BR112017023033B1 - Carotenoides oxidados e componentes dos mesmos para prevenir enterite necrótica - Google Patents
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Abstract
CAROTENOIDES OXIDADOS E COMPONENTES DOS MESMOS PARA PREVENIR ENTERITE NECRÓTICA. A Enterite Necrótica (NE) tem sido amplamente encontrada em frangos de corte comerciais quando produzidos sem o uso de promotores de crescimento antimicrobiano. A presente invenção proporciona um método e uso de carotenoides oxidados, componentes dos mesmos e composições e produtos contendo os mesmos, tais como, OxBC (?OxC-betaTM, Produto da Avivagen Inc., Canadá) para prevenir Enterite Necrótica em animais, tais como aves domésticas. As composições relacionadas, os kits também estão aqui incluídos na invenção.
Description
[001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade da patente provisória US N° 62/153.587 depositado em 28 de abril de 2015 e intitulado “Use of Fully Oxidized Beta Carotene and Methods for Preventing Necrotic Enteritis”. Todas essas referências são incorporadas na sua totalidade por referência.
[002] Esta invenção refere-se ao uso de carotenoides oxidados, tais como, carotenoides transformados por oxidação, tais como carotenoides completamente oxidados, tais como beta-caroteno (“OxBC”), componentes do mesmo, e copolímeros de carotenoide oxidado e composições e/ou produtos compreendendo os mesmos para prevenir e/ou reduzir o risco de desenvolver enterite necrótica (NE) e melhorar as condições associadas, tais como condições gastrointestinais associadas. A invenção também se relaciona a métodos, usos e kits associados.
[003] A enterite necrótica (NE) ocorre frequentemente em aves domésticas, tais como, frangos, patos e perus. Na maioria das vezes, ocorre em frangos de corte com cerca de 2 a 5 semanas de idade ou em frangos de criador e de produção de carnes e ovos em cerca de 12 a 16 semanas de idade, mas também podem ocorrer em outros animais, como cavalos, ovelhas, suínos, gado e peixe. Pode causar morte súbita com ou sem sinais clínicos ou perda de vitalidade, eficiência reduzida de conversão alimentar, perda de apetite e consumo de ração, redução do ganho de peso ou perda de peso, diarréia, hiperemia multifocal, hemorragias do intestino delgado, intestino de paredes finas, necrose mucosal confluente, morte súbita, aumento da mortalidade, redução da taxa de crescimento e uniformidade. O principal patógeno associado ao NE é Clostridium perfringens. Os fatores de pré-disposição incluem, entre outros, estresses ambientais, imunossupressão, coccidiose concorrente causada por infecção com espécies de Eimeria, composição de dieta, falta de nutrição, bacteriocinas, enzimas colagenolíticas e fatores de adesão e cepas produtoras de toxinas, tais como, Clostridium perfringens.
[004] Como observado acima, a enterite necrótica (NE) foi encontrada em muitos animais, incluindo várias aves, tais como, aves domésticas. É encontrada em grande parte em frangos de produção de carne comerciais quando produzidas sem o uso de promotores de crescimento antimicrobianos.
[005] A taxa de incidência de NE em fazendas de produção de frangos sem antibióticos aumentou de 13,6% em 2008 para cerca de 97,3% em 2011 (H-K Jang, Universidade Nacional de Chonbuk).
[006] Em populações saudáveis de frangos de corte, C. perfringens geralmente varia de 102 a 104 unidades formadoras de colônias (CFU) por grama do conteúdo intestinal do intestino delgado, com níveis potencialmente dependentes de um desafio bacteriano único ou acumulativo. O nível de C. perfringens em aves afetadas com NE é maior - a partir de a taxa de aves saudáveis quando começa a se tornar desequilibrada e, em seguida, subindo logaritmicamente às vezes atinge 107 unidades formadoras de cólon (CFU) por grama ou mais quando atingem o peso do mercado.
[007] Os tratamentos atuais incluem o uso de antibióticos, tais como, penicilinas (por exemplo, fenoximetil penicilina, amoxicilina), que podem ser colocados na água potável, ou Bacitracina no alimento (por exemplo, 100 ppm). Neomicina e eritromicina também são usados às vezes. O curso de tratamento, por exemplo, a medicação na água geralmente é 3-5 dias e a medicação no alimento é de 57 dias, dependendo da gravidade.
[008] Os antibióticos, tais como, pencillina e bacitracina, também foram usados no alimento como um preventivo.
[009] Em muitos países, as regulamentações locais ou condições de mercado impedem o uso rotineiro de muitos antibióticos e o uso de alimentos sem antibióticos é tendência. Como tal, também é o aumento na NE.
[0010] Existe uma necessidade de minimizar os efeitos da NE, tal como em frangos de corte, por exemplo, protegendo-os da infecção (por exemplo, para prevenir NE) ou reduzindo os níveis de bactéria de C. perfringens.
[0011] Em alguns aspectos, a invenção proporciona um método para uso de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamentes transformados, totalmente carotenoides oxidados, componentes dos mesmos, e copolímeros de carotenoides oxidados e composições e/ou produtos que compreendem os mesmos para prevenir e/ou reduzir o risco de desenvolver enterite necrótica (NE) e melhorar condições associadas, tais como, condições gastrointestinais associadas. Em alguns aspectos, os produtos de carotenoides completamente oxidados são selecionados do grupo que compreende: beta-caroteno completamente oxidado (OxBC), licopeno completamente oxidado, OxLic; luteína completamente oxidada, OxLut; e cantaxantina completamente oxidada, OxCan. Em outros aspectos, copolímeros de carotenoide oxidado e composições ou produtos que compreendem os mesmos são usados. Em outros aspectos, a invenção proporciona o uso dos carotenoides oxidados acima mencionados e composições para prevenir NE e/ou minimizar os seus efeitos ou condições associadas, tais como, reduzindo os níveis e/ou prevenindo o aumento ou a manutenção de baixos níveis de bactérias C. perfringens para minimizar o efeito ou reduzir o risco de desenvolver NE ou condições associadas. Em uma forma de realização, os as composições e os carotenoides oxidados da presente invenção não apresentam propriedades bactericidas ou bacteriostáticas ou antimicrobianas/antibióticas. Em outra forma de realização, a invenção proporciona um método para tratar ou facilitar o tratamento de NE. Em particular, em alguns aspectos, a invenção descreve um método para uso de carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, tais como, carotenoides completamente oxidados, tais como beta caroteno (OxBC) completamente oxidado, componentes do mesmo, copolímeros de carotenoide oxidado e composições e e/ou produtos oxidados que compreendem os mesmos, para prevenir infecções subclínicas com NE - uma doença que pode não ser facilmente observável para o produtor de aves domésticas, mas ainda tem um impacto negativo na saúde das aves, como pode ser visto no consumo reduzido de alimentos, eficiência reduzida de conversão alimentar ou avaliações de saúde entérica negativas.
[0012] Em outros aspectos, a invenção proporciona carotenoides oxidativamente transformados, tais como, carotenoides completamente oxidados, componentes dos mesmos, e copolímeros de carotenoides oxidados e composições e/ou produtos compreendendo os mesmos para resistir a NE e condições associadas, recuperar ou superar o mesmo ou manter um estado saudável à luz da exposição ou exposição potencial a um agente causador associado ao NE, como C. perfringens.
[0013] Em outros aspectos, a invenção proporciona composições, suplementos, pré-misturas, alimentos (ou outros alimentos) e kits compreendendo carotenoides oxidados, carotenoides oxidativamente transformados, tais como, carotenoides completamente oxidados, tais como beta caroteno completamente oxidado (OxBC), componentes dos mesmos, e copolímeros de carotenoides oxidados e composições e/ou produtos que compreendem os mesmos e métodos e usos para prevenir e/ou minimizar o efeito de NE ou condições associadas, tais como, reduzindo os níveis de bactérias C. perfringens e/ou prevenindo o aumento ou a manutenção de baixos níveis de bactéria C. perfringens para minimizar o efeito ou reduzir o risco de desenvolvimento de NE ou condições associadas.
[0014] Os aspectos e vantagens adicionais da presente invenção serão aparentes em vista da descrição a seguir. No entanto, deve ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, ao mesmo tempo que indicam formas de realização preferidas da invenção, são fornecidos apenas a título de ilustração, uma vez que várias mudanças e modificações dentro do espírito e do escopo da invenção tornar-se-ão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir desta descrição detalhada.
[0015] A invenção será agora descrita em relação aos desenhos, nos quais: Figura 1. Ilustra lesões intestinais macroscópicas resultantes de NE, usando um método conhecido de classificação de sua gravidade, Onde: “0” é onde não há lesão importante; “1” é um intestino delgado com paredes finas ou frágeis e hiperemia e hemorragias multifocais; "2" é hiperemia e hemorragia severas disseminadas e necrose ou ulceração focal; “3” é intestino de paredes finas, necrose mucosa confluente de necrose severa; e “4” é intestino de paredes finas, necrose extensiva, esfoliação da mucosa.
[0016] Figura 2. Análise de GPC de β-caroteno completamente oxidado, licopeno, cantaxantina e luteína. (A) OxBC, (B) OxLic, (C) OxCan e (D) OxLut. A absorbância UV foi monitorada a 220-400 nm. Onde mostrado, as linhas verticais correspondem a tempos de eluição dos padrões de peso molecular do poliéter (marcadores selecionados mostrados). Corte de coluna em aprox. 10.000 Da. O pico afiado em aprox. 5 min no GPC de OxLic indica a presença de polímeros com pesos moleculares > 10.000 Da.
[0017] Figura 3. Espectro de FTIR de (A) OxBC, (B) OxLic, (C) OxCan e (D)OxLut, obtido usando discos de NaCl e uma película moldada a partir de uma solução de CHCl3 ou discos de KBr.
[0018] Figura 4. Determinação da expressão do receptor CD14 em relação ao OxBC de (A) licopeno completamente oxidado (OxLuc), e (B) polímero de OxBC e frações de monômero norisoprenoide. As células de THP-1 foram tratadas por 24 horas com as concentrações indicadas de compostos.
[0019] “Animal” significa qualquer animal suscetível à NE, incluindo, sem limitação, humanos, cães, gatos, cavalos, ovelhas, suínos, bovinos, aves domésticas (incluindo, sem limitação, frangos (como frangos de corte e de produção de carne e ovos), patos e perus) e peixe.
[0020] Uma “quantidade suficiente” ou “quantidade eficaz” significa a quantidade de carotenoides oxidados, tais como, carotenoide oxidativamente transformado ou polímero de carotenoide completamente oxidado ou copolímero de carotenoide oxigenado, ou um componente ou componente(s) fracionado(s) do mesmo, ou composições compreendendo o mesmo necessário para prevenir e/ou intensificar a capacidade de resistir à NE e condições associadas, recuperar ou superar o mesmo ou manter um estado saudável à luz da exposição ou exposição potencial a um agente causador associado a NE, tal como C. perfringens. A quantidade eficaz de carotenoide ou composição oxidada da invenção usada para praticar os métodos da invenção varia dependendo do modo de administração, do tipo de animal, do peso corporal e da saúde geral do animal. Em última análise, o profissional médico assistente, como um médico ou profissional de cuidados veterinários ou de animais (incluindo agricultores, técnicos, conhecedores ou habilitados no campo) decidirá a quantidade adequada e o regime de dosagem. Essa quantidade é referida como uma “quantidade suficiente” ou “quantidade eficaz”.
[0021] As “Condições Associadas de Enterite Necrótica” incluem, mas não estão limitadas a, sintomas ou patologias gastrointestinais, tais como, apetite reduzido, taxa de ganho de peso reduzida, eficiência de conversão alimentar reduzida ou lesões intestinais.
[0022] “Carotenoide”, como aqui utilizado, refere- se a pigmentos de ocorrência natural do grupo terpenoide que podem ser encontrados em plantas, algas, bactérias e certos animais, tais como aves e mariscos. Os carotenoides incluem, mas não estão limitados a, carotenos, que são hidrocarbonetos (isto é, sem oxigênio) e seus derivados oxigenados (isto é, xantofilas). Exemplos de carotenoides incluem licopeno; a- caroteno; Y-caroteno; β-caroteno; zeaxantina; equinenona; isozeaxantina; astaxantina; cantaxantina; luteína; citranaxantina; etil éster do ácido b-apo-8’-carotenóico; hidroxi carotenoides, tais como, aloxantina, apocarotenol, astaceno, astaxantina, capsantina, capsorubina, carotenodióis, carotenotrióis, carotenóis, criptoxantina, β- criptoxantina, decaprenoxantina. epiluteína, fucoxantina, hidroxicarotenonas, hidroxiequinenonas, hidroxilopeno, luteína, licoxantina, neurosporina, fitoeno, fitofluoeno, rodopina, esferoidina, toruleno, violaxantina e zeaxantina; e carotenoides carboxílicos, tais como, ácido apocarotenoico, ácido β-apo-8’-carotenoico, azafrina, bixina, carboxilcarotenos, crocetina, ácido diapocarotenoico, neurosporaxantina, norbixina e ácido licopenoico.
[0023] “Copolímero Carotenoide oxigenado”, “Copolímero Carotenoide” e “Polímero”, como aqui usado, refere-se a um carotenoide, que é um composto insaturado, que foi oxidado nas suas ligações duplas reativas por reação espontânea com oxigênio molecular, resultando em copolímeros do carotenoide com oxigênio como principal produto e, isto é, separados e isolados de seus coprodutos norisoprenoides.
[0024] “Compreendendo”, tal como aqui usado é sinônimo de “incluindo” e “contendo” e são inclusivos ou abertos e não excluem elementos adicionais, elementos não apreciados ou etapas do método.
[0025] “Consiste em”, como aqui usado, é fechado e, submetido à doutrina de equivalentes, exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação.
[0026] “Carotenoide Totalmente Oxidado”, como aqui usado, refere-se a um carotenoide, que é um composto insaturado, que foi completamente oxidado em suas ligações duplas reativas por reação espontânea com oxigênio molecular, resultando em uma mistura de copolímeros do carotenoide com produtos de degradação de oxigênio e norosprenoides. Em alguns aspectos, o carotenoide completamente oxidado pode ser selecionado de OxBC, b- caroteno completamente oxidado; OxLic, licopeno completamente oxidado; OxLut, luteína completamente oxidada; e OxCan, cantaxantina completamente oxidada produzida da oxidação do carotenoide precursor isolado, referido como sinteticamente derivado em oposição a produtos de fonte natural).
[0027] O “beta-caroteno completamente oxidado” (“OxBC” - também às vezes referido na literatura sob a marca OxC-beta™ da Avivagen Inc.) é a mistura complexa de produtos formados pela oxidação completa e espontânea de β-caroteno e contém uma preponderância de compostos de copolímero de b- caroteno oxigenado. Como aqui usado, refere-se a uma composição carotenoide completamente oxidada derivada do produto comercial sintético de b-caroteno puro, que compreende cerca de 85% em peso de copolímeros de b-caroteno oxigenado e cerca de 15% de produtos de degradação de baixo peso molecular chamados norisoprenoides.
[0028] “Natural” ou “de fonte Natural”, como aqui usado refere-se a fontes de plantas (incluindo plantas ou partes das mesmas, em que as partes das mesmas podem incluir, mas não estão limitadas a, sementes, folhas e caules, frutas ou vegetais) ou microrganismos. “Produto natural” ou “Produto de fonte natural” refere-se a produtos derivados do processamento de fontes naturais de carotenoides oxidados, tais como, copolímeros de carotenoides oxidados e composições compreendendo os mesmos. Eles são derivados do processamento de fontes naturais sob condições de polimerização oxidativa. Tais fontes naturais podem incluir, mas não são necessariamente limitadas a: cenouras, tomate, alfafa, espirulina, quadril de rosa, pimentão, pimenta chili, páprica, batata doce, couve, espinafre, algas marinhas, grama de trigo, tagete, acácia branca e óleo de palmeira laca.
[0029] O “Carotenoide Transformado Oxidativamente” refere-se a um carotenoide que reagiu com até 6 a 8 equivalentes molares de oxigênio, ou uma quantidade equivalente de oxigênio de outro agente oxidante, resultando em uma mistura de produtos de clivagem oxidativa de muito baixo peso molecular e uma grande proporção de material oligomérico (isto é, esse componente do carotenoide oxidativamente transformado tendo um peso molecular médio de cerca de 900 Daltons). A reação resultante produz uma mistura que inclui espécies moleculares tendo pesos moleculares variando de cerca de 100 a 8.000 Daltons. Acredita-se que o material oligomérico seja formado pelas muitas possíveis recombinações químicas dos vários fragmentos oxidativos que são formados. Os métodos de produção de carotenoides transformados por oxidação são descritos na Patente US N° 5.475.006 e no Pedido de Patente US N° 08/527.039, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.
[0030] O “Carotenoide Oxidado”, como aqui usado, inclui um carotenoide que foi oxidado tal como “Carotenoide Oxidativamente Transformado”, “Carotenoide Completamente Oxidado” e “Copolímero de Carotenoide Oxidado” e componentes dos mesmos que resultam em atividades, composições e produtos desejados que contenham os mesmos, tais como, produtos e composições contendo copolímero de Carotenoide Oxigenado.
[0031] A “Composição Farmacêutica” significa uma composição contendo carotenoides oxidados, carotenoide transformado oxidativamente, carotenoide completamente oxidado ou um componente fracionado do mesmo ou um copolímero de carotenoide oxidado ou produto contendo copolímero de carotenoide oxidado, e formulado com um ou mais excipientes de tipo farmacêutico de uma maneira que esteja em conformidade com os requisitos de uma agência governamental que regule a fabricação e a venda de produtos farmacêuticos como parte de um regime terapêutico para o tratamento ou a prevenção de doenças em um mamífero (por exemplo, fabricados de acordo com os regulamentos GMP e adequados para administração a um humano). As composições farmacêuticas podem ser formuladas, por exemplo, para administração oral em forma de dosagem unitária (por exemplo, um comprimido, uma cápsula, uma microcápsula, uma cápsula de gel ou um xarope); para administração tópica (por exemplo, tal como, creme, gel, loção ou unguento); para administração intravenosa (por exemplo, como uma solução estéril livre de embolias particuladas e em um sistema solvente adequado para uso intravenoso); ou qualquer outra formulação aqui descrita.
[0032] Os “Carotenoides de Provitamina A” ou “PVA” referem-se a esses carotenoides, isto é, α, β e Y—carotenos e β-criptoxantina, que são capazes de serem convertidos por oxidação em vitamina A. “OxPVA” refere-se a carotenoides de provitamina A oxidados.
[0033] O “tratamento” refere-se à administração de uma composição para fins profiláticos e/ou terapêuticos. Para “prevenir doença” refere-se a tratamento profilático de um animal que ainda não está doente, mas que é suscetível ou que corre o risco de uma doença particular. Para “tratar a doença” ou usar para “tratamento terapêutico” refere-se à administração de tratamento a um animal que já sofre de uma doença para melhorar ou estabilizar a condição do animal. Assim, nas reivindicações e formas de realização, o tratamento é a administração a um animal para fins terapêuticos ou profiláticos. A terapia de acordo com a invenção pode ser realizada isoladamente ou em conjunto com outra terapia. Como aqui usado, “em risco” refere-se a animais propensos a saúde fraca, doença, suscetibilidade a infecções, problemas de mobilidade articular, níveis de atividade reduzidos e/ou má qualidade da pele.
[0034] Diversos benefícios para a saúde são atribuídos a carotenoides dietéticos. Os vários carotenoides de provitamina A, incluindo a- e β-carotenos e β- criptoxantina, proporcionam benefícios ligados às suas atividades de vitamina A. No entanto, menos fácil de explicar são outros benefícios que não sejam vitamina A dos carotenoides de provitamina A e de outros carotenoides que não podem ser convertidos em vitamina A.
[0035] Os carotenoides são pigmentos amarelos, laranja e vermelhos sintetizados por plantas. Existem mais de 600 carotenoides conhecidos que são constituídos por duas classes chamadas carotenos, que são puramente hidrocarbonetos, e xantofilas, que são carotenos substituídos por um ou alguns átomos de oxigênio, β-caroteno e licopeno são exemplos de carotenos comuns, enquanto a luteína, zeaxantina e cantaxantina são exemplos comuns de xantofilas. Os carotenoides mais comuns nas dietas norte- americanas são a-caroteno, β-caroteno, β-criptoxantina, luteína, zeaxantina e licopeno.
[0036] Todos os carotenoides são formados a partir de 8 unidades de isopreno e cada molécula de carotenoide contém 40 átomos de carbono. Estruturalmente, os carotenoides assumem a forma de uma cadeia de hidrocarbonetos de polietileno, que às vezes é terminada em uma ou ambas as extremidades por um anel. Os carotenoides que contêm anéis de b-ionona não substituídos (incluindo β-caroteno, a- caroteno, β-criptoxantina e Y—caroteno) têm atividade da vitamina A (o que significa que podem ser convertidos em retina). Em contrapartida, a luteína, a zeaxantina e o licopeno não possuem atividade de vitamina A.
[0037] Tradicionalmente, atividades que não sejam vitamina A foram atribuídas a ações do próprio carotenoide, muitas vezes como um antioxidante. No entanto, pesquisas recentes duvidam de um papel antioxidante, pelo menos em relação à inibição da carcinogênese, e aponta para a operação de outros mecanismos.
[0038] Embora tenha sido sabido que a adição de oxigênio é inerentemente favorecida na oxidação espontânea de compostos altamente insaturados, o envolvimento predominante e o significado da polimerização oxidativa de carotenoides haviam escapado de forma surpreendente antes dos relatórios dos inventores (ver também US 5.475.006; US 7.132.458; US 8.211.461: US 201 -0217244; US 2013-0131183 e US 2013-0156816). Além disso, os estudos com uma composição de β-caroteno completamente oxidado (denominada OxBC, o ingrediente ativo nos produtos de marca OxC-beta™ da Avivagen Inc.) obtida por reação espontânea de β-caroteno com oxigênio em um solvente, bem como com a o licopeno completamente oxidado formado de forma análoga, revelou que a fração polimérica é responsável pela atividade imunológica, que inclui a capacidade de iniciar e intensificar a função imune inata, bem como limitar os processos inflamatórios. O sistema estendido de ligações duplas conjugadas lineares presentes no β-caroteno é comum a todos os carotenoides, pelo qual se espera que outros carotenoides se comportem de forma semelhante nas suas reações espontâneas com oxigênio molecular e podem explicar os efeitos que não sejam de vitamina A e ambos os carotenoides da provitamina A (α-, β e Y-carotenos e β-criptoxantina) e os mais numerosos carotenoides que não podem ser convertidos em vitamina A.
[0039] Além disso, dada a ubiquidade de carotenoides, incluindo e especialmente o de b-caroteno, e a sua suscetibilidade conhecida à perda durante o processamento de alimentos, não está claro se e em que medida a oxidação e, em particular, a copolimerização ocorram naturalmente em alimentos e podem contar para esta perda. Foram identificado(a)s e desenvolvido(a)s produtos/composições contendo copolímeros de carotenoide oxigenado de fontes naturais que são distintas dos carotenoides completamente oxidados, para os métodos, os usos, as composições e os kits da presente invenção.
[0040] A verificação dos inventores de alimentos (tais como fontes de plantas) contendo copolímeros de carotenoide oxidado, como aqui descritos, com atividades imunológicas não vitamínicas antecipadas. Por exemplo, em um exemplo como aqui descrito, a natureza química do composto isolado a partir de pó de cenoura (originalmente rico em β- caroteno) foi confirmada pela comparação de análise elementar, termólise por GPC, IR, GC-MS e dados de UV com os de OxBC. A análise elementar, os dados de IR e GPC de compostos isolados da mesma maneira de outros alimentos secos apoiaram sua natureza de copolímero de oxigênio.
[0041] Descreveram-se aqui que os carotenoides transformados em compostos poliméricos têm potencial benéfico previamente não reconhecido nos métodos, nos usos, nas composições e nos kits da presente invenção. Em uma forma de realização, os produtos que compreendem o(s) copolímero(s) de oxigênio carotenoide é(são) feito(s) de produtos ricos em carotenoides in situ em oposição a carotenoides isolados ou sintéticos.
[0042] O ácido gerônico, um marcador de baixo peso molecular da presença de copolímeros de b-caroteno oxigenado, ocorre em alimentos frescos ou secos comuns, incluindo cenouras, tomates, batatas doces, páprica, quadril de rosa, algas marinhas, alfafa e leite, em níveis abrangendo uma faixa de cerca de mil vezes, de poucas partes por bilhão em alimentos frescos para partes por milhão em alimentos secos. Copolímeros isolados de alguns alimentos secos, por exemplo, pó de cenoura, pó de tomate, pó de espirulina, pó de quadril de rosa, pó de páprica, pó de algas e pó de grama de trigo, atinge partes por mil níveis - comparáveis aos níveis de carotenoides originais. A atividade biológica in vivo dos copolímeros suplementares de β-caroteno oxigenado foi previamente documentada em níveis de partes por milhão de, sugerindo que certos alimentos possuem tal atividade.
[0043] A descoberta de que a oxidação e os produtos de reação associados seriam encontrados dentro do ambiente muito mais complexo, em que os carotenoides que ocorrem naturalmente, isto é, em certas fontes de plantas, tais como, frutas e vegetais e certos microrganismos (algas, fungos e bactérias) não eram óbvios ou previsíveis à luz do microambiente complexo e muitos outros compostos potencialmente reativos no material biológico que poderiam desviar qualquer incipiente reação de oxidação de carotenoide em uma miríade de outras vias com diferentes resultados do produto.
[0044] Em um aspecto da invenção, os produtos de copolímero de carotenoide oxidado isolados desta maneira a partir de alimentos derivados de plantas secas não contêm os outros produtos de degradação de carotenoides de baixo peso molecular antecipados (por exemplo, incluindo ácido gerônico em produtos esperados para conter compostos de degradação de oxidação de b-caroteno). Isto é distinto dos carotenoides completamente oxidados (como OxBC, OxLic, OxLut ou OxCan), que contêm esses produtos.
[0045] Em outra forma de realização, a fonte da planta é selecionada do grupo que consiste em: cenouras, tomate, alfafa, espirulina, quadro de rosa, pimentão, pimenta chili, páprica, batata doce, couve, espinafre, algas marinhas, grama de trigo, tagete, acácia branca e óleo de palmeira laca. Em outra forma de realização, as fontes são produtos vegetais que são pós, p.ex., pó de cenoura, pó de tomate, pó de espirulina, pó de quadril de rosa, pó de páprica, pó de algas marinhas e pó de grama de trigo.
[0046] Em uma forma de realização, a fonte de microrganismo é selecionada do grupo que consiste em: bactérias, leveduras, fungos e algas, tais como, espirulina44 e formas geneticamente modificadas do mesmo que aumentam os carotenoides e, por conseguinte, o potencial para os copolímeros de carotenoides oxidados. Em algumas formas de realização adicionais, os microrganismos são selecionados do grupo das seguintes espécies: Algas: Espirulina, Dunaliella, Haematococcus, Murielopsis. Fungos: Blakeslea trispora. Leveduras: Xanthophyllomyces dendrorhous, Rhodotorula glutinis. Bactérias: Sphingomonas.
[0047] A verificação dos inventores de que os compostos de copolímeros de b-caroteno oxigenado OxBC, como usados nos Exemplos, são benéficos nos usos, métodos, composições e kits aqui descritos leva à expectativa de que os equivalentes de copolímeros em alimentos irão conferir bioatividades com implicações de saúde similares. A oxidação in situ de carotenoides alimentares resultantes de processos oxidativos desencadeados durante a digestão de frutas ou vegetais também poderia, pelo menos parcialmente, explicar a atividade de vitamina A com várias alterações ou variável de b-caroteno em alimentos em comparação com b-caroteno de suplementos.
[0048] A destruição oxidativa do β-caroteno e a perda de atividade percebida podem ser um ganho de atividade imunológica através da formação de copolímeros.
[0049] Verificou-se uma maneira de intensificar a quantidade de copolímero de carotenoide oxidado em uma fonte e/ou ter uma fonte com quantidades conhecidas e consistentes de copolímero de carotenoide oxidado para facilitar a dosagem consistente a quantidades efetivas conhecidas para alcançar resultados desejados.
[0050] Além disso, a presente invenção permite que um produz um copolímero de oxigênio de carotenoide que compreende produtos em situ sem iniciar a partir de carotenoides isolados como fonte e para fornecer produtos que compreendem níveis consistentes de copolímeros de carotenoides oxidados que tenham benefícios animais resultantes aqui descritos, incluindo relacionados à NE. Em um aspecto, os copolímeros de carotenoide oxidado de fontes naturais não compreendem (ou compreendem minimamente) produtos de degradação.
[0051] Como aqui descrito, a invenção tem várias aplicações relativas ao uso de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado. Eles incluem, mas não estão limitados aos seguintes aplicativos:
[0052] A presente invenção ilustra que os carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como, componentes compreendendo um copolímero de carotenoide oxidado contendo componente, tal como OxBC, pode ser usado para melhorar o peso corporal médio final em poucas partes por milhão (ppm) de níveis no alimento, com restauração ao nível do grupo de aves não desafiado. Em uma forma de realização, a invenção proporciona um método para o uso de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxigenado, tal como OxBC para proteger contra perdas de produtividade causadas por cargas de doenças subclínicas associadas a C. perfringens e/ou NE, em frangos de corte. Carotenoides oxidados podem ser usados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado, tal como OxBC como descrito aqui para “restaurar” ganho de peso ao nível que teria resultado se não houvesse doença, infecção por NE ou C. perfringens.
[0053] As classificações de lesões intestinais devido à infecção por NE foram significativamente atenuadas nos grupos de tratamento de OxBC em comparação com o grupo de aves não medicinais, com o grupo OxBC de 2 ppm mostrando a maior melhora. Outros carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoide oxidado, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes que compreendem um componente que contém um copolímero de carotenoide oxigenado, podem ser usados de forma semelhante.
[0054] Como tal, em um aspecto, a invenção proporciona um método de uso de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxigenado para proteger contra (a) lesões intestinais durante NE em aves domésticas, tais como, frangos de corte, causados por infecção por C. perfringens.
[0055] O número de bactérias de C. perfringens em fezes foi reduzido por carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado, ou em uma forma de realização de OxBC, em um padrão dependente da dose. Assim, a invenção pode ser usada para manter o equilíbrio das bactérias no intestino, tal como o intestino de um frango de frango, e evitar o crescimento excessivo das bactérias C. perfringens.
[0056] Níveis baixos de ppm de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxigenado, ou em uma forma de realização de OxBC, no alimento pode contribuir para a prevenção e melhoria de NE na fazenda de frangos de corte comercial e espera-se que tenha um efeito positivo na melhoria da produtividade para o período de alimentação.
[0057] Em uma forma de realização a invenção proporciona um método para manter aves domésticas (tais como frangos de corte) em boa saúde (tais como um estado de saúde não desafiado) na face de um desafio, tais como NE e C. perfringens, usando carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado em vez de um antimicrobiano. O uso de antimicrobianos em gados e aves domésticas tem sido amplamente associado a resíduos de drogas nos alimentos e na propagação de patógenos resistentes a antibióticos nos alimentos e no ambiente. Consequentemente, há pressão sobre os produtores de aves domésticas para reduzir o uso de antibióticos. Carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes que compreendem um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado. Em uma forma de realização, OxBC demonstrou aqui que não tem propriedades bactericidas ou bacteriostáticas e, portanto, não antimicrobiana, tornando-se uma alternativa útil a antibióticos para a prevenção ou controle de NE e C. perfringens em aves domésticas, tais como frangos de corte.
[0058] O método pode ser usado em animais, particularmente aves domésticas e em outra forma de realização, frangos de corte, de produção de carne e ovo e perus, que são susceptíveis a desafios de C. perfringens e/ou NE.
[0059] OxBC é o produto da auto-oxidação completa de beta-caroteno, um processo que resulta em uma nova composição livre de beta-caroteno, vitamina A ou atividade do agonista do receptor de ácido retinoico. É predominantemente formado por um processo de copolimerização de oxigênio que leva a um produto bem definido, consistentemente reprodutível, compreendido principalmente de copolímeros de b-caroteno oxigenado.
[0060] Estruturalmente, os polímeros de OxBC parecem ser uma forma menos polimerizada de esporopolenina, um biopolímero encontrado nas paredes de exina de esporos e pólens. Os polímeros já foram identificados como sendo formados a partir da auto-oxidação de carotenoides múltiplos, incluindo não apenas beta-caroteno, mas também, cantaxantina, luteína e licopeno. Outros carotenoides, tais como, astaxantina, são esperados completamente para sofrer predominantemente ao mesmo processo de polimerização.
[0061] As análises químicas indicam que a versão sintetizada é altamente análoga aos polímeros que ocorrem naturalmente em diferentes rações, alimentos e forragens (dados não publicados, manuscritos em preparação).
[0062] O OxBC é produzido em quantidade por aquecimento de uma solução de beta-caroteno sintético em um solvente “GRAS”, em uma atmosfera de oxigênio puro até a absorção de oxigênio tornar-se muito mais lento quando um ponto final definido é alcançado. Os métodos de fabricação de QC/QA foram estabelecidos e a capacidade de produção dos ativos puros (atualmente alvejados a aplicações de gado em alimentação) está agora em dezenas de toneladas métricas por ano. O OxBC foi abastecido para uso em frangos de corte como um concentrado de 10% produzido por secagem por pulverização de uma solução de OxBC em amido de milho para formar um produto consistente de “pré-mistura”. As concentrações maiores ou menores do ingrediente ativo podem ser usadas para moer em alimentos ou outras preparações de dosagem nos níveis de administração desejados. Outros Carotenoides Completamente Oxidados podem ser preparados de forma semelhante.
[0063] O OxBC, assim como outros carotenoides oxidados da presente invenção, devem ser formulados em conjunto com alimento ou serem administrados separadamente do alimento, contemporaneamente ou não.
[0064] Em uma forma de realização, os carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um copolímero de carotenoide oxidado contendo componentes administrados ou alimentados em uma quantidade eficaz sobre a ingestão livre de alimentos do animal. Em uma forma de realização, os carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes que compreendem um componente que contém um copolímero de carotenoide oxigenado é administrado ou alimentados livremente ou em intervalos ou em outra forma de realização, uma vez ao dia, em outra forma de realização duas vezes por dia, em mais uma outra forma de realização várias vezes ao dia, e em que a quantidade de carotenoides oxidados é ajustada para a quantidade desejada dependendo dos padrões de alimentação dos animais.
[0065] Em uma forma de realização, as quantidades de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo componente contendo copolímero de carotenoide oxidado são de 2 ppm a 30 ppm ou em outra forma de realização, de 2 a 15 ppm, a 10 ppm, a 8 ppm, ou a 6 ppm, proporcionado em intervalos curtos. Em outra forma de realização preferida sugere resultados experimentais que 2 ppm a 4 ppm alimentados diariamente durante um intervalo mais longo podem proporcionar o efeito ótimo, preservando a relação custo- benefício para o produtor de aves domésticas. PPM refere-se a partes do ingrediente ativo (por exemplo, carotenoide oxidado) por milhão de partes de dieta ou do alimento.
[0066] Carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes que compreendem um componente que contém um copolímero de carotenoide oxigenado ou em uma forma de realização, o OxBC ou equivalentes químicos óbvios do mesmo podem ser administrados por qualquer meio que produza o contato do referido agente ativo com os sítios de ação do agente no corpo de um indivíduo ou paciente para produzir um efeito terapêutico, em particular um efeito benéfico, mais particularmente um efeito benéfico prolongado. Os ingredientes ativos podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente e em qualquer ordem em diferentes pontos no tempo para proporcionar os efeitos benéficos desejados. Um composto e uma composição da invenção podem ser formulados para liberação prolongada, para dispensação local ou sistêmica. Encontra-se dentro da capacidade de um médico ou veterinário qualificado para selecionar uma forma e uma via de administração que otimize os efeitos das composições e dos tratamentos da presente invenção para proporcionar efeitos terapêuticos, em particular efeitos benéficos, mais particularmente efeitos benéficos prolongados.
[0067] Em uma forma de realização, a administração de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes que compreendem um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado, inclui qualquer modo que produza contato do referido agente ativo com os sítios de ação do agente in vivo ou no corpo do frango de corte ou de outros animais, para produzir o efeito desejado ou terapêutico, conforme o caso. Como tal, inclui a administração de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado ao sítio de ação - diretamente ou através de um modo de dispensação (por exemplo, formulações de liberação prolongada, veículos de dispensação que resultam na dispensação direcionada ao sítio ao intestino ou ao sítio desejado no corpo. Em uma forma de realização, os carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes que compreendem um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado podem ser usados em cerca de 1 a 30 ppm como uma forma de realização, em outra forma de realização, 2 semanas a 30 ppm, em outra forma de realização de 2-6 ppm para “uso contínuo” (inclusão em uma dieta normal), ou como de outra forma descrita aqui. As substâncias acima descritas podem ser formuladas em composições adequadas para administração aos animais, tais como, frangos de corte, em uma forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo. Por “forma biologicamente compatível adequada para administração in vivo” entende-se uma forma da substância a ser administrada em que quaisquer efeitos tóxicos são compensados pelos efeitos terapêuticos. As substâncias podem ser administradas a organismos vivos, incluindo animais, tais como, aves domésticas, em uma outra forma de realização, frangos, em uma outra forma de realização, os frango de corte, de produção de carne e ovos ou perus.
[0068] Assim, em uma forma de realização, a invenção proporciona o uso de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado na preparação de um medicamento para as aplicações aqui mencionadas. Em uma forma de realização, uma quantidade terapeuticamente eficaz de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado ou uma composição farmacêutica como aqui descrita é administrada a um paciente que necessite da mesma. Um paciente que necessite da mesma é qualquer animal que possa beneficiar de carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxigenado e seus efeitos como aqui descrito.
[0069] Uma substância ativa pode ser administrada de uma maneira conveniente, tal como por injeção (subcutânea, intravenosa, etc.), administração oral, inalação, aplicação mucosa, aplicação tópica, aplicação transdérmica, aplicação gástrica, aplicação entérica ou administração retal. Dependendo da via de administração, a substância ativa pode ser revestida em um material para proteger o composto da ação de enzimas, ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto. Em uma forma de realização, carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes que compreendem um componente contendo um copolímero de carotenoide oxigenado, são administrados através do alimento de um animal ou usando outras tecnologias conhecidas na técnica.
[0070] As composições aqui descritas podem ser preparadas por métodos conhecidos per se para a preparação de composições farmaceuticamente aceitáveis que podem ser administradas a indivíduos, de modo que uma quantidade eficaz da substância ativa seja combinada em uma mistura com um veículo ou carreador farmaceuticamente aceitável. Carreadores ou veículos adequados são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., EUA 1985 ou Remington's The Sciences and Practice of Pharmacy, 21a Edição”, (University of the Sciences in Philadelphia, 2005) ou Handbook of Pharmaceutical Additives (compilado por Michael e Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, Inglaterra (1995)). Nesta base, as composições incluem, embora não exclusivamente, soluções das substâncias em associação com um ou mais veículos, carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, e podem ser contidos em soluções tamponadas com um pH adequado e/ou ser iso- osmóticos com fluidos fisiológicos. Nesse sentido, pode ser feita referência à Patente US N° 5.843.456.
[0071] Em uma forma de realização, a invenção proporciona alimentos (tais como alimentos para animais/alimentos para aves domésticas) ou produtos alimentícios compreendendo carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como, componentes que compreendem um componente contendo um copolímero de carotenoide oxidado, que pode ser misturado com um artigo alimentício e alimentado ao animal em uma quantidade eficaz para tratamento e/ou prevenção de NE e/ou minimizando seus efeitos ou condições associadas, tais como por redução dos níveis de bactéria C. perfringens.
[0072] Na preparação de um artigo alimentício da invenção, os carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxigenado é opcionalmente misturado com um agente de volume antes de ser adicionado ao artigo alimentício. Os agentes de volume incluem, sem limitação, amido, proteína, gorduras e misturas dos mesmos. Desejavelmente, o agente de volume é selecionado de amido de milho, soro de leite, farinha, açúcar, farelo de soja, maltodextrina e goma guar. Os produtos alimentícios da invenção também podem incluir antioxidantes para evitar a oxidação adicional do carotenoide transformado oxidativamente ou um componente do mesmo. A oxidação pode ser prevenida pela introdução de antioxidantes de ocorrência natural, tais como, vitamina E, vitamina C e tocoferol ou de antioxidantes sintéticos, tais como hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado. Butil-hidroquinona terciário, propil galato ou etoxiquinina para o artigo alimentício. A quantidade de antioxidantes incorporados desta maneira depende de requisitos, tais como, formulação de produto, condições de transporte, métodos de acondicionamento e vida de prateleira desejada.
[0073] Em alguns aspectos, os produtos alimentícios da invenção incluem, sem limitação, produtos cozidos, bebidas, misturas de bebidas, barras saudáveis, biscoitos e alimentos para animais. O alimento para animais pode ser um alimento para animais de estimação seco ou semiúmido, ou alimento para um animal agrícola, tal como, alimento para cavalos, alimento para suínos (por exemplo, alimento para suínos recém-nascidos/jovem, alimento para suínos com final de cultivo ou alimento para suínos reprodutores), alimentação para aves domésticas (por exemplo, alimento de aves domésticas de peru, alimento para aves domésticas de corte ou alimento para aves domésticas de criação), alimento para ovelhas, alimento para gado (por exemplo, alimento para gado leiteiro ou alimento para bovinos de corte) ou alimentos para peixes (por exemplo, alimento para tilápia, alimento para peixe-gato, alimento para trutas, ou alimento para salmão).
[0074] Os alimentos para animais são geralmente formulados para proporcionar nutrientes de acordo com padrões da indústria. A presente invenção, em algumas formas de realização, proporciona alimentos para animais compreendendo um ou mais de: carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como, carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados (tais como OxBC), componentes dos mesmos ou componentes fracionados dos mesmos, tais como componentes compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado. As alimentações podem ser formuladas a partir de uma variedade de ingredientes alimentícios diferentes, que são escolhidos de acordo com o preço e da disponibilidade do mercado. Consequentemente, alguns componentes da alimentação podem mudar ao longo do tempo. Para discussões sobre formulações de alimento animal e diretrizes de NRC, ver Church. Livestock Feeds and Feeding, O&B Books, Inc., Corvallis Oreg. (1984) and Feeds and Nutrition Digest, Ensminger, Oldfield and Heineman eds., Ensminger Publishing Corporation, Clovis, Calif. (190), cada um dos quais é incorporado aqui por referência.
[0075] Outros ingredientes podem ser adicionados à alimentação animal, como necessário para promover a saúde e o crescimento do animal. Os ingredientes incluem, sem limitação, açúcares, carboidratos complexos, aminoácidos (por exemplo, arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, valina, tirosina, alanina, ácido aspártico, glutamato de sódio, glicina, prolina, serina e cisteína, entre outros), vitaminas (por exemplo, tiamina, riboflavina, piridoxina, niacina, niacinamida, inositol, cloreto de colina, pantotenato de cálcio, biotina, ácido fólico, ácido ascórbico, e vitaminas A, B, K, D, E, entre outros), minerais, proteínas (por exemplo, farinha de carne, farinha de peixe, ovos líquidos ou em pó, solúveis de peixe, concentrado de proteína de soro de leite), óleos (por exemplo, óleo de soja), amido de milho, fosfato de cálcio inorgânico, sulfato de cobre e cloreto de sódio. Qualquer ingrediente de medicamento conhecido na técnica também pode ser adicionado ao alimento para animal, incluindo, sem limitação, antibióticos e hormônios. Para suplementação de vitaminas, minerais e antibióticos de alimentos para animais, ver Church, Livestock Feeds and Feeding, O&B Books, Inc., Corvallis Oreg. (1984).
[0076] Qualquer mistura de alimento de animais conhecida na técnica pode ser usada de acordo com a presente invenção, incluindo, sem limitação, forragens, tais como Dactylis glomerata, Phleum pratense, Festuca arundinacea, azevém, alfafa, sanfeno, trevos e vicia, alimentos para grãos, tais como, milho, trigo, sorgo de cevada, triticale, centeio, canola e feijão de soja, resíduos de colheita, grãos de cereais, coprodutos de leguminosas e outros coprodutos agrícolas. Em situações em que o alimento resultante deve ser processado ou preservado, o alimento pode ser tratado com carotenoide transformado oxidativamente, um componente do mesmo, ou carotenoide transformado oxidativamente fracionado antes do processamento ou da preservação. Desejavelmente, o alimento para animal da invenção inclui farelo de colza, farelo de semente de algodão, farelo de soja ou farelo de milho.
[0077] O processamento pode incluir secagem, ensilagem, picar, granulação, cubagem, enfardamento, laminação, temperar, triturar, fissurar, estouro, extrusão, micronização, torrefação, flocação, cozimento e/ou explosão. Por exemplo, o alimento granulado é criado pela primeira mistura de componentes de alimento e, em seguida, compactando e extrusando os componentes de alimento através de uma matriz com calor e pressão. Os alimentos para animais da invenção podem ser granulados como descrito em, por exemplo, MacBain, Pelleting Animal Feed, American Feed Manufacturers Association, Arlington, Virginia (1974), aqui incorporado por referência.
[0078] Em outras formas de realização, a invenção proporciona pré-misturas ou suplementos que compreendem e que podem ser administrados ou tomados sozinhos ou em combinação com o alimento ou artigo alimentício ou água e/ou misturado com as mesma(s) proporções/quantidades apropriadas para obter o nível desejado de produto carotenoide oxidado compreendendo o copolímero para uso no animal.
[0079] Em uma forma de realização, a invenção proporciona um kit que compreende:
[0080] (i) carotenoides oxidados ou composições ou produtos contendo carotenoides oxidados, tais como carotenoides oxidativamente transformados, carotenoides completamente oxidados, componentes dos mesmos, tais como, compreendendo um componente contendo copolímero de carotenoide oxidado, e copolímero carotenoide oxidado e composições e/ou produtos que compreendendo os mesmos; e
[0081] (ii) instruções opcionalmente para uso na prevenção e/ou na redução do risco de desenvolvimento de Enterite necrótica (NE) e melhora as condições associadas, tais como condições gastrointestinais associadas e/ou para o tratamento de um animal tendo, ou em risco de, enterite necrótica ou exposto a C. perfringens.
[0082] A presente invenção é descrita nos seguintes Exemplos, que são apresentados para auxiliar na compreensão da invenção, e não devem ser interpretados para limitar de modo algum o escopo da invenção como definido nas reivindicações que se seguem a seguir.
[0083] OxBC é o produto da auto-oxidação completa do beta-caroteno, um processo que resulta em uma composição livre de beta-caroteno, vitamina A ou atividade agonista do receptor de ácido retinoico. É predominantemente formado por um processo de copolimerização de oxigênio que leva a um produto bem definido, consistentemente reprodutível, compreendido em grande parte por copolímeros de β-caroteno oxigenado que são mais completamente descritos em Burton et al. (1995 e 2014). Estruturalmente, os polímeros de OxBC parecem ser uma forma menos polimerizada de esporopolenina, um biopolímero encontrado nas paredes de exina de esporos e pólens.
[0084] Os alimentos animais usados nesta invenção, preparados por incorporação de OxBC como uma pré-mistura a 10% (p/p) com os outros ingredientes alimentares, continham o seguinte: Tabela 1. Fórmula de alimento comercial basal usada neste estudo Substâncias usadas: • OxBC (Avivagen, Canadá), grupos 3, 4 e 5 (Tabela 4) Bacitracina (BS Bacitrex 100, Coréia), grupo 6 (Tabela 4) • Virginiamicina (Stafac-20, Bayer Korea, Coreia), grupo 7 (Tabela 4) • As substâncias foram adicionadas à dieta comercial basal como indicado na Tabela 4
[0085] A enterite necrótica (NE) foi amplamente encontrada em frangos de corte comerciais quando produzidas sem o uso de promotores de crescimento antimicrobiano. Este estudo referenciado foi projetado para avaliar o efeito preventivo de OxBC (produto de gado Oxic-beta™ da Avivagen Inc., Canadá) em um modelo de enterite necrótica subclínica em frangos de corte. O OxBC foi avaliado quanto à sua capacidade de afetar de forma favorável várias medidas de saúde e produtividade de frangos de corte, incluindo taxa de sobrevivência (mortalidade), sinais clínicos, peso corporal, ganho de peso, lesões intestinais e enumeração bacteriana, em comparação com um grupo de controle não medicado desafiado.
[0086] Um total de 280 pintinhos de corte Ross de um dia de idade, obtidos de uma incubadora comercial, foi usado neste estudo. Os pintinhos foram vacinados contra a doença de Newcastle (vírus da doença de Newcastle) na incubadora.
[0087] As aves foram criadas em unidades isoladoras durante todo o período experimental.
[0088] • Isoladores de frango equipados com sistema de ventilação foram usados neste estudo.
[0089] • Havia 1 unidade isoladora por grupo de tratamento e cada unidade isoladora alojava vinte pintinhos no dia 1 do estudo (Tabela 1). O estudo foi realizado como duas repetições paralelas com 7 unidades isoladoras por repetição.
[0090] • A temperatura interna do isolador foi ajustada de modo a manter as temperaturas ideais para frangos de corte.
[0091] • No dia de estudo 1, havia 20 pintinhos por isolador. No dia de estudo 10, os cinco pintinhos menores em cada isolador foram submetidos a eutanásia e avaliados para lesões grosseiras do intestino delgado e enumeração C. perfringens no conteúdo intestinal. A avaliação no dia 10 foi feita para garantir a ausência de lesão de NE ou níveis patogênicos de C. perfringens antes do desafio experimental no dia 14. Após o dia 10 do estudo, havia 15 aves em cada isolador e essas aves foram usadas no parte de desafio do estudo.
[0092] Os frangos foram avaliados e pesados individualmente, portanto cada pássaro representa uma unidade experimental. Tabela 2. Distribuição dos pesos corporais iniciais a Os pintinhos com peso menor que 40 g foram excluídos devido à alta taxa de mortalidade antecipada para pintinhos com baixo peso. b 280 de um total de 400 pintinhos foram usados no experimento e o número de pintinhos por grupo no dia 1 foi de 20.
[0093] A dieta basal usada no estudo foi um alimento para frango de corte comercial padrão. A dieta basal foi suplementada com os níveis apropriados de OxBC ou antibiótico, como indicado na Tabela 4. Não foram usados anticoccidiostáticos no alimento no estudo. O modelo de frango de enterite necrótica subclínico foi induzido por desafio com C. perfringens (CP-13) isolado de um caso de campo de enterite necrótica em frango de corte. O desafio foi feito por gavagem oral duas vezes por dia com aproximadamente 1 x 107 CFU/ml nos dias 14, 15 e 16. Em uma forma de realização, uma pré-mistura de OxBC a 10% em amido foi incorporada no alimento juntamente com outros ingredientes.
[0094] ■ Os inventores aplicaram o mesmo programa de alimentação e a mesma formulação do que nas fazendas de frangos de corte comerciais (Tabela 1).
[0095] ■ Os alimentos experimentais foram administrados continuamente durante o período de estudo de 28 dias e a água foi administrada ad libitum durante todo o experimento.
[0096] A fórmula do alimento comercial basal usada neste estudo pode ser vista na Tabela 1 acima.
[0097] ■ Aplicação da cepa Clostridium perfringens CP-013 para induzir um modelo NE subclínico.
[0098] ■ Todas as aves, exceto o Grupo 1, foram desafiadas oralmente duas vezes por dia com aproximadamente 107 CFU/ml de C. perfringens nos dias 14, 15 e 16 (Tabela 3).
[0099] ■ A cepa de desafio possuía genes de cpa e cpb2, mas era negativa para o gene da toxina netB.
[00100] ■ Ver Shojadoost et al., 2012 para uma descrição detalhada de métodos para induzir NE em aves domésticas. Tabela 3. Administração de desafio de Clostiidiiim perfringens
[00101] ■ As classificações importantes (macroscópicas) foram avaliadas usando os critérios de Prescott (1978), com classificações variando de uma escala de 0 (sem lesão importante) a 4 (mais lesão severa)
[00102] ■ As le sões importantes no trato intestinal foram graduadas da seguinte forma: 0, sem lesões importantes; 1+, intestino delgado de paredes finas ou instáveis: 2+, necrose focal; 3+, manchas maiores de necrose; 4+, necrose severa e extensiva típica de casos de campo (Figura 1).
[00103] ■ Ver Prescott et al., 1978 para uma descrição detalhada da escala de classificação de lesão.
[00104] ■ O número de Clostridium perfringens foi medido como unidades formadoras de colônias por um grama de fezes coletadas do intestino delgado após a necropsia.
[00105] ■ Em resumo, 250 μL de amostra fecal foram carregadas no primeiro poço de cada fileira em uma placa de 96 poços, e as diluições em série de 10 vezes foram feitas usando uma pipeta de multicanais, transferindo 20 μL da coluna para 180 μL de meio na coluna, misturando 10 vezes e repetindo o processo;
[00106] as pontas da pipeta foram alteradas entre as diluições.
[00107] ■ Post eriormente, cinco repetições de 10 μL, de cada uma das cinco diluições selecionadas, foram plaqueadas sobre um meio de ágar usando uma pipeta de multicanais.
[00108] ■ As placas foram deixadas secar, e depois colocadas em uma incubadora.
[00109] ■ Ver Chen et al., 2003 para uma descrição detalhada dos métodos de enumeração bacteriana. • Projeto & parâmetros experimentais (Ver Tabelas 4 e 5) Tabela 4. Projeto experimental (em repetições paralelas)a a O estudo foi conduzido em duas repetições paralelas com cada repetição consistindo em 7 unidades isoladoras. b No dia de estudo - 1 havia 20 pintinhos por isolador, 5 pintinhos foram removidos dia de estudo 10 para avaliação pré-desafio de marcadores de NE. Tabela 5. Parâmetros de Avaliação
[00110] • Após o desafio do CP (dias 14 a 16), nenhuma mortalidade (precisamente morte) ou sinais clínicos (depressão severa, apetite diminuído, relutância ao movimento, diarréia e penas amassadas) foram observados em qualquer pássaro (ver Tabelas 6 e 7) Tabela 6. Taxa de sobrevivência
Tabela 7. Sinais clínicos
[00111] Após o desafio de Clostridium perfringens (dias 14-16), os pesos médios do corpo dos grupos do tratamento de OxBC foram significativamente (P < 0,05) aumentados em relação ao grupo de aves não medicamentoso (G2) de desafio. O grupo de OxBC de 2 ppm (G3) apresentou o maior ganho de peso total (dias 1 a 28) entre as três doses de OxBC. O tratamento com OxBC restaurou o peso corporal final e o ganho médio total de peso de aves desafiadas para níveis que não eram significativamente diferentes dos observados para os controles não desafiados (G1) (Tabela 8). Tabela 8. Peso Corporal médio do corpo e Ganho de Peso Percentual † Os sobrescritos a,b,c denota uma diferença estatisticamente significativa. * P < 0,05; ** P < 0,001, ANOVA de um só fator (SPSS 12.0). †† Ganho de peso percentual = [(peso final - peso inicial)/peso inicial] x 100.
[00112] As lesões macroscópicas (importantes) no intestino delgado foram avaliadas em 3 pontos de tempo durante o estudo:
[00113] • No dia de estudo 10, antes do desafio (nos dias 14-16), cinco aves de cada isolador foram submetidas a eutanásia e avaliadas para hiperemia e hemorragias pré- desafio.
[00114] • No dia de estudo 21, cinco dias após o desafio final de CP, três aves de cada isolador foram submetidas a eutanásia e avaliadas para lesões intestinais.
[00115] • No dia de estudo 28, o último dia do estudo, os 12 pássaros restantes em cada incubadora foram avaliados quanto a lesões intestinais.
[00116] A avaliação das amostras pré-desafio tomadas no dia 10 revelou que houve pouca ou nenhuma hiperemia e/ou hemorragias multifocal(ais) presente(s) na mucosa intestinal em qualquer dos grupos de tratamento. Este achado confirmou que as aves em todos os grupos estavam em boa saúde antes do período de desafio que começou no dia 14.
[00117] O desafio de C. perfringens induziu lesões no intestino delgado. O grupo não medicado desafiado (G2) apresentou a maior classificação de lesão média (1,54 ± 0,58), que foi significativamente maior do que as classificações para qualquer outro grupo no estudo (Tabela 9). O grupo não desafiado (G1) apresentou a maior classificação média de lesão de 0,30 ± 0,39.
[00118] Durante o período pós-desafio (dias 14 a 28), o tratamento com OxBC aliviou significativamente as lesões intestinais em comparação com o grupo não medicado desafiado. Notavelmente, a classificação de lesão média de aves alimentadas com 2 ppm de OxBC foi a menor (0,40 ± 0,51) de todos os grupos, exceto o grupo de controle não desafiado (Tabela 9).
[00119] As classificações de lesão médias também foram significativamente reduzidas em ambos os grupos antibióticos em relação aos controles não medicados desafiados (Tabela 9). Tabela 9. Pontuações da lesão intestinal (3 aves no dia 21 & 12 aves no dia 28 † Os sobrescritos a,b,c significam uma diferença estatisticamente significativa. * P < 0,05; ** P < 0,001, ANOVA unidirecional (SPSS 12.0). O desvio padrão foi calculado com o valor médio de cada grupo
[00120] O conteúdo de C. perfringens de amostras fecais coletadas do intestino delgado foi avaliado, por determinação de unidades formadoras de colônias (CPU), em três pontos de tempo durante o estudo.
[00121] • No dia de estudo 10, antes do desafio (nos dias 14 a 16), cinco aves de cada isolador foram submetidas a eutanásia e avaliadas quanto ao conteúdo de C. perfringens fecal.
[00122] • No dia de estudo 21, cinco dias após o desafio final de C. perfringens ("CP"), três aves de cada isolador foram submetidas a eutanásia e avaliadas quanto ao conteúdo de C. perfringens fecal.
[00123] • No dia de estudo 28, o dia final do estudo, as 12 aves restantes em cada incubadora foram avaliadas quanto ao conteúdo de C. perfringens fecal.
[00124] O nível pré-desafio de C. perfringens, determinado no dia 10, variou de 4,4 x 102 a 1,3 x 103 CFU nos sete grupos de tratamento (Tabela 10). Este nível baixo de C. perfringens é esperado, pois esta espécie é geralmente encontrada para residir no intestino de frangos de corte em níveis baixos e não patogênicos.
[00125] Para o grupo de controle não desafiado, os níveis de C. perfringens aumentaram ao longo do ensaio. Como indicado acima, C. perfringens é um residente normal da microflora de intestino de frango de corte e, em níveis baixos, as bactérias não afetam o pássaro. Também não é incomum que o conteúdo intestinal de C. perfringens aumente à medida que as aves envelhecem. Os níveis de C. perfringens observados no controle sem desafio ao longo deste estudo foram consistentes com os níveis não patológicos normalmente observados em aves saudáveis.
[00126] No período de pós-desafio, nos dias 21 e 28, aves no grupo desafiado e não medicado apresentaram níveis de C. perfringens significativamente superiores aos demais grupos (Tabela 10). O tratamento com OxBC significativamente e dependente da dose reduziu os níveis de C. perfringens em 2 a 3 ordens de grandeza em relação ao grupo não medicado desafiado em cada ponto de tempo pós-desafio avaliado (dias 21 e 28). Além disso, os níveis de C. perfringens nos grupos de OxBC não foram estatisticamente diferentes dos pássaros não desafiados (Tabela 10).
[00127] O uso de antibióticos também resultou em reduções significativas nos níveis de C. perfringens durante o período pós-desafio. No final do estudo, no dia 28, nenhum C. perfringens foi recuperado de amostras retiradas de aves em qualquer grupo de antibióticos. A abolição completa de C. Perfringens pelos antibióticos está em contraste com os efeitos de OxBC, que manteve níveis de C. perfringens nos níveis normais de não desafio (Tabela 10). Tabela 10. Enumeração de Clostridium perfringens no intestino delgado de frangos de corte
† Os sobrescritos a,b denotam uma diferença estatisticamente significativa *, P < 0,05; **, P < 0,001, ANOVA de um só fator (SPSS 12.0). Os valores médios dos grupos de tratamento com antibióticos (Grupos 6 e 7) foram excluídos da análise estatística porque o número de bactérias Clostridia não foi muito baixo ou detectado. O desvio padrão foi calculado com o valor médio de cada grupo.
[00128] • Este estudo avaliou o efeito preventivo de OxBC em um modelo subclínico de enterite necrótica no frango de corte. Vários parâmetros foram avaliados, incluindo taxa de sobrevivência (mortalidade), sinais clínicos, peso corporal, ganho de peso, lesão intestinal e enumeração bacteriana. OxBC foi avaliado em relação a um grupo de controle não medicado desafiado, um grupo de controle não desafiado, dois grupos de antibióticos (Bacitracina & Virginiamicina).
[00129] • Nenhuma mortalidade foi observada durante o ensaio para qualquer um dos grupos. Isso ocorre porque o estudo empregou um modelo de enterite necrótica subclínica que pretendia apresentar sinais clínicos ou indicadores patológicos em vez de alta característica de taxa de mortalidade de modelos agudos ou clínicos da doença.
[00130] • No período pós-desafio, nos dias 21 e 28, os pássaros em todos os grupos de OxBC apresentaram pesos corporais significativamente maiores (P < 0,05) em comparação com o grupo de controle não medicado desafiado.
[00131] • A gravidade das lesões importante observadas durante o ensaio foi consistente com o nível subclínico do modelo de desafio. A avaliação de lesões nos dias 21 e 28 revelou a presença de vários achados patológicos, tais como hiperemia severa e hemorragias disseminada(s), necrose focal ou ulceração da mucosa intestinal de aves no grupo de controle não medicado desafiado. Em contraste, as aves nos grupos OxBC e antibióticos mostraram classificações de lesões que foram reduzidas em aproximadamente 3 vezes em comparação com o grupo não medicado desafiado. Além disso, a severidade das lesões nos grupos OxBC e antibióticos não diferiu significativamente daqueles observados nas aves de controle não desafiadas. A melhoria nas classificações de lesão intestinal ocorreu em concorrência com uma redução nos níveis de C. perfringens nas fezes de aves alimentadas com OxBC ou antibióticos.
[00132] Este estudo demonstra a capacidade de níveis baixos em parte por milhão de OxBC no alimento para proteger contra os efeitos deletérios da enterite necrótica na saúde e na produtividade dos frangos de corte. Os benefícios de OxBC foram observados no nível de desempenho do crescimento (peso corporal e ganho de peso), saúde intestinal (gravidade reduzida de lesões por NE) e colonização de patógenos (níveis de C. perfringens reduzidos no intestino delgado). O fato que as aves que receberam OxBC realizado, bem como controles saudáveis não contestados, são evidências adicionais dos efeitos protetores do produto.
[00133] Em uma forma de realização, o uso de suplementação dietética de OxBC de 2 a 6 ppm como um aditivo alimentar em fazendas de frangos de corte comerciais pode contribuir a prevenção e melhoria de NE de frango e espera- se que tenha um efeito positivo na melhoria da produtividade durante o período de reprodução.
[00134] O ponto de partida - Carotenoides
[00135] Os carotenoides são pigmentos amarelos, laranja e vermelhos sintetizados por plantas. Existem mais de 600 carotenoides conhecidos que são constituídos por duas classes chamadas carotenos, que são puramente hidrocarbonetos e xantofilas, que são carotenos substituídos por um ou alguns átomos de oxigênio. O β-caroteno e o licopeno são exemplos de carotenos comuns, enquanto a luteína, a zeaxantina e a cantaxantina são exemplos comuns de xantofilas. Os carotenoides mais comuns nas dietas norte americanas são a- caroteno, β-caroteno, β-criptoxantina, luteína, zeaxantina e licopeno.
[00136] Todos os carotenoides são formados a partir de 8 unidades de isopreno e cada molécula de carotenoide contém 40 átomos de carbono. Estruturalmente, os carotenoides assumem a forma de uma cadeia de hidrocarboneto de polietileno, que por vezes é terminada em uma ou ambas as extremidades por um anel. Os carotenoides que contêm anéis de β-inonona não substituídos (incluindo β-caroteno, a- caroteno, β-criptoxantina e Y—caroteno) têm atividade de vitamina A (o que significa que podem ser convertidos em retinal). Em contrapartida, a luteína, a zeaxantina e o licopeno não possuem atividade de vitamina A.
[00137] A cor de carotenoides, variando de amarelo pálido a laranja brilhante a vermelho profundo, é diretamente ligada à sua estrutura. As ligações duplas de carbono-carbono interagem entre si em um processo chamado de conjugação, o que permite que os elétrons da molécula se movam livremente através dessas áreas da molécula e sofrem prontamente transições eletrônicas absorvendo energia na região da luz visível.
[00138] O mesmo sistema de duplas ligações conjugadas que dá origem à intensa cor dos carotenoides também os torna altamente susceptíveis à reação espontânea com oxigênio molecular. Verificou-se que a reação de oxidação ocorre predominantemente pela adição de múltiplas moléculas de oxigênio à molécula de carotenoide para formar produtos de copolímero de carotenoides oxidados [1, 2 e 11]. Por exemplo, o b-caroteno dissolvido em um solvente orgânico adequado (por exemplo, benzeno, acetato de etila), reage com quase 8 equivalentes de oxigênio molecular resultando em um aumento de peso líquido de aproximadamente 30%. O produto, OxBC, é composto principalmente de polímeros (85% em peso) com produtos de degradação de norisoprenoides (15%) proporcionando o equilíbrio.
[00139] A reação espontânea de β-caroteno com oxigênio prossegue predominantemente por adição para formar polímeros com um alto teor de oxigênio. OxBC é o produto de reação total e é composto de produtos de polímero (85%) e de clivagem (15%). Outros carotenoides reagem de forma semelhante, com uma preponderância da formação de produto polimérico.
[00140] A dominância do produto polimérico também se reflete na fórmula empírica de OxBC (Tabela), que difere apenas ligeiramente da fórmula empírica do seu produto polimérico isolado e é consistente com a adição de múltiplas moléculas de O2 por molécula de β-caroteno. O cromatograma de permeação em fase de gel (GPC) (isto é, cromatograma por exclusão de tamanho) de OxBC é dominado por um pico largo que se estende até aproximadamente 8.000 Da. com um PM médio de 900 Da. (Fig. 2A)
[00141] O sistema estendido de ligações duplas conjugadas lineares presentes no β-caroteno é comum a todos os carotenoides, pelo que se espera que outros carotenoides se comportem de forma semelhante nas suas reações espontâneas com oxigênio molecular. A Tabela abaixo mostra que esta expectativa é confirmada, como ilustrado pela comparação dos resultados das oxidações completas de β-caroteno, licopeno, cantaxantina e luteína.
[00142] A comparação dos resultados da oxidação espontânea total por oxigênio de β-caroteno, licopeno, cantaxantina e luteína é ilustrada na tabela a seguir: Tabela 11
n.d. - não determinado.
[00143] Em comum com a oxidação do β-caroteno, estes carotenoides apresentam uma alta absorção de oxigênio, como refletido no aumento geral substancial (>25%) no peso do produto e nas fórmulas empíricas similares, com uma predominância de produtos poliméricos, como mostrado por seus GPCs (Figuras 2B-3D). Além disso, todos os carotenoides completamente oxidados têm espectros de infravermelho (FTIR) (Fig. 3A-3D).
[00144] Verificou-se que o OxBC é capaz de exercer uma capacidade dupla incomum na função imunológica [3-5]. Os dois efeitos são (1) uma capacidade de iniciar e intensificar a função imune inata [2,3] e (2) para limitar o excesso de inflamação [12]. Esses efeitos são independentes de qualquer atividade de vitamina A porque o OxBC está livre de β- caroteno e vitamina A [3] e, além disso, demonstrou falta de capacidade para ativar receptores de ácido retinóico [3].
[00145] A verificação desta atividade decorre do reconhecimento dos produtos poliméricos b-caroteno predominantemente se forma espontaneamente em reação com o oxigênio molecular [2] e que esses produtos são os principais responsáveis pelas atividades imunológicas observadas [3] (ver abaixo).
[00146] Como este tipo de comportamento de oxidação não se limita a β-caroteno sozinho, mas é característico dos carotenoides em geral (ver acima), essas observações fornecem uma base tangível, credível e testável para explicar os efeitos não vitamínicos A de carotenoides de provitamina A (α-, b— e Y—carotenos e B-criptoxantina) e os carotenoides mais numerosos que não podem ser convertidos em vitamina A.
[00147] A triagem preliminar de OxBC usando uma matriz de expressão do gene PGR mostrou um padrão de atividade que indica o potencial para as duas capacidades imunomoduladoras chave (Tabela 3 na ref. [2]). Na primeira capacidade, relacionada à modulação da função imune inata, o OxBC regula positivamente a expressão de genes que codificam produtos que funcionam na sensoreação de patógeno e a detecção de padrões de moléculas associadas a patógenos (PAMPs), incluindo receptores tipo Toll (TLRs) e outras proteínas que atuam como cofatores para a detecção de PAMP, tais como CD14 (agrupamento de diferenciação 14).
[00148] Uma capacidade de iniciar a função imune inata foi corroborada in vitro e in vivo, como indicado pela expressão aumentada dos receptores TLR e CD 14 da membrana plasmática (Figs. 1 e 2 na ref. [3]). Além disso, como será descrito abaixo, um ensaio baseado na expressão do receptor CD14 indica que o produto de polímero é principalmente, se não totalmente, responsável pela atividade de beta-OxC.
[00149] O centro para as ações de intensificação imune do OxBC é a sua capacidade de aumentar o nível de receptores imunes de sensoreação de patógeno, incluindo receptores tipo Toll subtipos 2 (TLR-2 e TLR-4) e CD 14. Estes receptores desempenham o papel vital da detecção e ativação de patógeno do sistema imune inato. Ao aumentar o complemento do hospedeiro dos receptores imunes, o OxBC efetivamente aumenta o nível de vigilância imune para patógenos.
[00150] Para avaliar a capacidade de outros carotenoides para intensificar a imunidade inata, um ensaio foi desenvolvido com base na regulação positiva dos receptores de vigilância imune CD 14 [3]. O licopeno completamente oxidado (OxLyc) foi comparado com o β-caroteno completamente oxidado (OxBC). Embora o licopeno compartilhe o mesmo número de ligações duplas linearmente conjugadas que o β-caroteno, sem os grupos ciclo-hexila em cada extremidade.
[00151] A Fig. 4A mostra uma resposta à dose linear da expressão de CD14 à concentração de OxBC e OxLic, respectivamente, e que suas atividades são essencialmente indistinguíveis. A comparação do produto de licopeno com o produto de b-caroteno indica uma falta de influência dos grupos ciclo-hexila na resposta do receptor imune de CD14.
[00152] A Fig. 4B mostra que é a fração polimérica de OxBC que é o principal responsável pela regulação positiva da expressão de CD14. Esta verificação e as atividades essencialmente equivalentes de OxBC e OxLic no ensaio de CD14 são consistentes com a predominância do produto polimérico em cada um dos carotenoides oxidados e a forte semelhança entre seus espectros de FTIR, indicando a existência de elementos estruturais comuns nos polímeros de carotenoide oxidado.
[00153] A expressão de CD 14 foi quantificada usando análise de FACS. O efeito de cada composto é mostrado em relação a células não tratadas. Os pontos representam o erro médio e padrão de três experimentos separados. (A) O OxLic teve um efeito de dose significativo no conteúdo da superfície do CD14 (p = 0,020) que não era significativamente diferente do efeito do OxBC. (B) A análise de correlação indica um efeito de dose significativo para cada composto na expressão de CD14 com valores p de 0,0036 para OxBC, 0,0034 para o polímero, e 0,0113 para o monômero. A comparação da atividade relativa de cada composto (B) indica que o monômero é significativamente menos ativo do que o polímero (p < 0,001) e OxBC (p <0,01), enquanto não há diferença significativa entre as atividades do polímero e do OxBC. A atividade aparente do monômero pode ser devido à presença de polímeros residuais de peso molecular menor que não podem ser completamente removidos da fração de monômero (da ref. [3]).
[00154] A Importância de Intensificar a Imunidade Inata à Produção pecuária
[00155] As linhas pecuárias modernas foram selecionadas para um crescimento ótimo, eficiências de conversão alimentar e níveis de produção. Concomitante com a seleção genética para maiores potenciais de produção tem sido a redução no potencial imunológico mais caro do metabolismo dos animais. Como consequência, as espécies modernas de gado são susceptíveis à infecção. Esta suscetibilidade, juntamente com ambientes de produção intensos, torna os animais alimentares vulneráveis à infecção por numerosos patógenos. A redução das taxas de crescimento, a eficiência da conversão alimentar e o aumento da mortalidade provocado por infecções representam uma ameaça econômica significativa para a indústria pecuária em todo o mundo. Para tentar mitigar a ameaça que as infecções representam, a indústria voltou-se para o desenvolvimento de ingredientes alimentares com a capacidade de intensificar as defesas imunes inatas do hospedeiro. OxBC representa um tal ingrediente alimentício com a capacidade de impactar de forma benéfica o sistema imune inato do hospedeiro.
[00156] Nesse cenário, a importância das ações de intensificação imune de OxBC pode ser vista. Através da sua capacidade de aumentar o nível de receptores imunes de sensoreação de patógeno, incluindo TLR-2. TLR-4 e CD 14, OxBC pode reforçar o papel vital da detecção e ativação de patógenos do sistema imune inato. Ao aumentar o complemento do hospedeiro dos receptores imunes, o OxBC eficazmente aumenta o nível de vigilância imune para patógenos.
[00157] Esta vigilância aumentada leva a uma detecção, reação e depuração de patógenos em estágio anterior. As respostas imunológicas são metabolicamente dispendiosas e podem tirar recursos de vias de crescimento e produção. Através de seus efeitos sobre a expressão do receptor imune, OxBC proporciona um mecanismo para prevenir infecções em um estágio inicial, limitando assim o escopo e a duração da resposta imunológica e economizando recursos metabólicos. Como resultado, o animal é mantido em estado saudável e os recursos metabólicos podem ser conservados e direcionados para alcançar o potencial de crescimento completo do animal.
[00158] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe para fins de clareza e compreensão, será apreciada por um habilitado na técnica, a partir da leitura da descrição, que podem ser feitas várias mudanças na forma e no detalhe sem se afastar do verdadeiro escopo da invenção nas reivindicações anexas.
[00159] Todas as publicações, as patentes e os pedidos de patente são aqui incorporados por referência na sua totalidade na mesma extensão que se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência na sua totalidade. REFERÊNCIAS 1. Burton, GW, Daroszewski, J, Phipps, J. 1995. Extensively oxidized derivatives of carotenoids, retinoids and related conjugated polyenes useful as non-toxic cell-differentiation inducers, anti-proliferative agents, and anti-tumor agents. Patente US 5.475.006. 2. Burton. GW, Daroszewski, J, Nickerson, JG, Johnston, JB, Mogg, TJ, Nikiforov. GB. 2014. β-Carotene autoxidation: oxygen copolymerization, non-vitamin A products and immunological activity. Can. J. Chem. 92: 305-316. 3. Johnston JB, Nickerson JG, Daroszewski J, Mogg TJ, Burton GW. 2014. Biologically active polymers from spontaneous carotenoid oxidation: a new-frontier in carotenoid ativity. PLoS ONE 9 e111346. 4. Cui B, Liu S, Wang Q, Lin X. 2012. Effect of β- carotene on immunity function and tumour growth in hepatocellular carcinoma rats. Molecules 17: 8595-8603. 5. Shojadoost B, Vince AR, Prescott JF. 2012. The successful experimental induction of necrotic enteritis in chickens by Clostridium perfringens: a critical review. Veterinary research 43: 74. 6. Prescott JF, Sivendra R, Barnum DA. 1978. The use of bacitracin in the prevention and treatment of experimentally-induced necrotic enteritis in the chicken. The Canadian veterinary journal 19: 181-183. 7. Gholamiandehkordi AR, Timbermont L, Lanckrict A, Van Den Broeck W, Pedersen K, Dewulf J, Pasmans F, Haesebrouck F, Ducatelle R, Van Immerseel F. 2007. Quantification of gut lesions in a subclinical necrotic enteritis model. Avian pathology 36, 375-382. 8. Chen CY, Nace GW, Irwin PL. 2003. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of microbiological methods 55, 475-479. 9. Yan F, Zhao Y, Hu Y, Qiu J, Lei W, Ji W, Li X, Wu Q, Shi X, Li Z. 2013. Protection of chickens against infectious bronchitis virus with a multivalent DNA vaccine and boosting with an inactivated vaccine. J Vet Sci. 14:53-60. 10. Antao EM, Glodde S, Li G, Sharifi R, Homeier T, Laturnus C, Diehl I, Bethc A, Philipp HC, Preisinger R, Wieler LH, Ewers C. 2008. The chicken as a natural model for extraintestinal infections caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Microb Pathog. 45:361-369. 11. Burton, G.W., et al., Oxidized carotenoids, retinoids and related conjugated polyenes, and derived fractions and compounds useful as cell-differentiation inducers, cytostatic agents, and anti-tumor agents, em WO 96/05160, W.I.P. Organization, 1996. 12. Duquette, S.C., et al., Anti-inflammatory benefits of retinoids and carotenoid derivatives: retinoic acid and fully oxidized β-carotene induce caspase-3-dependent apoptosis and promote efferocytosis of bovine neutrophils. Am J Vet Res, 2014. 75.
Claims (4)
1. Uso de uma composição compreendendo beta-caroteno totalmente oxidado caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para reduzir a severidade de lesões intestinais associadas com Enterite Necrótica (NE) em aves domésticas.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as aves domésticas são frangos de corte.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o uso compreende administrar uma quantidade eficaz que é de 2 a 30 ppm de dieta.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as aves domésticas são criadas sem antibióticos.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562153587P | 2015-04-28 | 2015-04-28 | |
| US62/153,587 | 2015-04-28 | ||
| PCT/CA2016/050226 WO2016172787A1 (en) | 2015-04-28 | 2016-03-02 | Oxidized carotenoids and components thereof for preventing necrotic enteritis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112017023033A2 BR112017023033A2 (pt) | 2018-09-11 |
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Family
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