TWI384983B - 一種木樨素用於製備治療或預防血癌的保健食品之用途 - Google Patents

Description

一種木樨素用於製備治療或預防血癌的保健食品之用途

本發明係關於一種抑制癌細胞基因表現之化合物，特別是一種抑制癌細胞Glyoxalase-I基因表現之化合物及其在醫療上之用途。

癌症乃科技發展及生活變遷下而衍生之文明病，主要係由經常性接觸致癌因子，如放射性物質、菸或酒等環境因素以致控制細胞生長之基因發生突變，造成細胞異常增生，組織浸潤，甚至經由循環系統轉移至重要器官，影響正常生理機能；依世界衛生組織統計，在工業化國家，罹患癌症的人口與日俱增，為國人十大死亡原因之一。

一般而言，癌症的治療的原則主要係在不危及正常細胞之前提清除癌細胞，常見的治療手段多以外科手術直接切除病灶，若癌細胞已轉移至鄰近組織或重要器官則需藉由放射線療法或化學療法的輔助治療，以有效限制癌細胞的擴散；然而，放射線治療之輻射性與化學藥物之毒性皆缺乏對於癌細胞與正常細胞、組織之選擇性作用，易引發不可預期的副作用，如毛髮脫落、出血及嘔吐等，造成患者身心極大的負擔。

一直以來，癌症治療或預防效果之提升為當代學者所竭力推動與研發的目標，近年來，陸續有新型抗癌機制的提出，以抑癌基因(tumor suppressor gene)，如p53及p21，或是一些調控細胞週期之基因為作用標靶，藉由癌細胞與正常細胞在蛋白質表現上之差異，進而專一性抑制癌細胞之生長，誘導癌細胞發生自發性死亡(apoptosis)，以達到治療或預防癌症之功效(Igneyet al .,2006)。其中，第一型乙二醛酶(glyoxalase I；GLO-I)為一種含金屬酵素之二聚體(homodimeric Zn²⁺ -metalloenzyme)，可催化穀胱甘肽(Glutathione；GSH)酵素之轉型作用(GSH-dependent conversion)，以及協助GSH排除醣解作用產生的細胞毒素(Creightonet al . 2003)，GSH為麩胺酸、半胱胺酸及甘胺酸之聚合體，乃細胞內抗氧化、排毒及免疫調節之樞紐，主要係以其硫氫基(thiol)結合細胞內的毒物，進而將毒物自細胞內清除；其中，該GSH係在GLO-I與第二型乙二醛酶(glyoxalase II；GLO-II)之共同催化下，結合細胞中因醣類代謝而產生之細胞毒素-甲基二醛(methylglyoxal；MGO)以將其排除於細胞外，促進細胞生長。另一方面，該MGO則係在細胞代謝過程中扮演抑制細胞生長的調控因子，據相關研究指出，該GLO-I與MGO之平衡在細胞增生與凋亡的調控機制中具有重要的意義，並且，與多種腫瘤的發生具有直接的影響(Morcoset al .,2008 and Thornallyet al .,1996)。

目前，已知在多種腫瘤細胞(如大腸癌、胰臟癌、乳癌及腎臟癌等)中皆可觀察到GLO-I大量表現的情況，顯示癌細胞需大量表現GLO-I基因，將細胞內因過度增生，持續進行醣類代謝而產生大量的MGO排除，以維持癌細胞的正常生長(Amicarelliet .al .,1998)；同理可知，外生性的MGO或者GLO-I之抑制劑則可相對性地導致MGO於癌細胞之堆積，引發癌細胞自發性的死亡，進而抑制癌細胞的增生與擴散(Ayoub,Allen and Thornalley,1993)；因此，目前希望大量開發GLO-I之抑制劑，並且將該GLO-I之抑制劑應用於開發高療效且低副作用之抑癌藥物或相關保健食品，以改善癌症之臨床治療或預防之效果，造福於群眾。

本發明之主要目的係提供一種抑制癌細胞基因表現之化合物，可有效抑制癌細胞之Glyoxalase I基因表現，限制癌細胞之生長。

本發明次一目的係提供一種抑制癌細胞基因表現之化合物，可有效抑制癌細胞之Glyoxalase I基因表現，促使癌細胞計畫性死亡。

本發明再一目的係提供一種抑制癌細胞基因表現之化合物，可有效抑制癌細胞之Glyoxalase I基因表現，可應用於開發用以治療或預防癌症之相關保健食品。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：一種抑制癌細胞基因表現之化合物，係為一不飽和碳鏈相關之化合物(α,β-unsaturated carbonyl groups)。以及一種如上所述之抑制癌細胞基因表現的化合物在製備用以治療或預防癌症疾病的保健食品之用途。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之一種抑制癌細胞基因表現之化合物係為一不飽和碳鏈相關之化合物(α,β-unsaturated carbonyl groups)，如木犀素(Luteolin)、木犀素之類似物(analogues)及衍生物(derivatives)。

本發明之化合物可以專一性抑制癌細胞中Glyoxalase-I基因之表現，造成大量的細胞毒素-甲基二醛(methylglyoxal；MGO)累積於癌細胞無法移除，啟動細胞自發性死亡的作用機制，避免癌細胞的過度增生及轉移，有效抑止癌細胞之擴散；因此，該化合物係可應用於製備治療或預防癌症之保健食品，以改善癌症之治療現況。

本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物係可以由各種人工合成方式獲得，或者由天然植物，如類黃酮類(包含木犀素、檞皮素、聖草酚等)，經植物萃取處理而取得。

請參照第1圖所示，本實施例所採用的不飽和碳鏈相關之化合物係選木犀素(Luteolin)、其類似物及衍生物所組成之族群，該木犀素係可利用中藥熬煮或水萃等方式於芹菜、青椒、柑橘等植物取得。

本實施例係將上述各種植物之樣品置於一萃取溶劑(如水、甲醇或乙醇等)，利用高溫震盪的方式進行萃取，待適當時間後再以一離心過濾方式除去多餘之雜質或沉澱物，最後經純化而得本發明之化合物。其中，該植物樣品與萃取溶劑的重量比例較佳係1:2，使該植物樣品可以完全溶於萃取溶劑中，本發明係於一水浴恆溫裝置進行萃取，較佳萃取溫度為65℃。

為證實本發明之化合物具有抑制癌細胞Glyoxalase-I基因表現之功能及效果，係將木犀素(Luteolin)與一癌細胞株共同培養一段時間，再分別針對該癌細胞株進行細胞存活率、細胞蛋白質表現、流式細胞儀及共軛聚焦顯微鏡等分析試驗，紀錄該癌細胞株之細胞生理變化。

本發明係選用一人類癌細胞株，於一適當培養基中進行繼代培養，待該人類癌細胞株增殖至培養容器之7~8分滿，取一緩衝液，將增殖培養之人類癌細胞株由該培養容器之器壁沖刷至該緩衝液中，以方便進行該人類癌細胞株之細胞計數，以及後續細胞存活率、細胞蛋白質表現以及流式細胞儀等分析試驗。更詳言之，本實施例之人類癌細胞株係為一人類血癌細胞株U937(Human histiocytic lymphoma cells U937；以下簡稱U937)，乃購自於ATCC，編號CRL-2367^TM ；將該U937增殖培養於含有10%胎牛血清蛋白之RPMI培養基[10% fetal bovine serum(FBS)/Roswell Park Memorial Institute medium]，待U937長至培養容器之7成滿，進行細胞計數。本發明10%FBS/RPMI培養基之配方如第1表所示：

請參照第2a、2b及3圖所示，係木犀素(Luteolin)、與U937共同培養後之細胞活性，以及細胞中Glyoxalase-I表現量的分析結果；本發明係將7組U937(各組均含有一定細胞數量之U937，如1x10^4~7 cells/ml)分別與0、10、20、40、60、80及100微莫耳濃度(μM)之本發明之化合物-木犀素(Luteolin)共同培養24小時，係為第a、b、c、d、e、f及g組，最終以濃度60μM為上限做此實驗，再分別針對各組細胞進行西方墨點法及MTT分析之試驗。

更詳言之，本實施例係自上述5組(包含a至e組)之U937中分別取出適量細胞，以一定比例(較佳係1:10)稀釋於一商用蛋白質抽取溶劑(lysis buffer；Sigma)，進行均質處理，造成各組細胞溶解、破裂，以獲得細胞內的蛋白質；再由一商用蛋白質定量套組(Protein Assay Kit；Invitrogen)分析由各組(a至e組)U937細胞所抽取的蛋白質總量，取等量蛋白質，利用取自兔子之商用抗Glyoxalase-I多株抗體(Sigma)進行西方墨點法分析。

請再參照第2a及2b圖所示，本實施例係以癌細胞檢體中正常表現之β-actin的表現量為定量標準，分別比較各組細胞檢體中Glyoxalase-I的表現情況；由第2a圖結果，該b及c組之細胞檢體中所表現Glyoxalase-I的訊號與該對照組(a)訊號相比較，分別為a組訊號之0.99及0.79倍，及Glyoxalase-I的表現量較高，而其他d至e組細胞檢體中，Glyoxalase-I的表現量則相對較少(僅為該a組訊號之0.49或0.4倍)，並且，各組檢體在Glyoxalase-I表現量之差異似乎係與本發明化合物之劑量呈現反向趨勢關係。請再參照圖2b，係取60μM為本發明化合物-木犀素(Luteolin)之濃度點並觀察該Glyoxalase-I分別在0、6、12及24小時內之變化(分別標示為i、ii、iii及iv)，其結果顯示該細胞之Glyoxalase-I表現量係隨時間增加而呈現反向趨勢關係。由此可證實，本發明之化合物-木犀素(Luteolin)確實可以抑制人類癌細胞中Glyoxalase-I的表現，使該Glyoxalase-I於細胞內之表現量隨時間增加而遞減，且較高劑量(如40~60微莫耳濃度)之該化合物則可呈現較佳之抑制效果。

再者，將20微升(μl)之商用MTT溶液(Sigma M-2128)分別加入各組(a至g組)之U937，於37℃之恆溫細胞培養箱中培養2~3小時，此時，各組的U937可利用細胞內所含之琥珀酸去氫酶(Succinate dehygergenase)，將原本呈現黃色的商用MTT溶液還原成藍紫色的結晶物，然而，已死亡的U937，或者細胞活性較差的U937則係呈現較差的還原狀態；待還原反應完成後，將各組所產生之結晶物取出，分別溶解於一分散液，以分光光度計分析並紀錄各組分散液在波長570 nm下的吸光值。本實施例之分散液係採用適量之DMSO(購自於MERCK)溶解該結晶物，以進行吸光值之分析試驗。

請再參照第3圖所示，本發明係以第a組(對照組)所測得之吸光值為基準值，對照各組(a至g)測得之吸光值以推算各組U937之細胞活性；其中，該對照組(a)之U937的細胞活性係定義為100，相較於該對照組，該第b及c組之U937則具有60~100左右的細胞活性，而第d、e、f及g組U937所表現之細胞活性則明顯較第b及a組為差，僅有低於40左右的活性。由此可知，選用較高劑量(如40~100微莫耳濃度)本發明之化合物-木犀素(Luteolin)可以有效地抑制一人類癌細胞的細胞活性，造成癌細胞之死亡，或者喪失細胞活性，並且，該化合物對於癌細胞的抑制作用係呈現一正向劑量取向；因此，證實本發明之化合物確實具有影響癌細胞正常細胞表現之作用性，以致癌細胞之生長、增生受阻。

請參照第4a及4b圖所示，分別係上述第a、c、d組及e組之U937在與該木犀素(Luteolin)共同培養後之流式細胞儀分析結果，以及60μM之本發明化合物-木犀素(Luteolin)在培養第0、6、12及24小時之流式細胞儀之分析結果。本實施例係將分別擷取第a、c、d及e組之培養液，或者係培養第0、6、12及24小時後之e組培養液(分別標示為I、II、III及IV)，利用一商用螢光染劑[如propidium iodine(PI)、acridine organe(AO)及fluorescein diacetate(FDA)；Betcon Dickinson]進行細胞染色，再通入一流式細胞儀(FACScan laser flow cytometer analysis system；Becton Dickenson)，分析該U937在波長488 nm之雷射光激發下所產生之散射光，以推得該U937在各培養階段所呈現之細胞凋亡狀態。

由第4a及4b圖之結果，其中，對照組(a)之U937細胞中，僅有約2.2%之細胞呈現細胞凋亡的現象，而與本發明化合物-木犀素(Luteolin)共培養之U937細胞，則分別呈現5.7%(c)，17.7%(d)及66.5%(e)之細胞凋亡程度，顯示較高濃度之木犀素(Luteolin)係可引發較嚴重之細胞凋亡情況。另外，該U937細胞之凋亡現象係隨著培養時間的增加而逐漸加劇，至培養後期，如第12(III)及24(IV)小時處，該U937之凋亡程度已達7成左右；由此得知，本發明之化合物係可造成一人類癌細胞之細胞凋亡，並且隨著化合物濃度的提高或者作用時間的增加，該癌細胞凋亡的狀態則逐漸加劇。

請參照第5a及5b圖所示，分別係上述第a、c、d與e組之U937在與該木犀素(Luteolin)共同培養24小時之細胞DNA片段結果，以及以60μM木犀素(Luteolin)為濃度點在與U937細胞共同培養第0、6、12及24小時之細胞DNA片段結果(分別標示為1、2、3及4)；本實施例係利用DNA電泳在U937細胞中之DNA片段情況，進一步推定U937的DNA片段狀態。更詳言之，本發明係於第a、c、d及e組培養之U937挑取適量細胞，或者於培養第0、6、12及24小時挑取適量之U937細胞，利用Phenol:Chloroform:Isomyl Alcohol分離DNA，再以DNA電泳測定各組U937中DNA片段狀態。

由第5a及5b圖所示結果，相較於該對照組(a)，該U937的DNA片段會隨著所共同培養之木犀素(Luteolin)的濃度與時間而顯現不同表現程度之訊號，而共培養的木犀素(Luteolin)濃度越高(如60μM)、培養時間越長(如24小時)則U937的DNA片段所顯現的訊號較為不明顯。據此可知，該木犀素(Luteolin)可導致癌細胞的死亡，以致該癌細胞的DNA片段量明顯減少，並且較高濃度之木犀素，或者較長時間的木犀素處理對於癌細胞的抑制具有較顯著的效果，再次證實本發明之化合物對於人類癌細胞之抑制能力。

請參照第6a、6b及6c圖，分別係上述第a、c、d及e組之U937細胞與該木犀素(Luteolin)共同培養後之細胞染色結果；本實施例係利用免疫染色的方式標定一特定轉錄因子(如NFκB、DAPI及Merge)在各組U937細胞中之分布情況，進一步推定兩組U937的細胞狀態。更詳言之，本發明係利用取自於兔子之商用抗NFκB抗體(Sigma)進行免疫染色反應，再以一共軛焦顯微鏡(Leica TCS SP2 confocal microscope)觀察，以測定各組U937細胞中NFκB、DAPI及Merge之分布狀況與細胞狀態。

由第6a、6b及6c圖之結果，在第a、c、d與e組之U937的DNA凋亡情形，在第d組有明顯的凋亡小體，以及NFκB係均勻地分布於該U937細胞的各處(由第6b圖所示)，而在第c組及第d組，NFκB則係集中存在於該U937細胞的四周，再以第e組之濃度為60μM分別在培養第0、6、12及24小時[紀錄於第6c圖，分別標示為(1)、(2)、(3)及(4)]；由此可知，一人類癌細胞在正常培養狀態下會大量利用醣類養分，產生細胞毒素，引發細胞之發炎反應，因此可見大量NFκB進入細胞核(如第6b圖所示)誘發特定基因之轉錄作用(如Glyoxalase-I)，以開啟下游反應(如催化穀胱甘肽酵素之轉型作用)，移除細胞內所產生的毒素；而本發明之化合物-姜烯酸(6-shogaol)係可以抑止該NFκB進入細胞核(如第6b圖示)，阻斷下游反應進行，以致大量細胞毒素堆積於細胞內，最後造成該人類癌細胞之自發性死亡。

承上所述，本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物係為一不飽和碳鏈相關之化合物(α,β-unsaturated carbonyl groups)、其類似物或其衍生物，如木犀素(Luteolin)，該化合物可以阻斷NFκB的作用路徑，抑制人類癌細胞之Glyoxalase-I表現，以致由該Glyoxalase-I催化反應之正常細胞作用受到抑止，因此，無法有效排除由醣類代謝所產生的細胞毒素-甲基二醛(methylglyoxal；MGO)，大量毒素堆積於癌細胞內，影響其細胞活性，最後引發癌細胞之自發性的死亡(apoptosis)，進而抑制癌細胞的增生與擴散，同理可知，由木犀素(Luteolin)具有阻斷NFκB的作用路徑，抑制人類癌細胞之Glyoxalase-I表現，進而達到抑制癌細胞增生與擴散的功效；據此，本發明之化合物確實具有抑制癌細胞基因表現，可應用開發用以預防或治療癌症之藥物化合物、食品添加成分以及相關保健食品，具有提升臨床醫療品質之功效。

本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物，係可以做為一藥物活性成分(active substrate)，以各種方式單獨，或者結合至少一種藥物佐劑、藥物載劑、其他副成分、營養成分或他種藥物活性成分共同給予各種生物個體，較佳係經由口服方式定期給予各種生物個體一適當劑量，如每天給予1~2次，每次給予40~60微莫耳濃度(μM)/每單位重量公斤(kg)；再者，本發明之化合物可以藉由任何食品加工方法製成各種習知造型的口服錠劑(如錠、膠囊、粉末或滴劑)或相關食品(飲品、乳品或精力湯等)，以符合各種生物個體之使用。

本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物，可以有效抑制癌細胞之Glyoxalase I表現，限制癌細胞之生長，進而誘發癌細胞計畫性死亡，避免癌細胞之持續增生及擴散，為本發明之功效。

本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物，具有抑制癌細胞生長及擴散之特性，因此，可以應用於開發用以治療或預防癌症之相關保健食品，以提升臨床醫療的水準，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1圖：本發明不飽和碳鏈相關化合物-木犀素之化學結構。

第2a圖：本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物之西方點墨法分析結果之一。

第2b圖：本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物之西方點墨法分析結果之二。

第3圖：本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物之MTT分析結果。

第4a圖：本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物之流式細胞儀分析結果之一。

第4b圖：本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物之流式細胞儀分析結果之二。

第5a圖：DNA片段分析結果之一。

第5b圖：DNA片段分析結果之二。

第6a圖：本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物之共軛聚焦顯微鏡分析結果之一。

第6b圖：本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物之共軛聚焦顯微鏡分析結果之二。

第6c圖：本發明一種抑制癌細胞基因表現之化合物之共軛聚焦顯微鏡分析結果之三。

Claims (1)

1. 一種木樨素用於製備治療或預防血癌的保健食品之用途，其中，該木樨素係能夠抑制血癌細胞中第一型乙二醛酶(Glyoxalase-I，簡稱GLO-I)基因表現。