KR20100137748A

KR20100137748A - 항산화 단백질 엔알에프-2의 활성 증진, 간염 치료 및 예방 또는 간 보호에 유용한 3, 4-디히드록시벤잘아세톤

Info

Publication number: KR20100137748A
Application number: KR1020090055950A
Authority: KR
Inventors: 고종희; 연승우; 박은경; 유정수; 백남인; 강재훈
Original assignee: 일동제약주식회사
Priority date: 2009-06-23
Filing date: 2009-06-23
Publication date: 2010-12-31
Also published as: KR101184152B1

Abstract

본 발명은 3, 4-dihydroxybenzalacetone (이하 DBL로 명칭)의 항산화 단백질 Nrf-2의 활성 증진 및 간염 억제 활성에 대한 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본발명에 따른 DBL은 항산화 단백질 Nrf-2의 활성을 증대시켜, 활성산소에 의한 각종 질병과 노화 방지 및 면역력을 높여 이와 관련된 질병을 치료, 예방 또는 완화할 수 있으며, 또한 우수한 간염 억제 활성으로 간염 치료제, 예방제 및 간 보호제로 사용할 수 있다.

3, 4-dihydroxybenzalacetone (DBL), 항산화 단백질, Nrf-2, 간염치료제, 간 보호제, GOT, GPT

Description

항산화 단백질 엔알에프-2의 활성 증진, 간염 치료 및 예방 또는 간 보호에 유용한 3, 4-디히드록시벤잘아세톤 {3, 4-dihydroxybenzalacetone for the activation of antioxidant protein Nrf-2, the treatment and prevention of hepatitis or liver protection}

본 발명은 Nrf-2의 활성을 생체 내에서 증진시키고, 간염활성 억제 효과가 있는 DBL를 제공하는 것이다.

NF-E2 related factor 2 (Nrf-2)는 산화적 스트레스로부터 인체를 보호하고 생체 이물 (xenobiotic)의 해독 역할을 하는 phase II 효소라 불리는 일련의 단백질을 조절하는 주 조절자로 알려져 있다. Phase II 효소에는 glutathione S-transferase (GST), NAD(P)DH:quinine oxidoreductase 1 (NQO1), glutamyl-cysteinyl ligase (GCL), heme oxygenase (HO1)과 thioredoxin reductase 1 (TXNRD1)가 알려져 있다. Anti-oxidant responsive element (ARE)라고 불리는 공통적인 염기 서열이 이들 phase II 효소의 각 유전자의 프로모터에 있으며 이들 발현이 전사인자인 Nrf-2에 의해 조절된다. Nrf-2는 Keap1과 결합한 형태로 세포질에 존재하며 프로테아좀 단백질 분해 기작 (proteasomal degradation)에 의해 분해되 지만 (Chem. Res. Toxicol., 2005, 18, 1779-1791), 활성 산소, 15-deoxy-delta 12, 14-prostaglandin J₂, dithiolethiones 및 triterpenoids 등에 노출되면 Keap1과 분리되어 핵 내로 이동하여 다른 전사 인자와 함께 위에서 언급된 여러 효소의 발현을 증가시킨다 (J. Biol. Chem. 2003, 278, 8135-8145; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004, 101, 6379-6384; Arch. Biochem. Biophys. 2006, 454, 7-15).

이와 같이 Nrf-2의 활성 증진을 통한 산화적 스트레스 대한 보호는 활성 산소에 의한 노화와 관련된 만성 질환의 (동맥경화증, 고혈압, 당뇨병, 중추 신경계질환, 피부 질환, 눈 질환, 천식과 암) 발병을 예방하거나 늦추는데 유용할 것으로 예상되며 (Biomed. Pharmacother. 2003, 57, 251-260), 실제로 브로콜리를 비롯한 여러 채소에 포함되어 있는 sulforaphane는 Nrf-2의 활성 증진 물질로서 가장 잘 알려져 있으며 Nrf-2의 활성 증진을 통해 고혈압 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2004, 101, 7094-7099), 염증 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2004, 101, 7094-7099), 노화 관련 시력 감퇴 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, 89, 10446-10451), 암 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, 89, 2399-2403; Carcinogenesis. 2000, 21, 2287-2291)을 예방하거나 진행을 늦추는 것으로 알려져 있다. 또한, sulforaphane이 Nrf2 활성을 증진하여 외상 후 뇌 손상에 의한 지적 이상을 개선하는 효과가 있다고 보고되었으며 (Neurocsci. Lett., 2009, 460, 103-107; J. Neurotrauma, 2009, Epub ahead of print), 이외에도 Nrf-2의 활성 증가가 신경 세포를 보호하여 파킨슨병과 헌팅턴병과 같은 뇌질환을 치료하는데 유용할 것이라는 보고(PLoS one, 2009, 4, e5757)와 cisplatin에 의한 신장 독성 (Biochem. Pharmacol., 2008, 76, 597-607), acetaminophen에 의한 간 손상 (Toxicol. Appl. Pharmacol., 2009, 236, 109-114)과 급성 염증성 간 손상도 보호한다고 보고되었다. 간의 염증성 반응이 진행되는 동안, 정상 실질 세포 (parenchymal cell)의 산화적 스트레스에 의한 파괴가 간염과 만성 간염 질환으로 급성 염증성 간 손상을 유도하는데 Nrf-2에 의해 조절되는 적응반응 (adaptive response)은 염증성 산화적 손상과 염증성 산화환원 신호전달계 (proinflammatory redox-sensitive signaling)을 보호함으로써 염증을 약화시킨다. 실제로, Nrf-2의 활성을 증가시킨 쥐에 급성 염증성 간 손상을 유발시켰을 때 그 손상 정도를 줄여 염증으로 인한 간세포 괴사를 막아 급성 염증성 간 손상을 보호 한다고 보고되었다 (Toxicol. Sci. 2008, 104, 218-227).

간은 인체 내 소화기계와 전신순환계 사이에 위치하며 외부로부터 들어온 독성물질로부터 전신을 방어하고 생체 외 물질의 대사 등 기능을 담당하고 있다. 생체 내로 들어온 생체 외 물질은 일단 간을 통과하기 때문에, 간은 영양소 외에도 많은 독성 물질에 노출될 위험이 크고 다른 장기보다 손상 받을 가능성이 크다.

간 질환연구와 관련하여, 최근에는 간 질환 모델을 구현할 수 있는 사염화탄소로 유도된 간 손상 동물모델 및 D-갈라토스아민 (D-Galactosamine; 이하 D-Gal로 약칭함)과 지질다당체 (Lipopolysaccharide; 이하 LPS로 약칭함)로 유도된 급성간염모델이 개발되어 간 질환 치료제 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, D-gal/LPS로 유도된 간 손상 모델은 실제 대부분의 간 질환 발병 기전과 유사하게 면 역 반응의 활성화를 통해 간 손상을 유발하므로 간 질환 치료 및 예방제 개발에 적합한 동물모델이다 (Hepatology, 1999, 30, 151-159). D-gal/LPS로 유도된 급성 간염모델에서 D-gal은 간세포에서 RNA와 단백질 합성을 저해하여 LPS에 의한 간 독성을 극대화시키며, LPS는 간의 마크로파이지인 쿠퍼 (Kupffer) 세포의 사이토카인 (cytokine), 일산화질소 (NO), 활성산소의 분비 및 합성을 촉진하는 역할을 한다. 이 때, 과량 생성된 일산화질소 (NO)에 의해 유도되는 종양괴사인자 알파 (TNF-α)가 패혈증 또는 급성간염을 일으키는데 주된 역할을 한다고 알려져 있고, 실제로 TNF-α가 생체 내 (in vivo) 및 시험관 내 (in vitro) 간세포 사멸을 일으킨다는 결과가 보고되었다 (Am. J. Physiol. Regulatory Integrative comp Physiol., 2000, 278, R1196-R1201). 이와 같이 D-gal/LPS로 유도된 급성 간 손상은 혈중에 간조직에서 유리된 glutamic-pyruvic transaminase (GPT), glutamic-oxaloacetic transaminase (GOT)를 증가시키므로 이들 지표를 감소시키는 약물 개발에 유용하게 사용될 수 있다. 최근에는 상기 동물 모델을 이용하여 간 기능을 보호하여 간염 발생을 예방하거나 간염을 치료할 수 있는 약제들이 많이 개발되고 있다 (Boiirg. Med. Chem., 1997, 7, 2193-2198; Eur. J. Pharmacol., 1999, 368, 245-250).

DBL은 차가 버섯(Inonotus obliquus (persoon) Pilat : 러시아에서는 chaga라 불림) 추출물의 성분으로 항산화 요소 중 하나로 보고되었지만 (Chem. Pharm. Bull. 2007, 55, 1222-1226), 아직 그 역할에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 최근 일부 발혀진 DBL의 작용 기전으로는IκBα kinase의 활성을 저해함으로써 nuclear factor-κB를 억제해 세포 사멸을 유도하고, 세포 증식과 전이를 억제한다 는 것 (Mol. Cancer Ther. 2008, 7, 191-201)과 유방암 세포인 MCF-7 세포에서 [³H]estradiol이 결합하는 nuclear type II site에 경쟁적으로 결합함으로써 c-Myc와 cyclin D1의 유전자 발현의 증가를 저해하여 세포 증식을 억제한다는 보고가 있다 (Steroids 2006, 71, 865-874).

이에 본 발명자들은 세포 내에서 Nrf-2 활성을 증진시키는 물질에 대한 연구 중 DBL이 세포 내에서 Nrf-2 활성을 증가시킬 뿐 아니라, Nrf-2의 하위 단백질인 HO1의 발현을 증가시키고 D-gal/LPS로 유도된 간염 모델에서 혈중 GOT와 GPT를 대조군에 비해 낮추는 효과가 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Nrf-2 활성을 증진을 통하여 각종 질환을 치료 및 예방하고 우수한 간염활성 억제 효과를 보이는 DBL을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DBL의 Nrf-2의 활성 증진, 간염의 치료 및 예방 또는 간 보호 기능을 밝혀내고 이를 함유하는 조성물을 제공하고자 한다.

DBL이 Nrf-2의 전사 인자로서의 활성을 유도하는 것을 in vitro에서 확인하기 위하여 Nrf-2의 조절을 받는 유전자의 프로모터에 존재하는 ARE 염기 서열에 결합하는 정도를 측정한다. HepG2 세포에서 DBL이 Nrf-2의 하위 단백질 중 하나인 HO1 발현을 농도별로 증가시키는 것을 관찰함으로써, DBL이 Nrf-2가 ARE 염기 서열에 결합하는 활성을 증가시켜 하위 단백질 HO1 발현을 증가시킴을 확인한다. DBL이 Nrf-2가 Keap1과의 분리되어 세포질에서 핵으로 이동을 촉진함을 확인하기 위해 DBL 처리 후 핵 내 Nrf-2 단백질을 측정한다.

In vivo에서도 DBL이 Nrf-2 활성을 증가시키는지 확인하기 위해 실험쥐에 DBL을 경구 투여하고 3 시간 뒤에 간에서 HO1 발현을 관찰한다. 증가한 HO1 발현에 의해 D-gal/LPS로 유발된 간 손상 보호 여부를 GPT 및 GOP를 측정함으로써 관찰한다.

본 발명에서 사용되는 DBL은 IκBα kinase의 활성을 저해함으로써 nuclear factor-κB를 억제해 세포 사멸을 증가시키고, 세포 증식과 전이를 억제한다는 것 (Mol. Cancer Ther. 2008, 7, 191-201)과 유방암 세포인 MCF-7 세포에서 [³H]estradiol이 결합하는 nuclear type II site에 DBL이 경쟁적으로 결합함으로써 c-Myc와 cyclin D1의 유전자 발현이 증가하는 것을 저해하여 세포 증식을 억제한다고 보고되어 있지만, DBL이 Nrf-2의 활성를 증가시키는 것과 간염 치료 및 예방과간 보호 효과를 갖는다는 것은 어느 문헌에도 보고되거나 제안된 바가 없다. 본 발명자들은 DBL이 Nrf-2의 활성을 증진 및 간염 치료, 예방과 간 보호에 탁월한 효과를 갖는다는 것을 최초로 발견하였다.

본 발명은 또한 DBL을 함유하는 약학적 조성물 및 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 DBL을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제가 추가된 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등 모든 형태의 식품에 대한 조성물을 포함하며, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 추가로 포함할 수 있고 정제, 산제, 캡슐 및 음료 등의 형태로 제공 될수 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose) 또는 다중 투여량(multiple dose)으로 투여될 수 있고 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 DBL의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 500mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 100mg일 수 있다. 그러나 상기 DBL의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 DBL를 Nrf-2 증진제 또는 간염 치료, 예방 및 보호제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 DBL은 Nrf-2의 활성을 증가시킬 뿐 아니라, D-gal/LPS로 유도된 급성 간염모델에서의 치료 효능이 탁월하므로, Nrf-2의 활성 증가를 통해 치료, 예방 될 수 있는 질환의 치료 및 예방과 간염의 치료 및 예방 또는 간 보호제로서 유효하다.

본 발명은 Nrf-2의 활성 증진자이자, 간염 치료제 및 예방제 또는 간 보호제 로 사용될 수 있는 DBL (도1)의 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1. Reporter assay system을 이용한 Nrf-2 활성 측정

Nrf-2가 결합하는 ARE가 포함된 reporter vector인 pLenti-bsd/ARE-bla CellSensor^TM vector (Invitrogen, CA, USA)로 Nrf-2 활성을 측정했다. 활성 측정을 위해 간암 세포주인 HepG2 세포를 Nrf-2가 결합하여 하위 단백질의 발현을 유도하는 promter 염기서열 중 일부인 ARE 서열을 포함하고 이 서열에 Nrf-2가 결합 후 발현이 유도되는 β-lactamase 유전자가 이어서 결합된 pLenti-bsd/ARE-bla CellSensor^TM vector로 형질전환 시킨 ARE-bla-HepG2 세포주를 만들었다. Black-well/ clear-bottom/ 96-well plate에 ARE-bla-HepG2 세포를 3X10⁵ 개 씩 분주하고 5 시간 후, DBL을 농도별로 처리하여 16 시간 동안 배양하였다. DBL에 의해 Nrf-2가 활성화로 발현이 유도된 β-lactamase의 활성을 Live- BLAzer^TM-FRET B/G loading kit (Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 측정하였다. 기질인 CCF4-AM과 Solution B와 Solution C를 섞어 6X loading solution을 만들어 각 well에 1X가 되 도록 넣어주고 2 시간 동안 암 상태에서 방치 후 409 nm에서 excitation을 주고 기질 emission 파장인 530 nm와 생산물 emission 파장인 460 nm에서 각각 측정한 후 blank 값을 빼주어 생성된 기질의 형광을 측정하는 방법으로 DBL의 Nrf-2 활성 증진 효과를 분석하였다. 시험값의 편차를 줄이기 위해 530 nm에서 측정한 값으로 460 nm에서 측정한 값을 나눠준 후 처리군에 나온 값과 무처리군에서 나온 값의 비를 구하였다 (n=3, 평균 ± 표준편차). 결과는 도 2에서 보는 바와 같이 DBL 2.5 μM 이상 처리 시 무처리군에 비해 Nrf-2 활성이 2 배 이상 증가함을 관찰할 수 있었다.

실시 예 2. DBL이 세포 내 HO1 단백질 발현에 미치는 효과 측정

HepG2 세포를 6-well plate에 1X10⁶/well로 분주한 후, 37 ℃, 5 % CO₂배양기에 하루 동안 배양하였다. DBL을 2 ml 배지에 적절한 농도로 희석하여 20 ㎕씩 처리하였다. 16 시간 동안 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에 배양 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. Na₃VO₄와 protease inhibitor가 첨가된 TEN buffer (50 mM Tris-HCl, pH7.6, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100)로 단백질을 추출한 후 BCA 정량법을 이용하여 단백질을 정량하였다. HO1의 발현을 확인하기 위해 100 ㎍ 단백질을 12 % SDS-PAGE gel에서 분리한 후 PVDF membrane으로 transfer하고 5 % skim milk로 10 분간 blocking하여 anti-HO1 antibody (Stressgen, MI, USA)로 Western blot을 시행하였다. 6.2 μM DBL 이상에서 HO1 단백질 발현이 증가함을 확인할 수 있었다 (도3).

실시 예 3. DBL이 HepG2 세포에서 Nrf-2의 핵으로 이동에 미치는 효과 측정

HepG2 세포를 100 mm dish에 well마다 4X10⁶개씩 분주한 후 하루 동안 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 배양하였다. 100 % 메탄올에 녹인 DBL과 Nrf-2의 대표적인 활성 물질인 tBHQ를 각각 50 μM, 100 μM로 처리하고 한 시간 뒤에 Nuclear extraction kit (Active motif, CA, USA)을 사용하여 핵 단백질과 세포질 단백질을 분리하였다. 각 분리된 단백질 25 ㎍을 SDS-PAGE gel에서 분리한 후 PVDF membrane으로 transfer하고 5 % skim milk로 10 분간 blocking하고 anti-Nrf-2 antibody (Santa Cruz, CA, USA)로 Western blot을 시행하였다. anti-Lamin A antibody(Cell signaling technology, MA, USA)를 이용하여 핵 단백질이 동량임을 확인하였으며, 전체 단백질을 추출하여 전체 Nrf-2 단백질량에는 변화가 없음을 확인하였다. 그 결과 DBL을 50 μM 이상 처리 시 핵 내의 Nrf-2의 양이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다 (도4).

실시 예 4. DBL이 in vivo에서 HO1 mRNA와 단백질 발현에 미치는 효과 측정

DBL의 in vivo 활성을 관찰하고자 8 주령 C57/BL6인 수컷 쥐를 오리엔탈바이 오 (Gyongki, Korea)에서 구입하였다. 사육실 온도가 23±1 ℃, 습도는 50±10 %가 되도록 유지하였고, 명암은 12 시간으로 (day light 08:00~ 20:00)을 주기로 하여 2 주일간 환경에 적응시킨 후 실험에 착수하였다. 실험군은 50 % PEG400 투여군, 대조 시약인 sulforaphane 투여군, 약물인 DBL 투여군으로 나누어 실험하였다. 흡수를 돕기 위해 절식한 쥐에 50% PEG400에 녹인 sulforaphane는 90 mg/kg, DBL은 90, 180 mg/kg가 되도록 각 4 마리에 경구투여하고 부형제 투여군 역시 같은 방법으로 준비하였다. 투여 3 시간 후, 쥐를 희생시키고 간을 적출하였다. 적출한 간은 바로 액체 질소에 냉동시킨 후, -70 ℃에서 사용시까지 보관하였다. 적출한 간 조직은 Na₃VO₄와 protease inhibitor가 첨가된 TEN buffer (50 mM Tris-HCl, pH7.6, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100)로 단백질을 추출한 후 BCA 정량법을 이용하여 단백질을 정량하였다. HO1의 발현을 확인하기 위해 100 ㎍ 단백질을 12 % SDS-PAGE gel에서 분리한 후 PVDF membrane으로 transfer하고 5 % skim milk로 10 분간 blocking하여 HO1 (Stressgen, MA, USA)과 β-actin antibody(Cell signaling technology, CA, USA)로 Western blot을 시행하였다.

적출한 간의 일부는 One-step RNA reagent (바이오세상, Gyongki, Korea)를 이용하여 RNA를 추출하고 M-MLV reverse transcriptase (Promega, WI, USA)를 이용하여 cDNA를 만든 후 HO1의 발현을 확인하기 위해 PCR을 시행하였다. Normalization을 위해 GAPDH의 발현량도 함께 관찰하였다. HO1 mRNA 발현 확인 시험은 25 cycles, predenaturation은 94℃에서 3 분, denaturation은 94℃에서 40 초, annealing은 60 ℃에서 40 초, elongation은 72 ℃에서 50 초, post-elongation은 72 ℃에서 5 분간 시행하였으며 HO1 primer로는 5'-CCCACCAAGTTCAAACAGCTC-3' (sense)와 5'-AGGAAGGCGGTCTTAGCCTC-3' (anti-sense)를 사용하였다. PCR product는 1.5 % agarose gel에서 전기영동하였다.

180 mg/kg로 DBL를 경구 투여한 군의 간에서 3 시간 내에 HO1 mRNA 발현이 뚜렷하게 증가하였으며 (도5), HO1 단백질 발현은 90 mg/kg에서 동량의 sulforaphane과 유사하게 증가함을 관찰할 수 있었다 (도6).

실시예 5. D-Gal/LPS로 유도된 급성 간 손상 모델 시험

8 주령된 실험용 쥐 C57/BL6를 실험실 환경에 적응시키고, 사료와 물을 충분히 공급하였다. 실험군은 부형제군과 약물 투여군으로 나누어 실험하였다 (n=3). 실험군의 약물 농도는 180 mg/kg 용량을 D-gal/LPS 투여 48, 24와 2 시간 전에 경구 투여한 다음 D-gal (700 mg/kg) 및 LPS (10 ㎍/kg)를 차례로 복강 투여하였다. 대조군으로서 부형제군은 약물 대신 동량의 생리식염수만 투여하였다. 투여 6 시간 경과 후에 혈액을 채취하였다. 혈액은 3,000 rpm으로 원심 분리하여 혈청을 취하여 영하 20 ℃에서 보관하였다가 혈중 GOT 및 GPT를 측정하기 위하여 키트 (Cromatest, Spain)를 이용하여, 자동건조 화학 분석기 (A25 analyzer, Biosystems, Spain)로 측정하였다. 본 발명의 물질인 DBL은 D-gal/LPS로 유발된 간염 쥐에서 GOT 및 GPT 수치를 40 % 이상 감소시켜 간 보호 효과가 있음을 알 수 있 었다 (p < 0.05)(도7).

본 발명에 따라서, DBL은 in vitro와 in vivo 모두에서 Nrf-2의 활성을 증진시키는 기능을 갖으며, 또한 D-gal/LPS에 의해 유발된 간 손상 및 독성을 보호 및 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 산제의 제조

DBL 20 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

<제제예 2> 정제의 제조

DBL 10 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제 조한다.

<제제예 3> 주사제의 제조

DBL 1 ㎎

만니톨 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 2793 ㎎

Na2HPO4·12H2O 26 ㎎

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

<제제예 4> 건강 식품의 제조

DBL 500㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<제제예 5> 건강 음료의 제조

DBL 100㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 DBL의 구조식을 보여준 것이다.

도 2는 DBL에 의해 Nrf-2 활성이 증가하는 것을 측정한 것이다 (n=3, 평균±표준편차).

도 3은 DBL에 의해 HepG2 세포에서 HO1 단백질이 농도 의존적으로 증가하는 것을 측정한 것이다.

도 4는 DBL에 의해 HepG2 세포에서 Nrf-2가 핵으로 이동하는 것을 측정한 것이다.

도 5는 DBL을 경구 투여했을 때, 실험쥐의 간에서 HO1 mRNA가 증가하는 것을 측정한 것이다.

도 6은 DBL을 경구 투여했을 때, 실험쥐의 간에서 HO1 단백질이 증가하는 것을 측정한 것이다.

도 7은 D-gal/LPS로 유도된 간염모델에서 DBL에 대한 GPT 및 GOT를 측정한 것이다.

Claims

Nrf-2의 활성을 증가시킴으로써 치료, 예방 또는 완화할 수 있는 질병 또는 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위해 사용되는 DBL을 함유하는 조성물
제1항에 있어서, Nrf-2의 활성을 증가시킴으로써 치료, 예방 또는 완화할 수 있는 질병 또는 상태가 동맥경화증, 고혈압, 당뇨병, 중추 신경계질환, 피부 질환, 눈 질환, 천식, 암, 염증, 시력감퇴, 간 손상 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 조성물
DBL을 함유하는 간염의 치료 및 예방 또는 간 보호용 조성물
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, DBL을 함유하는 조성물이 산제, 정제, 주사제, 건강 식품캡슐 또는 건강 음료 중에서 선택되는 투여형태인 것을 특징으로 하는 제제