ES2903443T3 - Carotenoides oxidados y componentes de los mismos para prevenir la enteritis necrótica - Google Patents

Abstract

Betacaroteno completamente oxidado para su uso en la reducción de la gravedad de las lesiones intestinales asociadas con la enteritis necrótica (NE) en aves de corral, en donde el uso comprende la administración de una cantidad eficaz del betacaroteno completamente oxidado a dichas aves de corral.

Description

DESCRIPCIÓN

Carotenoides oxidados y componentes de los mismos para prevenir la enteritis necrótica

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de betacaroteno completamente oxidado (“OxBC”), y a las composiciones y/o productos que lo comprenden para prevenir y/o reducir el riesgo de desarrollar enteritis necrótica (NE [por sus siglas en inglés]) y mejorar las condiciones asociadas, tales como las condiciones gastrointestinales asociadas.

Antecedentes de la invención

Enteritis necrótica

La enteritis necrótica (NE) suele aparecer en aves de corral, como pollos, patos y pavos. La mayoría de las veces se produce en pollos de engorde entre las 2 y 5 semanas de edad o en gallinas reproductoras y ponedoras entre las 12 y 16 semanas de edad, pero también puede producirse en otros animales como caballos, ovejas, cerdos, bovinos y peces. Puede causar la muerte súbita con o sin signos clínicos o la pérdida de vitalidad, la reducción de la eficiencia de la conversión alimenticia, la pérdida de apetito y del consumo de alimento, la reducción de la ganancia de peso o la pérdida de peso, la diarrea, la hiperemia multifocal, las hemorragias del intestino delgado, la necrosis confluente de la mucosa, la muerte súbita, el aumento de la mortalidad, la reducción de la tasa de crecimiento y la uniformidad. El principal patógeno asociado a la NE es el Clostridium perfringens. Los factores predisponentes incluyen, entre otros, el estrés ambiental, la inmunosupresión, la coccidiosis concurrente causada por la infección con especies de Eimeria, la composición de la dieta, la falta de nutrición, las bacteriocinas, las enzimas colagenolíticas y los factores de adhesión y las cepas productoras de toxinas, como el Clostridium perfringens.

Como se ha señalado anteriormente, la enteritis necrótica (NE) se ha encontrado en muchos animales, incluidas varias aves, como las aves de corral. Se encuentra en gran medida en los pollos de engorde comerciales cuando se producen sin el uso de promotores de crecimiento antimicrobianos.

La tasa de incidencia de la NE en las granjas de producción de pollos de engorde sin antibióticos ha aumentado del 13,6 % en 2008 a cerca del 97,3 % en 2011 (H-K Jang, Universidad Nacional de Chonbuk).

Clostridium perfringens

En poblaciones sanas de pollos de engorde, el C. perfringens suele oscilar entre 102 y 104 unidades formadoras de colonias (CFU, por sus siglas en inglés) por gramo del contenido intestinal del intestino delgado, con niveles que pueden depender de una exposición bacteriana única o acumulativa. El nivel de C. perfringens en las aves afectadas por la NE es más alto, comenzando con la tasa de las aves sanas cuando empiezan a desequilibrarse y subiendo logarítmicamente hasta a veces alcanzar las 107 unidades formadoras de colonias (CFU) por gramo o más cuando alcanzan el peso de mercado.

Los tratamientos actuales incluyen el uso de antibióticos, como las penicilinas (por ejemplo, fenoximetilpenicilina, amoxicilina), que pueden colocarse en el agua para beber, o la bacitracina en el pienso (por ejemplo, 100 ppm). A veces también se utilizan la neomicina y la eritromicina. El curso del tratamiento, por ejemplo, la medicación en el agua suele ser de 3 a 5 días y la medicación en el pienso es de 5 a 7 días, dependiendo de la gravedad.

Los antibióticos, como la penicilina y la bacitracina, también se han utilizado en los piensos como medida preventiva. En muchos países, las normativas locales o las condiciones del mercado impiden el uso rutinario de muchos antibióticos y el uso de piensos sin antibióticos es una tendencia. Por lo tanto, también lo es el aumento de la NE.

Es necesario minimizar los efectos de la NE, como en los pollos de engorde, por ejemplo, protegiéndolos de la infección (por ejemplo, para evitar la NE) o reduciendo los niveles de la bacteria C. perfringens.

JAMES B. JOHNSTON ET AL: “Biologically Active Polymers from Spontaneous Carotenoid Oxidation: A New Frontier in Carotenoid Activity”, PLOS ONE, vol. 9, no. 10, 31 October 2014 (2014-10-31), page e111346, divulga el efecto de los carotenoides oxidados, como el OxBC sobre los patógenos bacterianos. En este documento no se divulga explícitamente un efecto específico sobre la reducción de la gravedad de las lesiones intestinales asociadas a la NE.

Resumen de la invención

En algunos aspectos, la invención proporciona un betacaroteno completamente oxidado (OxBC) para su uso en la reducción de la gravedad de las lesiones intestinales asociadas con la enteritis necrótica (NE) en aves de corral, en donde el uso comprende la administración de una cantidad eficaz del betacaroteno completamente oxidado a dichas aves de corral. En otros aspectos, la invención proporciona una composición que comprende betacaroteno completamente oxidado para su uso en la alimentación animal con el fin de reducir la gravedad de las lesiones intestinales asociadas a la enteritis necrótica en las aves de corral.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención serán evidentes a la vista de la siguiente descripción. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades preferidas de la invención, se dan sólo a modo de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención se harán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

La invención se describirá ahora en relación con los dibujos, en los que:

Figura 1. Ilustra las lesiones intestinales macroscópicas resultantes de la NE, utilizando un método conocido de puntuación de su gravedad, donde: “0” es cuando no hay lesión perceptible a simple vista; “1” es intestino delgado de paredes finas o friable e hiperemia y hemorragias multifocales; “2” es hiperemia y hemorragias severas diseminadas y necrosis focal o ulceración; “3” es intestino de paredes finas, necrosis severa, necrosis de la mucosa confluente; y “4” es intestino de paredes finas, necrosis extensa, exfoliación de la mucosa.

Figura 2. Análisis GPC de p-caroteno completamente oxidado, licopeno, cantaxantina y luteína. (A) OxBC, (B) OxLyc, (C) OxCan y (D) OxLut. La absorbancia UV se controló a 220-400 nm. Donde se muestra, las líneas verticales corresponden a los tiempos de elución de los estándares de peso molecular de poliéter (se muestran los marcadores seleccionados). El corte de la columna es de aproximadamente 10.000 Da. El pico agudo a aproximadamente 5 min en la GPC de OxLyc indica la presencia de polímeros con pesos moleculares > 10.000 Da.

Figura 3. Espectros FTIR de (A) OxBC, (B) OxLyc, (C) OxCan y (D) OxLut, obtenidos utilizando discos de NaCl y una película moldeada a partir de una solución de CHCl3 o discos de KBr.

Figura 4. Determinación de la expresión del receptor CD14 en relación con el OxBC de (A) licopeno completamente oxidado (OxLyc), y (B) fracciones de polímero y monómero norisoprenoide de OxBC. Las células THP-1 fueron tratadas durante 24 horas con las concentraciones indicadas de los compuestos.

Descripción detallada de la invención

“Animal” significa cualquier animal susceptible a la NE, incluyendo, sin limitación, seres humanos, perros, gatos, caballos, ovejas, cerdos, bovinos, aves de corral (incluyendo, sin limitación, gallinas (como pollos de engorde y ponedoras), patos y pavos) y peces.

Por “cantidad suficiente” o “cantidad eficaz” se entiende la cantidad de carotenoides oxidados, como carotenoides transformados oxidativamente o carotenoides completamente oxidados o polímeros de carotenoide-oxígeno, o un componente fraccionado de los mismos, o composiciones que comprenden los mismos necesarios para prevenir y/o mejorar la capacidad de resistir la NE y las condiciones asociadas, recuperar o superar la misma o mantener un estado saludable a la luz de la exposición o la posible exposición a un agente causante de la NE, como C. perfringens. La cantidad eficaz de carotenoide oxidado o de la composición de la invención utilizada para practicar los métodos de la invención varía según la forma de administración, el tipo de animal, el peso corporal y la salud general del animal. En última instancia, el profesional médico que lo atienda, como un médico o veterinario, o el profesional del cuidado de los animales (incluidos los ganaderos, los técnicos, los conocedores o los expertos en la técnica) decidirá la cantidad y el régimen de dosificación adecuados. Dicha cantidad se denomina “cantidad suficiente” o “cantidad eficaz”.

“Condiciones asociadas a la enteritis necrótica” incluyen, pero no se limitan a los síntomas o patologías gastrointestinales, como la reducción del apetito, la reducción de la tasa de ganancia de peso, la reducción de la eficiencia de conversión alimenticia o las lesiones intestinales.

“Carotenoide”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a los pigmentos naturales del grupo de los terpenoides que pueden encontrarse en las plantas, las algas, las bacterias y ciertos animales, como las aves y los mariscos. Los carotenoides incluyen, entre otros, los carotenos, que son hidrocarburos (es decir, sin oxígeno), y sus derivados oxigenados (es decir, las xantofilas). Algunos ejemplos de carotenoides son el licopeno; a-caroteno; Y-caroteno; pcaroteno; la zeaxantina; equinenona; isozeaxantina; astaxantina; cantaxantina; luteína; citranaxantina; el éster etílico del ácido p-apo-8'-carotenoico; hidroxicarotenoides, como alloxantina, apocarotenol, astaceno, astaxantina, capsantina, capsorubina, carotenedioles, carotenetrioles, carotenoles, criptoxantina, p-criptoxantina, decaprenoxantina, epiluteína, fucoxantina, hidroxicarotenonas, hidroxechinenonas, hidroxilicopeno, luteína, licoxantina, neurosporina, fitoeno, fitofluoeno, rodopina, esferoideno, toruleno, violaxantina y zeaxantina; y carotenoides carboxílicos, como ácido apocarotenoico, ácido p-apo-8'-carotenoico, azafrina, bixina, carboxilcarotenos, crocetina, ácido diapocarotenoico, neurosporaxantina, norbixina y ácido licopenoico.

“Copolímero de carotenoide-oxígeno”, “copolímero de carotenoide” y “polímero”, tal y como se utilizan en la presente, se refieren a un carotenoide, que es un compuesto insaturado, que ha sido oxidado en sus dobles enlaces reactivos mediante una reacción espontánea con oxígeno molecular, dando lugar a copolímeros del carotenoide con oxígeno como producto principal y que se separa y aísla de sus subproductos norisoprenoides.

“Carotenoide completamente oxidado”, tal y como se utiliza en la presente, se refiere a un carotenoide, que es un compuesto insaturado, que ha sido completamente oxidado en sus dobles enlaces reactivos por reacción espontánea con el oxígeno molecular, dando lugar a una mezcla de copolímeros del carotenoide con el oxígeno y productos de descomposición norisoprenoides. El carotenoide completamente oxidado utilizado en la presente invención es el OxBC, p-caroteno completamente oxidado. Otros carotenoides completamente oxidados descritos son el OxLyc, licopeno completamente oxidado; el OxLut, luteína totalmente oxidada; y el OxCan, cantaxantina totalmente oxidada producida a partir de la oxidación del carotenoide original aislado, que se denomina derivado sintético en contraposición a los productos de origen natural.

El “betacaroteno completamente oxidado” (“OxBC”), al que a veces se hace referencia en la literatura bajo la marca OxC-beta™ de Avivagen Inc.) es la mezcla compleja de productos formada por la oxidación completa y espontánea del pcaroteno y contiene una preponderancia de compuestos de copolímero de p-caroteno-oxígeno. Tal y como se utiliza en la presente, se refiere a una composición de carotenoides totalmente oxidada derivada del producto sintético y comercial del p-caroteno puro, que comprende aproximadamente el 85 % en peso de copolímeros de p-caroteno-oxígeno y aproximadamente el 15 % de productos de descomposición de bajo peso molecular llamados norisoprenoides.

“Natural” o “de origen natural”, tal y como se utiliza en la presente, se refiere a fuentes vegetales (incluyendo plantas o partes de las mismas, en donde las partes de las mismas pueden incluir, pero no se limitan a, semillas, hojas y tallos, frutas o verduras) o microorganismos. “Producto natural” o “producto de origen natural” se refiere a los productos derivados del procesamiento de fuentes naturales de carotenoides oxidados, como los copolímeros de carotenoide-oxígeno y las composiciones que los comprenden. Se derivan del procesamiento de fuentes naturales en condiciones de polimerización oxidativa. Dichas fuentes naturales pueden incluir, pero no están necesariamente limitadas a: zanahorias, tomate, alfalfa, espirulina, rosa mosqueta, pimiento dulce, pimiento picante, pimentón, boniato, col rizada, espinacas, algas, agropiro, caléndula, moringa oleifera y aceite de palma rojo.

“Carotenoide transformado oxidativamente” se refiere a un carotenoide que ha reaccionado con hasta 6 a 8 equivalentes molares de oxígeno, o con una cantidad equivalente de oxígeno procedente de otro agente oxidante, lo que da lugar a una mezcla de productos de escisión oxidativa de muy bajo peso molecular y a una gran proporción de material oligomérico (es decir, aquel componente del carotenoide transformado oxidativamente que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 90o daltons). La reacción resultante produce una mezcla que incluye especies moleculares con pesos moleculares que oscilan entre aproximadamente 100 y 8.000 daltons. Se cree que el material oligomérico se forma por las numerosas recombinaciones químicas posibles de los diversos fragmentos oxidativos que se forman. Los métodos de fabricación de carotenoides transformados oxidativamente se describen en la patente estadounidense núm. 5,475,006 y en la solicitud de patente estadounidense núm. 08/527,039.

“Carotenoide oxidado” incluye un carotenoide que ha sido oxidado, como el “carotenoide transformado oxidativamente”, el “carotenoide completamente oxidado” y el “copolímero de carotenoide-oxígeno” y los componentes de los mismos que dan lugar a las actividades deseadas, las composiciones y los productos que los contienen, como los productos y las composiciones que contienen carotenoide-oxígeno.

Por “composición farmacéutica” se entiende una composición que contiene carotenoides oxidados, carotenoides transformados oxidativamente, carotenoides completamente oxidados o un componente fraccionado de los mismos o un copolímero de carotenoide-oxígeno o un producto que contiene un copolímero de carotenoide-oxígeno, y que está formulada con uno o más excipientes de grado farmacéutico de manera que se ajusta a los requisitos de un organismo gubernamental que regula la fabricación y venta de productos farmacéuticos como parte de un régimen terapéutico para el tratamiento o la prevención de enfermedades en un mamífero (por ejemplo, fabricado de acuerdo con las normas GMP y adecuado para su administración a un ser humano). Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas, por ejemplo, para la administración oral en forma de dosis unitaria (por ejemplo, un comprimido, una cápsula, un comprimido oblongo, una cápsula de gelatina o un jarabe); para la administración tópica (por ejemplo, como una crema, un gel, una loción o una pomada); para la administración intravenosa (por ejemplo, como una solución estéril libre de émbolos de partículas y en un sistema de disolventes adecuado para el uso intravenoso); o cualquier otra formulación descrita en la presente.

“Carotenoides provitamina A” o “PVA” (por sus siglas en inglés) se refiere a aquellos carotenoides, concretamente a-, py Y-carotenos y p-criptoxantina, que son capaces de convertirse por oxidación en vitamina A. “OxPVA” se refiere a los carotenoides provitamina A oxidados.

“Tratar” se refiere a la administración de una composición con fines profilácticos y/o terapéuticos. “Prevenir la enfermedad” se refiere al tratamiento profiláctico de un animal que todavía no está enfermo, pero que es susceptible de padecer una enfermedad particular o que corre el riesgo de padecerla. “Tratar la enfermedad” o uso para un “tratamiento terapéutico” se refiere a la administración de un tratamiento a un animal que ya padece una enfermedad para mejorar o estabilizar su estado. Así, en las reivindicaciones y realizaciones, tratar es la administración a un animal con fines terapéuticos o profilácticos. La terapia de acuerdo con la invención puede realizarse sola o junto con otra terapia. Tal como se utiliza en la presente, “en riesgo” se refiere a los animales propensos a la mala salud, enfermedad, susceptibilidad a las infecciones, problemas de movilidad de las articulaciones, reducción de los niveles de actividad y/o mala calidad del pelaje.

Carotenoides oxidados

Los carotenoides de la dieta tienen diversos beneficios para la salud. Los diversos carotenoides provitamina A, incluidos los a- y p-carotenos y la p-criptoxantina, proporcionan beneficios relacionados con sus actividades de vitamina A. Sin embargo, son menos fáciles de explicar otros beneficios no relacionados con la vitamina A de los carotenoides provitamina A y de otros carotenoides que no pueden convertirse en vitamina A.

Los carotenoides son pigmentos amarillos, naranjas y rojos sintetizados por las plantas. Hay más de 600 carotenoides conocidos que se componen de dos clases llamadas carotenos, que son puramente hidrocarburos, y xantofilas, que son carotenos sustituidos con uno o unos pocos átomos de oxígeno. El p-caroteno y el licopeno son ejemplos de carotenos comunes, mientras que la luteína, la zeaxantina y la cantaxantina son ejemplos comunes de xantofilas. Los carotenoides más comunes en las dietas norteamericanas son el a-caroteno, el p-caroteno, la p-criptoxantina, la luteína, la zeaxantina y el licopeno.

Todos los carotenoides están formados por 8 unidades de isopreno y cada molécula de carotenoide contiene 40 átomos de carbono. Estructuralmente, los carotenoides adoptan la forma de una cadena de hidrocarburos de polieno, que a veces está terminada en uno o ambos extremos por un anillo. Los carotenoides que contienen anillos de p-ionona no sustituidos (incluidos el p-caroteno, el a-caroteno, la p-criptoxantina y el Y-caroteno) tienen actividad de vitamina A (lo que significa que pueden convertirse en retina). En cambio, la luteína, la zeaxantina y el licopeno no tienen actividad de vitamina A.

Tradicionalmente, las actividades no relacionadas con la vitamina A se han atribuido a las acciones del propio carotenoide, a menudo como antioxidante. Sin embargo, investigaciones recientes ponen en duda el papel antioxidante, al menos en lo que respecta a la inhibición de la carcinogénesis, y apuntan al funcionamiento de otros mecanismos.

Aunque se sabe desde hace tiempo que la adición de oxígeno se ve inherentemente favorecida en la oxidación espontánea de compuestos altamente insaturados, la participación predominante y la importancia de la polimerización oxidativa de los carotenoides habían escapado sorprendentemente a la atención antes de los informes de los inventores (véase también US 5,475,006; US 7,132,458; US 8,211,461; US 2011-0217244; US 2013-0131183; y US 2013-0156816). Además, los estudios con una composición de p-caroteno totalmente oxidada (denominada OxBC, el ingrediente activo de los productos de marca OxC-beta™ de Avivagen Inc.) obtenida por reacción espontánea del p-caroteno con oxígeno en un disolvente, así como con el licopeno completamente oxidado formado de forma análoga, han revelado que la fracción polimérica es responsable de la actividad inmunológica, que incluye la capacidad de cebar y mejorar la función inmunitaria innata, así como de limitar los procesos inflamatorios. El sistema ampliado de dobles enlaces conjugados lineales presente en el p-caroteno es común a todos los carotenoides, por lo que es de esperar que otros carotenoides se comporten de forma similar en sus reacciones espontáneas con el oxígeno molecular y puedan explicar los efectos no vitamínicos de los carotenoides provitamina A (a-, p- y Y-carotenos y p-criptoxantina) y de los más numerosos carotenoides que no pueden convertirse en vitamina A.

Además, dada la ubicuidad de los carotenoides, incluido y especialmente el p-caroteno, y su conocida susceptibilidad a la pérdida durante el procesamiento de los alimentos, no está claro si la oxidación y, en particular, la copolimerización se produce de forma natural en los alimentos y pueden ser la causa de esta pérdida, y en qué medida.

Los inventores han descubierto alimentos (como fuentes vegetales) que contienen copolímeros de carotenoide-oxígeno, tal como se describe en la presente, con actividades inmunológicas anticipadas no relacionadas con la vitamina A. Por ejemplo, en un ejemplo como el descrito en la presente, la naturaleza química del compuesto aislado del polvo de zanahoria (originalmente rico en p-caroteno) se confirmó comparando los datos de análisis elemental, GPC, IR, termólisis GC-MS y UV con los de OxBC. Los datos del análisis elemental, IR y GPC de los compuestos aislados de la misma manera de otros alimentos secos apoyaron su naturaleza de copolímero-oxígeno.

El ácido geránico, un marcador de bajo peso molecular de la presencia de copolímeros de p-caroteno-oxígeno, se encuentra en alimentos comunes frescos o secos, como zanahorias, tomates, boniatos, pimentón, rosa mosqueta, algas, alfalfa y leche, en niveles que abarcan un intervalo de aproximadamente mil veces, desde partes bajas por billón en alimentos frescos hasta partes por millón en alimentos secos. Los copolímeros aislados de algunos alimentos secos, como la zanahoria en polvo, el tomate en polvo, la espirulina en polvo, la rosa mosqueta en polvo, el pimentón en polvo, las algas en polvo y la hierba de trigo en polvo, alcanzan niveles de partes por mil, comparables a los niveles originales de carotenoides. La actividad biológica in vivo de los copolímeros de p-caroteno-oxígeno suplementarios se ha documentado previamente a niveles de partes por millón, lo que sugiere que ciertos alimentos tienen dicha actividad.

El hallazgo de los presentes inventores de que la oxidación y los productos de reacción asociados se encontrarían dentro del entorno mucho más complejo en el que los carotenoides se producen de forma natural, es decir, en ciertas fuentes vegetales, como frutas y verduras y ciertos microorganismos (algas, hongos y bacterias) no era obvio ni predecible a la luz del complejo microentorno y de los muchos otros compuestos potencialmente reactivos en el material biológico que podrían desviar cualquier reacción de oxidación incipiente de carotenoides por una miríada de otras vías con diferentes resultados de productos.

En un ejemplo descrito, los productos de copolímero de carotenoide-oxígeno aislados de esta manera a partir de alimentos secos derivados de plantas no contienen los otros productos de descomposición de carotenoides de bajo peso molecular previstos (por ejemplo, que incluyen el ácido geránico en productos que se espera que contengan compuestos de descomposición de la oxidación del p-caroteno). Esto es distinto de los carotenoides completamente oxidados (como OxBC, OxLyc, OxLut u OxCan), que sí contienen dichos productos.

En otro ejemplo, la fuente vegetal se selecciona del grupo que consiste en: zanahorias, tomate, alfalfa, espirulina, rosa mosqueta, pimiento dulce, pimiento picante, pimentón, boniato, col rizada, espinacas, algas, hierba de trigo, caléndula, moringa oleifera y aceite de palma rojo. En otra realización, las fuentes son productos vegetales en polvo, por ejemplo, zanahoria en polvo, tomate en polvo, espirulina en polvo, rosa mosqueta en polvo, pimentón en polvo, algas en polvo y hierba de trigo en polvo.

En un ejemplo, la fuente de microorganismos se selecciona del grupo que consiste en: bacterias, levaduras, hongos y algas, como la espirulina44 y las formas genéticamente modificadas de la misma que mejoran los carotenoides y, por tanto, el potencial de los copolímeros de carotenoide-oxígeno. En algunas otras realizaciones, los microorganismos se seleccionan del grupo de las siguientes especies: Algas: Spirulina, Dunaliella, Haematococcus, Murielopsis. Hongos: Blakeslea trispora. Levaduras: Xanthophyllomyces dendrorhous, Rhodotorula glutinis. Bacteria: Sphingomonas.

El descubrimiento por parte de los inventores de que los compuestos copolímeros OxBC p-caroteno-oxígeno, tal y como se utilizan en los Ejemplos, son beneficiosos en los usos, métodos, composiciones y kits descritos en la presente, lleva a esperar que los homólogos copolímeros en los alimentos impartan bioactividades con implicaciones similares para la salud. La oxidación in situ de los carotenoides de la dieta resultante de los procesos oxidativos desencadenados durante la digestión de la fruta o las verduras también podría explicar, al menos parcialmente, la actividad variable y varias veces inferior de la vitamina A del p-caroteno en los alimentos en comparación con el p-caroteno de los suplementos. La destrucción oxidativa del p-caroteno y la pérdida de actividad percibida podrían ser en realidad una ganancia de actividad inmunológica a través de la formación de copolímeros.

Los presentes inventores han desarrollado una forma de mejorar la cantidad de copolímero de carotenoide-oxígeno en una fuente y/o tener una fuente con cantidades conocidas y consistentes de copolímero de carotenoide-oxígeno para facilitar la dosificación consistente a cantidades efectivas conocidas para lograr los resultados deseados.

Además, la presente invención permite producir productos que comprenden copolímeros de oxígeno de carotenoides in situ sin partir de carotenoides aislados como fuente y proporcionar productos que comprenden niveles consistentes de copolímeros de oxígeno de carotenoides que tienen beneficios animales resultantes descritos en la presente, incluyendo los relacionados con la NE. En un aspecto, los copolímeros de carotenoide-oxígeno de fuentes naturales no comprenden (o comprenden mínimamente) productos de descomposición.

Métodos y usos

Como se describe en la presente, los ejemplos tienen varias aplicaciones en relación con el uso de carotenoides oxidados o composiciones o productos que contienen carotenoides oxidados, como carotenoides transformados oxidativamente, carotenoides completamente oxidados (como OxBC), componentes de los mismos o componentes fraccionados de los mismos, como componentes que comprenden un copolímero de carotenoide-oxígeno que contiene un componente. Incluyen, pero no se limitan, a las siguientes aplicaciones:

A. Restauración de la ganancia de peso.

El ejemplo descrito ilustra que los carotenoides oxidados o las composiciones o productos que contienen carotenoides oxidados, como los carotenoides transformados oxidativamente, los carotenoides completamente oxidados (como OxBC), los componentes de los mismos o los componentes fraccionados de los mismos, como los componentes que comprenden un copolímero de carotenoide-oxígeno que contiene un componente, como OxBC, pueden utilizarse para mejorar el peso corporal medio final a niveles bajos de partes por millón (ppm) en el pienso, con la restauración del nivel del grupo de aves no expuestas. En un ejemplo descrito, la invención proporciona un método para utilizar carotenoides oxidados o composiciones o productos que contienen carotenoides oxidados, como carotenoides transformados oxidativamente, carotenoides completamente oxidados (como OxBC), componentes de los mismos o componentes fraccionados de los mismos, como componentes que comprenden un copolímero de carotenoide-oxígeno que contiene un componente, como OxBC para proteger contra las pérdidas de productividad causadas por cargas de enfermedades subclínicas asociadas con C. perfringensy/o la NE, en pollos de engorde. Se pueden utilizar carotenoides oxidados o composiciones o productos que contengan carotenoides oxidados, como carotenoides transformados oxidativamente, carotenoides completamente oxidados (como OxBC), componentes de los mismos o componentes fraccionados de los mismos, como componentes que contengan un copolímero de carotenoide-oxígeno, como OxBC, tal como se describe en la presente, para “restaurar” el aumento de peso al nivel que se habría producido si no hubiera habido enfermedad, NE o infección por C. perfringens.

B. Protección de las lesiones intestinales.

Las puntuaciones de las lesiones intestinales debidas a la infección por NE se aliviaron significativamente en los grupos de tratamiento con OxBC en comparación con el grupo de aves no medicadas, siendo el grupo de 2 ppm de OxBC el que mostró la mayor mejora. Como se describe en la presente, los ejemplos tienen varias aplicaciones en relación con el uso de carotenoides oxidados o composiciones o productos que contienen carotenoides oxidados, como carotenoides transformados oxidativamente, carotenoides completamente oxidados (como OxBC), componentes de los mismos o componentes fraccionados de los mismos, como componentes que comprenden un copolímero de carotenoide-oxígeno que contiene un componente.

En algunos aspectos, la invención proporciona un betacaroteno completamente oxidado (OxBC) para su uso en la reducción de la gravedad de las lesiones intestinales asociadas con la enteritis necrótica (NE) en aves de corral, en donde el uso comprende la administración de una cantidad eficaz del betacaroteno completamente oxidado a dichas aves de corral. La invención también proporciona una composición que comprende betacaroteno completamente oxidado para su uso en la alimentación animal con el fin de reducir la gravedad de las lesiones intestinales asociadas a la enteritis necrótica en las aves de corral.

C. Reducción de la carga de patógenos.

El número de bacterias C. perfringens en las heces fue reducido por OxBC, en un patrón dependiente de la dosis. Por lo tanto, la invención puede utilizarse para mantener el equilibrio de las bacterias en el intestino, como el intestino de un pollo de engorde, y evitar el crecimiento excesivo de la bacteria C. perfringens.

D. Prevención y mejora de la NE.

Niveles bajos de ppm de carotenoides oxidados o composiciones o productos que contengan carotenoides oxidados, como carotenoides transformados oxidativamente, carotenoides completamente oxidados (como OxBC), componentes de los mismos o componentes fraccionados de los mismos, como componentes que contengan un copolímero de carotenoide-oxígeno, o en una realización OxBC, en los piensos pueden contribuir a la prevención y mejora de la NE en la cría comercial de pollos de engorde y se espera que tengan un efecto positivo en la mejora de la productividad durante el periodo de alimentación.

E. Uso de carotenoides oxidados o composiciones o productos que contienen carotenoides oxidados, como carotenoides transformados oxidativamente, carotenoides completamente oxidados (como OxBC), componentes de los mismos o componentes fraccionados de los mismos, como componentes que comprenden un copolímero de carotenoide-oxígeno que contiene un componente en lugar de antibióticos para controlar la NE y la infección por C. perfringens.

En un ejemplo, se proporciona un método para mantener a las aves de corral (como las pollos de engorde) en buen estado de salud (como un estado de salud no expuesto) frente a una exposición, como la NE y C. perfringens, utilizando carotenoides oxidados o composiciones o productos que contienen carotenoides oxidados, como carotenoides transformados oxidativamente, carotenoides completamente oxidados (como OxBC), componentes de los mismos o componentes fraccionados de los mismos, como componentes que comprenden un componente que contiene copolímero de carotenoide-oxígeno en lugar de un antimicrobiano. El uso de antimicrobianos en el ganado avícola se ha asociado ampliamente con los residuos de medicamentos en los alimentos y la propagación de patógenos resistentes a los antibióticos en los alimentos y el medio ambiente. En consecuencia, se presiona a los productores de aves de corral para que reduzcan el uso de antibióticos. Los carotenoides oxidados o composiciones o productos que contienen carotenoides oxidados, como carotenoides transformados oxidativamente, carotenoides completamente oxidados (como OxBC), componentes de los mismos o componentes fraccionados de los mismos, como componentes que comprenden un copolímero de carotenoide-oxígeno que contiene un componente. En una realización, el OxBC ha demostrado en la presente que no tiene propiedades bactericidas ni bacteriostáticas y que, por lo tanto, no es un antimicrobiano, lo que lo convierte en una alternativa útil a los antibióticos para la prevención o el control de la NE y de C. perfringens en las aves de corral, como los pollos de engorde.

Animales

El método descrito puede utilizarse en animales, particularmente en aves de corral y, en otra realización, en pollos de engorde, ponedoras y pavos, que son susceptibles a la exposición de C. perfringens y/o NE.

Carotenoides oxidados, como OxBC, composiciones y modos de administración y kits

El OxBC es el producto de la autoxidación completa del betacaroteno, un proceso que da lugar a una nueva composición libre de betacaroteno, vitamina A o actividad agonista del receptor del ácido retinoico. Se forma predominantemente mediante un proceso de copolimerización con oxígeno que da lugar a un producto bien definido y constantemente reproducible, compuesto en gran parte por copolímeros de p-caroteno-oxígeno.

Estructuralmente, los polímeros OxBC parecen ser una forma menos polimerizada de la esporopolenina, un biopolímero que se encuentra en las paredes de la exina de las esporas y los pólenes. Desde entonces, se ha identificado que los polímeros se forman a partir de la autoxidación de múltiples carotenoides, incluyendo no sólo el betacaroteno, sino también, la cantaxantina, la luteína y el licopeno. Es de esperar que otros carotenoides, como la astaxantina, sufran predominantemente el mismo proceso de polimerización.

Los análisis químicos indican que la versión sintetizada es altamente análoga a los polímeros que se encuentran de forma natural en diferentes alimentos, piensos y forrajes (datos no publicados; manuscrito en preparación).

El OxBC se produce en cantidad calentando una solución de betacaroteno sintético en un disolvente “GRAS”, en una atmósfera de oxígeno puro hasta que la absorción de oxígeno se hace muy lenta al alcanzar un punto final definido. Se han establecido métodos de control de calidad de la fabricación y la capacidad de producción del activo puro (actualmente destinado a aplicaciones en la alimentación del ganado) es ahora de decenas de toneladas métricas al año. El OxBC se suministró para su uso en pollos de engorde como un concentrado al 10 %, producido mediante el secado por pulverización de una solución de OxBC sobre almidón de maíz para formar un producto “premezclado” consistente. Podrían utilizarse concentraciones mayores o menores del ingrediente activo para molerlo en piensos u otras preparaciones de dosificación a los niveles de administración deseados. Otros carotenoides completamente oxidados pueden prepararse de forma similar.

El OxBC puede, al igual que otros carotenoides oxidados, formularse junto con el pienso o administrarse por separado del pienso, al mismo tiempo o no.

En una realización, el OxBC o la composición que contiene OxBC se administra o alimenta en una cantidad eficaz sobre la ingesta libre de alimentos del animal. En una realización, el OxBC o la composición que contiene OxBC se administra o alimenta libremente o a intervalos o en otra realización, una vez al día, en otra realización dos veces al día, en otra realización varias veces al día y en la que la cantidad de OxBC se ajusta a la cantidad deseada dependiendo de los patrones de alimentación de los animales.

En una realización, la cantidad de OxBC es de 2 ppm a 30 ppm o, en otra realización, de 2 a 15 ppm, a 10 ppm, a 8 ppm o a 6 ppm, suministrada en intervalos cortos. Otra realización preferida sugiere, a partir de los resultados experimentales, que de 2 ppm a 4 ppm suministradas diariamente durante un intervalo más largo pueden proporcionar el efecto óptimo, preservando al mismo tiempo la rentabilidad para el productor avícola. PPM se refiere a partes de ingrediente activo (por ejemplo, carotenoide oxidado) por millón de partes de dieta o pienso.

El OxBC puede administrarse por cualquier medio que produzca el contacto de dicho agente activo con los sitios de acción del agente en el cuerpo de un sujeto o paciente para producir un efecto terapéutico, en particular un efecto beneficioso, más particularmente un efecto beneficioso sostenido. Los principios activos pueden administrarse simultánea o secuencialmente y en cualquier orden en diferentes momentos para proporcionar los efectos beneficiosos deseados. Un compuesto y una composición de la invención pueden formularse para su liberación sostenida, para su administración local o sistémica. Está dentro de la capacidad de un médico o veterinario experto seleccionar una forma y ruta de administración que optimice los efectos de las composiciones y tratamientos de la presente invención para proporcionar efectos terapéuticos, en particular efectos beneficiosos, más particularmente efectos beneficiosos sostenidos.

En una realización, la administración de OxBC incluye cualquier modo que produzca el contacto de dicho agente activo con los sitios de acción del agente in vivo o en el cuerpo del pollo de engorde u otro animal, para producir el efecto deseado o terapéutico, según sea el caso. Como tal, incluye la administración de OxBC directamente o a través de un modo de entrega, por ejemplo, formulaciones de liberación sostenida, vehículos de entrega que resultan en la entrega dirigida al intestino o al sitio deseado en el cuerpo. En una realización, el OxBC o las composiciones que contienen OxBC pueden utilizarse en aproximadamente 1-30 ppm como una realización, en otra realización 2 semanas a 30 ppm, en otra realización de 2-6 ppm para “uso continuo” (inclusión en una dieta normal), o como se describe en la presente. Las sustancias descritas anteriormente pueden formularse en composiciones adecuadas para su administración a los animales, como los pollos de engorde, en una forma biológicamente compatible y adecuada para administración in vivo. Por “forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo" se entiende una forma de la sustancia que se va a administrar en la que cualquier efecto tóxico se ve compensado por los efectos terapéuticos. Las sustancias pueden administrarse a organismos vivos, incluyendo animales como las aves de corral, en otra realización, pollos, en otra realización pollos de engorde, ponedoras o pavos.

Por lo tanto, un ejemplo proporciona el uso de carotenoides oxidados o composiciones o productos que contienen carotenoides oxidados, como carotenoides transformados oxidativamente, carotenoides completamente oxidados (como OxBC), componentes de los mismos o componentes fraccionados de los mismos, como componentes que comprenden un copolímero de carotenoide-oxígeno que contiene un componente en la preparación de un medicamento para las aplicaciones señaladas en la presente. En una realización, una cantidad terapeuticamente eficaz de OxBC o una composición farmacéutica como la descrita en la presente se administra a un paciente en necesidad de la misma. Un paciente en necesidad de la misma es un animal de corral que puede beneficiarse de OxBC o de composiciones que contienen OxBC y de sus efectos, tal como se describe en la presente.

El principio activo puede administrarse de forma conveniente, como por inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación en las mucosas, aplicación tópica, aplicación transdérmica, aplicación gástrica, aplicación entérica o administración rectal. Dependiendo de la vía de administración, el principio activo puede estar recubierto de un material para proteger el compuesto de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto. En una realización, el OxBC o las composiciones que contienen OxBC se administran a través de la alimentación de un animal o mediante otras técnicas conocidas en la técnica.

Las composiciones descritas en la presente pueden prepararse mediante métodos conocidos per se para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que pueden administrarse a los sujetos, de manera que una cantidad eficaz del principio activo se combina en una mezcla con un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o portadores adecuados se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 1985 o en Remington's The Sciences and Practice of Pharmacy, 21st edition”, (University of the Sciences in Philadelphia, 2005) o en Handbook of Pharmaceutical Additives (compilado por Michael e Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, England (1995)). Sobre esta base, las composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones de las sustancias en asociación con uno o más vehículos, portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y pueden estar contenidas en soluciones amortiguadas con un pH adecuado y/o ser iso-osmóticas con fluidos fisiológicos. A este respecto, puede hacerse referencia a la patente estadounidense núm. 5,843,456.

Piensos y productos alimenticios, suplementos y premezclas

En una realización, la invención proporciona piensos (piensos para aves de corral) o productos alimenticios que comprenden OxBC o composiciones que contienen OxBC, que pueden mezclarse con un producto alimenticio y suministrarse al animal en una cantidad eficaz para reducir la gravedad de las lesiones intestinales asociadas a la enteritis necrótica en aves de corral.

En la preparación de un producto alimento de la invención, el OxBC o la composición que contiene OxBC se mezcla opcionalmente con un agente volumétrico antes de añadirlo al producto alimenticio. Los agentes de carga incluyen, sin limitación, almidón, proteínas, grasas y mezclas de los mismos. Es deseable que el agente volumétrico se seleccione entre el almidón de maíz, suero de leche, harina, azúcar, harina de soja, maltodextrina y goma guar. El producto alimenticio de la invención también puede incluir antioxidantes para evitar una mayor oxidación del carotenoide transformado oxidativamente o de un componente del mismo. La oxidación puede evitarse mediante la introducción de antioxidantes naturales, como la vitamina E, la vitamina C y el tocoferol, o de antioxidantes sintéticos, como el butilhidroxitolueno, el butilhidroxianisol, la terbutilhidroquinona, el galato de propilo o la etoxiquina en el producto alimenticio. La cantidad de antioxidantes incorporados de esta manera depende de requisitos tales como la formulación del producto, las condiciones de envío, los métodos de envasado y la vida útil deseada.

Los productos alimenticios de la invención son piensos para aves de corral (por ejemplo, piensos para pavos, piensos para pollos de engorde o piensos para ponedoras).

Los piensos se formulan generalmente para proporcionar nutrientes de acuerdo con las normas de la industria. Los piensos pueden formularse a partir de una variedad de ingredientes diferentes, que se eligen en función del precio y la disponibilidad del mercado. Por consiguiente, algunos componentes de los piensos pueden cambiar con el tiempo. Para las discusiones sobre las formulaciones de los alimentos para animales y las directrices del NRC, véase Church, Livestock Feeds and Feeding, O&B Books, Inc., Corvallis Oreg. (1984) y Feeds and Nutrition Digest, Ensminger, Oldfield y Heineman eds., Ensminger Publishing Corporation, Clovis, Calif. (1990).

Pueden añadirse otros ingredientes a los piensos según sea necesario para promover la salud y el crecimiento del animal. Los ingredientes incluyen, sin limitación, azúcares, carbohidratos complejos, aminoácidos (por ejemplo, arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, tirosina, alanina, ácido aspártico, glutamato de sodio, glicina, prolina, serina y cisteína, entre otros), vitaminas (por ejemplo, tiamina, riboflavina, piridoxina, niacina, niacinamida, inositol, cloruro de colina, pantotenato de calcio, biotina, ácido fólico, ácido ascórbico y vitaminas A, B, K, D y E, entre otras), minerales, proteínas (por ejemplo, harina de carne, harina de pescado, huevo líquido o en polvo, solubles de pescado, concentrado de proteína de suero), aceites (por ejemplo, aceite de soja), almidón de maíz, calcio, fosfato inorgánico, sulfato de cobre y cloruro de sodio. También puede añadirse al pienso cualquier ingrediente medicinal conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, antibióticos y hormonas. Para la suplementación con vitaminas, minerales y antibióticos de los alimentos para animales, véase Church, Livestock Feeds and Feeding, O&B Books, Inc., Corvallis Oreg. (1984).

Cualquier mezcla de alimentos para animales conocida en la técnica puede utilizarse de acuerdo con la presente invención, incluyendo, sin limitación, forrajes, como hierba de huerta, fleo, festuca alta, raigrás, alfalfa, esparceta, tréboles y vezas, alimentos en grano, como maíz, trigo, cebada sorgo, triticale, centeno, canola y soja, residuos de cultivos, granos de cereales, subproductos de legumbres y otros subproductos agrícolas. En situaciones en las que el pienso resultante vaya a ser procesado o conservado, el pienso puede ser tratado con carotenoide transformado oxidativamente, un componente del mismo, o carotenoide transformado oxidativamente fraccionado antes de su procesamiento o conservación. Deseablemente, el pienso de la invención incluye harina de colza, harina de algodón, harina de soja o harina de maíz.

El procesamiento puede incluir el secado, ensilado, troceado, peletización, corte en cubos, enfardado, el laminado, templado, molienda, el craqueo, estallido, extrusión, micronización, tostado, descascarillado, cocción y/o explosión. Por ejemplo, los piensos peletizados se crean mezclando primero los componentes de los piensos y luego compactando y extruyendo los componentes de los piensos a través de una matriz con calor y presión. Los piensos de la invención pueden granularse como se describe, por ejemplo, en MacBain, Pelleting Animal Feed, American Feed Manufacturers Association, Arlington, Va. (1974).

La presente invención se describe en los siguientes ejemplos, que se exponen para ayudar a la comprensión de la invención, y no deben interpretarse para limitar en modo alguno el alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones que siguen a continuación.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Preparación de betacaroteno completamente oxidado (OxBC)

El OxBC es el producto de la autoxidación completa del betacaroteno, un proceso que da lugar a una composición libre de betacaroteno, vitamina A o actividad agonista del receptor del ácido retinoico. Se forma predominantemente mediante un proceso de copolimerización con oxígeno que da lugar a un producto bien definido y constantemente reproducible, compuesto en gran parte por copolímeros de p-caroteno-oxígeno que se describe más detalladamente en Burton et al. (1995 y 2014). Estructuralmente, los polímeros OxBC parecen ser una forma menos polimerizada de la esporopolenina, un biopolímero que se encuentra en las paredes de la exina de las esporas y los pólenes.

Ejemplo 2 - Preparación de piensos para animales con OxBC

Los piensos para animales utilizados en esta invención, preparados mediante la incorporación de OxBC como premezcla al 10 % (p/p) con los demás ingredientes del pienso, contenían lo siguiente:

T l 1. F rm l l i n m r i l l iliz n i

Sustancias utilizadas:

■ OxBC (Avivagen, Canadá), grupos 3, 4 y 5 (Tabla 4) Bacitracina (BS Bacitrex 100, Corea), grupo 6 (Tabla 4).

■ Virginiamycin (Stafac-20, Bayer Korea, Corea), grupo 7 (Tabla 4).

■ Las sustancias se añadieron a la dieta comercial basal como se indica en la Tabla 4.

Ejemplo 3 - Efecto preventivo de OxBC en el modelo de exposición a la enteritis necrótica en pollos de engorde

La enteritis necrótica (NE) se ha encontrado en gran medida en los pollos de engorde comerciales cuando se producen sin el uso de promotores de crecimiento antimicrobianos. Este estudio de referencia se diseñó para evaluar el efecto preventivo de OxBC (producto OxC-beta™ Livestock de Avivagen Inc., Canadá) en un modelo de enteritis necrótica subclínica en pollos de engorde. Se evaluó la capacidad de OxBC para influir favorablemente en diversas medidas de salud y productividad de los pollos de engorde, como la tasa de supervivencia (mortalidad), los signos clínicos, el peso corporal, el aumento de peso, las lesiones intestinales y el recuento bacteriano, en comparación con un grupo de control de exposición no medicado.

Materiales y métodos:

1. Animales

En este estudio se utilizó un total de 280 pollos de engorde Ross de un día de edad, obtenidos de una incubadora comercial. Los pollos fueron vacunados contra la enfermedad de Newcastle (virus de la enfermedad de Newcastle) en la incubadora.

2. Alojamiento de las aves e instalación

Las aves se criaron en unidades de aislamiento durante todo el periodo experimental.

• En este estudio se utilizaron aisladores de pollos equipados con un sistema de ventilación.

• Había una unidad de aislamiento por grupo de tratamiento y cada unidad de aislamiento albergaba veinte pollos el día 1 del estudio (Tabla 1). El estudio se realizó en dos réplicas paralelas con 7 unidades de aislamiento por réplica.

• La temperatura interior del aislador se ajustó para mantener las temperaturas óptimas para los pollos de engorde.

• El día 1 del estudio había 20 pollos por aislador. En el día 10 del estudio, los cinco pollos más pequeños de cada aislador fueron eutanasiados y se evaluaron las lesiones perceptibles a simple vista del intestino delgado y el recuento de C. perfringens en el contenido intestinal. La evaluación en el día 10 se hizo para asegurar la ausencia de lesiones NE o niveles patógenos de C. perfringens previo a la exposición experimental en el día 14. Después del día 10 del estudio había 15 aves en cada aislador y estas aves se utilizaron en la parte de exposición del estudio.

• Los pollos fueron evaluados y pesados individualmente, por lo que cada ave representa una unidad experimental.

T l 2. Di ri i n ^ l r r l ini i l

3. Alimentación

La dieta basal utilizada en el estudio fue un pienso comercial estándar para pollos de engorde. La dieta basal se complementó con los niveles apropiados de OxBC o antibióticos indicados en la Tabla 4. En el estudio no se utilizaron anticoccidiales en la alimentación. El modelo de pollo con enteritis necrótica subclínica se indujo mediante la exposición con C. perfringens (CP-13) aislado de un caso de campo de enteritis necrótica en pollo de engorde. La exposición se hizo por gavación oral dos veces al día con aproximadamente 1 * 107 CFU/mL en los días 14, 15 y 16. En una modalidad, se incorporó al pienso una premezcla del 10 % de OxBC sobre almidón junto con otros ingredientes.

• Programa de alimentación

■ Los inventores aplicaron el mismo programa de alimentación y formulación que en las granjas comerciales de pollos de engorde (Tabla 1).

■ Los piensos experimentales se suministraron de forma continua durante el periodo de estudio de 28 días y el agua se suministró adlibitum durante todo el experimento.

La fórmula del pienso comercial basal utilizado en este estudio puede verse en la Tabla 1 anterior.

• Exposición

■ Aplicación de la cepa CP-013 de Clostridium perfringens para inducir un modelo de NE subclínica.

■ Todas las aves, excepto el Grupo 1, fueron expuestas por vía oral dos veces al día con aproximadamente 107 UFC/mL de C. perfringens los días 14, 15 y 16 (Tabla 3).

■ La cepa de exposición poseía los genes cpa y cpb2, pero era negativa para el gen de la toxina netB.

■ Véase Shojadoost et al., 2012 para una descripción detallada de los métodos para inducir la NE en las aves de corral.

Tabla 3. Administración de la exposición a Clostridium perfringens

• Puntuación de las lesiones macroscópicas

■ Las puntuaciones de las lesiones perceptibles a simple vista (macroscópicas) se evaluaron siguiendo los criterios de Prescott (1978), con puntuaciones que iban de una escala de 0 (ninguna lesión perceptible a simple vista) a 4 (la lesión perceptible a simple vista más grave).

■ Las lesiones perceptibles a simple vista en el tracto intestinal se calificaron de la siguiente manera: 0, sin lesiones perceptibles a simple vista; 1+, intestino delgado de paredes finas o friable; 2+, necrosis focal; 3+, parches más grandes de necrosis; 4+, necrosis severa y extensa normal en los casos de campo (Figura 1).

■ Véase Prescott et al., 1978 para una descripción detallada de la escala de puntuación de las lesiones.

• Enumeración bacteriana

■ El número de Clostridium perfringens se midió como unidades formadoras de colonias por un gramo de heces recogidas del intestino delgado tras la necropsia.

■ Brevemente, se cargaron 250 |jL de muestra fecal en el primer pocillo de cada fila de una placa de 96 pocillos, y se hicieron diluciones seriadas de 10 veces utilizando una pipeta multicanal, transfiriendo 20 j L de la columna a 180 j L de medio en la columna, mezclando 10 veces y repitiendo el proceso; las puntas de las pipetas se cambiaron entre las diluciones.

■ A continuación, se introdujeron en una placa cinco réplicas de 10 j L de cada una de las cinco diluciones seleccionadas en un medio de agar utilizando una pipeta multicanal.

■ Se dejaron secar las placas y se colocaron en una incubadora.

■ Véase Chen et al., 2003 para una descripción detallada de los métodos de enumeración bacteriana.

• Diseño experimental y parámetros (véanse las Tablas 4 y 5)

T l 4. Di ñ x rim n l n r li r l l

Tabla 5. Parámetros de evaluación

Resultados:

3.1 Tasa de supervivencia (mortalidad) y signos clínicos

Tras la exposición con CP (días 14-16), no se observó mortalidad (muerte aguda) ni signos clínicos (depresión severa, disminución del apetito, renuencia a moverse, diarrea y plumas erizadas) en ninguna de las aves (véanse las Tablas 6 y 7).

Tabla 6. Tasa de su ervivencia

Tabla 7. Si nos clínicos

3.2 Peso corporal medio y aumento de peso

Después de la exposición con Clostridium perfringens (días 14-16), el peso corporal medio de los grupos de tratamiento con OxBC aumentó significativamente (P < 0,05) en relación con el grupo de aves no medicadas (G2). El grupo de 2 ppm de OxBC (G3) tuvo el mayor aumento de peso global (días 1 a 28) entre las tres dosis de OxBC. El tratamiento con OxBC restauró el peso corporal promedio final y la ganancia de peso promedio general de las aves expuestas a niveles que no fueron significativamente diferentes de los observados para los controles no expuestos (G1) (Tabla 8).

T l . P r r l m i r n n n i

3.3 Puntuación de las lesiones intestinales

Se evaluaron las lesiones macroscópicas (perceptibles a simple vista) en el intestino delgado en 3 momentos del estudio:

■ En el día 10 del estudio, previo a la exposición (en los días 14-16), se aplicó la eutanasia a cinco aves de cada aislador y se evaluó la hiperemia y las hemorragias previas a la exposición.

■ El día 21 del estudio, cinco días posteriores a la última exposición con CP, se sacrificaron tres aves de cada aislador y se evaluaron las lesiones intestinales.

■ El día 28 del estudio, el último día del estudio, se evaluaron las lesiones intestinales de las 12 aves restantes de cada incubadora.

La evaluación de las muestras tomadas el día 10 previo a la exposición reveló que no había hiperemia multifocal ni hemorragias en la mucosa intestinal en ninguno de los grupos de tratamiento. Este hallazgo confirmó que las aves de todos los grupos estaban en buen estado de salud antes del período de exposición que comenzó el día 14.

La exposición con C. perfringens indujo lesiones en el intestino delgado. El grupo expuesto, no medicado (G2) tuvo la mayor puntuación media de lesiones (1,54±0,58), que fue significativamente más alta que las puntuaciones de cualquier otro grupo del estudio (Tabla 9). El grupo que no se sometió a la prueba (G1) tuvo la puntuación media más baja de 0,30±0,39.

Durante el período posterior a la exposición (días 14 a 28), el tratamiento con OxBC alivió significativamente las lesiones intestinales en comparación con el grupo que no recibió la exposición. Cabe destacar que la puntuación media de las lesiones de las aves alimentadas con 2 ppm de OxBC fue la más baja (0,40±0,51) de todos los grupos, excepto del grupo de control no expuesto (Tabla 9).

Las puntuaciones medias de las lesiones también se redujeron significativamente en ambos grupos con antibióticos en relación con los controles expuestos, no medicados (Tabla 9).

Tabla 9. Puntuaciones de las lesiones intestinales 3 aves el día 21 12 aves el día 28

3.4 Enumeración de Clostridium perfringens

El contenido de C. perfringens en las muestras fecales recogidas del intestino delgado se evaluó, mediante la determinación de unidades formadoras de colonias (CFU), en tres momentos del estudio.

■ En el día 10 del estudio, previo a la exposición (en los días 14-16), se aplicó la eutanasia a cinco aves de cada aislador y se evaluó el contenido fecal de C. perfringens.

■ El día 21 del estudio, cinco días posteriores a la última exposición con C. perfringens (“CP”), se aplicó eutanasia a tres aves de cada aislador y se evaluó el contenido fecal de C. perfringens.

■ El día 28 del estudio, el último día del estudio, se evaluó el contenido fecal de C. perfringens en las 12 aves restantes de cada incubadora.

El nivel de C. perfringens previo a la exposición, determinado el día 10, osciló entre 4,4 x 102 y 1,3 x 103 CFU en los siete grupos de tratamiento (Tabla 10). Este bajo nivel de C. perfringens es de esperar, ya que esta especie suele residir en el intestino de los pollos de engorde a niveles bajos y no patógenos.

En el grupo de control no expuesto, los niveles de C. perfringens aumentaron a lo largo del ensayo. Como se ha indicado anteriormente, el C. perfringens es un residente normal de la microflora intestinal de los pollos de engorde y, a niveles bajos, la bacteria no afecta al ave. Tampoco es raro que el contenido intestinal de C. perfringens aumente a medida que las aves envejecen. Los niveles de C. perfringens observados en el control no expuesto a lo largo de este estudio fueron consistentes con los niveles no patológicos normalmente observados en aves sanas.

En el periodo posterior a la exposición, en los días 21 y 28, las aves del grupo de exposición no medicado tenían niveles de C. perfringens significativamente más altos que los de todos los demás grupos (Tabla 10). El tratamiento con OxBC redujo los niveles de C. perfringens de forma significativa y dependiente de la dosis en 2 a 3 órdenes de magnitud en relación con el grupo expuesto no medicado en cada punto de tiempo posterior a la exposición evaluado (días 21 y 28). Además, los niveles de C. perfringens en los grupos OxBC no fueron estadísticamente diferentes de los de las aves no expuestas (Tabla 10).

El uso de antibióticos también dio lugar a reducciones significativas de los niveles de C. perfringens durante el periodo posterior a la exposición. Al final del estudio, en el día 28, no se recuperó C. perfringens en las muestras tomadas de las aves de ninguno de los grupos con antibióticos. La abolición completa de C. perfringens por los antibióticos contrasta con los efectos del OxBC, que mantuvo los niveles de C. perfringens en los niveles normales sin exposición (Tabla 10).

T l 1 . En m r i n l ri i m rfrin n n l in in l ll n r

4. Resumen del estudio

■ Este estudio evaluó el efecto preventivo de OxBC en un modelo subclínico de enteritis necrótica en el pollo de engorde. Se evaluaron varios parámetros, como la tasa de supervivencia (mortalidad), los signos clínicos, el peso corporal, el aumento de peso, la lesión intestinal y el recuento bacteriano. El OxBC se evaluó en relación con un grupo de control expuesto no medicado, un grupo de control no expuesto y dos grupos de antibióticos (Bacitracina y Virginiamicina).

■ No se observó mortalidad durante el ensayo en ninguno de los grupos. Esto se debe a que el estudio empleó un modelo de enteritis necrótica subclínica que pretendía presentar signos clínicos o indicadores patológicos en lugar de una alta tasa de mortalidad característica de los modelos agudos o clínicos de la enfermedad.

■ En el periodo posterior a la exposición, en los días 21 y 28, las aves de todos los grupos de OxBC presentaban pesos corporales medios significativamente superiores (P < 0,05) en comparación con el grupo de control expuesto, no medicado.

■ La gravedad de las lesiones perceptibles a simple vista observadas durante el ensayo fue coherente con el nivel subclínico del modelo de exposición. La evaluación de las lesiones en los días 21 y 28 reveló la presencia de diversos hallazgos patológicos, como hiperemia y hemorragias graves diseminadas, necrosis focal o ulceración de la mucosa intestinal de las aves del grupo de control expuesto no medicado. En cambio, las aves de los grupos OxBC y antibiótico mostraron puntuaciones de lesiones que se redujeron aproximadamente 3 veces en comparación con el grupo expuesto no medicado. Además, la gravedad de las lesiones en los grupos OxBC y antibiótico no difirió significativamente de las observadas en las aves de control no expuestas. La mejora en las puntuaciones de las lesiones intestinales se produjo al mismo tiempo que la reducción de los niveles de C. perfringens en las heces de las aves alimentadas con OxBC o antibióticos.

5. Conclusión

Este estudio demuestra la capacidad de niveles bajos de partes por millón de OxBC en el pienso para proteger contra los efectos nocivos de la enteritis necrótica en la salud y la productividad de los pollos de engorde. Los beneficios de OxBC se observaron a nivel de rendimiento de crecimiento (peso corporal y ganancia de peso), salud intestinal (reducción de la gravedad de las lesiones de la NE) y colonización de patógenos (reducción de los niveles de C. perfringens en el intestino delgado). El hecho de que las aves que recibieron OxBC se comportaron tan bien como los controles sanos no expuestos es una prueba más de los efectos protectores del producto.

En una realización, el uso de 2 a 6 ppm de suplemento dietético OxBC como aditivo alimentario en granjas comerciales de pollos puede contribuir a la prevención y mejora de la NE de los pollos y se espera que tenga un efecto positivo en la mejora de la productividad durante el período de cría.

Ejemplo 4 - Evidencia de que la mejora de las medidas de productividad en los animales destinados a la alimentación mediante el p-caroteno completamente oxidado está asociada a la actividad inmunológica y que ésta es un rasgo característico de los carotenoides completamente oxidados.

El punto de partida: los carotenoides

Los carotenoides son pigmentos amarillos, naranjas y rojos sintetizados por las plantas. Hay más de 600 carotenoides conocidos que se componen de dos clases llamadas carotenos, que son puramente hidrocarburos, y xantofilas, que son carotenos sustituidos con uno o unos pocos átomos de oxígeno. El p-caroteno y el licopeno son ejemplos de carotenos comunes, mientras que la luteína, la zeaxantina y la cantaxantina son ejemplos comunes de xantofilas. Los carotenoides más comunes en las dietas norteamericanas son el a-caroteno, el p-caroteno, la p-criptoxantina, la luteína, la zeaxantina y el licopeno.

Todos los carotenoides están formados por 8 unidades de isopreno y cada molécula de carotenoide contiene 40 átomos de carbono. Estructuralmente, los carotenoides adoptan la forma de una cadena de hidrocarburos de polieno, que a veces está terminada en uno o ambos extremos por un anillo. Los carotenoides que contienen anillos de p-ionona no sustituidos (incluidos el p-caroteno, el a-caroteno, la p-criptoxantina y el Y-caroteno) tienen actividad de vitamina A (lo que significa que pueden convertirse en retina). En cambio, la luteína, la zeaxantina y el licopeno no tienen actividad de vitamina A.

cantaxantina

El color de los carotenoides, que va desde el amarillo pálido hasta el rojo intenso, pasando por el naranja brillante, está directamente relacionado con su estructura. Los dobles enlaces carbono-carbono interactúan entre sí en un proceso llamado conjugación, que permite a los electrones de la molécula moverse libremente por estas zonas de la molécula y someterse fácilmente a transiciones electrónicas absorbiendo energía en la región de la luz visible.

El punto final: El oxígeno forma espontáneamente copolímeros con carotenoides como principal producto de reacción

El mismo sistema de dobles enlaces conjugados que da lugar al intenso color de los carotenoides también los hace muy susceptibles a la reacción espontánea con el oxígeno molecular. Los presentes inventores descubrieron que la reacción de oxidación se produce predominantemente por adición de múltiples moléculas de oxígeno a la molécula de carotenoide para formar productos de copolímero carotenoide-oxígeno [1,2 y 11]. Por ejemplo, el p-caroteno disuelto en un disolvente orgánico adecuado (por ejemplo, benceno, acetato de etilo), reacciona con casi 8 equivalentes de oxígeno molecular dando lugar a un aumento de peso neto de aproximadamente el 30 %. El producto, OxBC, se compone principalmente de polímeros (85 % en peso) y los productos de descomposición de los norisoprenoides (15 %) aportan el resto.

Copolímero de oxígeno Monómero norisoprenoide aproximadamente 85 % aproximadamente 75 %

MW 300-100.000 Da MW < 275 Da

La reacción espontánea del p-caroteno con el oxígeno procede predominantemente por adición para formar polímeros con un alto contenido de oxígeno. El OxBC es el producto total de la reacción y se compone tanto de polímeros (85 %) como de productos de escisión (15 %). Otros carotenoides reaccionan de forma similar, con una preponderancia de la formación de productos de polímero.

El predominio del producto polimérico también se refleja en la fórmula empírica de OxBC (Tabla), que difiere sólo ligeramente de la fórmula empírica de su producto polimérico aislado y es consistente con la adición de múltiples moléculas de O² por molécula de p-caroteno. El cromatograma por permeación de gel (GPC) (es decir, el cromatograma de exclusión por tamaño) del OxBC está dominado por un amplio pico que se extiende hasta aproximadamente 8.000 Da., con un MW medio de 900 Da. (Fig. 2A)

El sistema extendido de dobles enlaces conjugados lineales presentes en el p-caroteno es común a todos los carotenoides, por lo que se espera que otros carotenoides se comporten de forma similar en sus reacciones espontáneas con el oxígeno molecular. La tabla siguiente muestra que esta expectativa se confirma, como se ilustra al comparar los resultados de las oxidaciones completas de p-caroteno, licopeno, cantaxantina y luteína.

La comparación de los resultados de la oxidación completa y espontánea por el oxígeno del p-caroteno, el licopeno, la cantaxantina y la luteína se ilustra en la siguiente tabla:

Tabla 11

p-Caroteno Licopeno Cantaxantina Luteína

Fórmula molecular del carotenoide inicial C⁴⁰ H⁵⁶ C40 H56 C40 H52 O2 C40 H56 O2 Carotenoide completamente oxidado OxBC OxLyc OxCan OxLut

Fórmula empírica - producto total C⁴⁰ H⁶⁰ O¹⁵ C⁴⁰ H⁶¹ O²⁰ C⁴⁰ H⁵⁶ O¹³ C⁴⁰ H⁵⁹ O¹⁴ Fórmula empírica - polímero aislado C40 H59 O18 C40 H58 O20 C40 H51 O16 C40 H56 O15 Polímero - proporción de producto 85 % > 80 % > 80 % > 80 %

O² consumido (equivalentes) 6-8 n.d. 7 n.d.

Aumento de peso 30 % ~ 37 % 25 % 25 %

Análisis GPC (Fig. 3) ■/ ■/ ■/ ■/

Espectros infrarrojos (FTIR; Fig. 4) ■/ ■/ ■/ ■/

n.d. - no determinado.

En común con la oxidación del p-caroteno, estos carotenoides muestran todos ellos una elevada captación de oxígeno, como se refleja en el aumento global sustancial (> 25 %) del peso del producto y en las fórmulas empíricas similares, con predominio de productos poliméricos, como muestran sus GPC (Figs. 2B-3D). Además, todos los carotenoides completamente oxidados tienen espectros infrarrojos (FTIR) sorprendentemente similares (Figs. 3A-3D).

Mejora de la función inmunitaria: el ejemplo del p-caroteno completamente oxidado (OxBC)

Los inventores han descubierto que el OxBC es capaz de ejercer una doble capacidad inusual sobre la función inmunológica [3-5]. Los dos efectos son (1) la capacidad de preparar y mejorar la función inmunitaria innata [2,3] y (2) limitar el exceso de inflamación [12]. Estos efectos son independientes de cualquier actividad de la vitamina A porque el OxBC no contiene p-caroteno ni vitamina A [3] y, además, se ha demostrado que carece de la capacidad de activar los receptores del ácido retinoico [3].

El descubrimiento de esta actividad proviene del reconocimiento de los productos poliméricos que el p-caroteno forma predominantemente de forma espontánea en reacción con el oxígeno molecular [2] y que estos productos son los principales responsables de las actividades inmunológicas observadas [3] (véase más adelante).

Dado que este tipo de comportamiento de oxidación no se limita al p-caroteno, sino que es característico de los carotenoides en general (véase más arriba), estas observaciones proporcionan una base tangible, creíble y comprobable para explicar los efectos no vitamínicos de los carotenoides provitamina A (a-, p- y Y-carotenos y p-criptoxantina) y de los carotenoides más numerosos que no pueden convertirse en vitamina A.

El cribado preliminar del OxBC mediante una matriz de expresión génica por PCR mostró un patrón de actividad que indicaba el potencial de las dos capacidades inmunomoduladoras clave (Tabla 3 en la ref. [2]). En la primera capacidad, relacionada con la modulación de la función inmune innata, el OxBC regula la expresión de genes que codifican productos que funcionan en la detección de patógenos y de patrones de moléculas asociadas a patógenos (PAMP, por sus siglas en inglés), incluyendo los receptores tipo toll (TLR, por sus siglas en inglés) y otras proteínas que actúan como cofactores para la detección de PAMP, como el CD-14 (grupo de diferenciación 14).

Se ha corroborado la capacidad de cebar la función inmunitaria innata tanto in vitro como in vivo, como indica el aumento de la expresión de los receptores TLR y CD14 de la membrana plasmática (Figs.1 y 2 en la ref. [3]). Además, como se describirá más adelante, un ensayo basado en la expresión del receptor CD14 indica que el producto polimérico es el principal, si no el único, responsable de la actividad de OxC-beta.

Ampliación a otros carotenoides completamente oxidados - Demostración del aumento de los niveles de los receptores de vigilancia inmunitaria por el licopeno completamente oxidado

Un aspecto central de las acciones de mejora inmunológica del OxBC es su capacidad para aumentar el nivel de los receptores inmunitarios de detección de patógenos, incluidos los subtipos 2 y 4 de los receptores tipo Toll (TLR-2 y TLR4) y el CD14. Estos receptores desempeñan un papel vital en la detección de patógenos y la activación del sistema inmunitario innato. Al aumentar la dotación de receptores inmunitarios del huésped, el OxBC incrementa eficazmente el nivel de vigilancia inmunitaria de los agentes patógenos.

Para evaluar la capacidad de otros carotenoides de mejorar la inmunidad innata, se desarrolló un ensayo basado en la regulación de los receptores de vigilancia inmunitaria c D14 [3]. Se comparó el licopeno completamente oxidado (OxLyc) con el p-caroteno completamente oxidado (OxBC). Aunque el licopeno comparte el mismo número de dobles enlaces linealmente conjugados que el p-caroteno, carece de los grupos ciclohexilo en cada extremo.

La Fig. 4A muestra una respuesta lineal de la expresión de CD14 a la concentración de OxBC y OxLyc, respectivamente, y que sus actividades son esencialmente indistinguibles. La comparación del producto licopeno con el producto p-caroteno indica una falta de influencia de los grupos ciclohexilo sobre la respuesta del receptor inmunitario CD14.

Los copolímeros carotenoide-oxígeno son responsables de potenciar la inmunidad innata

La Fig. 4B muestra que es la fracción polimérica de OxBC la principal responsable de la regulación de la expresión de CD14. Este hallazgo y las actividades esencialmente equivalentes de OxBC y OxLyc en el ensayo de CD14 son consistentes con el predominio del producto polimérico en cada uno de los carotenoides oxidados y la fuerte similitud entre sus espectros FTIR, indicando la existencia de elementos estructurales comunes en los polímeros de carotenoides oxidados.

La expresión de CD14 se cuantificó mediante análisis FACS. El efecto de cada compuesto se muestra en relación con las células no tratadas. Los puntos representan la media y el error estándar de tres experimentos distintos. (A) OxLyc tuvo un efecto significativo de la dosis en el contenido de la superficie de CD14 (p = 0,020) que no fue significativamente diferente del efecto de OxBC. (B) El análisis de correlación indica un efecto significativo de la dosis de cada compuesto sobre la expresión de CD14 con valores p de 0,0036 para OxBC, 0,0034 para el polímero y 0,0113 para el monómero. La comparación de la actividad relativa de cada compuesto (B) indica que el monómero es significativamente menos activo que el polímero (p < 0,001) y el OxBC (p < 0,01), mientras que no hay diferencias significativas entre las actividades del polímero y el OxBC. La actividad aparente del monómero puede deberse a la presencia de polímeros residuales de menor peso molecular que no pudieron ser eliminados completamente de la fracción de monómero (de la ref. [3]).

La importancia de mejorar la inmunidad innata para la producción ganadera

Las líneas ganaderas modernas han sido seleccionadas para obtener un crecimiento óptimo, eficiencia en la conversión de piensos y niveles de producción. Concomitante con la selección genética para obtener un mayor potencial de producción, se ha reducido el potencial inmunológico de los animales, metabólicamente costoso. Como consecuencia, las especies de ganado modernas son susceptibles a las infecciones. Esta susceptibilidad, unida a los entornos de producción intensos, hace que los animales destinados a la alimentación sean vulnerables a la infección por numerosos patógenos. La reducción de las tasas de crecimiento, la eficiencia de la conversión de los piensos y el aumento de la mortalidad expuestos por las infecciones suponen una importante amenaza económica para la industria ganadera en todo el mundo. Para intentar mitigar la amenaza que suponen las infecciones, la industria ha recurrido al desarrollo de ingredientes para piensos con capacidad para mejorar las defensas inmunitarias innatas del huésped. El OxBC representa uno de esos ingredientes para piensos con capacidad para influir positivamente en el sistema inmunitario innato del huésped.

En este escenario, se puede ver la importancia de las acciones de mejora inmunológica de OxBC. A través de su capacidad para aumentar el nivel de los receptores inmunitarios de detección de patógenos, incluidos los TLR-2, TLR-4 y c D14, el OxBC puede reforzar el papel vital de la detección de patógenos y la activación del sistema inmunitario innato. Al aumentar la dotación de receptores inmunitarios del huésped, el OxBC incrementa eficazmente el nivel de vigilancia inmunitaria de los agentes patógenos.

Esta mayor observación permite detectar, reaccionar y eliminar los agentes patógenos en una fase más temprana. Las respuestas inmunológicas son metabólicamente costosas y pueden restar recursos a las vías de crecimiento y producción. A través de sus efectos sobre la expresión de los receptores inmunitarios, el OxBC proporciona un mecanismo para prevenir las infecciones en una fase temprana, limitando así el alcance y la duración de la respuesta inmunológica y ahorrando recursos metabólicos. Como resultado, el animal se mantiene en un estado saludable y los recursos metabólicos pueden conservarse y dirigirse a alcanzar el pleno potencial de crecimiento del animal.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a efectos de claridad y comprensión, un experto en la técnica apreciará, a partir de la lectura de la divulgación, que pueden realizarse diversos cambios de forma y detalle sin apartarse del verdadero alcance de la invención en las reivindicaciones adjuntas.

Referencias

1. Burton, GW, Daroszewski, J, Phipps, J. 1995. Extensively oxidized derivatives of carotenoids, retinoids and related conjugated polyenes useful as non-toxic cell-differentiation inducers, anti-proliferative agents, and anti-tumor agents. Patente estadounidense 5,475,006

2. Burton, GW, Daroszewski, J, Nickerson, JG, Johnston, JB, Mogg, TJ, Nikiforov, GB. 2014. p-Carotene autoxidation: oxygen copolymerization, non-vitamin A products and immunological activity. Can. J. Chem. 92: 305-316.

3. Johnston JB, Nickerson JG, Daroszewski J, Mogg TJ, Burton GW. 2014. Biologically active polymers from spontaneous carotenoid oxidation: a new frontier in carotenoid activity. PLoS ONE 9 e111346.

4. Cui B, Liu S, Wang Q, Lin X. 2012. Effect of p-carotene on immunity function and tumour growth in hepatocellular carcinoma rats. Molecules 17: 8595-8603.

5. Shojadoost B, Vince AR, Prescott JF. 2012. The successful experimental induction of necrotic enteritis in chickens by Clostridium perfringens: a critical review. Veterinary research 43: 74.

6. Prescott Jf , Sivendra R, Barnum DA. 1978. The use of bacitracin in the prevention and treatment of experimentallyinduced necrotic enteritis in the chicken. The Canadian veterinary journal 19: 181-183.

7. Gholamiandehkordi AR, Timbermont L, Lanckriet A, Van Den Broeck W, Pedersen K, Dewulf J, Pasmans F, Haesebrouck F, Ducatelle R, Van Immerseel F. 2007. Quantification of gut lesions in a subclinical necrotic enteritis model. Avian pathology 36, 375-382.

8. Chen CY, Nace GW, Irwin PL. 2003. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli. Journal of microbiological methods 55, 475-479.

9. Yan F, Zhao Y, Hu Y, Qiu J, Lei W, Ji W, Li X, Wu Q, Shi X, Li Z. 2013. Protection of chickens against infectious bronchitis virus with a multivalent DNA vaccine and boosting with an inactivated vaccine. J Vet Sci. 14:53-60.

10. Antao EM, Glodde S, Li G, Sharifi R, Homeier T, Laturnus C, Diehl I, Bethe A, Philipp HC, Preisinger R, Wieler LH, Ewers C. 2008. The chicken as a natural model for extraintestinal infections caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Microb Pathog. 45:361-369.

11. Burton, G.W., et al., Oxidized carotenoids, retinoids and related conjugated polyenes, and derived fractions and compounds useful as cell-differentiation inducers, cytostatic agents, and anti-tumor agents, in WO 96/05160, W.I.P. Organization, 1996.

12. Duquette, S.C., et al., Anti-inflammatory benefits of retinoids and carotenoid derivatives: retinoic acid and fully oxidized p-carotene induce caspase-3-dependent apoptosis and promote efferocytosis of bovine neutrophils. Am J Vet Res, 2014.

75.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Betacaroteno completamente oxidado para su uso en la reducción de la gravedad de las lesiones intestinales asociadas con la enteritis necrótica (NE) en aves de corral, en donde el uso comprende la administración de una cantidad eficaz del betacaroteno completamente oxidado a dichas aves de corral.

2. El betacaroteno completamente oxidado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las aves de corral son pollos de engorde.

3. El betacaroteno completamente oxidado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las lesiones intestinales son causadas por C. perfringens.

4. El betacaroteno completamente oxidado para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la cantidad eficaz es de 2 - 30 ppm de dieta.

5. Una composición que comprende betacaroteno completamente oxidado para su uso en la reducción de la gravedad de las lesiones intestinales asociadas a la enteritis necrótica en aves de corral, en donde la composición es un pienso para animales.

6. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el pienso para animales es un pienso para aves de corral.