CN107847467A - 用于预防坏死性肠炎的氧化的类胡萝卜素及其组分 - Google Patents

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Abstract

当在不使用抗微生物生长促进剂的情况下生产商业肉鸡时，在商业肉鸡中大量发现坏死性肠炎(NE)。本发明提供了氧化的类胡萝卜素、其组分以及含有其的组合物和产物——诸如OxBC(‘OxC‑betaTM’产品，来自Avivagen Inc.,Canada)——用于在诸如家禽之类的动物中预防坏死性肠炎的方法和用途。相关组合物、试剂盒也包含在本发明中。

Description

用于预防坏死性肠炎的氧化的类胡萝卜素及其组分
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年4月28日递交的且标题为“Use of Fully Oxidized ΒetaCarotene and Methods for Preventing Necrotic Enteritis(完全氧化的胡萝卜素的应用及预防坏死性肠炎的方法)”的美国临时专利申请号62/153,587的权益和优先权。所有这些参考文献通过引用整体并入。
技术领域
本发明涉及氧化的类胡萝卜素，诸如氧化转化的类胡萝卜素、诸如完全氧化的类胡萝卜素、诸如β-胡萝卜素(“OxBC”)、其组分和类胡萝卜素-氧共聚物，以及包含上述化合物的组合物和/或产物用于预防坏死性肠炎(NE)和/或降低发展出坏死性肠炎(NE)的风险以及缓解相关疾患、诸如相关的胃肠道疾患的用途。本发明还涉及相关方法、用途和试剂盒。
背景技术
坏死性肠炎
坏死性肠炎(NE)经常发生在家禽，诸如鸡、鸭和火鸡中。它最经常发生在大约2-5周龄的肉鸡以及大约12-16周龄的种鸡和蛋鸡中，但也可发生在其他诸如马、绵羊、猪、牛和鱼之类的动物中。它可引起伴随或不伴随临床体征的猝死或引起活力丧失、饲料转化效率降低、食欲不振和饲料消耗减少、增重降低或体重减轻、腹泻、多灶性充血、小肠出血、薄壁肠、融合性粘膜坏死、猝死、死亡率增加、生长速度和均一性降低。与NE相关的主要病原体是产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。诱发因素包括但不限于环境胁迫、免疫抑制、由艾美球虫属(Eimeria)物种感染引起的并发球虫病、膳食组成、缺乏营养、细菌素、胶原分解酶和粘附因子以及产毒菌株，诸如产气荚膜梭菌。
如上所述，在包括各种鸟(诸如家禽鸟类)的各种动物中已经发现了坏死性肠炎(NE)。当在没有使用抗微生物生长促进剂的情况下生产商业肉鸡时，主要在商业肉鸡中发现坏死性肠炎。
在无抗生素的肉鸡生产场中NE的发病率从2008年的13.6％上升到2011年的约97.3％(H-K Jang,Chonbuk National University)。
产气荚膜梭菌
在健康肉鸡群中，产气荚膜梭菌的范围通常为每克小肠肠内容物102至104个菌落形成单位(CFU)，其水平潜在依赖于一次性或累积的细菌攻击(challenge)。感染NE的鸟类中产气荚膜梭菌的水平较高——从健康鸟类开始变得不平衡时的比率开始，然后对数式上升，到它们达到市场重量时，有时达到每克107个菌落形成单位(CFU)或更多。
目前的治疗方法包括使用可以置于饮用水中的抗生素——诸如青霉素(如苯氧基甲基青霉素、阿莫西林)——或饲料中的杆菌肽(如100ppm)。有时也会使用新霉素和红霉素。例如，根据严重程度，水内药物的疗程通常为3-5天，而饲用药物的疗程为5-7天。
诸如青霉素和杆菌肽之类的抗生素已经作为预防剂被用于饲料中。
在许多国家，当地法规或市场条件阻止了许多抗生素的常规使用，并且现在的趋势是使用无抗生素的饲料。因此，NE也增加了。
需要使NE诸如在肉鸡中的影响减至最少——例如，通过保护它们免受感染(如以预防NE)或降低产气荚膜梭菌细菌的水平。
发明内容
在一些方面，本发明提供使用氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产品，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素、其组分和类胡萝卜素-氧共聚物以及包含上述化合物的组合物和/或产物来预防坏死性肠炎(NE)和/或降低发展出坏死性肠炎(NE)的风险和缓解相关疾患、诸如相关的胃肠道疾患的方法。在一些方面，完全氧化的类胡萝卜素产物选自包括以下各项的组：完全氧化的β-胡萝卜素(OxBC)；完全氧化的番茄红素(OxLyc)；完全氧化的叶黄素(OxLut)；和完全氧化的角黄素(OxCan)。在其他方面，使用类胡萝卜素氧共聚物以及包含类胡萝卜素氧共聚物的组合物或产物。在其他方面，本发明提供了前述氧化的类胡萝卜素和组合物用于预防NE和/或将其影响或相关疾患减至最少的用途，诸如通过降低产气荚膜梭菌细菌的水平和/或防止产气荚膜梭菌细菌增加或维持低水平的产气荚膜梭菌细菌以将NE或相关疾患的影响减至最少或者降低发展出NE或相关疾患的风险。在一个实施方案中，本发明的氧化的类胡萝卜素和组合物不显示杀菌或抑菌或抗-微生物/抗生素性质。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗NE或促进NE治疗的方法。特别地，在一些方面，本发明描述了使用氧化的类胡萝卜素，诸如氧化转化的类胡萝卜素，诸如完全氧化的类胡萝卜素，诸如完全氧化的β胡萝卜素(OxBC)，其组分，和类胡萝卜素-氧共聚物以及包含上述化合物的组合物和/或产物来预防NE的亚临床感染的方法——一种不可由家禽生产者容易地观察到、但仍然对鸟类健康有负面影响的疾病，诸如可从饲料消耗减少、饲料转化效率降低或负面的肠道健康评估看出。
在其他方面，鉴于暴露或潜在暴露于NE相关的致病剂诸如产气荚膜梭菌，本发明提供氧化转化的类胡萝卜素，诸如完全氧化的类胡萝卜素，其组分，和类胡萝卜素-氧共聚物以及包含上述化合物的组合物和/或产物以抵抗NE和相关疾患、恢复或克服NE和相关疾患或者维持健康状态。
在其他方面，本发明提供组合物、补充物、预混物、饲料(或其他食品)和试剂盒，其包含氧化的类胡萝卜素、氧化转化的类胡萝卜素、诸如完全氧化的类胡萝卜素、诸如完全氧化的β胡萝卜素(OxBC)、其组分和类胡萝卜素-氧共聚物以及包含上述化合物的组合物和/或产物，及通过诸如降低产气荚膜梭菌细菌的水平和/或预防产气荚膜梭菌细菌增加或维持低水平的产气荚膜梭菌细菌以将NE或相关疾患的影响减至最少或者降低发展出NE或相关疾患的风险来预防NE或相关疾患和/或将NE或相关疾患的影响减至最少的方法和用途。
根据之后的描述，本发明的其他方面和优点将是显而易见的。然而，应当理解，尽管指明了本发明的优选实施方案，详述和具体实施例仅以说明的方式给出，因为根据该详述在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员显而易知。
附图说明
现在将参考附图描述本发明，其中：
图1.说明由NE产生的肉眼可见肠道病变，使用已知的严重程度评分方法，其中：“0”是没有眼观病变的地方；“1”是薄壁或脆性小肠和多灶性充血和出血；“2”是播散性严重充血和出血和局灶性坏死或溃疡；“3”为薄壁肠、严重坏死融合性粘膜坏死；且“4”是薄壁肠、广泛的坏死、粘膜剥脱。
图2.完全氧化的β-胡萝卜素、番茄红素、角黄素和叶黄素的GPC分析。(A)OxBC、(B)OxLyc、(C)OxCan和(D)OxLut。在220-400nm下监测UV吸光度。当显示时，垂直线对应于聚醚分子量标准物的洗脱时间(显示选定标志物)。柱截断值约为10,000Da。在OxLyc GPC中约5min处的尖峰指示存在分子量>10,000Da的聚合物。
图3.使用NaCl压片(disk)和来自CHCl3溶液的流延薄膜或者KBr压片获得的(A)OxBC、(B)OxLyc、(C)OxCan和(D)OxLut的FTIR谱。
图4.(A)完全氧化的番茄红素(OxLyc)及(B)OxBC聚合物和降异戊二烯类(norisoprenoid)单体组分相对于OxBC的CD14受体表达的测定。用指定浓度的化合物测试THP-1细胞24小时。
具体实施方式
“动物”意指任何易感NE的动物，包括但不限于人、狗、猫、马、绵羊、猪、牛、家禽(包括但不限于鸡(诸如肉鸡和蛋鸡)、鸭和火鸡)和鱼。
“足够的量”或“有效量”意指鉴于暴露或潜在暴露于NE相关的致病剂(诸如产气荚膜梭菌)，为预防NE和相关疾患和/或增强抵抗NE和相关疾患的能力、恢复或克服NE和相关疾患或者维持健康状态所需的氧化的类胡萝卜素、诸如氧化转化的类胡萝卜素或完全氧化的类胡萝卜素或类胡萝卜素-氧聚合物，或其分级组分，或包含上述化合物的组合物的量。本发明的氧化的类胡萝卜素或组合物用于实施本发明的方法的有效量根据施用方式、动物类型、体重和动物的一般健康状态而变化。最终，主治医学专业人员诸如医师或兽医或动物护理专业人员(包括农民、技术人员、本领域的有学识或有技能人员)将决定适当的量和剂量方案。此类量被称为“足够的量”或“有效量”。
“坏死性肠炎的相关疾患”包括但不限于胃肠道症状或病状，诸如食欲降低、增重率降低、饲料转化效率降低或肠道病变。
如本文所用的“类胡萝卜素”是指可以在植物、藻类、细菌和某些动物(诸如鸟类和贝类)中发现的天然存在的萜类色素。类胡萝卜素包括但不限于作为烃(即没有氧)的胡萝卜素及其氧合衍生物(即叶黄素类)。类胡萝卜素的实例包括番茄红素；α-胡萝卜素；γ-胡萝卜素；β-胡萝卜素；玉米黄质；海胆酮；异玉米黄质；虾青素；角黄素；叶黄素；枳橙黄质；β-阿朴-8'-胡萝卜酸乙酯；羟基类胡萝卜素，诸如异黄素、阿朴胡萝卜醇、虾红素、虾青素、辣椒红素、辣椒玉红素、胡萝卜素二醇、胡萝卜素三醇、胡萝卜醇、隐黄质、β-隐黄质、癸异戊二烯黄素、表叶黄素、岩藻黄质、羟基胡萝卜酮、羟基海胆酮、羟基番茄红素、叶黄素、番茄黄质、链孢红素(neurosporine)、八氢番茄红素、六氢番茄红素(phytofluoene)、视紫红质(rhodopin)、球形烯、红酵母烯、紫黄质和玉米黄质；和羧酸类胡萝卜素，诸如阿朴胡萝卜酸、β-阿朴-8'-胡萝卜酸、玄参红酸、红木素、羧基胡萝卜素、番红花酸、二阿朴胡萝卜酸、链孢霉黄素、降红木素和番茄红素酸(lycopenoic acid)。
如本文所用的“类胡萝卜素-氧共聚物”、“类胡萝卜素共聚物”和“聚合物”是指一种不饱和化合物类胡萝卜素，其在其反应性双键处已通过与分子氧的自发反应而被氧化，从而产生作为主要产物的类胡萝卜素与氧的共聚物并且与其降异戊二烯类副产物分离和分隔开。
如本文所用的“包含”与“包括”和“含有”同义，并且是包容性的或开放式的且不排除额外的、未被提及的特征或方法步骤。
如本文所用的“由……组成”是封闭式的，并且根据等同原则，排除了权利要求中未指定的任何特征、步骤或成分。
如本文所用的“完全氧化的类胡萝卜素”是指一种不饱和化合物类胡萝卜素，其是在其反应性双键处已通过与分子氧的自发反应而被完全氧化，从而产生类胡萝卜素与氧的共聚物和降异戊二烯类分解产物的混合物。在一些方面，完全氧化的类胡萝卜素可选自OxBC，完全氧化的β-胡萝卜素；OxLyc，完全氧化的番茄红素；OxLut，完全氧化的叶黄素；和OxCan，完全氧化的角黄素，其通过氧化经分离的母体类胡萝卜素产生，与天然来源的产物相反被称为合成衍生的)。
“完全氧化的β-胡萝卜素”(“OxBC”——有时在文献中也被以AvivagenInc.OxC-betaTM品牌引用)是一种通过β-胡萝卜素的完全自发氧化形成的产物的复杂混合物，并且含有占优势的β-胡萝卜素-氧共聚物化合物。如本文所用，它是指衍生自纯β-胡萝卜素的合成商业产物的完全氧化的类胡萝卜素组合物，包含约85重量％的β-胡萝卜素-氧共聚物和约15重量％的称为降异戊二烯类的低分子量分解产物。
如本文所用的“天然的”或“天然来源的”是指植物来源(包括植物或其部分，其中其部分可包括但不限于种子、叶和茎、水果或蔬菜)或微生物。“天然产物”或“天然来源的产物”是指衍生自对天然来源的氧化的类胡萝卜素的加工的产物，诸如类胡萝卜素-氧共聚物和包含类胡萝卜素-氧共聚物的组合物。它们衍生自在氧化聚合条件下加工天然来源。这些天然来源可包括但不必限于：胡萝卜、番茄、苜蓿、螺旋藻、玫瑰果、甜椒、辣椒、红辣椒、甘薯、甘蓝、菠菜、海藻、小麦草、万寿菊、辣木(moringa oleifera)和红棕榈油。
“氧化转化的类胡萝卜素”是指已经与多达6至8摩尔当量的氧或者来自另一种氧化剂的等量的氧反应的类胡萝卜素，从而产生极低分子量的氧化分裂产物和大比例的寡聚物材料(即，具有约900道尔顿的中值分子量的氧化转化的类胡萝卜素的组分)的混合物。所得反应产生包含分子量范围为约100至8,000道尔顿的分子种类物质的混合物。据信寡聚物材料通过形成的各种氧化片段的许多可能的化学重组形成。在美国专利No.5,475,006和美国专利申请No.08/527,039中描述了制备氧化转化的类胡萝卜素的方法，所述专利和专利申请各自通过引用并入本文。
如本文所用的“氧化的类胡萝卜素”包括已被氧化的类胡萝卜素，诸如“氧化转化的类胡萝卜素”、“完全氧化的类胡萝卜素”和“类胡萝卜素-氧共聚物”及其产生所需活性的组分，含有已被氧化的胡萝卜素的组合物和产物，诸如含有类胡萝卜素-氧共聚物的产物和组合物。
“药物组合物”意指含有氧化的类胡萝卜素、氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素或其分级组分或类胡萝卜素-氧共聚物或含类胡萝卜素-氧共聚物的产物的组合物，并且作为用于哺乳动物治疗或预防疾病的治疗方案的一部分，与一种或多种药物级赋形剂一起以符合监管药物制造和销售的政府机构的要求的方式配制(如，根据GMP法规制造并适合于施用给人类)。可将药物组合物配制为例如用于以单位剂型(如片剂、胶囊、囊片、胶丸或糖浆)经口施用；用于局部施用(如，作为霜剂、凝胶、洗剂或软膏)；用于静脉内施用(如，作为不含微粒栓塞且于适于静脉内使用的溶剂系统中的无菌溶液)；或本文所述的任何其他制剂。
“维生素原A类胡萝卜素”或“PVA”是指那些类胡萝卜素，即α-、β-和γ-胡萝卜素及β-隐黄质，其能够通过氧化转化为维生素A。“OxPVA”是指氧化的维生素原A类胡萝卜素。
“治疗”是指出于预防性和/或治疗性目的施用组合物。“预防疾病”是指预防性治疗尚未生病、但对特定疾病易感或要不就是处于特定疾病风险的动物。“治疗疾病”或用于“治疗性治疗”是指向已经罹患疾病的动物施用治疗以改善或稳定动物的疾患。因此，在权利要求书和实施方案中，治疗是出于治疗性或预防性目的向动物施用。根据本发明的疗法可以单独进行或与另一种疗法联合进行。如本文所用，“处于风险中”是指动物易于出现健康状况不佳、易患病、易感染、关节活动问题、活动水平降低和/或皮毛质量差。
氧化的类胡萝卜素
各种健康益处归因于食用类胡萝卜素。几种维生素原A类胡萝卜素，包括α-和β-胡萝卜素及β-隐黄质，提供与其维生素A活性相关的益处。然而，不太容易解释的是维生素原A类胡萝卜素和不可转化成维生素A的其他类胡萝卜素两者的其他非维生素A益处。
类胡萝卜素是由植物合成的黄色、橘色和红色色素。已知有超过600种的类胡萝卜素，它们由两类组成，即完全为烃的胡萝卜素和作为被一个或几个氧原子取代的胡萝卜素的叶黄素类。β-胡萝卜素和番茄红素是常见的胡萝卜素的实例，而叶黄素、玉米黄质和角黄素是叶黄素类的常见实例。北美膳食中最常见的类胡萝卜素是α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、叶黄素、玉米黄质和番茄红素。
所有类胡萝卜素由8个异戊二烯单元形成，并且每个类胡萝卜素分子含有40个碳原子。在结构上，类胡萝卜素采取多烯烃链的形式，其有时在一个或两个末端处由环封端。含有未取代的β-紫罗兰酮环的类胡萝卜素(包括β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-隐黄质和γ-胡萝卜素)具有维生素A活性(意味着它们可以转化为视黄醛)。相比之下，叶黄素、玉米黄质和番茄红素没有维生素A活性。
传统上，非维生素A活性已被归因于类胡萝卜素本身通常作为抗氧化剂的作用。然而，最近的研究令人对至少在抑制致癌作用方面的抗氧化作用产生怀疑，并指出了其他机制的运作。
尽管早已经知道在高度不饱和化合物的自发氧化中添加氧是自然有利的，但在发明人的报告之前，令人惊讶的是没人注意到类胡萝卜素的氧化聚合的主要作用和意义(还参见US 5,475,006；US 7,132,458；US 8,211,461；US 2011-0217244；US 2013-0131183；和US2013-0156816)。此外，用通过β-胡萝卜素与氧在溶剂中自发反应获得的完全氧化的β-胡萝卜素组合物(称为OxBC，Avivagen Inc.的OxC-betaTM品牌产品中的活性成分)以及用类似地形成的完全氧化的番茄红素进行的研究，已经揭示了聚合物级分是免疫活性的原因，其包括引发和增强先天免疫功能以及限制炎症过程的能力。存在于β-胡萝卜素中的线性共轭双键的延长体系是所有类胡萝卜素所共有的，因此预期其他类胡萝卜素将在其与分子氧的自发反应中类似表现，并且可以解释维生素原A类胡萝卜素(α-、β-和γ-胡萝卜素及β-隐黄质)和不能转化为维生素A的更多的类胡萝卜素两者的非维生素A作用。
此外，鉴于类胡萝卜素(包括且尤其是β-胡萝卜素)的普遍性以及已知它们在食物加工过程中易损失，目前还不清楚氧化且特别地共聚是否和在多大程度上在食物中自然发生以及是否和在多大程度上可能造成这种损失。本发明人已经从天然来源鉴定和开发了与完全氧化的类胡萝卜素不同的含类胡萝卜素-氧共聚物的产物/组合物用于本发明的方法、用途、组合物和试剂盒。
如本文所公开，本发明人发现具有预期的非维生素A免疫活性的含类胡萝卜素-氧共聚物的食物(诸如植物来源)。例如，在如本文所述的一个实例中，通过将元素分析、GPC、IR、GC-MS热解和UV数据与来自OxBC的那些进行比较，确认了从胡萝卜粉末(原始富含β-胡萝卜素)分离的化合物的化学性质。以相同的方式从其他干燥食物分离的化合物的元素分析、IR和GPC数据支持其氧-共聚物性质。
本发明人在本文中公开了转化为聚合化合物的类胡萝卜素在本发明的方法、用途、组合物和试剂盒中具有之前未被认识的有益潜力。在一个实施方案中，包含一种或多种类胡萝卜素氧共聚物的产物是由富含类胡萝卜素的产物、而不是经分离的或合成的类胡萝卜素原位制备的。
葛让酸，一种β-胡萝卜素-氧共聚物存在的低分子量标志物，以从新鲜食物中的低的十亿分之几到干食物中的百万分之几的涵盖大约千倍范围的水平存在于包括胡萝卜、番茄、甘薯、红辣椒、玫瑰果、海藻、苜蓿和牛奶的常见新鲜或干燥食物中。从一些干燥食物如胡萝卜粉、番茄粉、螺旋藻粉、玫瑰果粉、红辣椒粉、海藻粉和小麦草粉中分离的共聚物达到千分之几水平——与原始的类胡萝卜素水平相当。之前已经记录了百万分之几水平的补充性β-胡萝卜素-氧共聚物的体内生物活性，表明某些食物具有此类活性。
本发明人发现了氧化和相关的反应产物将在类胡萝卜天然存在的复杂得多的环境(即在某些植物来源、诸如水果和蔬菜以及某些微生物(藻类、真菌和细菌))中发现，鉴于可将任何初期类胡萝卜素氧化反应向下转向具有不同产物结果的无数其他途径的生物材料中的复杂微环境和许多其他潜在有反应性的化合物，该发现并不显而易见或可预测。
在本发明的一方面，以该方式从干燥的植物来源的食物分离的类胡萝卜素-氧共聚物产物不含其他预期的低分子量类胡萝卜素分解产物(如，包括存在于预期含有β-胡萝卜素氧化分解化合物的产物中的葛让酸)。这不同于的确含有此类产物的完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC、OxLyc、OxLut或OxCan)。
在另一个实施方案中，植物来源选自由以下各项组成的组：胡萝卜、番茄、苜蓿、螺旋藻、玫瑰果、甜椒、辣椒、红辣椒、甘薯、甘蓝、菠菜、海藻、小麦草、万寿菊、辣木和红棕榈油。在另一个实施方案中，来源是呈粉末的植物产品，如胡萝卜粉、番茄粉、螺旋藻粉、玫瑰果粉、红辣椒粉、海藻粉和小麦草粉。
在一个实施方案中，微生物源选自由以下各项组成的组：细菌、酵母、真菌和藻类，诸如螺旋藻44和增强类胡萝卜素并因此增强了针对类胡萝卜素-氧共聚物的潜力的所述微生物源的遗传修饰形式。在一些另外的实施方案中，微生物选自由以下物种组成的组：藻类：螺旋藻属(Spirulina)、杜氏藻属(Dunaliella)、红球藻属(Haematococcus)、缪里尔藻属(Murielopsis)。真菌：三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)。酵母：红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)。细菌：鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)。
本发明人发现，如实施例中使用的OxBCβ-胡萝卜素-氧共聚物化合物在本文所述的用途、方法、组合物和试剂盒中是有益的，使得预期食物中的共聚物对应物将赋予生物活性以类似的健康意义。由消化水果或蔬菜期间释放的氧化过程产生的膳食类胡萝卜素的原位氧化还可以至少部分地导致食物中的β-胡萝卜素相较于来自补充物的β-胡萝卜素的可变且数倍更低的维生素A活性。β-胡萝卜素的氧化破坏和感知的活性丧失实际上可能是通过共聚物形成获得了免疫活性。
本发明人已经开发了一种增加来源中类胡萝卜素-氧共聚物的量的和/或使来源具有已知和一致量的类胡萝卜素-氧共聚物以促进一致给药至已知有效量从而达到预期结果的方式。
此外，本发明使得人们能够在原位产生包含类胡萝卜素氧共聚物的产物，而不用从作为来源的经分离的类胡萝卜素开始，并提供包含一致水平的类胡萝卜素-氧共聚物的产物，其具有本文所述的所得的动物益处，包括与NE有关。在一方面，来自天然来源的类胡萝卜素-氧共聚物不包含(或最低程度地包含)分解产物。
方法和用途
如本文所述，本发明就使用氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分而言具有若干种应用。它们包括但不限于以下应用：
A.增重恢复
本发明说明了氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分，诸如OxBC可用于以饲料中的低的百万分之几(ppm)水平改善最终平均体重，恢复到未被攻击的鸟类组的水平。在一个实施方案中，本发明提供使用氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分，诸如OxBC来针对肉鸡中由与产气荚膜梭菌和/或NE相关的亚临床疾病负担导致的生产力损失提供保护的方法。人们可使用如本文所述的氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分，诸如OxBC来“恢复”增重至若是无疾病、NE或产气荚膜梭菌感染本将可达到的水平。
B.肠道病变保护
与未用药鸟类组相比，OxBC治疗组中由于NE感染导致的肠道病变评分显著减小，其中2ppm OxBC组显示出最大的改善。可类似地使用其他氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分。
由此，一方面，本发明提供使用氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分、诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分来针对由产气荚膜梭菌感染导致的家禽诸如肉鸡中的NE期间的肠道病变提供保护的方法。
C.病原体载量减少
粪便中产气荚膜梭菌细菌的数量被氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分或在一个实施方案中的OxBC以剂量依赖性方式减少。因此，本发明可用于维持肠道、诸如肉鸡肠道中细菌的平衡，并防止细菌产气荚膜梭菌的过度生长。
D.NE的预防和改善
饲料中低ppm水平的氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分，或在一个实施方案中的OxBC，可有助于预防和改善商业肉鸡养殖中的NE并且预期在提高饲养期生产力方面有积极作用。
E.使用氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化 的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝 卜素-氧共聚物组分的组分而不是抗生素来控制NE和产气荚膜梭菌感染
在一个实施方案中，本发明提供在面对攻击、诸如NE和产气荚膜梭菌时使用氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分而不是抗微生物剂来维持家禽(诸如肉鸡)的良好健康(诸如未被攻击的健康状态)的方法。在家禽家畜中使用抗微生物剂已经广泛地与食物中的药物残留和抗生素抗性病原体在食物和环境中的繁殖有关。因此，家禽生产者有压力减少其抗生素使用。氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分。在一个实施方案中，OxBC已经在本文中证明它既没有杀菌性质也没有抑菌性质，因此不是抗微生物剂，这使其成为用于预防或控制家禽、诸如肉鸡中的NE和产气荚膜梭菌的抗生素的有用替代物。
动物
该方法可用于对产气荚膜梭菌攻击和/或NE易感的动物，特别是家禽和在另一个实施方案中的肉鸡、蛋鸡和火鸡。
氧化的类胡萝卜素，诸如OxBC，组合物和施用方式及试剂盒
OxBC是β-胡萝卜素的完全自氧化的产物，所述完全自氧化是一个产生不含β-胡萝卜素、维生素A或视黄酸受体激动剂活性的新型组合物的过程。它主要通过氧共聚过程形成，所述过程产生主要包含β-胡萝卜素-氧共聚物的明确定义的、可始终一致地再生产的产物。
在结构上，OxBC聚合物似乎是孢子花粉素的聚合较少的形式，孢子花粉素是一种在孢子和花粉的外壁中存在的生物聚合物。所述聚合物已一早被鉴定为由多种类胡萝卜素的自氧化形成，所述类胡萝卜素不仅包括β-胡萝卜素，而且还包括角黄素、叶黄素和番茄红素。充分预期其他类胡萝卜素诸如虾青素主要经历相同的聚合过程。
化学分析指明，合成的版本高度类似于天然存在于不同食物、饲料和草料(未公布的数据；投稿中稿件)中的聚合物。
通过在纯氧气氛中在“GRAS”溶剂中加热合成的β-胡萝卜素的溶液，直到氧摄取变得非常慢，达到定义的终点来大量产生OxBC。已经制定了制造的QC/QA方法，并且纯活性物(目前针对饲喂的牲畜应用)的生产能力现在每年达到几十公吨。OxBC作为通过将OxBC溶液喷雾干燥到玉米淀粉上形成一致的“预混合”产物而产生的10％浓缩物被供应用于肉鸡。更高或更低浓度的活性成分可用于以所需的施用水平研磨成饲料或其他给药制剂。可类似地制备其他完全氧化的类胡萝卜素。
OxBC以及本发明的其他氧化的类胡萝卜素可与饲料一起配制或者可与饲料同时或不同时分开施用。
在一个实施方案中，优先于动物自由摄取食物，以有效量施用或饲喂氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分。在一个实施方案中，自由地或以一定间隔或在另一个实施方案中每天一次、在另一个实施方案中每天两次、在又一个实施方案中每天数次施用或饲喂氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分，并且其中根据饲喂动物的方式将氧化的类胡萝卜素的量调整至所需量。
在一个实施方案中，氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分的量是以短间隔提供的2ppm至30ppm，或在另一个实施方案中，2至15ppm、至10ppm、至8ppm或至6ppm。另一个优选的实施方案根据实验结果表明以更长的间隔每天饲喂2ppm至4ppm可提供最佳效果，同时维护家禽生产者的成本效益。PPM是指每百万份膳食或饲料中的活性成分(如氧化的类胡萝卜素)的份数。
氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分或在一个实施方案中的OxBC或其明显的化学等效物可通过产生所述活性剂与受试者或患者体内所述药剂的作用位点相接触的任何方式进行施用，以产生治疗效果，特别是有益效果，更特别是持续的有益效果。活性成分可以在不同的时间点同时或依序地且以任何顺序施用以提供期望的有益效果。本发明的化合物和组合物可以被配制用于持续释放，用于局部或全身递送。选择优化本发明组合物和治疗效果的形式和给药途径，以提供治疗效果，特别是有益效果，更具体地持续的有益效果在技术医师或兽医的能力范围内。
在一个实施方案中，施用氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分包括产生所述活性剂与肉鸡或其他动物的体内或身体内的所述药剂的作用位点相接触以产生期望效果或治疗效果的任何模式，视具体情况而定。因此，其包括施用氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分至作用位点——直接地或通过一种递送方式(如持续释放制剂、导致定点递送到肠道或体内所需位点的递送媒介物。在一个实施方案中，氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分可以作为一个实施方案以约1-30ppm使用，在另一个实施方案中以30ppm使用2周，在另一个实施方案中以2-6ppm‘连续使用’(包含在正常膳食中)，或如本文另外描述。上述物质可以配制成适合的组合物，以用于以适用于体内施用的生物相容形式施用至动物，诸如肉鸡。“适于体内施用的生物相容形式”意指待施用的物质的形式，在所述形式中治疗效果超过了任何毒性作用。该物质可以施用至活生物体，包括动物，诸如家禽，在另一个实施方案中鸡，在另一个实施方案中肉鸡、蛋鸡或火鸡。
因此，在一个实施方案中，本发明提供氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分在制备本文中指出的应用所用医药中的用途。在一个实施方案中，向有需要的患者施用治疗有效量的氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分或如本文所述的药物组合物。有需要的患者是可受益于氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分以及其如本文所述的作用的任何动物。
活性物质可以诸如通过注射(皮下、静脉内等)、经口施用、吸入、粘膜施加、局部施加、经皮施加、胃施加、肠溶施加或经直肠施用的方便方式施用。根据施用途径，可以在材料中涂覆活性物质以保护化合物免受可使化合物失活的酶、酸和其他天然条件的作用。在一个实施方案中，氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分通过饲喂动物或使用本领域已知的其他技术施用。
本文所述的组合物可以通过本身已知的制备药学上可接受的组合物的方法制备，其可以施用至受试者，使得有效量的活性物质与药学上可接受的赋形剂或载体组合在混合物中。适合的赋形剂或载体描述于例如雷明顿药学大全(Remington’s PharmaceuticalSciences)(Remington’s Pharmaceutical Sciences,麦克出版公司(Mack PublishingCompany),Easton,Pa.,USA 1985)或雷明顿药学的科学与实践(Remington’s TheSciences and Practice of Pharmacy),第21版”,(University of the Sciences inPhiladelphia,2005)或药品添加剂手册(Handbook of Pharmaceutical Additives)(Michael和Irene Ash汇编,高尔出版公司(Gower Publishing Limited),Aldershot,England(1995))。在此基础上，该组合物包括(尽管并不排它)与一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂相关联的物质的溶液，并且可以包含在具有适合的pH的缓冲溶液中和/或与生理流体等渗。在这方面，可以参考美国专利No.5,843,456。
饲料和食品、补充物及预混物
在一个实施方案中，本发明提供饲料(诸如动物饲料/家禽饲料)或食品，其包含可以以诸如通过降低产气荚膜梭菌细菌的水平而治疗和/或预防NE和/或将其影响或相关疾患减至最少的有效量与食品混合并饲喂至动物的氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分。
在制备本发明的食品期间，将氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分与增量剂任选地混合，然后加入到食品中。增量剂包括但不限于淀粉、蛋白质、脂肪及其混合物。理想地，增量剂选自玉米淀粉、乳清、面粉、糖、大豆粉、麦芽糖糊精和瓜尔胶。本发明的食品还可以包含抗氧化剂以防止氧化转化的类胡萝卜素或其组分进一步氧化。可通过向食品引入诸如维生素E、维生素C和生育酚的天然存在的抗氧化剂或者诸如丁基化羟基甲苯、丁基化羟基苯甲醚、叔丁基氢醌、没食子酸丙酯或乙氧喹的合成抗氧化剂来防止氧化。以这种方式掺入的抗氧化剂的量取决于要求，诸如产品配方、运输条件、包装方法和期望的保存期限。
在一些方面，本发明的食品包括但不限于烘焙食物、饮料、饮料混合物、健康条、饼干和动物饲料。动物饲料可以是干燥或半湿润的宠物食物，或用于农业动物的饲料，诸如马饲料、猪饲料(如，保育/幼畜猪饲料、生长育肥猪饲料或种畜群猪饲料)、家禽饲料(如火鸡家禽饲料、肉鸡家禽饲料或种鸡家禽饲料)、绵羊饲料、牛饲料(如奶牛饲料或肉牛饲料)或鱼饲料(如，罗非鱼饲料、鲶鱼饲料、鳟鱼饲料或鲑鱼饲料)。
动物饲料通常被配制成根据工业标准提供营养物质。在一些实施方案中，本发明提供包含以下各项中一种或多种的动物饲料：氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素(诸如OxBC)、其组分或其分级组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物组分的组分。饲料可从根据市场价格和可得性选择的各种不同的饲料成分配制。因此，饲料的一些组分可能会随时间而变化。关于动物饲料配方和NRC指南的讨论，参见Church,家畜饲养(Livestock Feeds and Feeding),O&BBooks,Inc.,Corvallis Oreg.(1984)和饲料与营养文摘(Feeds and Nutrition Digest),Ensminger,Oldfield和Heineman编辑,恩斯明格出版公司(Ensminger PublishingCorporation),Clovis,Calif.(1990)，其每一个通过引用并入本文。
可以根据需要将其他成分添加到动物饲料中以促进动物的健康和生长。该成分包括但不限于糖、复合碳水化合物、氨基酸(如精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和半胱氨酸等)、维生素(如硫胺素、核黄素、吡哆醇、烟酸、烟酰胺、肌醇、氯化胆碱、泛酸钙、生物素、叶酸、抗坏血酸和维生素A、B、K、D、E等)、矿物质、蛋白质(如肉粉、鱼粉、液体或粉末蛋、鱼可溶物、乳清蛋白浓缩物)、油(如大豆油)、玉米淀粉、钙、无机磷酸盐、硫酸铜和氯化钠。也可将本领域中已知的任何医药成分添加到动物饲料中，包括但不限于抗生素和激素。对于动物饲料的维生素、矿物质和抗生素补充，参见Church,家畜饲养,O&B Books,Inc.,Corvallis Oreg.(1984)。
根据本发明，可使用本领域已知的任何动物饲料掺混物，包括但不限于草料诸如果园草、梯牧草、高羊茅、黑麦草、苜蓿、红豆草、三叶草和巢菜，谷物饲料诸如玉米、小麦、大麦高粱、黑小麦、黑麦、油菜和大豆，作物残体，谷粒，豆类副产品和其他农副产品。在所得饲料待加工或保存的情况下，饲料可以在加工或保存之前用氧化转化的类胡萝卜素、其组分或分级的氧化转化的类胡萝卜素进行处理。理想地，本发明的动物饲料包括菜籽粉、棉籽粉、大豆粉或玉米粉。
加工可以包括干燥、青贮、切碎、粒化、压块、打包、轧制、调制(tempering)、磨碎、裂解、爆裂(poping)、挤出、微粉化、烘烤、制片、蒸煮和/或炸裂(exploding)。例如，首先混合饲料组分，然后在加热加压下压缩并通过模具挤出饲料组分，来产生粒化饲料。本发明的动物饲料可如例如通过引用并入本文的MacBain,动物饲料造粒(Pelleting AnimalFeed),美国饲料制造商协会(American Feed Manufacturers Association),Arlington,Va.(1974)中所述那样粒化。
在其他实施方案中，本发明提供预混物或补充物，其包含饲料或食品或水并且可以单独或与饲料或食品或水组合施用或使用和/或以适当的比例/量与饲料或食品或水混合，以获得包含共聚物的氧化的类胡萝卜素产品的期望水平，以在动物中使用。
试剂盒
在一个实施方案中，本发明提供包含以下的试剂盒：
(i)氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素、其组分诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物的组分的组分，及类胡萝卜素-氧共聚物以及包含上述化合物的组合物和/或产物；和
(ii)可选的用于预防坏死性肠炎(NE)和/或降低发展出坏死性肠炎(NE)的风险和缓解相关疾患、诸如相关的胃肠道疾患和/或用于治疗患有坏死性肠炎或处于坏死性肠炎风险中或暴露于产气荚膜梭菌的动物的使用说明书。
在以下实施例中描述了本发明，这些实施例经阐述有助于理解本发明，并且不应被解释为以任何方式限制权利要求书中限定的本发明的范围。
实施例
实施例1–完全氧化的β胡萝卜素(OxBC)的制备
OxBC是β‐胡萝卜素的完全自氧化的产物，所述完全自氧化是一个产生不含β-胡萝卜素、维生素A或视黄酸受体激动剂活性的组合物的过程。它主要通过氧共聚过程形成，所述过程产生主要包含β-胡萝卜素-氧共聚物的明确定义的、可始终一致地再生产的产物，这在Burton等(1995和2014)中更完整地描述。在结构上，OxBC聚合物似乎是孢子花粉素的聚合较少的形式，孢子花粉素是一种在孢子和花粉的外壁中存在的生物聚合物。
实施例2–具有OxBC的动物饲料的制备
通过将OxBC作为10％(w/w)预混物与其他饲料成分一起掺入而制备的本发明中使用的动物饲料含有以下物质：
表1.本研究中所用的基础商业饲料的配方
所用的物质：
·OxBC(Avivagen,Canada)，组3、4和5(表4)杆菌肽(BS Bacitrex 100,Korea)，组6(表4)
·维吉尼亚霉素(Stafac-20,Bayer Korea,Korea)，组7(表4)
·如表4所示，向基础商业膳食添加了物质
实施例3–OxBC对使用肉鸡的坏死性肠炎攻击模型的预防性作用
当在不使用抗微生物生长促进剂的情况下生产时，主要在商业肉鸡中发现坏死性肠炎(NE)。这项参考的研究经设计用以在肉鸡中评价OxBC(‘OxC-betaTM家畜产品，来自Avivagen Inc.,Canada)在亚临床坏死性肠炎模型中的预防性作用。相较于攻击的未用药对照组，评价了OxBC能够有利地实现肉鸡健康和生产力的各种量度(measure)的能力，包括存活(死亡)率、临床体征、体重、增重、肠道病变和细菌计数。
材料和方法：
1.动物
在本研究中，共使用了280只从商业孵化场获得的一日龄罗氏肉鸡(Rossbroiler)雏鸡。将雏鸡在孵化场针对新城病(Newcastle disease)(新城病病毒)接种疫苗。
2.鸟舍和设施
在整个实验期间，将鸟在隔离器单元中养殖。
·本研究采用配有通气系统的鸡隔离器。
·每个处理组有1个隔离器单元，并且在第1个研究日每个隔离器单元容纳了二十只雏鸡(表1)。该研究以两次平行重复实验运行，每个重复实验使用7个隔离器单元。
·调整隔离器的室内温度，以维持对于肉鸡最佳的温度。
·在第1个研究日，每个隔离器中有20只雏鸡。在第10个研究日对每个隔离器中的五只最小的雏鸡进行安乐死，并且评价小肠的眼观病变及肠内容物中的产气荚膜梭菌计数。在第10天进行评价，以确保在第14天实验性攻击之前不存在NE病变或致病水平的产气荚膜梭菌。在第10个研究日后，每个隔离器中有15只鸟，并且这些鸟用于本研究的攻击部分。
·对鸡进行单独评价和称重，因此每只鸟代表一个实验单位。
表2.起始体重的分布
a由于预期体重不足雏鸡的死亡率高，排除重量小于40g的雏鸡。
b实验中使用了总共400只雏鸡中的280只，并且第1天每组的雏鸡数量为20只。
3.饲喂
本研究中使用的基础膳食是标准的商业肉鸡饲料。基础膳食补充有适当水平的OxBC或抗生素，如表4所示。在研究中没有使用饲用抗球虫药。亚临床坏死性肠炎鸡模型，通过在肉鸡中用从坏死性肠炎现场实例中分离的产气荚膜梭菌(CP-13)攻击诱导。通过在第14、15和16天用大约1×107个CFU/ml，每天两次经口灌胃进行所述攻击。在一个实施方案中，将淀粉中OxBC的10％预混物与其他成分一起掺入饲料中。
●饲喂程序
■本发明人采用与商业肉鸡场相同的饲喂程序和配方(表1)。
■在28天的研究期间不间断地给予实验饲料，并且在整个实验期间自由给水。
本研究所用的基础商业饲料的配方可见于上表1中。
●攻击
■施加产气荚膜梭菌CP-013菌株以诱导亚临床NE模型。
■除了组1之外的所有鸟类都是在第14、15和16天(表3)用大约107个CFU/ml产气荚膜梭菌每天两次经口进行攻击。
■攻击菌株具有cpa和cpb2基因，但对于netB毒素基因是阴性的。
■参见Shojadoost等，2012对在家禽中诱导NE的方法的详述。
表3.产气荚膜梭菌攻击施用
●肉眼可见病变评分
■使用Prescott(1978)的标准评估了眼观(肉眼可见)病变评分，评分范围从0(无眼观病变)到4(最严重眼观)
■肠道眼观病变如下分级：0，无眼观病变；1+，薄壁或脆性小肠；2+，局灶性坏死；3+，较大的坏死斑块；4+，严重广泛的坏死，典型的现场实例(图1)。
■参见Prescott等，1978对病变评分量表的详述。
●细菌计数
■将产气荚膜梭菌的数量测量为尸检后从小肠收集的每克粪便的菌落形成单位。
■简言之，将250μL粪便样品上样到96孔板的每行第一个孔中，并且使用多通道移液管通过从纵列转移20μL至纵列内的180μL培养基中、混合10次并重复该过程来制备10倍连续稀释液；在稀释之间更换移液管吸头。
■此后，使用多通道移液管将来自五个选定的稀释液中的每一个的五个10μL重复样品在琼脂培养基上涂板。
■使板干燥，然后放入培养箱中。
■参见Chen等，2003对细菌计数方法的详述。
●实验设计和参数(参见表4和5)
表4.实验设计(平行重复实验)a
a该研究以两次平行重复实验进行，每个重复实验由7个隔离器单元组成。
b在第1个研究日，每个隔离器中有20只雏鸡，在第10个研究日取出5只雏鸡用于攻击前NE标志物评价。
表5.评价参数
结果：
3.1存活率(死亡率)和临床体征
●CP攻击(第14-16天)后，在任何鸟中均未观察到死亡(急性死亡)或临床体征(严重抑郁、食欲降低、不愿移动、腹泻和羽毛皱乱)(参见表6和7)。
表6.存活率
表7.临床体征
3.2平均体重和增重
产气荚膜梭菌攻击(第14-16天)后，OxBC处理组的平均体重相对于攻击-未用药的鸟组(G2)显著(P<0.05)增加。在三个OxBC剂量中，2ppmOxBC组(G3)具有最高的总增重(第1至28天)。OxBC治疗恢复了经攻击的鸟的最终平均体重和总平均增重至相较于对未被攻击的对照(G1)观察到的水平没有显著差异的水平(表8)。
表8.平均体重和增重百分比
上标a,b,c表示统计学上的显著差异。*,P<0.05；**,P<0.001,单向ANOVA(SPSS12.0)。
增重百分比＝[(最终体重–起始体重)/起始体重]×100。
3.3肠道病变评分
在研究期间在3个时间点评价小肠中肉眼可见(眼观)病变：
●在第10个研究日，在攻击(在第14-16天)之前，将来自每个隔离器的五只鸟进行安乐死，并评价攻击前充血和出血。
●在第21个研究日，最后的CP攻击之后五天，将来自每个隔离器的三只鸟安乐死并评价肠道病变。
●在第28个研究日，研究的最后一天，评价每个培养箱中剩下的12只鸟的肠道病变。
在第10天取得的攻击前样品的评价揭示，在任何处理组中，在肠粘膜上几乎没有至没有多灶性充血和/或出血。这一发现证实，在第14天开始的攻击期之前，所有组中的鸟类健康状况良好。
产气荚膜梭菌攻击在小肠中诱导病变。攻击的-未用药组(G2)具有最高的平均病变评分(1.54±0.58)，其显著高于研究中任何其他组的评分(表9)。未被攻击组(G1)具有最低的平均病变评分，为0.30±0.39。
在攻击后时期(第14至28天)，与攻击的-未用药组相比，OxBC治疗显着缓解了肠道病变。显著地，饲喂2ppm OxBC的鸟的平均病变评分是除了未被攻击的对照组之外的所有组中最低的(0.40±0.51)(表9)。
相对于攻击的-未用药对照，两个抗生素组中的平均病变评分也显著降低(表9)。
表9.肠道病变评分(第21天3只鸟及第28天12只鸟)
上标a,b,c表示统计学上的显著差异。*,P<0.05；**,P<0.001,单向ANOVA(SPSS12.0)。用各组平均值计算标准偏差
3.4产气荚膜梭菌的计数
通过测定研究期间的三个时间点的菌落形成单位(CFU)来评价从小肠收集的粪便样品的产气荚膜梭菌含量。
●在第10个研究日，在攻击(在第14-16天)之前，对来自每个隔离器的五只鸟进行安乐死，并评价粪便产气荚膜梭菌含量。
●在第21个研究日，最后产气荚膜梭菌(“CP”)攻击后五天，对来自每个隔离器的三只鸡进行安乐死，并评价粪便产气荚膜梭菌含量。
●在第28个研究日，研究的最后一天，评价每个孵化器中剩下的12只鸟的粪便产气荚膜梭菌含量。
在第10天测定的产气荚膜梭菌的攻击前水平的范围在七个处理组中为4.4x 102至1.3x 103个CFU(表10)。这种低水平的产气荚膜梭菌是预期的，因为这种物种通常被发现以低的非致病水平驻留在肉鸡肠道中。
对于未被攻击的对照组，产气荚膜梭菌水平在整个试验期间增加。如上所指示，产气荚膜梭菌是肉鸡肠道微生物群落的常驻菌，且在低水平下该细菌不影响鸟类。产气荚膜梭菌的肠内容物随着鸟龄的增加而增加也不罕见。在整个本研究中，在未被攻击的对照中观察到的产气荚膜梭菌水平与健康鸟类中通常观察到的非病理水平一致。
在攻击后时期，在第21和28天，攻击+未用药组中的鸟类具有显著高于所有其他组的产气荚膜梭菌水平(表10)。在评价的每个攻击后时间点(第21和28天)，OxBC处理显著并剂量依赖性地将产气荚膜梭菌水平相对于攻击的未用药组降低2至3个数量级。此外，OxBC组中的产气荚膜梭菌水平与未被攻击鸟类的那些没有统计学差异(表10)。
使用抗生素也导致攻击后时期间产气荚膜梭菌水平显著降低。到研究结束时，在第28天，未从任一抗生素组的鸟取得的样品中回收到产气荚膜梭菌。通过抗生素完全消除产气荚膜梭菌与将产气荚膜梭菌水平保持在正常无攻击水平的OxBC作用相反(表10)。
表10.肉鸡小肠中产气荚膜梭菌计数
上标[a,b]表示统计学上的显著差异。*,P<0.05；**,P<0.001,单向ANOVA(SPSS12.0)。将抗生素处理组(组6和7)的平均值排除在统计学分析之外，因为梭菌细菌的数量不是非常低的或可检测到。用各组平均值计算标准偏差.
4.研究概述
●本研究评估了肉鸡中OxBC在坏死性肠炎的亚临床模型中的预防性作用。评价了若干参数，包括存活(死亡)率、临床体征、体重、增重、肠道病变和细菌计数。相对于攻击的-未用药的对照组、未被攻击的对照组、两个抗生素组(杆菌肽和维吉尼亚霉素)评价OxBC。
●在试验期间没有观察到任何组有死亡。这是因为该研究采用旨在呈现临床体征或病理学指标、而不是疾病的急性或临床模型的高死亡率率特征的亚临床坏死性肠炎模型。
●在攻击后时期内，在第21和28天，相较于攻击的-未用药的对照组，所有OxBC组中的鸟类平均体重显著更高(P<0.05)。
●试验期间观察到的眼观病变的严重程度与攻击模型的亚临床水平一致。在第21和28天病变的评价揭示，在攻击的-未用药的对照组中存在各种病理学发现，诸如鸟肠道粘膜的播散性严重充血和出血、局灶性坏死或溃疡。相比之下，OxBC和抗生素组中的鸟类显示比攻击的-未用药组减少约3倍的病变评分。此外，OxBC和抗生素组中病变的严重程度与未被攻击的对照鸟中观察到的那些病变的严重程度没有显著差异。肠道病变评分的提高与饲喂OxBC或抗生素的鸟类的粪便中的产气荚膜梭菌水平降低同时发生。
5.结论
本研究证明了饲料中低的百万分之几的水平的OxBC针对坏死性肠炎对肉鸡健康和生产力的有害影响提供保护的能力。在生长性能(体重和增重)、肠道健康(NE病变严重程度降低)和病原体定植(小肠中产生气荚膜梭菌水平降低)的水平上观察到OxBC的益处。接受OxBC的鸟类与健康的未被攻击的对照表现同样良好的事实进一步证明了产品的保护作用。
在一个实施方案中，在商业养鸡场使用2至6ppm食用OxBC补充剂作为饲料添加剂可有助于预防和改善鸡NE，并预计在提高生殖期期间生产力方面具有积极的作用。
实施例4–关于通过完全氧化的β-胡萝卜素实现的提高的食用动物生产力的量度与 免疫活性相关，并且这是完全氧化的类胡萝卜素的性能特征的证据。
起点-类胡萝卜素
类胡萝卜素是由植物合成的黄色、橘色和红色色素。已知有超过600种的类胡萝卜素，它们由两类组成，即完全为烃的胡萝卜素和作为被一个或几个氧原子取代的胡萝卜素的叶黄素类。β-胡萝卜素和番茄红素是常见的胡萝卜素的实例，而叶黄素、玉米黄质和角黄素是叶黄素类的常见实例。北美膳食中最常见的类胡萝卜素是α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、叶黄素、玉米黄质和番茄红素。
所有类胡萝卜素由8个异戊二烯单元形成，并且每个类胡萝卜素分子含有40个碳原子。在结构上，类胡萝卜素采取多烯烃链的形式，其有时在一个或两个末端处由环封端。含有未取代的β-紫罗兰酮环的类胡萝卜素(包括β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-隐黄质和γ-胡萝卜素)具有维生素A活性(意味着它们可以转化为视黄醛)。相比之下，叶黄素、玉米黄质和番茄红素没有维生素A活性。
类胡萝卜素的颜色范围从淡黄色到亮橘色到深红色，直接与它们的结构相关联。碳-碳双键在称为共轭的过程中相互作用，这使得分子中的电子自由移动经过分子的这些区域并且通过吸收可见光区域中的能量容易地经历电子跃迁。
终点–氧与胡萝卜素自发形成共聚物作为主要反应产物
产生类胡萝卜素的浓烈颜色的非常相同的共轭双键体系也使得它们对与分子氧的自发反应高度易感。本发明人发现，氧化反应主要通过将多个氧分子加成至类胡萝卜素分子以形成类胡萝卜素-氧共聚物产物发生[1、2和11]。例如，β-胡萝卜素溶于适合的有机溶剂(如苯、乙酸乙酯)中，与几乎8当量的分子氧反应，导致净重增加约30％。该产物OxBC主要由聚合物(85重量％)与提供平衡的降异戊二烯类分解产物(15％)组成。
β-胡萝卜素与氧的自发反应主要通过加成以形成具有高氧含量的聚合物进行。OxBC是总反应产物，并且由聚合物(85％)和分裂产物(15％)组成。其他类胡萝卜素类似地反应，其中聚合物产物形成占优势。
聚合物产物的优势也反映在OxBC(表)的经验式中，其与其经分离的聚合物产物的经验式仅略有不同，并且与每个β-胡萝卜素分子加成多个分子O2一致。OxBC的凝胶相渗透色谱图(GPC)(即尺寸排阻色谱图)由扩展到约8,000Da的宽峰占主导，其中值MW为900Da(图2A)。
存在于β-胡萝卜素中的延长的线性共轭双键体系是所有类胡萝卜素所共有的，因此预期其他类胡萝卜素在其与分子氧的自发反应中将表现相似。下表显示，如通过比较β-胡萝卜素、番茄红素、角黄素和叶黄素的完全氧化的结果所说明，这一期望得以证实。
氧对β-胡萝卜素、番茄红素、角黄素和叶黄素的自发完全氧化的结果的比较于下表中说明：
表11
n.d.–未测定。
与β-胡萝卜素的氧化一样，这些类胡萝卜素都显示出高的氧摄取，如产品重量的总体显著增加(≥25％)和类似经验式所反映，其中如由其GPC所显示，聚合物产物占优势(图2B-3D)。此外，所有完全氧化的类胡萝卜素具有惊人相似的红外谱(FTIR)(图3A-3D)。
增强免疫功能——完全氧化的β-胡萝卜素(OxBC)的实例
本发明人已经发现OxBC能够在免疫功能上发挥不寻常的双重能力[3-5]。这两个效应是(1)引发和增强先天免疫功能的能力[2,3]和(2)限制过量的炎症的能力[12]。这些效应与任何维生素A活性无关，因为OxBC不含β-胡萝卜素和维生素A[3]，并且此外，已显示缺乏激活视黄酸受体的能力[3]。
这种活性的发现源自认识到聚合物产物β-胡萝卜素主要在与分子氧的反应中自动形成[2]，并且这些产物主要是观察到的免疫活性的原因[3](见下文)。
由于这种类型的氧化行为不仅仅局限于β-胡萝卜素，而是类胡萝卜素的一般特征(见上文)，这些观察结果为解释维生素原A类胡萝卜素(α-、β-和γ-胡萝卜素及β-隐黄质)和更多种不能转化为维生素A的类胡萝卜素两者的非-维生素A作用提供了有形、可信赖且可测试的基础。
使用PCR基因表达阵列的初步OxBC筛选显示活性模式，表明了两种关键免疫调节能力的潜力(参考文献[2]中的表3)。在与先天免疫功能调节有关的第一种能力中，OxBC上调了基因的表达，所述基因编码的产物在病原体感知和病原体相关分子模式(PAMP)检测中起作用，所述产物包括Toll样受体(TLR)和作为PAMP检测的辅因子的其他蛋白质，诸如CD-14(分化簇14)。
在体外和体内都证实了引发先天免疫功能的能力，如由质膜TLR和CD14受体表达增加所说明(参考文献[3]中的图1和图2)。此外，如下所述，基于CD14受体表达的测定法表明聚合物产物主要(如果不是完全地)是OxC-β的活性的原因。
延伸至其他完全氧化的类胡萝卜素——通过完全氧化的番茄红素证明增加的免疫 监视受体水平
OxBC的免疫增强作用的核心是其提高感知病原体的免疫受体水平的能力，包括Toll样受体亚型2和4(TLR-2和TLR-4)及CD14。这些受体起着病原体检测和先天免疫系统激活的重要作用。通过增加宿主的免疫受体补体，OxBC有效提高了针对病原体的免疫监视的水平。
为了评估其他类胡萝卜素增强先天免疫的能力，基于CD14免疫监视受体的上调开发了测定法[3]。将完全氧化的番茄红素(OxLyc)与完全氧化的β-胡萝卜素(OxBC)比较。虽然番茄红素与β-胡萝卜素共有相同数量的线性共轭双键，但其在每个末端处缺乏环己基基团。
图4A显示了CD14表达分别对OxBC和OxLyc的浓度的线性剂量-响应，并且它们的活性基本上是不可区分的。番茄红素产物与β-胡萝卜素产物的比较表明缺乏环己基基团对CD14免疫受体响应的影响。
类胡萝卜素-氧共聚物是增强先天免疫的原因
图4B显示，OxBC的聚合物级分主要是上调CD14表达的原因。这一发现和OxBC和OxLyc在CD14测定法中的基本等效的活性与聚合物产物在每种氧化的类胡萝卜素中的优势以及它们的FTIR谱之间的强相似性是一致的，表明在氧化的类胡萝卜素聚合物中存在共同的结构元素。
使用FACS分析来定量CD14表达。显示每种化合物相对于未处理的细胞的作用。点代表三个独立实验的平均值和标准误差。(A)OxLyc对CD14表面含量具有显著的剂量作用(p＝0.020)，与OxBC的作用没有显著差异。(B)相关分析表明，每种化合物对CD14表达的显著剂量作用，其中p值对于OxBC为0.0036，对于聚合物为0.0034，对于单体为0.0113。每种化合物的相对活性比较(B)表明，单体的活性比聚合物(p<0.001)和OxBC(p<0.01)显著更低，而聚合物与OxBC的活性之间无显著的差异。单体的表观活性可能是由于残留的较低分子量聚合物存在导致的，其不能从单体级分中完全除去(来自参考文献[3])。
增强先天免疫对家畜生产的重要性
根据最佳生长、饲料转化效率和生产水平，现代的家畜系已经经过选择。伴随着更高生产潜力的遗传选择一直是动物的在代谢上代价高的(metabolically costly)免疫潜力的降低。因此，现代家畜物种对感染易感。这种易感性加上密集的生产环境使得食用动物易受到许多病原体的感染。感染引起的生长速率降低、饲料转化效率降低和死亡率升高对全世界的畜牧业构成重大的经济威胁。为了尝试和减轻感染造成的威胁，行业已经转向了开发具有增强宿主先天免疫防御能力的饲料成分。OxBC代表一种这样的饲料成分，其具有有益地影响宿主的先天免疫系统的能力。
在这种情况下，可以看出OxBC的免疫增强作用的重要性。通过其增加感知病原体的免疫受体(包括TLR-2、TLR-4和CD14)水平的能力，OxBC可以增强病原体检测和先天免疫系统激活的重要作用。通过增加宿主的免疫受体补体，OxBC有效提高了病原体免疫监视的水平。
这种提高的监视导致病原体的早期检测、反应和清除。免疫应答在代谢上代价高，且可以将资源从生长和生产途径中拿走。通过其对免疫受体表达的作用，OxBC提供了一种在早期阶段预防感染的机制，从而限制了免疫应答的范围和持续时间并节省了代谢资源。因此，将动物维持在健康状态，并且代谢资源可以被保存并且引导到获得动物的充分生长潜力。
尽管出于清楚和理解的目的已经对前述发明进行了稍许详细地描述，但是本领域技术人员在阅读本公开内容后将会理解，可在不背离权利要求书中本发明的真实范围的情况下进行各种形式和细节上的改变。
所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示通过引用整体并入。
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Claims (16)

1.一种通过向动物施用有效量的氧化的类胡萝卜素来在所述动物中预防坏死性肠炎(NE)及缓解相关疾患的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述相关疾患包括食欲降低、体重增加速率降低、饲料转化效率降低或肠道病变。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述动物是家禽。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述家禽是肉鸡。
5.一种通过向患有坏死性肠炎或产气荚膜梭菌感染的家禽施用有效量的氧化的类胡萝卜素来恢复所述家禽中体重增加速率的方法。
6.一种通过向用产气荚膜梭菌激发攻击的家禽施用有效量的氧化的类胡萝卜素来减少所述家禽中病原体载量的方法。
7.一种使用氧化的类胡萝卜素来保护家禽免受坏死性肠炎或产气荚膜梭菌导致的肠道病变的方法。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述有效量是膳食的2–30ppm的膳食。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述氧化的类胡萝卜素是完全氧化的类胡萝卜素。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述完全氧化的类胡萝卜素选自由以下各项组成的组：OxBC、OxLyc、OxLut和OxCan。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述完全氧化的类胡萝卜素是OxBC。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述氧化的类胡萝卜素是类胡萝卜素-氧共聚物或者含类胡萝卜素-氧共聚物的产物或组合物。
13.一种包含氧化的类胡萝卜素的组合物，其用于动物饲料中以预防家禽中的NE或降低家禽中的NE的发病率。
14.根据权利要求13所述的组合物，其用于家禽饲料中。
15.一种试剂盒，其包含：
(i)组合物，所述组合物包含氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素、其组分，诸如包括含类胡萝卜素-氧共聚物的组分，和类胡萝卜素-氧共聚物以及包含上述化合物的组合物和/或产物；和
(ii)可选的用于预防坏死性肠炎(NE)和/或降低发展出坏死性肠炎(NE)的风险和缓解相关疾患、诸如相关的胃肠道疾患，以及用于治疗患有坏死性肠炎或处于坏死性肠炎风险中或暴露于产气荚膜梭菌的动物的使用说明书。
16.一种使用氧化的类胡萝卜素或者含氧化的类胡萝卜素的组合物或产物，诸如氧化转化的类胡萝卜素、完全氧化的类胡萝卜素、其组分，和类胡萝卜素-氧共聚物以及包含上述化合物的组合物和/或产物来用于预防坏死性肠炎(NE)或暴露于产气荚膜梭菌，和/或降低发展出坏死性肠炎(NE)的风险或暴露于产气荚膜梭菌的风险，以及缓解NE相关疾患、诸如相关的胃肠道疾患的方法。
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