitus, hyperhomocysteinemia, malignancies , and or or osteoporosis, as well as pre- and postoperative thrombosis prophylaxis,
  • the present invention further relates to the use of said compounds and drug combinations for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment and / or protection against medical indications of the human organism or of the organism of other mammals.
  • the present invention encompasses the use of at least one compound of the invention or pharmaceutically acceptable salts or solvates thereof as an adjunct to pharmaceutical compositions to improve the availability of drugs in these pharmaceutical compositions in mammals.
  • the present invention encompasses the use of the compounds according to the invention or pharmaceutically acceptable salts or solvates thereof as a food additive, as an additive for the protection of cells in fermenters or bioreactors, as pet food and as a plant protection agent.
  • Tumors such as leukemias and lymphomas, solid tumors such as melanoma, epithelial tumors such as mammary, lung, gastrointestinal, (eg pancreas), especially gastric and colon and prostate and head and neck
  • the present invention comprises methods for preparing the compound I. comprising the steps of: a) providing an active ingredient selected from the group consisting of isoflavone, daidzein, genistein, prunetin, biochanin A, orobol, santal, glycitein, pratense, formononetin, genistin, 6 "-O-malonylgenistin, 6" -O Acetylgenistine, daidzin, 6 "-O-malonyldaidzine, 6" -O-acetyldaidzine, glycitin, ononine and sissotrine, and / or a pharmaceutically acceptable solvate or salt of the active ingredient, wherein the active ingredient optionally has a protected side group, b) providing a peptide or peptide derivative of 2 to 5 amino acids in length or providing an amino acid and / or a solvate or salt of the peptide or amino acid, at least one of the amino acid
  • the preparation is carried out by means of a) 1. Preparation of a peptide of suitable length and sequence with at least one
  • the starting point of the invention is the surprising finding that the new compounds of the formula (I) are transported much more effectively into the cell via a cellular peptide transport system. This ensures that even lower concentrations of these compounds trigger physiological effects especially in the prevention, treatment and alleviation of human platelet aggregation and tumors and associated indications. Thus, much lower levels are required than when using the corresponding pure isoflavone or isoflavone glycoside.
  • the compound components X and Pep interact synergistically in an advantageous manner due to their covalent linkage.
  • synergy effects can occur with other active ingredients.
  • an active substance is understood as meaning a substance which, when administered to a mammal, in particular a human, can cause a pharmaceutically desired change in a physiological state of the treated mammal.
  • An active ingredient is understood in particular to mean the pharmaceutically active constituent of a drug, in particular also the active ingredient X of the compound according to the invention.
  • substances in their singular form are also referred to in the context of this invention, they also mean mixtures of several of the corresponding substances, unless otherwise stated.
  • the invention therefore also relates to those pharmaceutical compositions in which the active ingredient is a mixture of two or more compounds of the formula (I).
  • compounds according to the invention which are produced under an active ingredient and a peptide or covalently linked therefrom are also each pharmaceutically acceptable salts or solvates are counted.
  • peptides encompasses linear or branched peptides which can consist of both the 20 gene-coded amino acids and of unnaturally occurring alpha, beta and gamma amino acids.
  • a peptide derivative is understood as meaning a peptide which is represented in the main and / or in the side chain by at least one linear, cyclic or branched, halogenated or hydroxy or amine-substituted or unsubstituted, saturated or aliphatic alkyl, alkyl ether,
  • Alkylthioether, alkoxy, acyl or aryl radical is modified, wherein the radical contains between 1 and 20 carbon atoms.
  • the pharmaceutical or therapeutic effect achieved by the compound is also that of an antioxidant when the active ingredient X is formed from an isofiavon or an isoflavone glycoside.
  • the compound according to the invention makes it possible for the first time to achieve an antioxidant activity of an isoflavone previously suspected or only described at high concentrations at pharmaceutically acceptable concentrations of the active ingredient in the target cells of a treated mammal, especially a human.
  • a means is thus provided for the first time with which the hitherto only suspected beneficial effects of isoflavones and isoflavone glycosides can be reproducibly achieved.
  • Isoflavones, isoflavone glycosides and their pharmaceutically acceptable salts or solvates can thus be used for the first time in a pharmaceutical composition with peptides of precisely known, uniform and reproducible nature.
  • the amount of active ingredient and / or the amount of peptide each alone is insufficient to produce the pharmaceutical or therapeutic effect.
  • Hydrogen peroxide is a triggering or at least promoting factor in the emergence of numerous
  • Isoflavone compositions particularly in humans, have failed to reduce the availability of hydrogen peroxide and to eliminate its disease-promoting or disease-causing effects. In particular, it has not been reproducibly succeeded by administering the isoflavones and isoflavone glycosides
  • the compound of the invention provides a remedy for the first time.
  • a compound of the invention of one of the previously described types which is adapted to inhibit platelet aggregation Prevention and / or treatment of hypertension, hypercholesterolemia, hyperhomocysteinemia, diabetes mellitus, myocardial infarction, stroke, atherosclerotic vascular disease, malignancies, and osteoporosis.
  • compounds according to the invention are present in an amount which is sufficient to bring about an inhibition of platelet aggregation when administered to a mammal, in particular a human.
  • Such an effect has not been reproducibly achieved, especially when administering daidzein, daidzin, genistein and / or genistin, if appropriate with customary pharmaceutical auxiliaries and carriers, using physiologically acceptable concentrations of the named active ingredient or of the active substances mentioned.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is therefore advantageously suitable as a substitute for conventional acetylsalicylic acid and / or clopidogrel-containing pharmaceutical compositions.
  • the pharmaceutical according to the invention is therefore advantageously suitable as a substitute for conventional acetylsalicylic acid and / or clopidogrel-containing pharmaceutical compositions.
  • compositions make it possible, without the known side effects of conventional pharmaceutical compositions with acetylsalicylic acid and / or clopidogrel-based active ingredients, to achieve a desired therapeutic effect, in particular to inhibit platelet aggregation in the blood of a treated human or other mammal.
  • compositions according to the invention which are particularly suitable for inhibiting platelet aggregation in a mammal such as, for example, humans.
  • the undesirable side effects occurring in connection with the use of conventional acetylsalicylic acid and / or clopidogrel-based antiplatelet agents as well as treatment failure can be avoided or at least reduced.
  • the therapeutic efficacy may include or consist of an antioxidant effect, in particular the lowering of the availability of hydrogen peroxide in a mammal, and particularly preferably the inhibition of platelet aggregation.
  • the pharmaceutical preparation according to the invention is preferably prepared for oral or parenteral administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be present in particular in the form of a tablet, dragee, juice or other solution.
  • Composition may preferably be as pharmaceutically acceptable carrier and
  • Excipients contain water and glucose. Further suitable auxiliaries and carriers are taken from the expert in the publication by Fiedler, H.P., Encyclopedia of adjuvants for pharmacy, cosmetics and adjacent fields, 4th edition, Aulendorf: ECV Editio Kantor-Verlag, 1996.
  • composition according to the invention is preferably formulated as a solid or liquid dosage form, in particular powders, powders, granules, tablets, in particular film-coated tablets, pastilles, sachets, cachets, dragees, capsules, ointments, creams, hydrogels, pastes, patches, solutions, emulsions, in particular of Oil-in-water type, suspensions such as lotions, injection and infusion preparations.
  • the pharmaceutical preparation according to the invention contains the compound optionally in particularly selected amounts. Usually, a preparation according to the invention will also contain iron in the previously known, optionally preparation-dependent amounts. If the pharmaceutical composition according to the invention contains the compound according to the invention as an active ingredient, the amount thereof is at least 1 mg per administration unit (for example per tablet) and preferably up to 500 mg per administration unit.
  • compositions according to the invention contain a total of
  • the concentration of the compound according to the invention is at least 0.1 mg / ml and preferably up to 100 mg / ml, more preferably 10 to 50 mg / ml.
  • Example 1 Anti-tumor Efficiency of Glu-Glu Genistein
  • the novel derivative Glu-Glu-Genistein can be transported much more effectively into the cell by means of the two glutamic acid residues via a cellular peptide transport system. It is therefore to be expected that even lower concentrations of Glu-Glu-Genistein can trigger physiological effects such as an induction of apoptosis (physiological cell death).
  • Cutaneous squamous cell carcinoma SCC-12, SCC-13
  • the cells are pre-cultivated for 2-3 weeks until a uniform growth (logarithmic phase) is established.
  • the cells are seeded in 6-well dishes (in each case 200,000 cells per well). The treatment takes place after 24 hours.
  • Apoptosis 24 hours before sowing, the cells get fresh growth medium.
  • the cells are seeded to the determined conditions in 6-well dishes (i.d.R .: 200,000 cells per well). After 24 hours the treatment is carried out. Used concentrations and treatment times depend on the results of the preliminary experiments. Growth and effects are monitored and recorded microscopically at least once a day. After the incubation period, the 6-well dishes are centrifuged and the cell pellet is lysed. Using anti-histone and anti-DNA antibodies, a sandwich ELISA is carried out, which allows a statement about the extent of DNA fragmentation (Cell Death Detection ELISA, Roche). Apoptosis is presented in relative terms relative to untreated controls.
  • the cells receive fresh growth medium 24 hours before sowing. The cells are seeded in 6-well dishes to the determined conditions (i.d.R. ': 200,000 cells per well). After 24 hours the treatment is carried out. Used concentrations and treatment times depend on the results of the preliminary experiments. Growth and effects are monitored microscopically and recorded at least once a day. After the incubation period, the cell culture supernatant is harvested. In this, the activity of the lactate dehydrogenase is determined by an enzymatic detection method (LDH release assay, Fa. Roche). Cytotoxicity is presented in relative terms relative to untreated controls.
  • LDH release assay Fa. Roche
  • Proliferation Assay 24 hours before sowing, the cells get fresh growth medium. The cells are seeded in low density in 6-well dishes (usually: 50,000 cells per well). After 24 hours the treatment is carried out. The cell proliferation determinations are made at times 0, 1, 2, 3, 5, 7 days after treatment. To determine the cell number, the adherent cells are fixed and stained with crystal violet. The intensity of the coloring is determined photometrically. The cell proliferation is shown in growth curves.
  • a platelet aggregation superior to the genistein can be achieved due to improved intracellular availability. This is done via a coupling to the dipeptide GIu-GIu, so that Gen-Glu-Glu iS a peptidomimetic via specific oligopeptide transporters of the platelet membrane is increasingly transported to intracellular.
  • Platelet rich plasma is spiked with genistein dissolved in DMSO in different concentrations: 0, 25, 50, 100, 200 ⁇ M. Subsequently, measurement of collagen induced aggregation by means of
  • Genistein 1 in DCM are added 4.9 ml (2 eq.) Of pyridine and 13.05 g (60.7 mmol, 2.1 eq.) Of di-tert-butyl dicarbonate and the mixture is stirred at room temperature for 30 min touched. The solvent is stripped off, the oily residue is coevaporated twice with toluene. The resulting solid is dried under high vacuum.
  • reaction mixture is diluted with ethyl acetate and washed three times with water, then the organic phase is dried over sodium sulfate and concentrated in water
  • Genistein-Glu-Glu linked ether coupling N-terminal, methyl group as link, binding via the OH group in C 5 position of the genistein, in the following L2
  • Genistein-Glu-Glu ether coupling C-terminal via the OH group in C 5 position of the genistein, in the following A2
  • Genistein-Glu linker ether coupling N-terminal, binding via the OH group in position C 5 , in the following L1
  • Genistein-Glu ether coupling C-terminal, binding via the OH group in C 5 position of the genistein, in the following A1 • native genistein
  • the substances used are genistein, Glu-Glu 1 DMSO, Ala-Ala from the Fma Sigma-Aldrich, Kunststoff.
  • the measurement was performed using the Platelet Aggregation Profiler model PAP-8E from Bio / Data Corporation, an 8-channel aggregometer with computer-aided digital curve generation. preanalytics
  • the whole blood thus obtained is centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes.
  • the platelet-rich plasma (PRP) so obtained is allowed to rest for 45 minutes at room temperature.
  • platelet-poor plasma is obtained from the same sample by means of customary centrifuging in order to generate the respective blank values.
  • For the measurement cuvettes are used with 0.25ml filling volume.
  • genistein and the peptides used for use AIa-AIa and Glu-Glu are prepared in a ratio of 1 mg to 1 ml stock solutions, genistein and the investigated coupling products in DMSO, Glu-Glu and Ala-Ala in H 2 O.
  • the aggregation-inhibiting effect of native genistein was determined: The reference (no addition) resulted in an aggregation of 90%, corresponding also to the preliminary test. After addition of genistein 50 ⁇ M resulted an aggregation of 82% of the platelets, with the addition of genistein 100 ⁇ M an aggregation of 50% and at a concentration of 200 ⁇ M an almost complete inhibition of platelet aggregation.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutisch wirksame Verbindungen aus einem Isoflavon oder Isoflavon-Glycosid und, kovalent mit diesem verbunden, einer Aminosäure, einem Peptid oder Peptid-Derivat mit 2 bis 5 Aminosäuren, sowie pharmazeutisch akzeptable Salze oder Solvate dieser Verbindungen, sowie Verwendungen solcher Stoffe für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere für die Behandlung von Thrombozytenaggregation und für die Tumortherapie. Anwendungsgebiete der Erfindung sind demzufolge die Medizin und die pharmazeutische Industrie. Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben die allgemeine Formel (I) X-Pep, wobei X ein Isoflavon oder Isoflavon-Glycosid ist, und Pep eine Aminosäure oder ein Peptid oder Peptid-Derivat mit 2 bis 5 Aminosäuren ist, und zwischen X und Pep entweder durch eine kovalente Bindung oder ein Linkersystem eine Verknüpfung besteht.

Description

Pharmazeutisch wirksame Verbindungen
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutisch wirksame Verbindungen aus einem Isoflavon oder Isoflavon-Glycosid und, kovalent mit diesem verbunden, einer Aminosäure, einem Peptid oder Peptid-Derivat mit 2 bis 5 Aminosäuren, sowie pharmazeutisch akzeptable Salze oder Solvate dieser Verbindungen, sowie Verwendungen solcher Stoffe für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, insbesondere für die Behandlung von Thrombozytenaggregation und für die Tumortherapie. Anwendungsgebiete der Erfindung sind demzufolge die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Isoflavone, gelegentlich auch Isoflavonoide genannt, bilden eine Gruppe von zumeist gelblich gefärbten Pflanzenfarbstoffen, die sich vom Isoflavon ableiten. Im Rahmen dieser Erfindung werden zu den Isoflavonen auch deren Glycoside gezählt. Zu den bekannteren Isoflavonen zählen insbesondere Isoflavon, Daidzein, Genistein, Prunetin, Biochanin A, Orobol, Santal, Glycitein, Pratensein, Formononetin, Genistin, 6"-O- Malonylgenistin, 6"-O-Acetylgenistin, Daidzin, 6"-O-Malonyldaidzin, 6"-O-Acetyldaidzin, Glycitin, Ononin und Sissotrin und ferner Genistin, Daidzin, 6"-O-Malonylglycitin und 6"- O-Acetylglycitin. Die Malonyl-Glucoside des Genisteins machen den Hauptanteil der Isoflavone in Sojabohnen aus. In fermentierten Sojaprodukten liegen die Isoflavone hauptsächlich in ihrer jeweiligen Aglycon-Form Genistein, Daidzein und Glycitein vor.
Von einigen Isoflavonen ist bekannt, dass sie eine Estrogen-Wirkung beispielsweise auf Weidetiere zeigen. Von anderen Isoflavonen wird vermutet, dass sie eine antioxidative Wirkung im Menschen oder anderen Säugetieren besitzen, ein Beweis einer solchen Wirkung ist bisher nicht gelungen. Ebenfalls umstritten ist, ob und ggf. welche Isoflavone eine anti-karzinogene, anti-atherogene, anti-osteoporotische und/oder hypolipidemische Wirkung besitzen. Vielfach war es nämlich bisher nicht möglich, die den Isoflavonen zugeschriebenen Wirkungen durch Verabreichen des reinen Isoflavons, ggf. mit üblichen pharmazeutischen Träger- und Hilfsstoffen, zu reproduzieren. So ist es insbesondere nicht gelungen, eine antioxidative Wirkung von Genistein trotz Gabe hoher Dosen und Nachweis einer hohen Konzentration von Genistein in den Zielzellen eines Menschen zu erreichen. Beispielsweise hemmen bekanntermaßen Isoflavone, insbesondere Genistein, die Thrombozytenaggregation dosisabhängig (1 ). Dabei ist der Einfluss des Isoflavons auf die Funktion der Thrombozyten komplexer Natur: Einerseits blockiert insbesondere Genistein diverse Membranrezeptoren (Adenosinrezeptor, von Willebrand Faktor) (2, 3), und auf Grund seiner charakteristischen chemischen Struktur insbesondere auch den Thromboxan A2 Rezeptor (4). Andererseits hemmt Genistein die Thrombozytenaggregation durch Modulation intrazellulärer Stoffwechselvorgänge: Hemmung der Tyrosinkinase im Stoffwechsel der Cyclooxygenase (5), Modulation des cAMP durch Hemmung der Phosphodiesterase (6), Reduktion intrazellulärer Verfügbarkeit von Peroxid als wichtigem Agens von Phospholipase C und Arachidonsäurestoffwechsel (7, 8).
Genistein ist ein aus Soja gewonnenes Isoflavon. Verschiedene Untersuchungen zeigen einen hemmenden Effekt von Genistein auf das Wachstum von bösartigen Zellen, wie zum Beispiel denen von hämatopoetischen Tumoren wie Leukämien und Lymphomen, Melanomen und epithelialen Tumoren wie Mamma-, Lungen-, Prostata- und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen (7-5)
Die wachstumshemmende Aktivität von Genistein beruht auf seiner antiproliferativen und proapoptotischen Wirkung (6). Sie zeigte sich aber aufgrund der eingeschränkten zellulären Aufnahme von Genistein in Zellkultursystemen erst bei relativ hohen Konzentrationen, die in vivo nur schwer zu erreichen sind (7).
Es wurde bereits vorgeschlagen, synergistische pharmazeutische Zusammensetzungen aus Isoflavonen oder Isoflavon-Glycosiden mit kurzkettigen Peptiden herzustellen (PCT/DE2006/001795). In diesen Zusammensetzungen war die Verfügbarkeit der Isoflavone durch verbesserte zelluläre Aufnahme erheblich gesteigert. Jedoch sind hierfür vergleichsweise hohe Konzentrationen an Substrat - insbesondere Peptid - notwendig. Einerseits kommt es bei oraler Applikation zu einer teilweisen Aufspaltung der verwendeten Peptide bei der Magen-Darmpassage, andererseits liegen die Plasmahalbwertzeiten für Peptide im Bereich von Minuten, was die Verfügbarkeit vermindert sowie unerwünschte Nebeneffekte hervorruft. Beispielsweise sind solche Nebeneffekte von Glutaminsäure (als Abbauprodukt von GIu-GIu) im Sinne von zentralnervösen Störungen beschrieben worden. Das hat zur Folge, dass eine präzise Steuerbarkeit von Plasmaspiegeln nach Applikation, wie sie für die Therapie bestimmter Erkrankungen unabdingbar ist, nicht erreicht wird. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, den oben beschriebenen Nachteilen abzuhelfen oder sie zumindest zu mildern. Insbesondere sollten Verbindungen bereitgestellt werden, die neben unterschiedlichsten Anwendungsmöglichkeiten insbesondere als Pharmakon i.S. eines Genisteinderivates verwendbar sind, wobei durch verbesserte intrazelluläre Verfügbarkeit bspw. eine dem Genistein bzw. den
Zusammensetzungen Isoflavone/kurzkettige Peptide überlegene Hemmung der
Thrombozytenaggregation oder eine verbesserte Anti-Tumor-Aktivität erreicht werden sollte. Soweit möglich sollten auch weitere Anwendungsgebiete von Isoflavonen erschlossen werden.
Diese Aufgabe wird durch Verbindungen gemäß Anspruch 1 , pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 10, und die Verwendung solcher Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 11 oder 14-16 gelöst. Die weiteren Ansprüche sind bevorzugte Ausgestaltungen und Ausführungsformen der Erfindung.
Vollkommen überraschend hat sich herausgestellt, dass Verbindungen gemäß der Formel (I),
(I) X-Pep ,
wobei X ein Isoflavon oder Isoflavon-Glycosid ist und Pep eine Aminosäure oder ein Peptid oder Peptid-Derivat mit 2 bis 5 Aminosäuren ist, und wobei zwischen X und Pep eine kovalente Verbindung besteht oder die Verknüpfung durch ein geeignetes Linkersystem (wie Ethylenglykol, Ethanolamin, höhere Homologe davon oder die entsprechenden Polyethylenglykolderivate) hergestellt wird, sowie pharmazeutisch akzeptable Salze oder Solvate dieser Verbindungen, die Wirkungen des Isoflavonbestandteils der Verbindung auf Organismen, insbesondere Säugetiere, verstärken oder biologische Wirkungen überhaupt erst zur Entfaltung bringen.
In bevorzugten Ausführungsformen besteht der Bestandteil X der Verbindung I aus einem Isoflavon oder Isoflavon-Glycosid einer Substanz der allgemeinen Formel (II) oder aus einem pharmazeutisch akzeptablen Salz oder Solvat einer solchen Substanz gebildet:
wobei die Reste R1 , R2, R3, R4, R5 und R6 jeweils unabhängig voneinander bedeuten können: Wasserstoff, Hydroxy, Methoxy oder Glycosid (GIc), wobei einer der Reste 1 - 6 in der Verbindung I durch den Rest Pep (Bedeutung siehe oben) ersetzt ist. Bevorzugte Verknüpfungsstellen sind R2 und R5.
Das Glycosid in Formel Il hat die allgemeine Formel III
wobei R unabhängig von R1 , R2, R3, R4, R5 und R6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Acetyl und Malonyl.
Besonders bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen der Bestandteil X aus Isoflavon, Daidzein, Genistein, Prunetin, Biochanin A, Orobol, Santal, Glycitein, Pratensein, Formononetin, Genistin, 6"-O-Malonylgenistin, 6"-O- Acetylgenistin, Daidzin, 6"-O-Malonyldaidzin, 6"-O-Acetyldaidzin, Glycitin, Ononin oder Sissotrin gebildet ist.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen enthält der Bestandteil X zwei bis drei OH- Gruppen, welche frei oder ganz oder teilweise mit Monosacchariden, inkl. teilweise mit Essigsäure, Malonsäure, Zimtsäure, Cumarsäure, Caffeesäure, Ferulasäure acylierten Monosacchariden oder Disacchariden, inkl. teilweise mit Essigsäure, Malonsäure, Zimtsäure, Cumarsäure, Caffeesäure, Ferulasäure acylierten Disacchariden, Methyl oder Sulfat substituiert sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist X aus Genistein, Genistin, Daidzein oder Daidzin, bevorzugt Genistein, gebildet.
Der Peptidrest der Verbindung X-Pep (I) ist bevorzugt aus einem Peptid oder Peptid- Derivat mit 2 bis 5 Aminosäuren gebildet, wobei mindestens 2 Aminosäuren Seitenketten umfassen, die bei pH=7 negativ geladen sind.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Bestandteil Pep aus einem Dipeptid gebildet, das aus der Gruppe der Peptide mit den Sequenzen DD, EE, DE, ED; ausgewählt ist, wobei D=Asparaginsäure und E=Glutaminsäure ist. Derart kurze Peptidbestandteile und deren pharmazeutisch akzeptable Salze oder Solvate haben sich überraschend als besonders stark synergistisch wirksam, insbesondere in Kombination mit Genistein,
Genistin, Daidzein und Daidzin, erwiesen. Von den genannten Dipeptiden ist Glutaminsäuredipeptid (Peptid der Sequenz EE) besonders bevorzugt. Mit
Glutaminsäuredipeptid in Verbindung mit Genistein konnte eine besonders markante
Steigerung der thrombozytenaggregationshemmenden Wirkung sowie bei der
Hemmung des Tumorwachstums, im Vergleich zu Genistein, in vitro und auch in vivo bei Menschen beobachtet werden.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist der Bestandteil Pep aus einem Peptid gebildet, das aus der Gruppe der Peptide mit den Sequenzen
DDDDD, DDDDE, DDDED, DDDEE, DDEDD, DDEDE, DDEED, DDEEE, DEDDD, DEDDE, DEDED, DEDEE, DEEDD, DEEDE, DEEED, DEEEE, EDDDD, EDDDE, EDDED, EDDEE, EDEDD, EDEDE, EDEED, EDEEE, EEDDD, EEDDE, EEDED, EEDEE, EEEDD, EEEDE, EEEED, EEEEE,
DDDD, DDDE, DDED, DDEE, DEDD, DEDE, DEED, DEEE, EDDD, EDDE, EDED, EDEE, EEDD, EEDE, EEED, EEEE1
DDD, DDE, DED, DEE, EDD, EDE, EED, EEE;
ausgewählt ist, wobei D=Asparaginsäure und E=Glutaminsäure ist. Prinzipiell sind alle möglichen Kombinationen von X und Pep, die kovalent verknüpft sind, als erfindungsgemäße Verbindung geeignet. Beispielsweise hat sich für verschiedene Einsatzbereiche eine Verbindung bewährt, bei der das Isoflavon Genistein mit dem Peptid oder Peptid-Dehvat der Sequenz EE kovalent verknüpft ist, wobei E=Glutaminsäure ist.
Im Prinzip kann die kovalente Verknüpfung zwischen X und Pep innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung auf beliebige Weise, vorzugsweise über eine Carbamat-, Ether- oder Esterbindung, ausgebildet sein. Besonders bewährt hat sich, wenn das Peptid über seine N-terminale Aminogruppe oder über seine C-terminale Carboxylgruppe oder die daraus durch Reduktion erhältliche primäre Hydroxylfunktion direkt mit einer Hydroxylgruppe von X, die an einer der Positionen R1-R6 befindlich ist, unter Ausbildung einer kovalenten Carbamat-, Ether-, oder Esterbindung verbunden ist, oder über ein geeignetes Linkersystem das beide Funktionalitäten verbindet. Geeignet als Linkersystem sind Ethylenglykol, Ethanolamin, höhere Homologe davon oder die entsprechenden Polyethylenglykolderivate.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist dabei die kovalente Verknüpfung über ein Amid, einen Ether oder einen Carbonsäureester ausgebildet, vorzugsweise wenn die Verknüpfung über R2 oder R5 von X erfolgt ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner die Verwendung dieser Verbindungen oder pharmazeutisch akzeptabler Salze oder Solvate davon zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung und/oder zum Schutz vor medizinischen Indikationen des menschlichen Organismus oder des Organismus anderer Säugetiere.
Bevorzugte medizinische Indikationen umfassen dabei die Prophylaxe und Therapie der thrombembolischen Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Gefässerkrankungen und Gefässanomalien, Erkrankungen im Zusammenhang mit einer erhöhten Thromozytenzahl und / oder Thrombozytenaggregation, Stoffwechselerkrankungen und Krebserkrankungen Besonders bevorzugte medizinische Indikationen umfassen dabei die Prophylaxe und Therapie von: Hypertonie, Hypercholesterinämie, Herzinfarkt und Reinfarkt, Infarkte und Reinfarkte anderer Organe, Schlaganfall, Lungenembolie, Beinvenenthrombose, arteriosklerotische Gefäßerkrankungen, durch erhöhte Thrombozytenzahl und oder Aggregation verursachte Erkrankungen, Diabetes mellitus, Hyperhomocysteinämie, Malignome, und oder Osteoporose, sowie die prä und postoperative Thromboseprophylaxe,
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der genannten Verbindungen und Wirkstoffkombinationen zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung und/oder zum Schutz vor medizinischen Indikationen des menschlichen Organismus oder des Organismus anderer Säugetiere.
Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung wenigstens einer erfindungsgemäßen Verbindung oder pharmazeutisch akzeptabler Salze oder Solvate davon als Zusatz zu pharmazeutischen Zusammensetzungen, um die Verfügbarkeit von Wirkstoffen in diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen in Säugetieren zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung umfasst insbesondere die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutisch akzeptabler Salze oder Solvate davon als Nahrungsmittelzusatz, als Zusatzstoff zum Schutz von Zellen in Fermentern oder Bioreaktoren, als Tiernahrung und als Pflanzenschutzmittel.
Besonders bevorzugt ist insbesondere die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutisch akzeptablen Salze oder Solvate davon zur
Verminderung der humanen Thrombozytenaggregation oder des Wachstums von bösartigen Zellen des Menschen, wie zum Beispiel denen von hämatopoetischen
Tumoren wie Leukämien und Lymphomen, soliden Tumoren wie Melanomen, epithelialen Tumoren wie Mamma-, Lungen-, gastrointestinalen, (z. B. Bauchspeicheldrüse), insbesondere Magen- und Dickdarm und Prostata und Kopf-Hals
Karzinomen
Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der Verbindung I umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Wirkstoffs, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Isoflavon, Daidzein, Genistein, Prunetin, Biochanin A, Orobol, Santal, Glycitein, Pratensein, Formononetin, Genistin, 6"-O-Malonylgenistin, 6"-O-Acetylgenistin, Daidzin, 6"-O-Malonyldaidzin, 6"-O-Acetyldaidzin, Glycitin, Ononin und Sissotrin, und/oder eines pharmazeutisch akzeptablen Solvats oder Salzes des Wirkstoffs, wobei der Wirkstoff ggf. eine geschützte Seitengruppe aufweist, b) Bereitstellen eines Peptids oder Peptid-Derivats mit 2 bis 5 Aminosäuren Länge oder Bereitstellen einer Aminosäure und/oder eines Solvats oder Salzes des Peptids oder der Aminosäure, wobei zumindest eine der Aminosäuren eine Seitengruppe besitzt, die geschützt ist, und der N-Terminus des Peptids oder der Aminosäure geschützt ist und/oder der C-Terminus des Peptids oder der Aminosäure an einer Festphase gebunden ist, c) Mischen des Stoffs aus a) mit dem Stoff aus b) und einem Aktivierungsreagens, vorzugsweise zur Aktivierung von Carboxyl- oder Hydroxylgruppen.
Beispielsweise erfolgt die Herstellung mittels a) 1. Herstellung eines Peptids geeigneter Länge und Sequenz mit wenigstens einer
(OtBu) geschützten Seitengruppe und Boc-geschütztem N-Terminus via Festphasensynthese am Harz und Abspaltung vom Harz.
2. Kupplung von X an das geschützte Dipeptid mit HATU.
3. tBu/Boc-Entschützung. 4. Reinigung.
b)
1. Herstellung eines Peptids geeigneter Länge und Sequenz mit wenigstens einer (OtBu) geschützten Seitengruppe und Boc-geschütztem N-Terminus via Festphasensynthese am Harz und Abspaltung vom Harz.
2. Kupplung von BocX an das geschützte Dipeptid mit HATU.
3. tBu/Boc-Entschützung.
4. Reinigung. C)
1. Herstellung eines Peptids geeigneter Länge und Sequenz mit wenigstens einer (OtBu) geschützten Seitengruppe und Fmoc-geschütztem N-Terminus via Festphasensynthese am Harz und anschliessender Fmoc-Spaltung. 2. Umsetzung mit BocX und Triphosgen.
3. Abspaltung von Harz.
4. tBu/Boc-Entschützung.
5. Reinigung.
oder d)
0. Ankupplung einer N-terminal Fmoc geschützten Aminosäure an ein Harz, wobei die Aminosäure eine Allylester geschützte Seitengruppe aufweist,
1. A) Spaltung des Allylesters am Harz. B) Kupplung der freigesetzten Säuregruppe mit BocX unter Verwendung von HATU. 2. A) Fmoc-Spaltung. B) Ggf. Kopplung wenigstens einer weiteren vorzugsweise N- terminal Boc geschützten Aminosäuren, die eine tBU geschützte Seitengruppe aufweist, an den festphasengebundenen N-Terminus.
3. Abspaltung von Harz.
4. tBu/Boc-Entschützung. 5. Reinigung.
oder e)
1. Herstellung eines Peptids geeigneter Länge und Sequenz mit wenigstens einer (OtBu) geschützten Seitengruppe und Fmoc-geschütztem N-Terminus via Festphasensynthese am Harz und anschliessender Fmoc-Spaltung.
2. Herstellung eines etherverknüpften Ethanolamin-X-Konjugates.
3. Kupplung der beiden Fragmente.
4. Entschützung.
5. Reinigung.
Ausgangspunkt der Erfindung ist die überraschende Feststellung, dass die neuen Verbindungen der Formel (I) über ein zelluläres Peptidtransportsystem deutlich effektiver in die Zelle transportiert werden. Damit ist gewährleistet, dass auch bereits niedrigere Konzentrationen dieser Verbindungen physiologische Effekte auslösen können, insbesondere bei der Vorbeugung, Behandlung und Linderung von humaner Thrombozytenaggregation und Tumoren und damit verbundenen Indikationen. Somit sind auch wesentlich niedrigere Mengen erforderlich als bei der Verwendung des entsprechenden reinen Isoflavons oder Isoflavon-Glycosids.
Insbesondere wirken die Verbindungsbestandteile X und Pep durch ihre kovalente Verknüpfung auf vorteilhafte Weise synergistisch zusammen. Dabei können zusätzlich Synergieeffekte mit weiteren Wirkstoffen eintreten.
Dabei wird unter einem Wirkstoff eine Substanz verstanden, die bei Verabreichung an ein Säugetier, insbesondere einem Menschen, eine pharmazeutisch gewünschte Veränderung eines physiologischen Zustandes des behandelten Säugetiers hervorrufen kann. Unter einem Wirkstoff wird insbesondere die pharmazeutisch wirksame Bestandteil eines Arzneimittels verstanden, insbesondere auch der Wirkstoffbestandteil X der erfindungsgemäßen Verbindung. Soweit ferner im Rahmen dieser Erfindung Substanzen in ihrer Singularform bezeichnet werden, so sind damit auch Mischungen mehrerer der entsprechenden Substanzen gemeint, soweit nichts anderes gesagt ist. Die Erfindung betrifft daher auch solche pharmazeutischen Zusammensetzungen, bei denen der Wirkstoff ein Gemisch zweier oder mehrerer Verbindungen der Formel (I) ist.. Ferner werden erfindungsgemäß unter einem Wirkstoff und einem Peptid bzw. daraus durch kovalente Verknüpfung hervorgegangene erfindungsgemäße Verbindungen, auch deren jeweils pharmazeutisch akzeptable Salze oder Solvate gezählt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff Peptide lineare oder verzweigte Peptide, die sowohl aus den 20 gencodierten Aminosäuren, als auch aus nichtnatürlich auftretenden alpha-, beta- und gamma-Aminosäuren bestehen können.
Unter einem Peptid-Derivat wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Peptid verstanden, das in der Haupt und/oder in der Seitenkette durch mindestens einen linearen, zyklischen oder verzweigten, Halogen- oder Hydroxy- oder Amin-substituierten oder nicht-substituierten, gesättigten oder aliphatischen Alkyl-, Alkylether-,
Alkylthioether-, Alkoxy-, Acyl- oder Aryl-Rest modifiziert ist, wobei der Rest zwischen 1 und 20 Kohlenstoffatome enthält. Die pharmazeutische bzw. therapeutische Wirkung, die durch die Verbindung erreicht wird, ist insbesondere auch die eines Antioxidationsmittels, wenn der Wirkstoff bzw. Wirkstoffbestandteil X aus einem Isofiavon oder einem Isoflavon-Glycosid gebildet ist. Die erfindungsgemäße Verbindung ermöglicht es erstmals, eine bisher vermutete oder nur bei hohen Konzentrationen beschriebene antioxidative Wirkung eines Isoflavons bei pharmazeutisch akzeptablen Konzentrationen des Wirkstoffs in den Zielzellen eines behandelten Säugetiers, insbesondere eines Menschen, zu erreichen. Durch die erfindungsgemäße Verbindung wird damit erstmals ein Mittel bereitgestellt, mit dem die bisher nur vermuteten förderlichen Wirkungen von Isoflavonen und Isoflavon- Glycosiden reproduzierbar erzielt werden können. Isoflavone, Isoflavon-Glycoside und deren pharmazeutisch akzeptable Salze oder Solvate können somit erstmals in einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit Peptiden mit genau bekannter, gleichmäßiger und reproduzierbarer Beschaffenheit eingesetzt werden.
Insbesondere ist es bevorzugt, wenn die Menge an Wirkstoff und/oder die Menge an Peptid jeweils allein nicht ausreichend ist zum Erzeugen der pharmazeutischen bzw. therapeutischen Wirkung.
Besonders bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Verbindung einer der zuvor beschriebenen Arten zum Herabsetzen der Verfügbarkeit von Wasserstoffperoxid in einem Säugetier, insbesondere einem Menschen. Wasserstoffperoxid ist ein auslösender oder zumindest fördernder Faktor beim Entstehen zahlreicher
Erkrankungen von Säugetieren, insbesondere des Menschen. Mit den herkömmlichen
Isoflavon-Zusammensetzungen ist es insbesondere beim Menschen nicht gelungen, die Verfügbarkeit von Wasserstoffperoxid herabzusetzen und dessen krankheitsfördernde oder krankheitsauslösende Wirkung zu beseitigen. Insbesondere ist es bisher nicht reproduzierbar gelungen, durch Verabreichen der Isoflavone und Isoflavon-Glycoside
Genistein, Daidzein, Genistin und/oder Daidzin die Verfügbarkeit von
Wasserstoffperoxid in den Körperzellen eines Menschen oder anderen Säugetiers physiologisch wirksam herabzusetzen. Die erfindungsgemäße Verbindung schafft hier erstmals Abhilfe.
Ferner ist eine erfindungsgemäße Verbindung einer der zuvor beschriebenen Arten bevorzugt, die eingerichtet ist zum Hemmen der Thrombozytenaggregation, zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Hypertonie, Hypercholesterinämie, Hyperhomocysteinämie, Diabetes mellitus, Herzinfarkt, Schlaganfall, atherosklerotischer Gefäßerkrankung, Malignomen, und Osteoporose.
Vorzugsweise liegen in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung erfindungsgemäße Verbindungen in einer solchen Menge vor, die ausreicht, um bei Verabreichung an ein Säugetier, insbesondere einem Menschen, eine Hemmung der Thrombozytenaggregation, herbeizuführen. Eine solche Wirkung ist insbesondere bei Verabreichen von Daidzein, Daidzin, Genistein und/oder Genistin, ggf. mit üblichen pharmazeutischen Hilfsstoffen und Trägern, nicht reproduzierbar unter Verwendung physiologisch akzeptabler Konzentrationen des genannten Wirkstoffs bzw. der genannten Wirkstoffe gelungen. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist daher vorteilhafterweise geeignet als Ersatz herkömmlicher Acetylsalicylsäure- und/oder Clopidogrel-enthaltender pharmazeutischer Zusammensetzungen. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen ermöglichen es, ohne die bekannten Nebenwirkungen herkömmlicher pharmazeutischer Zusammensetzungen mit Acetylsalicylsäure- und/oder Clopidogrel-basierten Wirkstoffen eine gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, insbesondere die Thrombozytenaggregation im Blut eines behandelten Menschen oder anderen Säugetiers zu hemmen.
Mit den genannten Stoffen, insbesondere mit Genistein, lassen sich erfindungsgemäße Verbindungen herstellen, die besonders geeignet sind zum Hemmen der Thrombozytenaggregation in einem Säugetier wie beispielsweise dem Menschen. Mit derartigen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können insbesondere die im Zusammenhang mit der Verwendung herkömmlicher Acetylsalicylsäure- und/oder Clopidogrel-basierter Thrombozytenaggregationshemmer auftretenden, unerwünschten Nebenwirkungen sowie ein Therapieversagen vermieden oder zumindest verringert werden.
Die therapeutische Wirksamkeit kann insbesondere umfassen oder bestehen aus einer antioxidativen Wirkung, insbesondere dem Herabsetzen der Verfügbarkeit von Wasserstoffperoxid in einem Säugetier, und insbesondere vorzugsweise der Hemmung der Thrombozytenaggregation. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung ist vorzugsweise eingerichtet zur oralen oder parenteralen Applikation. Dazu kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung insbesondere in Form einer Tablette, Dragee, Saft oder sonstiger Lösung vorliegen. Die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung kann vorzugsweise als pharmazeutisch akzeptable Träger- und
Hilfsstoffe Wasser und Glucose enthalten. Weitere geeignete Hilfs- und Trägerstoffe entnimmt der Fachmann der Veröffentlichung von Fiedler, H. P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio- Kantor-Verlag, 1996.
Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung formuliert als feste oder flüssige Arzneiform, insbesondere Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, insbesondere Filmtabletten, Pastillen, Sachets, Cachets, Dragees, Kapseln, Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten, Pflaster, Lösungen, Emulsionen, insbesondere vom Öl-in-Wasser- Typ, Suspensionen wie beispielsweise Lotionen, Injektions- und Infusionszubereitungen.
Je nach Zubereitungsart enthält die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung die Verbindung gegebenenfalls in besonders ausgewählten Mengen. Üblicherweise wird eine erfindungsgemäße Zubereitung auch Eisen in den bisher bekannten, ggf. zubereitungsabhängigen Mengen enthalten. Wenn die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung die erfindungsgemäße Verbindung als Wirkstoff enthält, so beträgt dessen Menge zumindest 1 mg pro Darreichungseinheit (beispielsweise pro Tablette) und vorzugsweise bis zu 500 mg pro Darreichungseinheit.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen enthalten insgesamt
10 mg bis 500 mg der Verbindungen pro Darreichungseinheit, insbesondere pro
Tablette, wobei Mengen von 100 mg bis 500 mg für eine Darreichung in Tablettenform bevorzugt sind. Bei Darreichung in parenteral zu verwendender Lösung beträgt die Konzentration an der erfindungsgemäßen Verbindung zumindest 0,1 mg/ml und vorzugsweise bis zu 100 mg/ml, besonders bevorzugt 10 bis 50 mg/ml.
Das neue Derivat Glu-Glu-Genistein (I1 X = Genistein, Pep = GIu-GIu) kann bspw. mittels der beiden Glutaminsäurereste über ein zelluläres Peptidtransportsystem deutlich effektiver in die Zelle transportiert werden. Damit ist gewährleistet, dass auch bereits niedrigere Konzentrationen von Glu-Glu-Genistein physiologische Effekte wie eine Induktion der Apoptose (physiologischer Zelltod) auslösen können.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Ausführungsbeispiele und der Figuren näher erläutert, wobei der Gegenstand der Erfindung nicht auf die Ausführungsbeispiele und die Figuren beschränkt ist.
Beispiel 1) Anti-Tumor-Effizienz von Glu-Glu-Genistein Das neue Derivat Glu-Glu-Genistein kann mittels der beiden Glutaminsäurereste über ein zelluläres Peptidtransportsystem deutlich effektiver in die Zelle transportiert werden. Damit ist zu erwarten, dass auch bereits niedrigere Konzentrationen von Glu-Glu- Genistein physiologische Effekte wie eine Induktion der Apoptose (physiologischer Zelltod) auslösen können.
Ziele
• Die verbesserte Anti-Tumor-Aktivität des neuen Genisteinderivats Glu-Glu- Genistein werden im Vergleich zu Genistein in 8 ausgewählten Zelllinien humaner Tumoren demonstriert. • Die Effekte werden in den Vorversuchen zunächst auf den Ebenen der Apoptoseinduktion, der Zytotoxität sowie der Proliferationshemmung untersucht.
Vorgehen
• Zelllinien: Mammakarzinom: MCF-7, MDA 435
Kolonkarzinom: SW-620, SW-480
Malignes Melanom: A-375, SK-Mel-13
Kutanes Plattenepithelkarzinom: SCC-12, SCC-13
• Die Zellen werden 2-3 Wochen vorkultiviert, bis sich ein gleichmäßiges Wachstum (logarithmische Phase) eingestellt hat.
• Für die durchzuführenden Experimente werden die Zellen in 6-well-Schalen ausgesät (jeweils 200.000 Zellen pro well). Die Behandlung erfolgt nach 24 Stunden.
• In Vorexperimenten werden zunächst 5 verschiedene Konzentrationen von Glu-Glu- Genistein und von Genistein eingesetzt. Die Wirkung auf Proliferation und Zelltod wird mikroskopisch beurteilt. Beobachtungszeiten: 4h, 8h, 24h, 48h, 72h, 6 Tage. Die Konfluenz sowie der Anteil an abgelösten Zellen werden in Wachstumsprotokollen festgehalten. Aufgrund dieser Protokolle werden zwei geeignete Konzentrationen ausgewählt. • Ggf. muss ein zweites Pilotexperiment mit veränderten Bedingungen durchgeführt werden.
• Apoptosebestimmung: 24h vor der Aussaat bekommen die Zellen frisches Wachstumsmedium. Die Zellen werden zu den ermittelten Bedingungen in 6-well- Schalen ausgesät (i.d.R.: 200.000 Zellen pro well). Nach 24 h wird die Behandlung durchgeführt. Eingesetzte Konzentrationen und Behandlungszeiten richten sich nach den Ergebnissen der Vorexperimente. .Das Wachstum sowie die Effekte werden mindestens 1x täglich mikroskopisch kontrolliert und protokolliert. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die 6-well-Schalen zentrifugiert und das Zellpellet lysiert. Unter Verwendung von anti-Histon sowie anti-DNA-Antikörpern wird ein Sandwich- ELISA durchgeführt, der eine Aussage über das Maß der DNA-Fragmentierung erlaubt (Cell Death Detection ELISA, Fa. Roche). Die Apoptose wird in relativen Werten im Verhältnis zu unbehandelten Kontrollen dargestellt.
• Zytotoxizitätsbestimmung: 24h vor der Aussaat bekommen die Zellen frisches Wachstumsmedium. Die Zellen werden zu den ermittelten Bedingungen in 6-well- Schalen ausgesät (i.d.R.': 200.000 Zellen pro well). Nach 24 h wird die Behandlung durchgeführt. Eingesetzte Konzentrationen und Behandlungszeiten richten sich nach den Ergebnissen der Vorexperimente. Das Wachstum sowie die Effekte werden mindestens 1x täglich mikroskopisch kontrolliert und protokolliert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird der Zellkulturüberstand geerntet. In diesem wird mit einer enzymatischen Nachweismethode die Aktivität der Laktat-Dehydrogenase bestimmt (LDH-release-assay, Fa. Roche). Die Zytotoxizität wird in relativen Werten im Verhältnis zu unbehandelten Kontrollen dargestellt.
• Proliferationsassay: 24h vor der Aussaat bekommen die Zellen frisches Wachstumsmedium. Die Zellen werden in geringer Dichte in 6-well-Schalen ausgesät (i.d.R.: 50.000 Zellen pro well). Nach 24 h wird die Behandlung durchgeführt. Die Bestimmungen zur Zeilproliferation werden zu den Zeitpunkten 0, 1 , 2, 3, 5, 7 Tagen nach Behandlung durchgeführt. Zur Bestimmung der Zellzahl werden die anhaftenden Zellen fixiert und mit Kristallviolett gefärbt. Die Intensität der Färbung wird photometrisch bestimmt. Die Zeilproliferation wird in Wachstumskurven dargestellt.
• Für alle drei Experimentserien (Apoptose, Zytotoxizität und Zeilproliferation) werden folgende Ansätze durchgeführt: a) unbehandelte Kontrollen, b) Genistein, Konzentration 1 , c) Genistein, Konzentration 2, d) GIu-GIu, Konzentration 2, e) GIu- Glu-Genistein, Konzentration 1 , f) Glu-Glu-Genistein, Konzentration 2. Alle Experimente werden mit jeweils Dreifachwerten durchgeführt. Die gesamte Serie an Experimenten wird 1x wiederholt.
• Die Ergebnisse werden mit Hilfe der Mathematik unscharfer Systeme (Leibnizsystem) ausgewertet und ein Abschlussbericht erstellt.
Durch den Einsatz repräsentativer Karzinomzelllinien und die Prüfung der für eine Antitumortherapie wesentlichen zellulären Funktionskaskaden ergeben sich stringente Hinweise zur Funktion von Glu-Glu-Genistein im Bereich der Tumortherapie.
Beispiel 2)
Durch eine erfindungsgemäße Verbindung lässt sich auf Grund verbesserter intrazellulärer Verfügbarkeit eine dem Genistein überlegene Hemmung der Thrombozytenaggregation erreichen. Dies geschieht über eine Koppelung an das Dipeptid GIu-GIu, so dass Gen-Glu-Glu i.S. eines Peptidomimetikums über spezifische Oligopeptidtransporter der Thrombozytenmembran vermehrt nach intrazellulär transportiert wird.
Versuche
• Plättchenreiches Plasma (PRP) wird mit in DMSO gelöstem Genistein in unterschiedlichen Konzentrationen versetzt: 0, 25, 50, 100, 200 μM. Anschließend Messung der Collageninduzierten Aggregation mittels der
Aggregometrie unter Zusatz von Collagen 1 ug/ml. Auswertung und Identifizierung einer beginnend effektiven Genisteinkonzentration (ca 50 μM)
• Testung von Genistein vs Gen-Glu-Glu wie oben beschrieben im Bereich der zuvor bestimmten beginnend effektiven Konzentration, beispielsweise 0, 25, 50, 75 μM. Es zeigt sich eine Überlegenheit von Gen-Glu-Glu in Bezug auf die
Hemmung der collageninduzierten Aggregation.
• Wiederholung des zweiten Versuchs, aber nach vorheriger Zugabe des indifferenten Dipeptides AIa-AIa in 100facher Konzentration, also 0, 2.5, 5, 7.5 mM. Es zeigt sich nunmehr eine Antagonisierung des spezifischen Gen-Glu-Glu Effektes, da die Peptidtransporter durch den Überschuss von AIa-AIa blockiert werden.
Beispiel 3) Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen
C-terminale Modifikation:
a) Isomer 1 :
4. Herstellung von BOcGIu(OtBu)GIu(OtBu)OH via Festphasensynthese am TCP- Harz und Abspaltung vom Harz. 5. Kupplung von Genistein an das geschützte Dipeptid mit HATU.
6. tBu/Boc-Entschützung.
7. Reinigung.
Abkürzungen:
TCP-Harz Merrifield-Harz mit 2-Chlorotrityllinker
HATU O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N',-tetramethyluronium- hexafluorophosphat, ein Kupplungsreagens GIu Glutaminsäure
Boc tert.-Butyloxycarbonyl, eine Schutzgruppe
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, eine Schutzgruppe tBu tert.-Butyl, eine Schutzgruppe
Beispiel 4
Herstellung von 7, 4'-Di-(tert.-Butyloxycarbonyloxy)-hydroxy-3-phenyl-4H- chromen-4-one
Zu einer Lösung von 8.1 g (29.7 mmol) Genistein 1 in DCM werden 4.9 ml_ (2 eq.) Pyridin und 13.05 g (60.7 mmol, 2.1 eq.) Di-tert.-butyl-dicarbonat gegeben und die Mischung 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird abgezogen, der ölige Rückstand wird zweimal mit Toluol koevaporiert. Der anfallende Feststoff wird am Hochvakuum getrocknet.
Ausbeute: 13 g 2 in Form eines weißen amorphen Feststoffs, der üblicherweise zu etwa 30% aus dem dreifach umgesetztem Genistein besteht.
Beispiel 5
Herstellung von 5-(2-aminoethoxy)-7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4- one
Eine Lösung von 2 (8 g, 17.01 mmol), N-Boc-Ethanolamin (4.11 g 25.5 mmol, 1.5 eq.) und Triphenylphosphin (6.69 g, 25.5 mmol, 1.5 eq.) in DCM wird auf -15°C gekühlt, dann wird, verteilt über 5 min, eine Lösung von Diisopropylazodicarboxylat (5.159 g, 25.5 mmol, 1.5 eq.) in DCM zugetropft. Die Mischung wird auf RT gebracht und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit DCM verdünnt, zweimal mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird abgezogen, der Rückstand wird dreimal mit Toluol koevaporiert. Der erhaltene Rückstand wird mit möglichst wenig DCM gelöst und durch Zugabe von Diethylether gefällt. Ausbeute: 10.9 g eines weißen Feststoffes bestehend aus 3 und Tris-BocGenistein. Das Zwischenprodukt 3 (5.4 g) wird in 10 mL Methanol gelöst und bei RT mit 30 ml_ gesättigter methanolischer HCl (1.25 mol/l) behandelt. Nach kurzer Zeit beginnt die Ausfällung eines gelben Feststoffs, der nach 12h abgesaugt wird. Trocknen in Vakuum liefert reines 4 als HCI-SaIz, das ohne weitere Reinigung umgesetzt wird. Ausbeute: 1.4 g 4 als leuchtend gelbes feines Pulver.
Beispiel 6
Herstellung von 5-{2-GluGlu-2-aminoethoxy)-7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H- chromen-4-one
Zu einer Lösung von 4 (1.22 g, 3.49 mmol) in DMF werden Boc-Glu(OtBu)Glu(OtBu)OH
(1.1 g, 2.59 mmol, 0.75 eq.) und PPA (50% in DMF, 2.14 mL) gegeben und die
Mischung durch Zugabe von N-Ethyldiisopropylamin auf pH 8-9 eingestellt. Es wird 12h bei RT gerührt.
Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat verdünnt und dreimal mit Wasser gewaschen, danach wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und im
Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird chromatographisch gereinigt
(Hexan/Ethylacetat 7:3 → 9:1→ reines Ethylacetat).
Ausbeute: 1.04 g (34%) 5 als weißer Schaum.
Das Zwischenprodukt 5 (1.04 g) wird mit 5 mL Ethylacetat aufgeschlämmt und mit 20 mL HCl in Ether (2M) versetzt, wobei sich die Mischung gelb färbt und klar wird. Nach 6h wird das ausgefallene Produkt abgesaugt, mit Ethylacetat und Diethylether gewaschen und anschließend im Hochvakuum getrocknet. Ausbeute: 820 mg des an chromatographisch reinem 6 als gelbes Pulver. 415 mg des Rohprodukts werden in Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Ausbeute: 291 mg 6 in Form eines gelben Schaums.
Beispiel 7 Biologische Testung
Versuchsbeschreibung
Substanzen
Untersucht wurden jeweils folgende fünf Genistein-Glu-Glu Konjugate:
• Genistein-Glu-Glu Carbamat, die Koppelung erfolgt C-terminal über die OH- Gruppe in C7 Position des Genisteins, im folgenden C1
• Genistein-Glu-Glu gelinkerter Ether, Koppelung N-terminal, Methylgruppe als Link, Bindung über die OH-Gruppe in C5 Position des Genisteins, im folgenden L2
• Genistein-Glu-Glu Ether, Koppelung C-terminal über die OH-Gruppe in C5 Position des Genisteϊns, im folgenden A2
• Genistein-Glu gelinkerter Ether, Koppelung N-terminal, Bindung über die OH- Gruppe in Position C5, im folgenden L1
• Genistein-Glu Ether, Koppelung C-terminal, Bindung über die OH-Gruppe in C5 Position des Genisteins, im folgenden A1 • Natives Genistein
• Gemisch natives Genistein/ GIu-GIu
Materialien
Die verwendeten Substanzen Genistein, GIu-GIu1 DMSO, AIa-AIa stammen von der Fma Sigma-Aldrich, München. Zur Messung wurde der Platelet Aggregation Profiler Model PAP-8E der Firma Bio/Data Corporation, ein 8-Kanal Aggregometer mit rechnergestützter digitaler Kurvenerstellung, verwendet. Präanalytik
Nach Blutentnahme aus großkalibriger Vene in ungepuffertes Citrat 10% wird das so gewonnene Vollblut bei ca 1500U/min 10 Minuten zentrifugiert. Das so gewonnene Plättchenreiche Plasma (PRP) wird 45 Minuten bei Raumtemperatur Ruhen gelassen. Gleichzeitig wird aus der gleichen Probe durch gewohntes Zentrifugieren Plättchenarmes Plasma zur Erstellung der jeweiligen Leerwerte gewonnen. Zur Messung werden Küvetten mit 0.25ml Füllvolumen verwandt.
Von den zu prüfenden Substanzen, einschließlich Genistein sowie den zur Verwendung kommenden Peptiden AIa-AIa und GIu-GIu werden im Verhältnis 1 mg auf 1 ml Stammlösungen erstellt, Genistein sowie die untersuchten Koppelungsprodukte in DMSO, GIu-GIu und AIa-AIa in H2O.
Vorversuch In mehreren Vorversuchen wird zum einen ein normales Aggregationsverhalten der nativen Probe nach Zugabe von 1 μg/ml Collagen (87% Plättchenaggregation, s.u.) sowie ein indifferentes Verhalten von DMSO im Bereich der verwendeten Konzentrationen gezeigt. In der Citratblutprobe wurden 230.000 μl Thrombozyten gemessen.
Messungen
Zunächst wurde die aggregationshemmende Wirkung von nativem Genistein ermittelt: Bei der Referenz (kein Zusatz) ergab sich eine Aggregation von 90%, entsprechend auch dem Vorversuch. Nach Zugabe von Genistein 50μM ergab sich eine Aggregation von 82% der Plättchen, unter Zugabe von Genistein 100μM eine Aggregation von 50% und bei einer Konzentration von 200μM eine nahezu vollständige Hemmung der Thrombozytenaggregation.
Die Ergebnisse decken sich im wesentlichen sowohl mit eigenen älteren Untersuchungen als auch mit den in der Literatur beschriebenen Effekten. Zur Problematik der Vergleichbarkeit wurde dabei schon Stellung bezogen.
Entsprechend der eigenen Vorgabe betrachteten wir nun wie auch erwartet eine Konzentration von 50μM als eine beginnend effektive Wirkkonzentration. Entsprechend untersuchten wir die fünf Genisteinderivate in Bezug auf die collagen-induzierte Aggregation (wiederum 1 μg/ml) bei einer Konzentration von 50μM. Es ergaben sich folgende Ergebnisse:
Auffallend ist - neben einer erheblich ausgeprägteren aggregationshemmenden Wirkung aller getesteter Substanzen gegenüber dem nativen Genistein (FA 82%) - eine deutliche Desaggreagation im zeitlichen Verlauf, zu erkennen an der Rückläufigkeit der Kurven bzw Differenz zwischen MA und FA. Darüber hinaus ist die Geschwindigkeit der Aggregation, der so genannte „Slope" insbesondere bei L2 aber auch bei C1 gegenüber dem nativen Genistein deutlich vermindert.
Zum Vergleich erfolgte eine Aggregationsmessung nach Zugabe von Genistein 50μM und GIu-GIu 150μM im Sinne eines Gemisches. Die Messung erfolgte direkt, also ohne relevante Vorinkubation, sofern dies nicht schon der Meßmethode immanent ist. Auch hier zeigte sich eine dem Genistein überlegene Wirkung von MA 56% bzw FA 44% (Genistein MA 85%, FA 82%).
Um die Hypothese zu untermauern, dass es sich bei den beobachteten Phänomenen um einen verbesserten Membrantransport über spezifische Peptridtransporter auf der Thrombozytenmembran handelt, erfolgte eine erneute Messung der Aggregation unter dem Einfluß von L2 nach vorheriger Zugabe des indifferenten, aber als Substrat der Peptidtransporter fungierenden Dipeptids AIa-AIa im lOfachen molaren Überschuß, also 1_2 50μM/Ala-Ala 500μM: Die zuvor beobachtete fast vollständige Aggregationshemmung konnte so teilweise antagonisiert werden.
Weitere Versuche
Im weiteren haben wir die Substanz L2 auf ihre aggregationshemmenden Eigenschaften hin untersucht. Zunächst wird die Aggregation nach Zugabe von L2 in einer Konzentration von 50 μM nach Zugabe von Collagen in ansteigenden Konzentrationen untersucht (beobachteter Effekt reversibel?):
Collageninduzierte Aggregation nach Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen von L2, Collagen in einer Konzentration von 1 μg/ml (Dosis-Wirkungsbeziehung?):
L2 50 μM nach Zugabe von ADP 2μM, Collagen 1 μM, Ristocetin 0,5, 1 ,0, 1 ,5 mg/ml, Adrenalin 8μM, Arachidonsäure 0,5 μM
L2 nach Zugabe Maximale Aggregation Endpunk von t
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Claims

Patentansprüche
1. Verbindung gemäß Formel (I),
(I) X-Pep
wobei
- X ein Isoflavon oder Isoflavon-Glycosid ist, und
- Pep eine Aminosäure oder ein Peptid oder Peptid-Derivat mit 2 bis 5 Aminosäuren ist, und zwischen X und Pep eine direkte kovalente Verknüpfung besteht, oder die Verknüpfung durch ein geignetes Linkersystem (wie Ethylenglykol, Ethanolamin, höhere Homologe davon oder die entsprechenden Polyethylenglykolderivate) hergestellt wird,
sowie pharmazeutisch akzeptable Salze oder Solvate dieser Verbindungen.
2. Verbindung nach Anspruch 1 , wobei das Isoflavon oder Isoflavon-Glycosid 2 - 4 OH-Gruppen enthält, welche teilweise mit Monosacchariden, inkl. teilweise mit Essigsäure, Malonsäure, Zimtsäure, Cumarsäure, Caffeesäure, Ferulasäure acylierten Monosacchariden oder Disacchariden, inkl. teilweise mit Essigsäure, Malonsäure, Zimtsäure, Cumarsäure, Caffeesäure, Ferulasäure acylierten Disacchariden, Methyl oder Sulfat substituiert sind.
3. Verbindung nach Anspruch 1 und 2, wobei X aus einem Isoflavon oder Isoflavon- Glycosid einer Substanz der allgemeinen Formel (II) oder aus einem pharmazeutisch akzeptablen Salz oder Solvat einer solchen Substanz gebildet wird,
wobei die Reste R1 , R2, R3, R4, R5 und R6 jeweils unabhängig voneinander bedeuten können: Wasserstoff, Hydroxy, Methoxy oder Glycosid (GIc) und einer der Reste 1 - 6 in der Verbindung I durch den Rest Pep (Bedeutung siehe oben) bevorzugt an den Verknüpfungsstellen R2 und R5 ersetzt ist.
4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei das Glycosid GIc die allgemeine Formel III
aufweist, wobei R unabhängig von R1 , R2, R3, R4, R5 und R6 aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Acetyl und Malonyl ausgewählt ist.
5. Verbindungen nach Anspruch 1 bis 4, wobei das Isoflavon oder Isoflavon-Glycosid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Isoflavon, Daidzein, Genistein,
Prunetin, Biochanin A, Orobol, Santal, Glycitein, Pratensein, Formononetin,
Genistin, 6"-O-Malonylgenistin, 6"-O-Acetylgenistin, Daidzin, 6"-O-Malonyldaidzin,
6"-O-Acetyldaidzin, Glycitin, Ononin und Sissotrin.
6. Verbindung nach Anspruch 1 , wobei das Isoflavon Genistein ist.
7. Verbindung nach Anspruch 1 , wobei X eine der folgenden Formeln IV - VII bedeutet
8. Verbindungen nach Anspruch 1 bis 7, wobei das Peptid oder Peptid-Derivat 2 bis 5 Aminosäuren umfasst, und wobei mindestens 2 Aminosäuren Seitenketten umfassen, die bei pH=7 negativ geladen sind.
9. Verbindungen nach Anspruch 1 bis 7, wobei das Peptid oder Peptid-Derivat ein
Dipeptid ist, ausgewählt aus der Gruppe der Peptide mit den Sequenzen DD, EE, DE, ED; wobei D=Asparaginsäure und E=Glutaminsäure ist.
10. Verbindungen nach Anspruch 1 bis 7, wobei das Peptid oder Peptid-Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe der Peptide mit den Sequenzen
DDDDD, DDDDE, DDDED, DDDEE, DDEDD, DDEDE, DDEED, DDEEE, DEDDD, DEDDE, DEDED, DEDEE, DEEDD, DEEDE, DEEED, DEEEE, EDDDD, EDDDE, EDDED, EDDEE, EDEDD, EDEDE, EDEED, EDEEE, EEDDD, EEDDE, EEDED, EEDEE, EEEDD, EEEDE, EEEED, EEEEE,
DDDD, DDDE, DDED, DDEE, DEDD, DEDE, DEED, DEEE, EDDD, EDDE, EDED, EDEE, EEDD, EEDE, EEED1 EEEE,
DDD, DDE, DED, DEE, EDD, EDE, EED, EEE;
wobei D=Asparaginsäure und E=Glutaminsäure ist.
11.Verbindungen nach Anspruch 1 , wobei das Isoflavon Genistein ist und das Peptid oder Peptid-Derivat die Sequenz EE hat; wobei E=Glutaminsäure ist.
12. Verbindung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Verknüpfung als Carbamat-, Ether- oder Esterbindung ausgebildet ist.
13. Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend Verbindungen gemäß
Anspruch 1-12.
14. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1-13. zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder zum Schutz vor einer medizinischen Indikation ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Erkrankungen im Zusammenhang mit einer erhöhten Thrombozytenaggregation, Stoffwechsel-Erkrankungen,
Knochenerkrankungen oder Krebserkrankungen.
15. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die medizinische Indikation ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe:
Leukämie, Lymphom, Melanom, Mammakarzinom, Lungenkarzinom, Prostatakarzinom, Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom, Kolonkarzinom.
16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die medizinische Indikation ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe:
Hypertonie, Hypercholesterinämie, Herzinfarkt, arteriosklerotische Gefäßerkrankungen, Schlaganfall, durch erhöhte Thrombozytenaggregation verursachte Krankheiten, Diabetes mellitus, Hyperhomocysteinämie, Malignome,
Osteoporose.
17. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bis 12 als Nahrungsmittelzusatz.
18. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bis 12 als Zusatzstoff zum
Schutz von Zellen in Fermentern oder Bioreaktoren.
19. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bis 12 als Tiernahrung.
20. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bis 12 als Pflanzenschutzmittel.
21. Herstellung von Verbindungen der Formel I, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Wirkstoffs, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Isoflavon, Daidzein, Genistein, Prunetin, Biochanin A, Orobol, Santal, Glycitein, Pratensein, Formononetin, Genistin, 6"-O-Malonylgenistin, 6"-O- Acetylgenistin, Daidzin, 6"-O-Malonyldaidzin, 6"-O-Acetyldaidzin, Glycitin, Ononin und Sissotrin, und/oder eines pharmazeutisch akzeptablen Solvats oder Salzes des Wirkstoffs, wobei der Wirkstoff ggf. eine geschützte Seitengruppe aufweist, b) Bereitstellen einer Aminosäure oder eines Peptids oder Peptid-Derivats mit 2 bis 5 Aminosäuren Länge oder Bereitstellen einer Aminosäure und/oder eines Solvats oder Salzes des Peptids oder der Aminosäure, wobei zumindest eine der Aminosäuren eine Seitengruppe besitzt, die geschützt ist, und der N-Terminus des Peptids oder der Aminosäure geschützt ist und/oder der C- Terminus des Peptids oder der Aminosäure an einer Festphase gebunden ist, c) Mischen des Stoffs aus a) mit dem Stoff aus b) und einem Aktivierungsreagens, vorzugsweise zur Aktivierung von Carboxyl- oder
Hydroxylgruppen.
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