CN101702906B - 用于抑制金属蛋白活性的抗体和含有所述抗体的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有通式(I)的化合物，其中m和n各自独立地为1-6的整数；X1-X3和Y1-Y3各自独立地为O或S；R1-R3各自独立选自氢、烷基和环烷基；R为(CH2)x-C(＝O)NR′-(CH2)y-NR′R″，其中：x和y各自独立地为1-6的整数；R′和R″各自独立选自氢、烷基和环烷基；本发明还涉及包含能够与上述化合物特异性结合的抗原识别区的抗体。

Description

用于抑制金属蛋白活性的抗体和含有所述抗体的药物组合物
发明领域和背景
本发明涉及半抗原分子和可以用于抑制金属蛋白(例如金属蛋白酶)活性的针对所述半抗原的抗体，以及利用抗体治疗与金属蛋白活性异常有关的疾病(例如转移癌)的方法。
基质金属蛋白(MMP)是参与胞外基质(ECM)重塑的关键酶。这些酶能够破坏关节软骨的多种结缔组织组分或基底膜。
人MMP基因家族由至少28种结构上相关的蛋白质组成(参见图1)，它们共有类似的总体为球形的拓扑结构(图2和Borkakoti，1998)。每种MMP均以无活性的潜在酶原分泌出来。催化性锌结构域(catalytic zinc domain)由大约180个氨基酸组成，其中高度保守序列HE-GH-LGL-H提供3个与金属Zn(2+)离子结合的组氨酸(即H)残基。酶原中催化性锌离子的第四结合部位与半胱氨酸残基结合(Morgunova等，1999)，它在酶激活时从活性部位解离出来(Van Wart和Birkedal-Hansen，1990)。结果，活化MMP中的第四结合部位被一个水分子占据，该水分子还与保守的谷氨酸残基以氢键连接。这个过程促使活化水分子水解靶底物的肽键。
金属蛋白酶不受控制地分解结缔组织是许多病理病症的特征，或许是由过度的MMP活性引起的，或者是由天然MMP组织抑制剂(TIMP)与MMP的比率失调引起。TIMP通过与MMP的活性锌结合部位形成化学计量复合物来抑制MMP(Gomez等，1997；Henriet等，1999；Bode等，1999；Will等，1996)。当TIMP水平不足时，ECM的进行性缓慢降解可以在类风湿性关节炎(Walakovits等，ArthritisRheum，35：35-42，1992)和骨关节炎(Dean等，J.Clin.Invest.84：678-685，1989)中导致软骨基质丧失，或者在骨质疏松症中导致骨基质降解(Hill等，Biochem.J.308：167-175，1995)。在其它情况下，例如充血性心力衰竭，可能发生心脏ECM的快速降解(Armstrong等，Canadian J.Cardiol.10：214-220，1994)。
另外，已知MMP在例如以下细胞因子和趋化因子成熟中起作用：半乳凝素-3(Ochieng J.，Biochemistry，199433(47)：14109-14)、纤溶酶原(Patterson，BC.，JBC，1997272(46)：28823-5)、白介素-8、结缔组织激活肽III、血小板因子-4(Van den Steen，2000Blood.2000年10月15日；96(8)：2673-81)、白介素-1β前体(pro-interleukin-1β)(Schonbeck，1998)、白介素-2受体α链[Sheu，B.C，Hsu，S.M.，Ho，H.，Lien，H.C.，Huang，S.C.，Lin，R.H.A novel role of metalloproteinase incancer-mediated immunosuppression (金属蛋白酶在癌症介导的免疫抑制中的新作用)Cancer Research(2001)61，237-242]以及转化生长因子-β前体(pro-transforming growth factor-β)[TGF-β，Yu，Q.Stamenkovic，I.Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion andangiogenesis(细胞表面定位的基质金属蛋白酶-9蛋白水解性激活TGF-β并促进肿瘤侵袭和血管生成)Genes Dev(2000)14，163-176]。
还与MMP活性不受控制有关的其它病理病症包括转移性肿瘤细胞ECM的快速重塑。在这种情况下，活化MMP由癌细胞或周围组织表达。有相当多的证据表明，MMP参与肿瘤的生长和扩散(例如参见Davidson等，Chemistry & Industry，258-261，1997，以及其中的参考文献)。在肿瘤转移过程中，MMP被用于分解ECM，使得原发性肿瘤癌细胞侵入附近血管，在血管中被转运到不同器官中，并建立继发性肿瘤。在这些继发性部位的侵袭性生长是由MMP介导的，可破坏组织。另外，MMP活性对新血管侵袭性向内生长(亦称血管生成)产生影响，这是肿瘤生长超过一定大小时所必需的。研究表明，MMP家族成员之一，即分泌的人MMP-9(亦称明胶酶B)，不仅在胞外基质(ECM)分解代谢中，而且还在与多发性硬化(MS)等神经病有关的蛋白质底物加工中起关键作用(Opdenakker，2003)。最新研究表明，MMP-9在通过裂解加工前的II型胶原而促进自身免疫病方面具有至关重要的作用(Van den Steen，2004)。裂解产物是胶原II型片段，一般认为这些片段是发生自身免疫病的残留表位。
倘若MMP在人类生理学和病理学中具有广泛作用，那么对于为了设计抑制MMP过高活性的药物而付诸大量努力也就不足为奇。
药物开发的努力集中在含有与锌离子配位从而使靶MMP失活的官能团的抑制剂类别。这类抑制剂中的一种为异羟肟酸抑制剂(hydroxamate inhibitor)，这是一种纤维胶原的小肽类似物，以二配位基的方式，通过异羟肟酸基上的羟基和羰基氧与催化部位的锌离子发生特异性相互作用[Grams等(1995)，Biochem.34：14012-14020；Bode等(1994)，EMBO J.，13：1263-1269]。
基于异羟肟酸的MMP抑制剂通常包括碳主链(WO 95/29892、WO 97/24117、WO 97/49679和EP 0780386)、肽基主链(WO 90/05719、WO 93/20047、WO 95/09841和WO 96/06074)或肽模拟物主链(peptidomimetic back-bone)[Schwartz等，Progr.Med.Chem.，29：271-334(1992)；Rasmussen等，Pharmacol.Ther.，75：69-75(1997)；Denis等，Invest.New Drugs，15：175-185(1997)]。或者，它们含有磺酰氨基磺酰基，该基团的一侧与苯环结合，且磺酰氨基的氮通过1-4个碳原子的链与异羟肟酸基结合(EP 0757984 A1)。
其它基于肽的MMP抑制剂为具有胶原酶抑制活性的巯基酰胺类化合物(美国专利第4,595,700号)；抑制MMP-3、MMP-2和胶原酶的含有联苯乙基甘氨酸(biphenylethylglycine)的N-羧基烷基衍生物(Durette等，WO-9529689)；抑制MMP、TNF-α和可聚蛋白聚糖酶的内酰胺衍生物(参见US 6,495,699)以及三环磺酰胺化合物类(参见US6,492,422)。
虽然基于肽的MMP抑制剂具有明确的治疗潜力，但是它们在临床治疗中的应用有限。基于肽的异羟肟酸的生产非常昂贵，且代谢稳定性和口服生物利用度低[例如巴马司他(batimastat)(BB-94)]。这些化合物被快速葡糖醛酸化、氧化成羧酸并在胆汁中分泌[Singh等，Bioorg.Med.Chem.Lett.5：337-342，1995；Hodgson，“Remodelling MMPIs(MMPI的重塑)”，Biotechnology 13：554-557，1995)]。另外，基于肽的MMP抑制剂常常对每个MMP酶都具有相同或相似的抑制作用。例如，据报道，巴马司他针对MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7和MMP-9中的每一种的IC50值为约1nM至约20nM[Rasmussen等，Pharmacol.Ther.，75(1)：69-75(1997)]。此外，若干异羟肟酸抑制剂的应用与严重副作用相关，例如肌肉骨骼问题与马立马司他(marimastat)(BB-2516)、泛发性斑丘疹(widespread maculopapular rash)与CGS27023A(Novartis)[Levitt等，2001，Clin.Cancer Res.7：1912-1922]和肝脏异常、贫血症、肩背疼痛、血小板减少症、恶心、疲劳、腹泻和深静脉血栓形成与BAY12-9566(Bayer)[Heath等，2001，Cancer Chemother.Pharmacol.48：269-274]相关。此外，用马立马司他、普啉司他(prinomastat)(AG 3340，Agouron)和Bay 12-9566对晚期癌症患者进行的III期临床试验证实在抑制转移方面没有临床功效(Zucker等，2000，Oncogene 19：6642-50)。
其它MMP抑制剂是化学修饰的非微生物源四环素类(chemicallymodified nonmicrobial tetracyclines，CMTs)，该抑制剂显示体外阻断若干MMP的表达。然而，发现这些化合物的体内功效有限，例如，CMT抑制剂多西环素降低人类患者颈动脉粥样硬化斑块中MMP-1的组织水平，但不降低MMP-2、MMP-3或MMP-9的组织水平(Axisa等，2002，Stroke 33：2858-2864)。
最近，根据MMP活性部位的X射线晶体学信息设计出基于机制的MMP抑制剂(mechanism-based MMP inhibitor)，即SB-3CT(Brown等，2000)。X射线吸收研究显示，该分子与催化性锌的结合使活性部位金属离子周围的构象环境重构回到酶原的构象环境[Kleifeld等，2001，J Biol.Chem.276：17125-31]。然而，用该药物获得的治疗功效仍有待核实。
另一类天然抑制剂是单克隆抗体。已经生产出针对MMP-1催化结构域内特定肽序列的若干抗体(Galvez等，2001，J.Biol.Chem.，276：37491-37500)。然而，虽然这些抗体可抑制MMP的体外活性，但是结果表明这类抗体的体内功效尚未得到证实。
如上文中所述，MMP的催化部位包括在酶活化之后可用于底物结合的配位金属离子(参见图2a-c)。因此可以理解，针对酶的一级氨基酸序列的常规抗体不能将酶的活性形式与无活性形式区别开来，因此不能用作这类酶的有效抑制剂。
本发明的发明人之前曾经提出，同时识别MMP催化部位的电子决定子和结构决定子(determinant)的抗体是它的有效抑制剂，因此可以用于治疗与MMP活性失调有关的疾病(参见PCT公开文本WO2004/087042)。
因此，对于模拟金属蛋白催化部位的电子决定子和结构决定子的特异性半抗原化合物以及针对所述半抗原化合物的特异性抗体存在普遍公认的需要，并且十分理想的是获得所述特异性半抗原化合物及其特异性抗体。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供具有以下通式(I)的化合物：
Figure G2008800126731D00061
其中：
m和n各自独立地为1-6的整数；
X1-X3和Y1-Y3各自独立地为O或S；
R1-R3各自独立选自氢、烷基和环烷基；和
R为(CH2)x-C(＝O)NR′-(CH2)y-NR′R″
其中：
x和y各自独立地为1-6的整数；和
R′和R″各自独立选自氢、烷基和环烷基。
根据本发明下述优选实施方案的进一步特征，本发明的化合物具有下式(II)结构：
Figure G2008800126731D00071
其中R＝-CH2-C(＝O)NH-CH2-CH2-NH2。
根据本发明的另一个方面，提供具有下式(II)的化合物：
Figure G2008800126731D00072
其中R＝-CH2-C(＝O)NH-CH2-CH2-NH2。
根据本发明的又一个方面，提供包含能够特异性结合上述化合物的抗原识别区的抗体。
根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述抗原识别区包含选自SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12的CDR氨基酸序列。
根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述CDR氨基酸序列由选自SEQ ID NO：13、14、15、16、17和18的核酸序列编码。
根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述抗体能够抑制金属蛋白的活性。
根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述金属蛋白是基质金属蛋白酶。
根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述基质金属蛋白酶是明胶酶。
根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述明胶酶选自MMP-2和MMP-9。
根据本发明的再一个方面，提供产生金属蛋白抑制剂的方法，该方法包括产生针对上述化合物的抗体，从而制备金属蛋白抑制剂。
根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述抗体为多克隆抗体。
根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述抗体为单克隆抗体。
根据本发明的又一个方面，提供包含所述抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
根据本发明的又一个方面，提供治疗有需要的受治疗者的与金属蛋白活性失调或异常有关的疾病的方法，该方法包括给予受治疗者治疗有效量的权利要求4-10中任一项的抗体，从而治疗受治疗者的与金属蛋白活性失调或异常有关的疾病。
根据所述优选实施方案更进一步的特征，所述疾病是炎性肠病(inflammatory bowel disease)。
根据本发明的又一个方面，提供抑制细胞的基质金属蛋白酶活性的方法，该方法包括使细胞与权利要求4-10中任一项的抗体接触，从而抑制细胞的基质金属蛋白酶活性。
本发明通过提供新的半抗原组合物而成功地克服了现有已知构型的缺点，所述半抗原组合物可以用于产生同时识别金属蛋白催化部位的电子决定子和结构决定子的抗体。
除非另有定义，否则本文所用的所有科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。虽然类似或等同于本文所述方法和材料的方法和材料可用于本发明的实施或检验，但是下面描述了合适的方法和材料。万一发生抵触，则以本专利说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅是示例性的，而不是限制性的。
附图说明
本文仅通过举例并参考附图对本发明进行描述。要强调的是，就现在具体参考附图细节而言，仅以本发明的优选实施方案为例且仅为了说明性地论述本发明的优选实施方案而给出细节，并且是为了提供我们认为是对本发明的原理和构思方面最有用和最易理解的描述而提供这些细节。在这点上，我们没有试图以比基本理解本发明所必需的更为详细的方式来说明本发明的结构细节，附图中的说明，可使本领域技术人员了解本发明的几种形式如何具体体现在实施中。
附图中：
图1A-D是以下分子结构的示意图：Co/ZnTCPP-[间-四(4-羧基苯基)-卟啉]钴/锌(II)([meso-Tetrakis(4-carboxyphenyl)-porphyrinato]cobalt/zinc(II))(图1A-B)、Imisdp-[2-(2-氨基乙基氨基甲酰基)-乙氧基甲基]-三-[2-(N-(3-咪唑-1-基-丙基))-乙氧基甲基]甲烷([2-(2-minoethylcarbomoyl)-ethoxymethyl]-tris-[2-(N-(3-imidazol-1-yl-propyl))-ethoxymethyl]methane)及MMP催化性锌部位的保守锌-蛋白连接。
图1E-H是图1A-D中所示结构的三维示意图。注意，ZnTCPP保持平面构象，而CoTCPP具有扭曲的微周期构象(distortedmicrocycle conformation)。显然，Imisdp结构与图1G中所示的MMP-9催化性锌离子的最接近的环境十分相似。
图2A是Imisdp(绿色碳原子)与MMP-9活性部位3个保守组氨酸(PDB代码1GKC，灰色碳原子)的三维计算结构之间的结构叠加图(overlay)。催化性锌离子被描绘成橙色球，水分子被描绘成蓝色球，氮被涂成蓝色，氧为红色。
图2B是ZnTCPP卟啉环(CSD代码AKICOM)(绿色碳原子)与MMP-9活性部位3个保守组氨酸(灰色碳原子PDB代码1GKC)之间的结构叠加图，催化性锌离子被描绘成橙色球，氮被涂成蓝色。
图3A-C蛋白质印迹图像显示小鼠IgG-琼脂糖(IgG-Agarose)固定化mAb使重组MMP-2催化结构域(MMP-2cat)或Pro-MMP-2和Pro-MMP-9从溶液中沉淀出来(pull down)的能力。用于各实验的抗体为6C6、13E11和13E15。图3A-将MMP-2cat(2μg)与抗小鼠IgG-琼脂糖(cntl，泳道1)或抗CoTCPP、抗ZnTCPP和抗Imisdp mAb(10μg)-抗小鼠IgG-琼脂糖一起在20℃下温育2小时，免疫沉淀物(泳道2、3、5)经离心后洗涤三次，用SDS/PAGE凝胶分离，通过考马斯染色观测。图3B-按与A相同的方式，将Pro-MMP-2、Pro-MMP-9与mAb-抗小鼠IgG-琼脂糖一起温育。免疫沉淀物(泳道2、4、6左和泳道1、3、5右)和未结合组分(泳道1、3、5左和2、4、6右)用SDS/PAGE凝胶分离，通过考马斯染色观测。图3C-将用APMA进行活化(左)或未进行活化(右)的HT 1080细胞的条件培养液与抗CoTCPP mAb进行免疫沉淀，并用抗MMP-2的特异性抗体通过蛋白质印迹进行分析。
图4A-B是抗CoTCPP mAb抑制MMP-2(A)和MMP-9(B)的Lineweaver-Burk图。速度单位为μmol/秒钟-1，底物单位为μM-1。图4A-MAb浓度为6μM(实心三角)、18μM(实心方块)、24μM(空心圆)和0μM(空心方块)。MMP-2cat浓度为200nM。图4B-抑制全长APMA激活的MMP-9，mAb浓度为6μM(空心方块)、12μM(实心三角)、24μM(空心方块)和0μM(实心方块)。MMP-9浓度为20nM。抑制模式表明抗CoTCPP mAb作为MMP-2和MMP-9的竞争性抑制剂起作用。
图5是显示抗Imisdp mAb抑制MMP-2和MMP-9的曲线图。将MMP-9催化结构域(20nM)(实心圆)或全长APMA激活的MMP-2(实心三角，5nM)加到荧光底物OCAcPLGLA2pr(Dnp)-AR-NH2(10μM)与含有浓度递增的mAb的缓冲液R的混合物中。
曲线表示采用Origin程序的与以下方程拟合的非线性最小二乘方：vi/vo＝(Km+[S])/(Km(1+[I]/Ki)+[S])。
图6A是显示MMP-2cat活性形式和MMP-2cat的抗CoTCPPmAb抑制形式的锌k-边(k-edge)光谱的光谱图。图中显示活性MMP-2cat(虚线)和MMP-2cat-mAb复合物(实线)的锌K-边区的归一化原始XAS数据。
图6B显示相对于活性MMP-2cat(虚线)，MMP-2cat-mAb复合物(实线)移动到较高能量的边缘位置。
图6C表示所显示的MMP-2cat活性(黑色)和抑制(绿色)形式的EXAFS结果。结果用R空间(R-space)和反转换至k空间表示。
图7A-B照片显示抗CoTCPP mAb抑制细胞表面明胶酶活性的能力。在1μM 13E11 mAb存在或不存在下，放置在用DQ-明胶包被的盖玻片上的HT1080细胞的代表性荧光显微图。作为由降解明胶发射的荧光的量度，对细胞表面明胶分解活性进行了分析。未处理细胞具有显著的细胞表面明胶酶活性，在1μM抗CoTCPP mAb存在下受到明显抑制。蓝色的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，表示细胞核的位置。
图8是显示不同MMP活性部位(S1口袋)构型的示意图。
图9是Imisdp的合成流程图。
图10显示本发明抗体的氨基酸序列，其中突出显示的为CDR区。
图11A-D是说明仅与MMP9和MMP2活性构象结合的6C6的照片和模型。图11A：与得自小鼠腹水的6C6共纯化的活性MMP9的检测。使用市售的抗MMP9抗体，对由含有MMP9的小鼠腹水纯化的MAb(10μg)进行蛋白质印迹(WB)分析。按相同方式纯化的非相关IgG mAb(Non related IgG mAb)用作阴性对照(MAb对照)。由Hilla转染细胞纯化的人ProMMP9用作分子量标记以分辨活性种类。纯化通过亲合层析法进行，使用通过其恒定区结合mAb的G蛋白微珠，使抗原结合部位游离出来与抗原相互作用。图11B、图11C：分析固定在A蛋白微珠上的6C6mAb使ProMMP2、ProMMP9或MMP2催化性片段(缺乏血红素结合蛋白和前域(pro domains))从溶液中沉淀出来的能力。将固定在A蛋白琼脂糖微珠的MAb 6C6(10μg)与MMP2催化性片段(1μg)(图11B)、ProMMP9(图11C上图)或ProMMP2(2μg)(图11C下图)一起在20℃下温育2小时。微珠结合的mAb复合物经离心分离，并洗涤三次，用SDS/PAGE凝胶分离后，通过考马斯染色观测。免疫沉淀物(6C6)和未结合组分用SDS/PAGE凝胶分离，通过考马斯染色观测。将作为仅非特异性吸收酶的阴性对照与A蛋白琼脂糖微珠一起温育。图11D：表面图像中显示有前域(pro-domain)(下图)和无前域(上图)的缺乏血红素结合蛋白结构域的MMP2的三维结构(PDB ID：1CK7)。催化结构域和纤连蛋白结构域用蓝绿色表示，前肽(pro-peptide)用红色表示。催化性锌离子被描绘成橙色球体，与如黄色条棒所示的3个保守组氨酸结合。如图所示，前肽结构域在空间上阻断活性部位。
图12A-B是与6C6mAb对MMP-9抑制机制有关的曲线图和数据。图12A：将MMP-9重组催化性片段(无血红素结合蛋白和前域)与变化量的mAb一起预温育。在加入荧光肽底物(10μM)后测量残留的酶活性。通过拟合到竞争性抑制方程式(vi/vo＝Km+[S]/(Km(1+I/Ki)+[S])Km＝9.14±0.8)求出Ki(插图)。在mAb不存在(●)，或者在0.7μM(■)mAb或2μM(○)mAb存在下，将活性MMP-9(固定浓度为2nM)在100mM NaCl、10mM CaCl2、100mMTris(pH 7.5)中于37℃预温育60分钟。然后加入荧光肽底物(Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2)以达到所需的0-30μM范围内的终浓度(S)，底物水解的初始速度通过测量荧光的增加来确定。通过将实验数据拟合到Michaelis-Menten方程式推导出表观Km值和Vmax值。将推导值用来重新绘制双倒数Linweaver-Burk图，交叉点表示6C6竞争性抑制MMP-9。图12B：将不同的MMP与变化量的mAb预温育。加入荧光肽底物(10μM)后，测量残留的酶活性。通过拟合到竞争性抑制方程式(vi/vo＝Km+[S]/(Km(1+I/Ki)+[S])求出Ki，对于由Hila细胞纯化的全长MMP2，Km＝2.46±0.34，对于MT1-MMP的催化结构域，Km＝16±1。还使用全长MMP-2和MMP-9检测了6C6的有效抑制(数据未显示)。
图13是不同MMP的结构叠加图，显示活性部位保守的整体拓扑结构，其中主要在周边环(peripheral loops)内有变化。MMP9(PDB1GKC)-蓝绿色，MMP2(PDB 1QIB)-红紫色，MT1-MMP(PDB1BUV)-橙色，MMP7(PDB 1MMQ)-红色，TACE(PDB 2I47)-黄色。保守组氨酸用条棒表示，催化性锌离子被描绘成橙色球体。显然，MMP-2和MMP-9周边环的整体拓扑图类似。这就可以解释受测组的酶中6C6对MMP-2和MMP-9的选择性。
图14A-C是说明6C6抑制细胞表面明胶酶活性的荧光显微图。在5μM mAb不存在(图14A)或在5μM mAb存在(图14B)下，或者在15μM基于机制的纳摩尔明胶酶抑制剂SB-3CT存在(图14C)下，置于用DQ-明胶包被的盖玻片上的HT1080细胞的代表性荧光显微图(由原位酶谱法测定(in situ zymography assay)产生)。作为由降解明胶发射的荧光量度，对细胞表面明胶分解活性进行了分析。未处理细胞具有显著的细胞表面明胶酶活性(green)，它在mAb存在下被显著抑制。
图15A-C是表示6C6处理对C57BL/6小鼠急性DSS结肠炎各种表现的作用的图。通过2％DSS诱发疾病达5天，从第0天开始每日经腹膜内注射5或1.5mg/kg小鼠给予6C6处理。图15A：每日监测DAI(这是体重、直肠出血和大便粘稠度的综合评分，数值范围为0-4)，求出临床分值。数据用第6天至第10天每只动物平均值的点分布表示。图15B：结肠长度。图15C：死亡率。所提供的数据是两次实验的综合结果，每组共15只小鼠*，相对于结肠炎未治疗小鼠作用显著(p＜0.05)。
图16是得自活性MMP9(黑色)和抑制MMP9-6C6复合物(红色)于锌K边X射线吸收光谱法的结果的曲线图。结果用锌离子径向分布的形式表示。相对于活性MMP-9，MMP-9催化结构域-mAb复合物(红色)的位置移动到较高能量(插图)，这就表明了与催化性锌离子结合。X射线光谱数据的结构分析表明，6C6与锌离子直接结合，并形成五配位锌-蛋白复合物。显然，这种结合模式类似于在MMP活性部位与TIMP的结合。
优选实施方案的描述
本发明涉及可用于抑制金属蛋白活性的抗体及其片段。准确地讲，本发明抗体可以用于治疗与基质金属蛋白酶活性失调有关的疾病，例如多发性硬化、自身免疫病和转移癌。
参照附图和附图说明，可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细说明至少一个本发明的实施方案之前，应该了解本发明在其应用于以下说明书中所述细节或实施例中所例举细节时并无限制。本发明可有其它实施方案，或者能够以各种方式实施或实现。同样，还应了解本文所用措辞和术语是为了说明目的，不应视为限制。
基质金属蛋白酶参与许多生物学过程，范围从细胞增殖、分化和胞外基质重塑(ECM)到血管生成和细胞迁移。这些过程在基质金属蛋白酶的功能(MMP)及其天然组织抑制剂(TIMP)之间需要精妙的平衡。失去这种平衡是包括转移性肿瘤、神经变性性疾病和骨关节炎在内的多种病理病症的标志。
本领域已知多种MMP抑制剂，包括小肽抑制剂，例如异羟肟酸、非微生物源四环素和单克隆抗体。虽然前者受生长成本高、降解性强、口服生物利用度低和缺乏特异性的限制，但是后者中无一证实有体内治疗功效。
本发明的发明人之前曾提出，同时识别金属酶催化部位的电子决定子和结构决定子的抗体可以用作金属酶的有效抑制剂。使用半抗原模拟作为免疫原的金属酶金属结合催化部位，使得能够产生高效治疗性抗体，可用来治疗以金属蛋白活性升高为特征的临床病症(参见本发明人的WO2004/087042)。
在将本发明付诸实施时，本发明的发明人设计出精确模拟MMP中反应性锌部位的局部结构和构象的新的半抗原化合物。化合物[2-(2-氨基乙基氨基甲酰基)-乙氧基甲基]-三-[2-(N-(3-咪唑-1-基-丙基))-乙氧基甲基]甲烷，简称Imisdp(参见图1)，可以模拟4-配位几何结构以及由与3个组氨酸排列和水配位的锌离子所引起的类似力场。由3个咪唑碱基和作为第4个配体的水分子形成大致的四面体构象。图2A显示所构建的具有MMP-9(PDB 1GKC)催化部位的Imisdp化合物的构建的3D模型叠加图，它已被修饰以代表锌配体的四面体几何结构。该修饰包括将存在于X射线结构的配体(异羟肟酸抑制剂)用水分子置换，并应用多层QM/MM方法(multilayer QM/MM approach)(参见材料和方法)使整个酶最优化成局部最小化。根据组氨酸的ε-氮与锌离子的距离(分别为2.04±0.06和2.02)以及3个组氨酸对于金属的相对取向，计算得出的MMP-9中组氨酸锌模体和Imisdp之间存在高度相似性。
正如在下文以及在随后的实施例部分中所述一样，本发明的发明人用Imisdp使小鼠免疫，筛选出与MMP-2和MMP-9交叉反应的MMP抗体。该抗体称为6C6(参见图10和随后的实施例部分的实施例1-2)。发现6C6结合MMP-2/9，并竞争性地抑制MMP-9、MMP-2(Ki范围1μM-5μM)和MT1-MMP(Ki为15μM，参见下表4)的活性。通过各种生物化学和生物物理学工具体外和原位证实了结合并抑制MMP-9和MMP-2(参见实施例4-7和实施例9)。重要的是，6C6仅与活化形式的MMP-9和MMP-2结合(参见实施例3和实施例8)。该酶形式缺乏前域，该前域保护存在于酶部分内的催化性锌复合物。本发明的发明人指出，按照本发明方法所产生的抗体能够体内结合MMP-9(图11A)。此外，本发明的发明人指出，本发明抗体具有用于治疗炎性肠病的治疗潜力(实施例10)。
总之，本发明的结果支持Imisdp作为用于产生金属蛋白抑制剂的重要试剂(平台)、以及6C6及衍生肽和模拟肽(peptidomimetics)作为有价值的治疗工具的用途。
这些结果表明，通过噬菌体展示和mAb或其片段的点突变，使用这些抗体作为设计各MMP的选择性肽抑制剂的平台的潜力。
因此，根据本发明的一个方面，提供具有以下通式(I)的化合物：
Figure G2008800126731D00161
其中：
m和n各自独立地为1-6的整数；
X1-X3和Y1-Y3各自独立地为O或S；
R1-R3各自独立选自氢、烷基和环烷基；和
R为(CH2)x-C(＝O)NR′-(CH2)y-NR′R″
其中：
x和y各自独立地为1-6的整数；和
R′和R″各自独立选自氢、烷基和环烷基。
根据本发明这个方面的优选实施方案，所述化合物是[2-(2-氨基乙基氨基甲酰基)-乙氧基甲基]-三-[2-(N-(3-咪唑-1-基-丙基))-乙氧基甲基]甲烷，简述Imisdp，具有以下通式(II)：
其中R＝-CH2-C(＝O)NH-CH2-CH2-NH2。
在随后的实施例部分的实施例7中描述了Imisdp的合成。
因为Imisdp模拟MMP-9和MMP-2中反应性锌部位的局部结构和瞬时构象，所以它可用来产生金属蛋白抑制剂。
因此，根据本发明的一个方面，提供产生金属蛋白抑制剂的方法。
该方法通过产生针对上述化合物(即Imisdp)的抗体或抗体片段来实现。参见随后实施例部分的实施例1-2以及“材料和方法”部分。
本发明的“金属蛋白”是指结合金属的蛋白质，其中金属结合部位构成酶催化结构域的组成部分，它在电子上和结构上都与Imisdp的类似。
本发明这个方面的金属蛋白优选为金属蛋白酶-MMP(例如明胶酶，例如MMP-2和MMP-9)。
应当了解的是，MMP家族的所有成员均被翻译成潜在酶，在激活时转化成活性酶，其中活性部位的金属离子易于达到底物结合的目的。例如，以前提出的解释MMP体外活化的“半胱氨酸转换模型(cysteine switch model)”。半胱氨酸转换模型提出，在激活时，通过由锌原子上解离出带有巯基(Cys)的前肽，使潜在的锌结合部位转化成催化性锌结合部位。前肽的裂解导致酶的前域结构水解，催化性锌离子的屏蔽被去除。从而，金属离子和活性部位口袋易于达到底物结合和水解的目的[Van Wart和Birkedal-Hansen(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，5578-5582]。
根据本发明的教导内容产生的抗体和抗体片段用作MMP的有效抑制剂，这是由于它们具有同时结合催化性锌部位内的金属离子和配位氨基酸的能力，从而特异性抑制直接参与上述病理过程的这些酶的活性构象。
本文所用术语“抗体”是指完整的抗体分子，术语“抗体片段”是指其功能性片段，例如能够结合巨噬细胞的Fab、F(ab′)2和Fv。这些功能性抗体片段如下定义：(i)Fab，该片段含有抗体分子的单价抗原结合片段，可通过用酶即木瓜蛋白酶消化完整抗体产生，得到完整的轻链和一条重链的一部分；(ii)Fab′，可通过用胃蛋白酶处理完整抗体后还原来获得抗体分子的这个片段，得到完整轻链和重链的一部分；每个抗体分子得到2个Fab′片段；(iii)(Fab′)2，可以用酶即胃蛋白酶处理完整抗体但无需随后的还原获得该抗体片段；F(ab′)2是2个Fab′片段由2个二硫键连接在一起的二聚体；(iv)Fv，定义为含有表达成2条链的轻链可变区和重链可变区的遗传工程片段；(v)单链抗体(“SCA”)，是一种遗传工程分子，含有由合适的多肽接头连接的轻链可变区和重链可变区作为遗传融合的单链分子；和(vi)编码单一互补决定区(CDR)的肽。
抗体(即单克隆和多克隆抗体)的制备方法是本领域众所周知的。抗体可以通过本领域已知的若干方法中的任一种来制备，这些方法可采用诱导体内产生抗体分子，筛选文献所公开的高度特异性结合反应物的免疫球蛋白文库或组[Orlandi D.R.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86：3833-3837，Winter G.等(1991)Nature 349：293-299]，或者通过传代细胞系培养产生单克隆抗体分子。这些包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EB病毒(EBV)杂交瘤技术[Kohler G.等(1975)Nature 256：495-497，Kozbor D.等(1985)J.Immunol.Methods 81：31-42，Cote R.J.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：2026-2030，Cole S.P.等(1984)Mol.Cell.Biol.62：109-120]。
如果本发明化合物太小不能引起强免疫原性反应(immunogenicresponse)，则这类抗原(半抗原)可与抗原中性载体(antigenically neutralcarrier)例如匙孔
Figure G2008800126731D00191
血蓝蛋白(KLH)或血清白蛋白[例如牛血清白蛋白(BSA)]载体偶联(参见美国专利号5,189,178和5,239,078以及实施例部分的实施例2)。与载体的偶联可以采用本领域众所周知的方法进行；例如，可以实现与氨基的直接偶联，并任选接着使所形成的亚氨基键还原。或者，可以采用缩合剂(例如二环己基碳二亚胺)或其它碳二亚胺脱水剂使载体偶联。接头化合物也可用于实现偶联；同双功能接头和异双功能接头均可获自Pierce Chemical Company，Rockford，Ill。然后，可将所得免疫原性复合物注射到例如小鼠、兔等合适的哺乳动物受治疗者体内。合适的方案包括按照加强血清中抗体产生的时间表，在佐剂存在下重复注射免疫原。应用本领域众所周知的免疫测定法，可容易地测定出免疫血清的效价。
所获得的抗血清可以直接使用，或者按照上文中所述获得单克隆抗体。
可以应用本领域众所周知的方法，获得抗体片段(参见例如Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York，1988，通过引用结合到本文中)。例如，可以通过蛋白水解抗体，或者通过在大肠杆菌(E.coli)或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白质表达系统)中表达编码该片段的DNA，来制备本发明的抗体片段。
或者，可以通过常规方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体获得抗体片段。例如，可以通过用胃蛋白酶对抗体进行酶促切割提供表示为F(ab′)2的5S片段，来产生抗体片段。还可以使用巯基还原剂，任选使用巯基(由切割二硫键所产生)的封闭基团，对该片段进行进一步切割以产生3.5S Fab′单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行酶促切割来直接产生2个单价Fab′片段和Fc片段。这些方法参见例如Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647及其中所包括的参考文献，所述专利通过引用全部结合到要本文中。另参见Porter，R.R.，Biochem.J.，73：119-126，1959。切割抗体的其它方法，例如分离重链形成单价轻链-重链片段，进一步切割片段，或者还可以使用其它酶促技术、化学或遗传技术，只要该片段与被完整抗体识别的抗原结合。
Fv片段包含VH链和VL链的缔合物。该缔合物可以是非共价的，参见Inbar等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 69：2659-62，1972。或者，可变链可以通过分子间的二硫键连接，或者通过化学试剂(例如戊二醛)交联。优选Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建结构基因来制备，该结构基因包含编码由寡核苷酸连接的VH和VL区的DNA序列。将该结构基因插入表达载体中，随即将表达载体导入宿主细胞，例如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接2个V区的接头肽的单一多肽链。有关产生sFv的方法参见例如Whitlow和Filpula，Methods，2：97-105，1991；Bird等，Science 242：423-426，1988；Pack等，Bio/Technology11：1271-77，1993；以及Ladner等，美国专利第4,946,778号。
CDR肽(“最小识别单位”)可以通过编码构建目标抗体CDR的基因获得。例如，通过采用聚合酶链式反应以合成抗体生成细胞RNA的可变区，来制备这类基因。参见例如Larrick和Fry，Methods，2：106-10，1991。
应当了解的是，用于人的疗法或诊断剂，优选使用人源化抗体。非人类(例如鼠)抗体的人源化形式是免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列)，其含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中得自受体互补决定区(CDR)的残基被得自小鼠、大鼠或兔等非人类物种的CDR(供体抗体)的残基置换，所述非人类物种的CDR具有所需要的特异性、亲和力和性能。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人类残基置换。人源化抗体还可包含在受体抗体、引入的CDR或构架序列中都不存在的残基。一般而言，人源化抗体可包含基本上所有的至少一个、通常2个可变区，其中所有或基本上所有的CDR区都相当于非人类免疫球蛋白的CDR区，所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最理想还可包括至少免疫球蛋白恒定区的一部分(Fc)，通常为人免疫球蛋白恒定区的一部分[Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)]。
使非人类抗体人源化的方法是本领域众所周知的。人源化抗体一般具有一个或多个从非人类来源引入其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常被称为输入残基(import residue)，通常得自输入可变区。可以基本上按照Winter及同事的方法[Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988)]，用啮齿动物的一个或多个CDR序列取代相应的人抗体序列，来进行人源化。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上不超过一个完整的人可变区被相应的得自非人类物种的序列取代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基及可能一些FR残基被得自啮齿动物抗体相似位点的残基取代的人抗体。
还可以采用本领域已知的各种技术制备人抗体，包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)和Boerner等，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)]。同样，可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物中来制备人抗体，转基因动物例如其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全被失活的小鼠。在攻击后，观察到人抗体的产生，这在包括基因重排、装配和抗体所有组成成分在内的所有方面都与在人体内观察到的十分相似。该方法参见例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和下列科技出版物：Marks等，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。
一旦获得抗体，便可测定它们的金属蛋白抑制活性。金属蛋白抑制活性合适的测定条件参见Knight等，FEBS Letters 296(3)：263-266(1992)，Cawston等，Anal.Biochem，99：340-345(1979)，Cawston等，Methods in Enzymology 80：771以及下列等等(1981)；Cawston等，Biochem.J.，195：159-165(1981)，Weingarten等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，139：1184-1187(1984)和美国专利号4,743,587和5,240,958。
如上所述，采用上述方法，本发明的发明人能够制备MMP-2和MMP-9的基质金属蛋白酶(MMP)抑制性抗体，简称6C6，这是SEQID NO：1中所提供的序列。SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12中提供CDR序列。
因此，本发明提供包含上述CDR序列和同源物及其片段中的至少一个的任何(多)肽序列，只要它保持金属蛋白抑制活性(特异性抑制金属蛋白的催化活性)。这类多肽的实例是抗体(见上文)。
本文所用术语“多肽”包括天然肽类(或为降解产物，或为合成肽或重组肽)和模拟肽类(通常为合成肽)，以及作为肽类似物的拟肽和半拟肽(semipeptoid)，它们具有这类修饰例如使得肽在体内更稳定或者更能够透过细胞。这类修饰包括但不限于N端修饰、C端修饰、肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、主链修饰和残基修饰。用于制备肽模拟化合物的方法是本领域众所周知的，具体参见例如Quantitative Drug Design，C.A.Ramsden Gd.，第17.2章，F.ChoplinPergamon Press(1992)，该文献通过引用并入，如同其全篇公布于本文。下文中将提供这个方面的更多详情。
肽内的肽键(-CO-NH-)可以被例如以下化学键和衍生物取代：N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮基亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)(其中R为甲基等任何烷基)、碳(carba)键(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH＝CH-)、逆酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R为“正常”侧链，天然存在于碳原子上。
这些修饰可发生在沿肽链的任何键上，甚至同一时间发生在若干键上(2-3)。
天然的芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe还可以用例如以下非天然的合成酸取代：苯基甘氨酸、Tic、萘基甘氨酸(naphtylalanine、Nal)、苯基异丝氨酸、去酮苏氨酸(threoninol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe或邻甲基-Tyr的卤化衍生物。
除上述的以外，本发明的肽还可包括一个或多个修饰氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合糖等)。
要了解的是，在本说明书和下面的权利要求书部分中，所用术语“氨基酸”包括20个天然存在的氨基酸；翻译后常在体内被修饰的氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其它不常用的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”同时包括D-氨基酸和L-氨基酸。
下表1和表2列出可用于本发明的天然存在的氨基酸(表1)和不常用或修饰的氨基酸(例如合成的氨基酸，表2)。
                        表1
  氨基酸   三字母缩写   一字母符号
  丙氨酸   Ala   A
  精氨酸   Arg   R
  天冬酰胺   Asn   N
  天冬氨酸   Asp   D
  半胱氨酸   Cys   C
  谷氨酰胺   Gln   Q
  谷氨酸   Glu   E
  甘氨酸   Gly   G
  组氨酸   His   H
  异亮氨酸   Iie   I
  亮氨酸   Leu   L
  赖氨酸   Lys   K
  甲硫氨酸   Met   M
  苯丙氨酸   Phe   F
  脯氨酸   Pro   P
  丝氨酸   Ser   S
  苏氨酸   Thr   T
  色氨酸   Trp   W
  酪氨酸   Tyr   Y
  缬氨酸   Val   V
  上述任何氨基酸   Xaa   X
                         表2
  不常用的氨基酸  代码   不常用的氨基酸  代码
  α-氨基丁酸  Abu   L-N-甲基丙氨酸  Nmala
  α-氨基-α-甲基丁酸  Mgabu   L-N-甲基精氨酸  Nmarg
  氨基环丙烷-羧酸  Cpro   L-N-甲基天冬酰胺  Nmasn
  L-N-甲基天冬氨酸  Nmasp
  氨基异丁酸  Aib   L-N-甲基半胱氨酸  Nmcys
  氨基降冰片烷基-羧酸  Norb   L-N-甲基谷氨酰胺  Nmgin
  L-N-甲基谷氨酸  Nmglu
  环己基丙氨酸  Chexa   L-N-甲基组氨酸  Nmhis
  环戊基丙氨酸  Cpen   L-N-甲基异亮氨酸  Nmile
  D-丙氨酸  Dal   L-N-甲基亮氨酸  Nmleu
  D-精氨酸  Darg   L-N-甲基赖氨酸  Nmlys
  D-天冬氨酸  Dasp   L-N-甲基甲硫氨酸  Nmmet
  D-半胱氨酸  Dcys   L-N-甲基正亮氨酸  Nmnle
  D-谷氨酰胺  Dgln   L-N-甲基正缬氨酸  Nmnva
  D-谷氨酸  Dglu   L-N-甲基鸟氨酸  Nmorn
  D-组氨酸  Dhis   L-N-甲基苯丙氨酸  Nmphe
  D-异亮氨酸  Dile   L-N-甲基脯氨酸  Nmpro
  D-亮氨酸   Dleu   L-N-甲基丝氨酸   Nmser
  D-赖氨酸   Dlys   L-N-甲基苏氨酸   Nmthr
  D-甲硫氨酸   Dmet   L-N-甲基色氨酸   Nmtrp
  D-鸟氨酸   Dorn   L-N-甲基酪氨酸   Nmtyr
  D-苯丙氨酸   Dphe   L-N-甲基缬氨酸   Nmval
  D-脯氨酸   Dpro   L-N-甲基乙基甘氨酸   Nmetg
  D-丝氨酸   Dser   L-N-甲基-叔丁基甘氨酸   Nmtbug
  D-苏氨酸   Dthr   L-正亮氨酸   Nle
  D-色氨酸   Dtrp   L-正缬氨酸   Nva
  D-酪氨酸   Dtyr   α-甲基-氨基异丁酸   Maib
  D-缬氨酸   Dval   α-甲基-γ-氨基丁酸   Mgabu
  D-α-甲基丙氨酸   Dmala   α-甲基环己基丙氨酸   Mchexa
  D-α-甲基精氨酸   Dmarg   α-甲基环戊基丙氨酸   Mcpen
  D-α-甲基天冬酰胺   Dmasn   α-甲基-α-萘基丙氨酸   Manap
  D-α-甲基天冬氨酸   Dmasp   α-甲基青霉胺   Mpen
  D-α-甲基半胱氨酸   Dmcys   N-(4-氨基丁基)甘氨酸   Nglu
  D-α-甲基谷氨酰胺   Dmgln   N-(2-氨基乙基)甘氨酸   Naeg
  D-α-甲基组氨酸   Dmhis   N-(3-氨基丙基)甘氨酸   Norn
  D-α-甲基异亮氨酸   Dmile   N-氨基-α-甲基丁酸   Nmaabu
  D-α-甲基亮氨酸   Dmleu   α-萘基丙氨酸   Anap
  D-α-甲基赖氨酸   Dmlys   N-苄基甘氨酸   Nphe
  D-α-甲基甲硫氨酸   Dmmet   N-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸   Ngln
  D-α-甲基鸟氨酸   Dmorn   N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸   Nasn
  D-α-甲基苯丙氨酸   Dmphe   N-(2-羧乙基)甘氨酸   Nglu
  D-α-甲基脯氨酸   Dmpro   N-(羧甲基)甘氨酸   Nasp
  D-α-甲基丝氨酸   Dmser   N-环丁基甘氨酸   Ncbut
  D-α-甲基苏氨酸   Dmthr   N-环庚基甘氨酸   Nchep
  D-α-甲基色氨酸   Dmtrp   N-环己基甘氨酸   Nchex
  D-α-甲基酪氨酸   Dmty   N-环癸基甘氨酸   Ncdec
  D-α-甲基缬氨酸   Dmval   N-环十二基甘氨酸   Ncdod
  D-α-甲基丙氨酸   Dnmala   N-环辛基甘氨酸   Ncoct
  D-α-甲基精氨酸   Dnmarg   N-环丙基甘氨酸   Ncpro
  D-α-甲基天冬酰胺   Dnmasn   N-环十一基甘氨酸   Ncund
  D-α-甲基天冬氨酸   Dnmasp   N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸   Nbhm
  D-α-甲基半胱氨酸   Dnmcys   N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸   Nbhe
  D-N-甲基亮氨酸   Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸   Nhtrp
  D-N-甲基赖氨酸   Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸   Nmgabu
  N-甲基环己基丙氨酸   Nmchexa   D-N-甲基甲硫氨酸   Dnmmet
  D-N-甲基鸟氨酸   Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸   Nmcpen
  N-甲基甘氨酸   Nala   D-N-甲基苯丙氨酸   Dnmphe
  N-甲基氨基异丁酸   Nmaib   D-N-甲基脯氨酸   Dnmpro
  N-(1-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nleu   D-N-甲基苏氨酸   Dnmthr
  D-N-甲基色氨酸   Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸   Nva
  D-N-甲基酪氨酸   Dnmtyr   N-甲基-α-萘基丙氨酸   Nmanap
  D-N-甲基缬氨酸   Dnmval   N-甲基青霉胺   Nmpen
  γ-氨基丁酸   Gabu   N-(对羟基苯基)甘氨酸   Nhtyr
  L-叔丁基甘氨酸   Tbug   N-(硫甲基)甘氨酸   Ncys
  L-乙基甘氨酸   Etg   青霉胺   Pen
  L-高苯丙氨酸   Hphe   L-α-甲基丙氨酸   Mala
  L-α-甲基精氨酸   Marg   L-α-甲基天冬酰胺   Masn
  L-α-甲基天冬氨酸   Masp   L-α-甲基-叔丁基甘氨酸   Mtbug
  L-α-甲基半胱氨酸   Mcys   L-甲基乙基甘氨酸   Metg
  L-α-甲基谷氨酰胺   Mgln   L-α-甲基谷氨酸   Mglu
  L-α-甲基组氨酸   Mhis   L-α-甲基高苯丙氨酸   Mhphe
  L-α-甲基异亮氨酸   Mile   N-(2-甲基硫乙基)甘氨酸   Nmet
  D-N-甲基谷氨酰胺   Dnmgln   N-(3-胍基丙基)甘氨酸   Narg
  D-N-甲基谷氨酸   Dnmglu   N-(1-羟乙基)甘氨酸   Nthr
  D-N-甲基组氨酸   Dnmhis   N-(羟乙基)甘氨酸   Nser
  D-N-甲基异亮氨酸   Dnmile   N-(咪唑基乙基)甘氨酸   Nhis
  D-N-甲基亮氨酸   Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸   Nhtrp
  D-N-甲基赖氨酸   Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸   Nmgabu
  N-甲基环己基丙氨酸   Nmchexa   D-N-甲基甲硫氨酸   Dnmmet
  D-N-甲基鸟氨酸   Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸   Nmcpen
  N-甲基甘氨酸   Nala   D-N-甲基苯丙氨酸   Dnmphe
  N-甲基氨基异丁酸   Nmaib   D-N-甲基脯氨酸   Dnmpro
  N-(1-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nleu   D-N-甲基苏氨酸   Dnmthr
  D-N-甲基色氨酸   Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸   Nval
  D-N-甲基酪氨酸   Dnmtyr   N-甲基-a-萘基丙氨酸   Nmanap
  D-N-甲基缬氨酸   Dnmval   N-甲基青霉胺   Nmpen
  γ-氨基丁酸   Gabu   N-(对羟基苯基)甘氨酸   Nhtyr
  L-叔丁基甘氨酸   Tbug   N-(硫甲基)甘氨酸   Ncys
  L-乙基甘氨酸   Etg   青霉胺   Pen
  L-高苯丙氨酸   Hphe   L-α-甲基丙氨酸   Mala
  L-α-甲基精氨酸   Marg   L-α-甲基天冬酰胺   Masn
  L-α-甲基天冬氨酸   Masp   L-α-甲基-叔丁基甘氨酸   Mtbug
  L-α-甲基半胱氨酸   Mcys   L-甲基乙基甘氨酸   Metg
  L-α-甲基谷氨酰胺   Mgln   L-α-甲基谷氨酸   Mglu
  L-α-甲基组氨酸   Mhis   L-α-甲基高苯丙氨酸   Mhphe
  L-α-甲基异亮氨酸   Mile   N-(2-甲基硫乙基)甘氨酸   Nmet
  L-α-甲基亮氨酸   Mleu   L-α-甲基赖氨酸   Mlys
  L-α-甲基甲硫氨酸   Mmet   L-α-甲基正亮氨酸   Mnle
  L-α-甲基正缬氨酸   Mnva   L-α-甲基鸟氨酸   Morn
  L-α-甲基苯丙氨酸   Mphe   L-α-甲基脯氨酸   Mpro
  L-α-甲基丝氨酸  mser   L-α-甲基苏氨酸   Mthr
  L-α-甲基缬氨酸  Mtrp   L-α-甲基酪氨酸   Mtyr
  L-α-甲基亮氨酸  Mval   L-N-甲基高苯丙氨酸   Nmhphe
  N-(N-(2，2-二苯基乙基)  Nnbhm   N-(N-(3，3-二苯基丙基)
  氨基甲酰甲基-甘氨酸  Nnbhm   氨基甲酰甲基(1)甘氨酸   Nnbhe
  1-羧基-1-(2，2-二苯基乙基氨基)环丙烷  Nmbc
可通过本领域众所周知的方法，包括噬菌体展示和计算生物学，来产生对目标金属蛋白酶的亲和力改进或生物活性提高的肽。
可以通过肽合成领域技术人员已知的任何技术合成本发明的肽。对于固相肽合成，多项技术的概述可参见：Stewart，J.M.和Young，J.D.(1963)，“Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成法)”，W.H.Freeman Co.(San Francisco)；及Meienhofer，J(1973)，“HormonalProteins and Peptides(激素蛋白和肽)”第2卷，第46页，Academic Press(New York)。有关经典液相合成的综述参见Schroder，G.和Lupke，K.(1965)。The Peptides，第1卷，Academic Press(New York)。有关重组技术还可参见下面更多的参考文献。
本发明还包括编码上述多肽序列的核酸序列(参见SEQ ID NO：13、14、15、16、17和18)。
如上文中所述，本发明抗体的一个具体用途是预防或治疗与金属蛋白(例如金属蛋白酶)活性失调或异常有关的疾病。
这类疾病的实例包括但不限于关节炎疾病，例如骨关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)、脓毒性关节炎、软组织风湿病、多软骨炎和腱炎；转移性肿瘤；牙周病；角膜溃疡，例如由碱灼伤或其它灼伤引起的角膜溃疡、由辐射引起的角膜溃疡、由维生素E或类视色素缺乏引起的角膜溃疡；肾小球病，例如蛋白尿；营养不良性大疱性表皮松解(dytrophobic epidermolysis bullosa)；骨再吸收疾病(bone resorptiondiseases)，例如骨质疏松症；佩吉特病(Paget′s disease)；甲状旁腺功能亢进和胆脂瘤；通过防止排卵或着床的节育；与肿瘤生长有关或与伴发糖尿病性视网膜病和黄斑变性的新血管形成有关的血管生成；伴发动脉粥样硬化斑破裂的冠状动脉血栓形成；肺气肿；伤口愈合和HIV感染。
如实施例10中所述，本发明的发明人证实，本发明的抗体可用于治疗肠易激病(irritable bowel disease)。
炎性肠病(IBD)是严重的胃肠疾病，其特征是肠炎和组织重塑，发病频率高，对于患者结果可能是致残的。IBD的主要形式，即溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(Crohn′s disease)是慢性复发性疾病，其临床特征是腹痛、腹泻、直肠出血和发热。
因此，根据本发明的另一个方面，提供抑制有需要的受治疗者的基质金属蛋白酶活性的方法。
本发明优选的个体受治疗者为动物，例如哺乳动物(例如犬、猫、绵羊、猪、马、牛、灵长类)，优选为人。
该方法包括向受治疗者提供治疗有效量的本发明MMP抑制剂(即上文所述的抗体或抗体片段)。
正如下文中的进一步详述，可通过直接给药来提供MMP抑制剂(例如口服给药或注射)，或者可由所给予个体靶细胞的多核苷酸构建体表达。
将本发明的MMP抑制剂本身提供给个体，或者可作为其中与药学上可接受的载体相混合的药物组合物的组成部分提供给个体。
本文所用的“药物组合物”是指一种或多种本文所述的活性成分与生理上合适的载体和赋形剂等其它化学组分的制剂。药物组合物的目的是有助于将化合物给予生物。
本文术语“活性成分”是指负责生物效应的抗体制备物。
下文术语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”可以互换使用，是指不会对生物产生明显刺激性并且不会削弱所给予化合物的生物活性和性能的载体或稀释剂。佐剂包括在这些术语内。包括在药学上可接受的载体中的成分之一可为例如聚乙二醇(PEG)、多种同时可溶于有机介质和水性介质的生物相容性聚合物(Mutter等(1979)。
本文术语“赋形剂”是指加到药物组合物中以进一步促进活性成分给药的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇类。
药物的制备和给药技术可参见“Remington’s PharmaceuticalSciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本，该文献通过引用结合到本文中。
例如，合适的给药途径可包括口服、直肠、经黏膜，尤其是经鼻、经肠或胃肠外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接脑室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
或者，可以按局部方式而不是按全身方式给予制剂，例如通过将制剂直接注射到患者体内的特定部位。
本发明的药物组合物可通过本领域众所周知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、包糖衣(dragee-making)、水飞(levigating)、乳化、包囊、包封或冻干步骤。
本发明的药物组合物可以按常规方式，使用一种或多种生理上可接受的载体(包括赋形剂和助剂)来配制，所述赋形剂和助剂促进活性成分加工成可以药用的制剂。合适的剂型取决于所选择的给药途径。
对于注射，可以在水溶液中，优选中在生理上相容的缓冲液(例如Hank溶液(Hank′s solution)、林格液(Ringer′s solution)或生理盐缓冲液)中配制本发明的活性成分。对于经黏膜给药，在剂型中使用适于待渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂一般为本领域所知。
对于口服给药，可容易地通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体相混合来配制所述化合物。这类载体能够使本发明的化合物配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等，以用于患者口服摄取。可以使用固体赋形剂，任选将所得混合物研磨，并对颗粒混合物进行加工，如有需要在加入合适的助剂之后，得到片剂或锭剂片芯，从而制备口服使用的药物制剂。合适的赋形剂尤其为填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如有需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如藻酸钠。
锭剂片芯包有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，它可任选含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普胶、聚乙二醇、二氧化钛、清漆溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。还可将染料或颜料加到片剂或锭剂包衣中以鉴定或鉴别活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推合式胶囊剂(push-fit capsules)以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封胶囊剂。推合式胶囊剂可含有活性成分以及与之混合的：填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉类、润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁以及任选稳定剂。在软胶囊剂中，可将活性成分溶于或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油、液状石蜡或液态聚乙二醇。另外，可加入稳定剂。用于口服给药的所有剂型都应为适于所选择的给药途径的剂量。
对于口腔给药，组合物可采用按常规方式配制的片剂或糖锭剂形式。
对于通过经鼻吸入给药，根据本发明使用的活性成分便于以气溶胶喷雾剂的形式由使用合适抛射剂的压缩包装或喷雾器递送，合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氟四氟乙烷或二氧化碳。在压缩气溶胶的情况下，可以通过提供以定量递送的阀门来确定剂量单位。用于分配器的例如明胶的胶囊和筒，可以制成装有化合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以配制本文所述制剂用于胃肠外给药，例如通过推注注射或连续输注。用于注射的剂型可呈单位剂型，例如安瓿或多剂量容器，任选加入防腐剂。组合物可以是油性或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并可含有调配剂(formulatory agent)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
胃肠外给药的药物组合物包括水可溶形式的活性制剂水溶液。另外，活性成分的混悬剂可制备成合适的油基或水基注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯)或脂质体。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可含有合适的稳定剂或增加活性成分溶解度的物质供制备高度浓缩的溶液剂。
或者，活性成分可以是粉针剂的形式，在使用前用合适的溶媒(例如无热原的无菌水基溶液)配制。
本发明的制剂还可以使用例如常用的栓剂基质(例如可可脂或其它甘油酯)配制成直肠用组合物，例如栓剂或滞留型灌肠剂。
适用于本发明这个方面的药物组合物包括这样组合物，其中活性成分以可达到既定目的的有效量包含于其中。更准确地讲，治疗有效量是指活性成分的量可有效地预防、减轻或改善疾病症状或延长待治疗的受治疗者的存活时间。
治疗有效量的确定尽在本领域技术人员掌握之中。
对于用于本发明方法的任何制剂，治疗有效量或剂量可从体外实验中作出初步估计。例如，可以在动物模型中配制的剂量以及这类信息可以用来更准确的确定在人体中的有益剂量。
本文所述活性成分的毒性和治疗功效可通过体外标准药学方法，在细胞培养物或实验动物中确定。从这些体外实验和细胞培养实验及动物研究中获得的数据，可以用于配制用于人的各种剂量。剂量可根据所使用的剂型和所采用的给药途径而变化。确切的剂型、给药途径和剂量可由各医师考虑患者病况后做出选择[参见例如Fingl等，(1975)“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第1章，第1页]。
根据待治疗疾病的严重程度和反应性，给药可以是单次给药或多次给药，其中疗程持续数天至数周，或者直到达到治愈，或者达到减轻疾病的状态。
待给予的组合物的量必然将取决于待治疗的受治疗者、疾病的严重程度、给药方式、处方医师的判断等等。
还可以制备包括配制在与之相容的药物载体中的本发明的制备物的组合物，将其装入合适的容器中，并贴上用于治疗指定疾病的标签。
如有需要，本发明的组合物可以存在于包装或分配装置中，例如经FDA核准的药盒，药盒可装有一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如，包装可包括金属或塑料薄膜(plastic foil)，例如泡罩包装。包装或分配装置可随附给药说明书。包装或分配器还可随容器附上通知书，通知书的格式由监管药品的生产、使用或销售的政府机构规定，通知书上注明组合物的形式或者人用或兽用给药已获政府机构批准。例如，这类通知书可以是经美国食品与药物管理局(U.S.Food andDrug Administration)批准的处方药物标签或核准的药品插页。
如上文中所述，本发明的抗体抑制剂可以由核酸构建体表达。
应当了解的是，编码本发明抗体的多核苷酸优选还编码使抗体分泌或运输到感兴趣的亚细胞或胞外定位的信号肽。例如，当靶金属蛋白为MMP时，分泌信号肽优选符合读框地与编码抗体区段的多核苷酸缀合。
还要进一步了解的是，重组单链Fv(ScFv)片段可以优选表达，因为与完整抗体分子相比，它们的结构复杂度明显降低。如上文中所述，ScFv是由VL和VH抗体多肽链组成的蛋白质，其中VL的羧基端通过肽桥与VH的氨基端连接而合成为单链。重组产生这些肽的方法是本领域众所周知的[参见Bird等，Science 242：423-426(1988)；Huston等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；及de Kruif等，J.Mol.Biol.248：97-105(1995)]。根据本发明这个方面的实施方案，在用本发明化合物免疫后，由经免疫的动物中收获脾脏mRNA，并用来在展示ScFv片段的噬菌体中产生cDNA文库。然后筛选噬菌体颗粒，以确定特异性并优选与目标金属蛋白活化形式发生相互作用的噬菌体颗粒。从这些噬菌体颗粒中回收ScFv区段，并克隆到表达构建体中(参见美国专利第5,800,814号)。
可以将本发明这个方面的核酸构建体给予个体受治疗者的靶细胞(即体内基因疗法)。
或者，通过合适的基因递送溶媒/方法(转染、转导、同源重组等)和所需要的表达系统将核酸构建体导入合适的细胞，然后使修饰细胞在培养中增殖，再送回到个体体内(即离体基因疗法)。
为了使本发明的抗体或抗体片段能够进行细胞表达，本发明的核酸构建体还包括至少一个顺式作用调节元件。本文所用术语“顺式作用调节元件”是指多核苷酸序列，优选为启动子，它与反式作用调节子结合并调节位于其下游的编码序列的转录。
本发明的方法可以使用任何可利用的启动子。在本发明一个优选的实施方案中，本发明核酸构建体所用的启动子在特定的转化细胞群中具有活性。细胞类型特异性和/或组织特异性启动子的实例包括例如以下启动子：肝脏特异性的白蛋白[Pinkert等(1987)Genes Dev.1：268-277]、淋巴特异性启动子[Calame等(1988)Adv.Immunol.43：235-275]；特别是T细胞受体的启动子[Winoto等(1989)EMBO J.8：729-733]和免疫球蛋白的启动子[Banerji等(1983)Cell 33729-740]；神经元特异性启动子，例如神经丝启动子[Byrne等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477]；胰腺特异性启动子[Edlunch等(1985)Science 230：912-916]或乳腺特异性启动子，例如乳清启动子(美国专利第4,873,316号和欧洲申请公布号264,166)。本发明的核酸构建体可进一步包括增强子，它可以接近或远离启动子序列，并可在上调由此开始的转录中起作用。
本发明方法的构建体优选进一步包括合适的选择标记和/或复制起点。优选所用的构建体是穿梭载体，它既可以在大肠杆菌中扩增(其中构建体包含合适的选择标记和复制起点)，又可与细胞增殖相容或整合到所选的基因和组织中。例如，本发明的构建体可以是质粒、杆粒(bacmid)、噬菌粒、黏粒、噬菌体、病毒或人工染色体。
现行优选的体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒构建体转染，所述构建体例如腺病毒、慢病毒、单纯疱疹I病毒或腺伴随病毒(AAV)及基于脂质体的系统。用于脂质-介导的基因转移的有益的脂质为例如DOTMA、DOPE和DC-Chol[Tonkinson等，Cancer Investigation，14(1)：54-65(1996)]。用于基因疗法的最优选的构建体为病毒，最优选为腺病毒、AAV、慢病毒或反转录病毒。病毒构建体(例如反转录病毒构建体)包括至少一个转录启动子/增强子或基因座限定元件(locus-defining element)或通过其它方法(例如可变剪接、核RNA输出或信使的翻译后修饰)控制基因表达的其它元件。这类载体构建体还包括包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分以及适于所用病毒的正链和负链引物结合部位，除非它已存在于病毒构建体中。另外，这类构建体通常还包括用于肽或抗体从其所处宿主细胞中分泌出来的信号序列。优选用于此目的的信号序列是哺乳动物信号序列。任选构建体还可包括指导聚腺苷酸化的信号，以及一个或多个限制位点和翻译终止序列。举例来说，这类构建体通常可包括5′LTR、tRNA结合部位、包装信号、DNA第二链合成起点和3′LTR或其部分。可以使用是非病毒的其它载体，例如阳离子脂质、聚赖氨酸和树状聚体。
实施基因疗法方案的优选模型可参见Somia和Verma[(2000)Nature Reviews 1：91-99]、Isner(2002)Myocardial gene therapy(心肌基因疗法).Nature 415：234-239；High(2001)Gene therapy：a 2001perspective(基因疗法：2001年展望).Haemophilia 7：23-27；及Hammond和McKirnan(2001)Angiogenic gene therapy for heart disease：a review of animal studies and clinical trials(用于心脏病的血管生成基因疗法：动物研究与临床试验综述).49：561-567。
由于本发明抗体差异性识别金属蛋白活化形式的能力(参见实施例部分的实施例3)，因此可用作有效的诊断和预后工具，例如通过监测生物样品[即任何身体样品，例如血液(血清或血浆)、唾液、腹水、胸膜积液、尿液、活检样品、分离细胞和/或细胞膜制备物]中的MMP活性。当评价其中MMP活化失调促使肿瘤侵袭的癌细胞的转移特点时，这就变得特别重要。同样，本发明的抗体可以用于监测MMP抑制剂的治疗剂量。对于这类应用，本发明的抗体优选采用在本领域有标准用途的放射性、荧光、生物或酶标签或标记的任一种标记。有关这类标记用途的美国专利包括美国专利号3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。
应当了解的是，这类检测方法还可用于高通量筛选新的MMP。简单地说，可使多个生物样品与本发明的抗体接触，其中活化MMP与所述抗体连接。采取措施来使用包括例如得自肿瘤细胞系的活化MMP的生物样品。通常，使用放射性标记以减少实验体积。
或者，本发明的抗体可以用来纯化生物样品中的活性金属酶。
多种蛋白质纯化方法为本领域所知。例如，本发明的抗体或抗体片段可用于亲合层析法以分离金属酶。可以制备其中所述抗体与固体基材连接的柱子，固体基材例如琼脂糖、交联葡聚糖(Sephadex)等颗粒，使细胞裂解物等生物样品过柱，洗涤柱子后，通过浓度递增的温和变性剂，从而可释放出纯的金属酶。
诊断或治疗药盒内可包括根据本发明的教导内容产生的抗体或其片段。抗体或抗体片段可与适当的缓冲剂和防腐剂一起包装在一个或多个容器中，用于诊断或用于直接的治疗性治疗。
因此，抗体或其片段各自可以在单一容器中混合，或者放在各自的容器中。优选容器包括包装标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料(例如玻璃或塑料)制成。
另外，还可以加入其它添加剂，例如稳定剂、缓冲剂、阻断剂等。这类药盒中的抗体还可与固体支持体(例如微珠、阵列基材(例如芯片)等)连接，并用于诊断目的。药盒还可包括说明书，以确定受试对象是否患有与目标MMP表达有关的病症、障碍或疾病，或者是否有患与目标MMP表达有关的病症、障碍或疾病的风险。
考察以下实施例，本发明的其它目的、优势和新的特征对于本领域普通技术人员是显而易见的，这些实施例并不是限制性的。另外，本文上述的，以及所附权利要求书部分所要求保护的本发明各个不同的实施方案和方面，都可以在下述实施例中找到实验支持。
实验例
下面参考以下实施例并结合上述说明书，以非限制性方式对本发明进行说明。
一般而言，本文所用术语和本发明所采用的实验室方法包括分子学、生物化学、微生物学和重组DNA技术。文献中有对这类技术的详细说明。参见例如“Molecular Cloning：A laboratory Manual(分子克隆实验指南)”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology(现代分子生物学实验指南)”，第I-III卷，Ausubel，R.M.编著(1994)；Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验指南)”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆实验指南)”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“RecombinantDNA(重组DNA)”，Scientific American Books，New York；Birren等(编著)“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(基因组分析：试验手册系列)”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中公开的方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook(细胞生物学实验手册)”，第I-III卷，Cellis，J.E.编著(1994)；“CurrentProtocols in Immunology(现代免疫学指南)”第I-III卷，Coligan J.E.编著(1994)；Stites等(编著)，“Basic and Clinical Immunology(基础和临床免疫学)”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；MishellShiigi(编著)，“Selected Methods in Cellular Immunology(细胞免疫学精选方法)”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；专利和科技文献中披露了可应用的大量免疫测定法，参见例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“OligonucleotideSynthesis(寡核苷酸合成)”Gait，M.J.编著(1984)；“Nucleic AcidHybridization(核酸杂交)”Hames，B.D.和Higgins S.J.编著(1985)；“Transcription and Translation(转录和翻译)”Hames，B.D.和Higgins S.J.编著(1984)；“Animal Cell Culture(动物细胞培养)”Freshney，R.I.编著(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes(固定化细胞和酶)”IRLPress，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆实践指南)”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology(酶学方法)”第1-317卷，Academic Press；“PCR Protocols：A Guide To Methods AndApplications(PCR方案：方法和应用指南)”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual(蛋白纯化与鉴定实验指南)”CSHL Press(1996)；所有文献都通过引用结合到本文，正如本文中全部列出的一样。还提供贯穿本文的其它一般性参考文献。我们认为其中的方法是本领域众所周知的，仅为了方便读者而在此提供。所有包括在其中的资料都通过引用结合到本文中。
                      材料与方法
重组酶-使MMP-2的催化结构域(GenBank检索号NP 032636.1的氨基酸110-467)在T7启动子控制下在BL-21细胞内表达。细胞用1mM异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷诱导5小时。按缓冲液与最初培养体积为1∶25的比率，将细胞沉淀重新悬浮于50mM Tris(pH 8.0)、0.5mM EDTA、50mM NaCl、5％甘油和1％曲通(Triton)X-100中。该悬液以15,000rpm离心10分钟，将沉淀溶于50mM Tris(pH 8.0)、0.5mM EDTA、50mM NaCl、5％甘油和0.2％肌氨酰后，在冰上温育30分钟。将上清液部分加到5ml明胶-琼脂糖柱(预装，AmershamBiosciences)上，预平衡后用透析缓冲液(50mM Tris(pH 8.0)、50mMNaCl、5mM CaCl2、10μM ZnCl2、0.02％苄泽(Brij))洗涤。蛋白质用50mM Tris(pH 8.0)、1M NaCl、5mM CaCl2、10μM ZnCl2、0.02％苄泽和15％Me2SO洗脱[Rosen，O.，Inhibition of MMPs by MonoclonalAntibodies(通过单克隆抗体抑制MMP).2001]，用SDS-PAGE测定，通过荧光肽降解测定其催化活性[Knight，C.G.，F.Willenbrock和G.Murphy，A novel coumarin-labelled peptide for sensitive continuousassays of the matrix metalloproteinases(用于基质金属蛋白灵敏性连续测定的新的香豆素标记的肽).FEBS Lett，1992.296(3)：第263-6页]。
将pTWIN表达载体中的Pro-MMP-9[缺乏铰链区和血红素结合蛋白结构域，Ala1-Gly424|P14780|MMP9人基质金属蛋白酶-9前体(MMP-9)(EC 3.4.24.35)]在大肠杆菌ER2566中表达，并按照较早文献中所述方法从包含体中纯化至均质[Bjorklund，M.，P.Heikkila和E.Koivunen，Peptide inhibition of catalytic and noncatalyitc activities ofmatrix metalloproteinase-9 blocks tumor cell migration and invasion(肽抑制基质金属蛋白酶-9的催化和非催化活性阻断肿瘤细胞迁移和侵袭).J Biol Chem，2004.279(28)：第29589-97页]。Pro-MMP-9用1mM对氨基苯乙酸汞(APMA，ICN Biomedicals Inc.，Ohio，USA)激活，在37℃下溶于200mM Tris达30分钟。
使人重组pro-MMP-2和pro-MMP-9在用相应的重组痘苗病毒感染的HeLa S3细胞内表达，并按前述方法纯化至均质[Olson，M.W.，Gervasi，D.C.，Mobashery，S.和Fridman，R.(1997)J.Biol.Chem.272，29975-29983；Fridman，R.，Fuerst，T.R.，Bird，R.E.，Hoyhtya，M.，Oelkuct，T.M.，Kraus，S.，Komarek，D.，Liotta，L.A.，Berman，M.L.和Stetler-Stevenson，W.G.(1992)J.Biol.Chem.267，15398-15405]。
四羧基苯基卟啉Co(II)/Zn(II)(CoTCPP/ZnTCPP)-按文献所述方法，使ZnCl2与TCPP的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液反应合成ZnTCPP[Harada，A.等，Control of photoinduced electron transfer fromzinc-porphyrin to methyl viologen by supramolecular formation betweenmonoclonal antibody and zinc-porphyrin(通过在单克隆抗体与锌-卟啉之间形成超分子来控制光诱导的电子由锌-卟啉转移到甲基紫罗碱上).Photochem Photobiol，1999.70(3)：第298-302页]。按文献所述方法，使Co(OAc)2·4H2O与TCPP的DMF溶液反应来合成CoTCPP[Harada，A.等，Control of photoinduced electron transfer from zinc-porphyrin tomethyl viologen by supramolecular formation between monoclonalantibody and zinc-porphyrin(通过在单克隆抗体与锌-卟啉之间形成超分子来控制光诱导的电子由锌-卟啉转移到甲基紫罗碱上).PhotochemPhotobiol，1999.70(3)：第298-302页]，并纯化。
Imisdp的合成-见下文实施例7中所述。
半抗原与蛋白质缀合-通过加入1，1’-羰基二咪唑的DMF溶液(摩尔比率为1∶1)，并温育1小时，激活半抗原(4mg)用于缀合。将1-50μmoles的活化半抗原加到20mg/mL BSA或匙孔血蓝蛋白(KLH)的0.1M碳酸盐缓冲液(pH 8)中。将该溶液在室温下搅拌3小时后，针对PBS充分透析。
免疫和融合-使用缀合CoTCPP、ZnTCPP或Imisdp的各佐剂(KLH)使BALB/c小鼠免疫。按照标准方法进行免疫，随后与NSO骨髓瘤细胞系融合[Harlow，E.和Lane，D.，Using Antibodies：ALaboratory Manual Portable Protocol No.I.1998]。
抗体筛选
ELISA-采用直接ELISA，其中相应的半抗原-BSA(3μg/ml/PBS)包被在Nunc maxisorp板上，筛选生长的杂交瘤上清液中与ZnTCPP、CoTCPP或Imisdp有反应性的抗体。在4℃下进行包被过夜，在20℃下与抗体温育1小时。HRP缀合的抗小鼠mAb(Sigma)用作第二抗体，2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，ABTS，Sigma)用作底物。含有0.005％(体积/体积)吐温20(Tween 20)的PBS(PBST)用作洗涤剂。稀释缓冲液为PBS。在SPECTRAFluor Plus分光计(Tecan，Austria)中用微量板读板仪记录A602。按同样方式，使对照上清液与BSA包被板一起温育。0.5毫光密度(millioptical density)以上的吸光度值被视为阳性。
竞争ELISA-根据早前所述步骤，将不同的稀释度的杂交瘤上清液用半抗原-BSA包被板温育。绘制滴定曲线，在50％结合时测定滴定稀释度(titer dilution)。根据之前所述步骤，将稀释至滴定浓度的上清液与可溶性ZnTCPP、CoTCPP或Imisdp化合物一起预温育30分钟后，转移到半抗原包被的微量滴定板。估算的解离常数为达到50％结合所需的可溶性半抗原的浓度。
制备与纯化-所选择的杂交瘤通过有限稀释亚克隆两次，接着将姥鲛烷(pristine)(2，6，10，14-四甲基十五碳烷)预处理的腹水瘤给BALB/c小鼠注射，来进行大规模制备。MAb用G蛋白琼脂糖(Sepharose)4 Fast Flow(Amersham Biosciences)亲合层析法纯化。按12,000g将腹水离心15分钟，除去不溶性颗粒和脂质。1mL腹水用PBS稀释至5倍体积后，加到5mL柱体积G蛋白琼脂糖中。通过SDS-PAGE对洗脱峰进行分析。
同种型测定-将从生长在培养瓶中经克隆的杂交瘤中获得的培养物上清液用作mAb源。通过小鼠单克隆抗体同种型测定试剂盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)(HyCult biotechnology b.v.，The Netherlands)确定各抗体的同种型。
纯化抗体的免疫印迹分析-用8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离出纯化抗体，转印到NC膜(Bio-Rad)上，随后使用抗MMP-9抗体(Sigma)进行免疫印迹分析。与辣根过氧化物酶(Sigma)缀合的山羊抗小鼠IgG被用作第二抗体。应用ECL(Pierce)对信号进行检测。
使用纯化蛋白质的结合测定法-将MAb(10μg)与抗小鼠IgG琼脂糖微珠(Sigma)一起在PBS中于4℃温育过夜。洗涤未结合的抗体之后，在室温下温育2小时后，加入纯化的Pro-MMP-2、Pro-MMP-9、MMP-2催化结构域、MT1催化结构域或TACE(2μg)。微珠经离心收集，并用PBS洗涤三次。保持与微珠结合的蛋白质用SDS样品缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE分级分离后，用考马斯蓝染色进行检测。
免疫沉淀与蛋白质印迹-将HT1080细胞接种到培养皿中。达到80％汇合后，更换培养基(补充了10％FCS、非必需氨基酸、青霉素、链霉素、丙酮酸钠和L-谷氨酰胺的DMEM)为无血清培养基(无FCS)。再温育24小时后，由贴壁细胞收获条件培养液(CM)后，使用Millipore Centricon-10(Bedford，MA)浓缩。将浓缩的上清液用于免疫沉淀。将CM与抗1(CoTCPP)mAb(15μg/ml)一起在4℃下温育过夜。将A蛋白琼脂糖(CL-4B Amersham Biosciences)加到样品中，并在室温下混合2小时。微珠用PBS洗涤3次后，悬浮于SDS样品缓冲液中，加热到95℃达3分钟。通过离心回收免疫沉淀物，并进行SDS/PAGE。分离之后，将蛋白质转印到硝化纤维(NC)膜上，用抗MMP-2抗体探查。
为了激活由HT1080细胞产生的ProMMP-2，将1mM 4-氨基苯乙酸汞(APMA)加到浓缩的CM中后，在37℃下温育6小时。活化之后，将CM在4℃下针对PBS透析(3次)，除去APMA。如上所述用活化培养基进行免疫沉淀。
采用直接ELISA与活性MMP-9结合-使MMP-9催化结构域(2μg/ml)固定在微量滴定板各孔中。根据ELISA筛选中所述相同方法，将mAb(1mg/ml)加到各孔中。抗MMP-9抗体(Sigma)用作阳性对照，由腹水中纯化的非相关小鼠IgG亲和力用作阴性对照。
动力学分析-按照之前所述，测量酶促MMP活性[Solomon，A.等，Pronounced diversity in electronic and chemical properties betweenthe catalytic zinc sites of tumor necrosis factor-alpha-converting enzymeand matrix metalloproteinases despite their high structural similarity(肿瘤坏死因子-α-转化酶与基质金属蛋白酶催化性锌部位间尽管结构相似性高但其电化学性质仍具有显著的多样性).J Biol Chem，2004.279(30)：第31646-54页]。按照Knight等人所述[FEBS Lett，1992.296(3)：第263-6页]，通过在λex＝340nm和λem＝390nm下监测荧光肽Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2(购自Calbiochem-Novabiochem AG)的降解，来测定MMP-9、MMP-2和MT1-MMP的活性。标准测定混合物含有50mM Tris缓冲液(pH 7.5)、200mM NaCl、5mM CaCl2、20μM ZnCl2和0.05％苄泽。通过监测荧光肽QF-45(Mca-Ser-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Lys(二硝基苯基)-NH2)(购自Calbiochem-Novabiochem AG)的降解，来测定TACE的酶活性。
原位酶谱法-为了通过原位酶谱法确定MMP的净明胶分解活性的位置，将分子内猝灭的异硫氰酸荧光素标记的DQ明胶(MolecularProbes)用作由明胶酶降解的底物。通过明胶酶的蛋白酶解得到切割的异硫氰酸荧光素-明胶肽，该荧光定位表明净明胶分解活性的部位。简单来讲，将人纤维肉瘤HT1080细胞(它产生MMP-2、MMP-9和MT1-MMP)置于12mm盖玻片上。在24小时温育后，细胞用1μM13E11 mAb在37℃下处理30分钟。未处理细胞用作本实验的阴性对照。细胞用PBS洗涤后，与含有60μg/ml DQ明胶的酶谱法反应缓冲液(0.05M Tris-HCl、0.15M NaCl、5mM CaCl2和0.2mM NaN3(pH 7.6)一起在37℃下温育过夜，高浓度的叠氮化物防止明胶被吞噬，因此使细胞表面明胶分解活性得以出现)。对于处理细胞，酶谱法缓冲液含有1μM CoTCPP mAb。温育期结束时，无需固定或进一步洗涤，确定MMP的明胶分解活性的位置，并用荧光显微镜拍照，并通过Spot数码照相机拍摄影像。
                   实施例1
     锌活性部位通过小型有机金属化合物的构象模拟
MMP活性部位的锌离子是通过3个保守组氨酸残基均匀配位的。在酶原活化和底物蛋白酶解期间，锌配位由处于非催化阶段的4-配位四面体几何结构变化成为处于催化阶段的5-配位三角双锥体[Auld，D.S.，Zinc coordination sphere in biochemical zinc sites(生物化学锌部位的锌配位球体).Biometals，2001.14(3-4)：第271-313页]。因此，保守组氨酸相对于锌离子可呈不同的几何结构。为了取得这些构象，选出2种化合物作为模拟Imisdp和Co/ZnTCPP锌环境的模型(图1)。Imisdp(按以下实施例7提供的方法合成)化合物可以模拟4-配位几何结构。在这种情况下，由3个咪唑碱基和作为第四配体的水分子构成大致的四面体构象。
图2A表示构建的具有MMP-9(PDB 1GKC)催化部位的Imisdp分子3D模型的叠加图[Rowsell，S.等，Crystal structure of human MMP9in complex with a reverse hydroxamate inhibitor(与反向异羟肟酸抑制剂形成复合物的人MMP9的晶体结构).J Mol Biol，2002.319(1)：第173-81页]，它已被修饰以代表锌配体的四面体几何结构。该修饰包括将存在于X射线结构中的配体(异羟肟酸抑制剂)用水分子置换，并通过多层QM/MM方法(参见材料与方法)使全酶最优化到局部最小化。根据组氨酸的ε-氮与锌离子的距离(分别为2.04±0.06和2.02)及3个组氨酸对于金属的相对取向，计算得出的MMP-9的组氨酸锌模体和Imisdp之间存在高度相似性。第二种分子即Zn/CoTCPP在相对于金属离子的共面构象中，与锌或其类似金属钴的配位上具有4个咪唑碱基[Stevens，E.D.，Electronic Structure of Metalloporphyrins.1.Experimental Electron Density Distribution of(meso-Tetraphenylporphinato)cobalt(II)(金属卟啉1的电子结构：(间-四苯基卟啉)钴(II)的实验电子密度分布).J.Am.Chem.SOC，1981.103(17)：第5087-5095页]。该构型模拟5-配位三角双锥体几何结构中3个组氨酸中2个的构象，其中金属几乎与构成该角锥底基的2个组氨酸共面。图2B显示MMP-9(PDB 1GKC)的晶体结构，其中锌被5个配体配位(2个额外的配体是由异羟肟酸抑制剂提供的)，该角锥底基的2个组氨酸的取向和它们与锌离子的距离(对于MMP-9、ZnTCPP和CoTCPP分别为2.2±0.02、2.03±0.04和1.95)与Co/ZnTCPP分子的相当。
                      实施例2
              单克隆抗体的产生和筛选
通过使免疫小鼠后，用相应的化合物作为包被抗原，通过ELISA筛选选出特异性抗体，来产生针对CoTCPP、ZnTCPP和Imisdp的单克隆抗体(图1)。选出三种抗体用于深入的研究。需要注意的是，之所以选出这些克隆，是因为基于竞争ELISA筛选，它们分别对其免疫性半抗原显示出最佳亲和力。它们的范围为0.01-0.09μM的结合常数(下表3)是高亲和力mAb的特征。将MAb在小鼠腹水中增殖，并用G蛋白微珠纯化。
表3-抗CoTCPP、ZnTCPP和Imisdp单克隆抗体的同种型和ELISA
                  竞争分析一览
免疫性半抗原    抗体同种型    Kd[μM]*    命名
CoTCPP          IgG2b         0.09        13E11
ZnTCPP          IgG2a         0.01        15E12
Imisdp          IgG2a         0.09        6C6
*-通过竞争ELISA测定抗体对于其免疫性半抗原的结合亲合力(Kd)(有关详情参见材料与方法)。
                     实施例3
          单克隆抗体与MMP-2和MMP-9交叉反应
为了确定抗模拟MMP催化部位的锌组氨酸构象的合成化合物而产生的mAb，是否与MMP-2和MMP-9活性部位中暴露出来的锌组氨酸模体发生交叉反应，首先采用直接ELISA筛选结合MMP-9的单克隆抗体。
使3种结合MMP-9催化结构域的mAb直接吸附到微量滴定板各孔中(市售的抗MMP-9抗体用作阳性对照，非相关IgG用作阴性对照)。有趣的是，在小鼠腹水中增殖的mAb与存在于小鼠腹水中的活性MMP-9共纯化出来。仅纯化抗体与作为第一抗体的抗MMP-9抗体的蛋白质印迹分析显示清晰的条带，对应于活性MMP-9约82KDa的预期分子量。因此，mAb在体内与天然酶形成复合物。
接着采用基于免疫亲和力的测定法，筛选结合MMP-2的单克隆抗体。将抗体与MMP-2催化结构域(MMP-2cat)一起体外温育，然后用抗小鼠IgG琼脂糖微珠沉淀出来。如图3A显示，所有mAb均结合MMP-2cat。
为了确定结合发生在与活性部位直接相互作用的整个过程中，对mAb结合Pro-MMP-2和Pro-MMP-9的能力进行了分析。在潜在酶中，前域结构保护催化性裂隙(catalytic cleft)。因此，倘若前域结构识别活性部位内的组氨酸锌模体，则通过前域结构阻断活性部位可防止mAb结合。在相同条件下，未检测到与酶原的结合(图3B)。对这种与活性MMP-2结合但不与Pro-MMP-2结合的模式，进一步在类似于体内环境下用由人纤维肉瘤(HT1080)细胞培养物分泌出来的全长天然MMP-2进行仔细的研究。HT1080条件培养液与抗CoTCPP抗体免疫沉淀后，进行蛋白质印迹分析显示，与活性MMP-2但不与Pro-MMP-2结合(图3C)。这些结果表明，所有3种抗体均与MMP-2和MMP-9发生交叉反应。活性部位裂隙的暴露是抗体结合必不可少的，这就验证了mAb直接与MMP-2和MMP-9的活性部位相互作用。
                    实施例4
   抗CoTCPP和抗Imisdp mAb体外抑制MMP-2和MMP-9
抗Imisdp和抗CoTCPP mAb在微摩尔范围内抑制MMP-2和MMP-9的蛋白水解活性(图5)。在连续荧光测定法中，用猝灭的荧光肽底物，进行了mAb抑制MMP的动力学分析。预料不到的是，抗ZnTCPP mAb没有显示抑制作用。
为了测定通过抗CoTCPP mAb的抑制性质，在mAb存在或不存在时，使用酶与不同浓度的荧光肽底物进行了该实验。图4A-B中所示的Lineweaver-Burk图中的数据是特有的竞争性抑制曲线，其中MMP-9和MMP-2的Ki值分别为13μM和24μM。竞争性抑制曲线表明，mAb结合的部位与肽底物结合的部位相同。这种抑制模式进一步证实了与活性部位的直接相互作用。显然，抗Imisdp mAb对MMP-2和MMP-9显示浓度依赖性抑制作用，表现出竞争性抑制，针对MMP-9和MMP-2的计算Ki值分别为5.8μM和3μM(图5)。因为mAb识别MMP-2和MMP-9的结合部位，通过亲和力成熟方法，可同时在结构上和静电上，进一步达到mAb和MMP之间界面互补的最优化(Paul J.Carter Nature Reviews Immun.第6卷，2006343-357)。采用这个方法可得到高特异性的抑制剂，它将同时利用活性部位内部或外部的特异性特征。
                   实施例5
                  原位酶谱法
为了证实抗CoTCPP mAb在细胞水平上的抑制活性，通过原位酶谱法，研究了抗体对组成型分泌MMP-2和MMP-9的人纤维肉瘤HT1080细胞的明胶分解活性的作用。为了通过原位酶谱法确定MMP的明胶分解活性的位置，将分子内猝灭的异硫氰酸荧光素标记的明胶(DQ-明胶)用作底物。通过明胶酶的蛋白酶解得到切割的异硫氰酸荧光素-明胶肽，该荧光的定位表明净明胶分解活性的部位。
未处理人纤维肉瘤HT1080细胞(图7A)具有明显的细胞表面明胶分解活性。在1μM mAb(图7B)存在下，与对照细胞中所观察到的相比，明胶酶活性降低。这些结果表明，抗CoTCPP mAb在细胞水平上抑制MMP-2和MMP-9。
               实施例6
            本发明mAb的选择性
通过研究抗CoTCPP和抗Imisdp mAb针对MMP-14(MT1 mmP)和TNF-α-转化酶(TACE)的结合和抑制作用，对抗体选择性进行了测定，TNF-α-转化酶是一种属于相关ADAM(整联蛋白和金属蛋白酶)家族的锌依赖性金属蛋白酶(ADAM-17)。通过用合适肽底物的体外荧光酶活性实验，测定了针对MT1 MMP和TACE的抑制作用。抗CoTCPP mAb显示对MT1 MMP或TACE没有抑制作用。为了确定它是否结合TACE和MT1 MMP但却没有相应发生的抑制作用，用纯化的酶进行了基于免疫亲和力的实验，仍未检测到结合。与抗CoTCPP mAb相反，抗Imisdp mAb抑制MT1 MMP，Ki值为10μM，但是对TACE没有显示抑制作用。结果见下表4。
                      表4
MMP        6C6(IC50μM)    13E11(IC50μM)    15E12(IC50μM)
MMP-2      3±0.2          24±1             NI
MMP-9      4.5±0.2        15±0.8           NI
MT1-MMP    14.4±0.7       NI                NI
TACE       NI              NI                NI
NI，在高达30μM浓度时“不抑制”
在MMP家族成员与TACE之间，在活性部位存在高度的结构相似性，具体而言，锌结合部位周围的三维结构元件几乎相同，这归因于适应底物肽主链的需要和保守锌-结合模体EXXHXXGXXH的存在[Solomon，A.等，Pronounced diversity in electronica nd chemicalproperties between the catalyticc zinc sites of tumor necrosisfactor-alpha-converting enzyme and matrix metalloproteinases despitetheir high structural similarity(肿瘤坏死因子-α-转化酶与基质金属蛋白酶催化性锌部位间尽管结构相似性高但其电化学性质仍具有显著的多样性).J Biol Chem，2004.279(30)：第31646-54页；Lukacova，V.等，A comparison of the binding sites of matrix metalloproteinases andtumor necrosis factor-alphd converting enzyme：implications forselectivity(基质金属蛋白酶和肿瘤坏死因子-α转化酶结合部位的比较涉及选择性).J Med Chem，2005.48(7)：第2361-70页]。因此，不指望MMP间mAb的选择性仅基于保守组氨酸锌模体的识别。然而，与小分子量合成抑制剂不同，作为大蛋白质分子的抗体必须限制对包埋在蛋白质构架内活性部位裂隙的可及性。特别是因为mAb与催化性锌离子具有特异性相互作用，锌离子暴露于溶液的程度对于抗体结合必然十分关键。MT1 MMP与在很大程度上的TACE，是通过与相对于包埋起来的催化性锌离子有关的纵深的S1口袋(如其晶体结构所示)来区分的。活性部位深度的这种差异可说明抗体为什么对TACE缺乏抑制作用。这些结果表明，可根据催化性锌离子的暴露程度达到选择性。当比较MMP和TACE时，应当考虑的另一个重要因素是活性部位口袋在疏水性和极性等化学性质方面的差异(参见图8)。例如，TACE的活性部位的极性比大多数MMP的活性部位的大。Solomon等人证实，活性部位极性的这类变化直接影响活性部位组氨酸咪唑环针对催化性锌离子的取向[Solomon，A.等，Pronounced diversity inelectronic and chemical properties between the catalytic zinc sites oftumor necrosis factor-alpha-converting enzyme and matrixmetalloproteinases despite their high structural similarity(肿瘤坏死因子-α-转化酶与基质金属蛋白酶催化性锌部位间尽管结构相似性高但其电化学性质仍具有显著的多样性).J Biol Chem，2004.279(30)：第31646-54页]。
通过测定抗CoTCPP和抗Imisdp与非相关锌依赖性酶-碳酸酐酶(CA)和布氏热厌氧菌(brockii)醇脱氢酶(TbADH)的交叉反应性，进一步仔细研究了抗CoTCPP和抗Imisdp的选择性。与MMP类似，CA含有与3个组氨酸残基和1个水分子四面体配位的锌离子，TbADH含有与4个不同的氨基酸残基(组氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)四面体配位的催化性锌离子。进行了合适的体外功能性抑制实验以及相似的基于免疫亲和力的实验，以研究与这些酶的交叉反应性，然而未观察到结合或抑制。还对抗CoTCPP mAb与相关生理性卟啉(例如肌红蛋白和血红蛋白和维生素等内的血红素基)的交叉反应性进行了测定。在竞争ELISA以及免疫亲和力测定法中未检测到交叉反应。
碳酸酐酶、醇脱氢酶都具有相当程度包埋的活性部位，同样，肌红蛋白和血红蛋白的卟啉部分也不暴露。维生素B12在平面咪唑结构中心含有金属，但是轴向配体可能干扰mAb的结合。总之，这些结果证实，抗CoTCPP mAb识别无轴向金属-配位残基干扰的相对暴露的金属-咪唑构型。
                           实施例7
[2-(2-氨基乙基氨基甲酰基)-乙氧基甲基]-三-[2-(N-(3-咪唑-1-基-丙
         基))-乙氧基甲基]甲烷锌(II)的合成，图9(3)
(i)四(2-五氯-苯氧基羰基-乙氧基甲基)甲烷的合成：按照HaimWeizmann等人的方法(JACS 1996，118，12368-12375)，进行五氯苯酚-取代四-活性酯(pentachlorophenol-substitution tetra-active ester)的合成。
(a)单取代的三活性酯的制备：将四活性酯(1)(1g，0.69mmol)和BocNHCH2CH2NH2(100mg，0.62mmol)溶于20ml无水二氯甲烷。在用三乙胺保持pH～8的同时，将该溶液搅拌过夜。使该溶液浓缩后，用快速色谱法纯化(CHCl3∶乙酸乙酯(90∶10))，得到(152mg，收率15％)。1H NMR 250MHz(CDCl3)δ：1.4(s，9H，Boc)；2.4(t，2H，J＝6Hz，-CH2-CH2-CONH)；2.9(t，6H，J＝6Hz，-CH2-CH2-COOPCP)；3.2(q，2H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-NHBoc)；3.31(t，2H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-NHBoc)；3.38(s，2H，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-)；3.42(s，6H，-C-CH2-O-CH2-CH2-COOPCP)；3.61(t，2H，J＝6Hz，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-)；3.78(t，6H，J＝6Hz，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-)；5.03(t，1H，NH)；6.7(t，1H，NH)。
(b)三(咪唑)的制备：将单取代的三活性酯(150mg，0.11mmol)和1-(3-氨基丙基)-咪唑(33μlt，0.39mmol)溶于(20ml)无水THF中后，在室温下搅拌过夜。使白色溶液浓缩后，用硅胶(0.063-0.200mm)柱色谱法纯化(采用CHCl3∶甲醇(50-90％))，得到(45mg，收率44％)。1HNMR 250MHz(CDCl3/MeOD)δ：1.45(s，9H，Boc)；2.0(m，6H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi)；2.4(t，6H，J＝6Hz，-O-CH2-CH2-CONH-)；2.5(t，2H，J＝6Hz，-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc)；3.0(m，8H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi，-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc)；3.1(t，2H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-NHBoc)；3.4(b，8H，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-)；3.6(m，8H，J＝6Hz，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NHBoc，)；4.0(t，6H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi)；5.5(t，1H，NH)；6.98(s，3H，Imi)；7.06(s，3H，Imi)7.32(t，3H，NH)；7.57(s，3H，Imi)。ESI-MS：910.87[M+Na]+，925.98[M+K]+。
(c)具有游离胺的三(咪唑)(2)的制备：将三(咪唑)(40mg，0.045mmol)溶于6ml二氯甲烷和三氟乙酸(2∶1)的混合物中后搅拌1小时。使反应混合物浓缩，与四氯化碳蒸发数次后，经高真空干燥从混合物中除去TFA，得到(30mg，收率85％，b)。1H NMR 250MHz(CDCl3/MeOD)δ：1.9(m，6H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi)；2.3(m，8H，J＝6Hz，-O-CH2-CH2-CONH-，-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2)；2.9(t，2H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi)；3.0(t，2H，J＝14Hz，-CONH-CH2-CH2-NH2)；3.31(t，2H，J＝6Hz，-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2)；3.4(b，8H，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-)；3.6(m，8H，J＝6Hz，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2)；4.0(t，6H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi)；7.26(s，3H，Imi)；7.32(s，3H，Imi)；8.82(s，3H，Imi)。
3.三(咪唑)-Zn(II)复合物(3)的制备：将化合物2(30mg，0.038mmol)溶于1ml甲醇。向该溶液加入2-3滴1N NaOH溶液和ZnCl2(5mg，0.04mmol)后搅拌半小时。经过滤得到白色沉淀(12mg，收率37％)。1H NMR 250MHz(MeOD/D2O)δ：1.8(m，6H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi)；2.4(m，8H，J＝6Hz，-O-CH2-CH2-CONH-，-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2)；3.0(t，2H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi)；3.0(t，2H，J＝6Hz，-CONH-CH2-CH2-NH2)；3.31(b，2H，-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2)；3.4(b，8H，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-)；3.6(m，8H，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-，-C-CH2-O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2)；4.2(b，6H，-CONH-CH2-CH2-CH2-imi)；7.19(s，3H，Imi)；7.28(s，3H，Imi)；8.55(s，3H，Imi).ESI-MS：852.09[M+1]+。
Figure G2008800126731D00511
            R＝O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2
[2-(2-氨基乙基氨基甲酰基)-乙氧基甲基]-三-[2-(N-(3-咪唑-1-基-丙基))-乙氧基甲基]甲烷。
                     实施例8
            6C6与明胶酶催化部位的交叉反应
现已发现，一定量的6C6与得自腹水的活性MMP9共纯化。通过蛋白质印迹和明胶酶谱法(数据未显示)表明，腹水瘤中存在可检测量的MMP9，诱导小鼠mAb增殖。用G蛋白亲合层析法(G蛋白与抗体恒定区结合，留下游离的可变区与抗原相互作用)，从小鼠腹水中纯化出MMP9-抗体复合物。如图11A所示，使用市售的抗MMP9抗体，通过蛋白质印迹法纯化的6C6MMP9复合物，对共纯化的MMP9进行了检测。鉴定出对应于活性MMP9的分子量为～82kDa的条带缺乏前域。在按相同方式纯化和分析的非相关小鼠mAb对照中，未检测出此条带。这些结果表明，6C6与内源活性小鼠MMP9形成了特异性体内复合物。
为了进一步检查与高度同源的MMP2酶的活性形式的结合，体外进行了类似的免疫沉淀实验。将6C6与纯化的MMP2催化性片段按3∶1摩尔比率一起温育。A蛋白琼脂糖免疫沉淀物的SDS-PAGE分析显示，6C6与活性MMP2催化性片段形成特异性复合物(图11B)。仅A蛋白微珠无法使MMP2免疫沉淀。其次，测定了与无活性酶原(潜在酶)形式MMP2和MMP9的结合。由于所有MMP都作为无活性的酶原产生，因此它们具有阻碍活性部位的约80-90氨基酸的N端前肽[Bode，W.和K.Maskos，Biol Chem，2003.384(6)：第863-72页](图11D)。以相同方式，用pro MMP2和pro MMP 9进行了免疫沉淀实验。重要的是，抗体不与潜在酶结合(图11C)。引人注目的是，6C6仅与其中活性部位锌蛋白质复合物暴露于溶液的活性酶构象结合。
这些结果证实，针对模拟活性部位的生物无机化学半抗原产生和筛选的6C6抗体，与MMP2和MMP9的蛋白质活性部位发生交叉反应。显然，锌三角架半抗原能够模拟天然蛋白质中相应锌-组氨酸表位的三维结构。显然，识别这个最小金属-蛋白质结构表位足以引起与天然酶发生交叉反应。仅与活化酶结合而不与其中前域阻碍接近催化性锌蛋白表位的它们的潜在形式结合(图11D)，这就表明6C6与锌催化部位的直接相互作用。需要注意的是，6C6在体内结合天然的MMP9证实，抗体可以在复杂的蛋白质环境中与酶形成特异性复合物。
将活化酶种类与潜在形式区分开来是6C6独特而有价值的功能性质。这种活性是6C6独有的，与针对MMP9产生的其它抗体不同。这是因为用蛋白质免疫通常得到针对表面环的表位，而催化性氨基酸大多包埋在酶表面的裂隙内部。该分子这个组成部分被视为低免疫原性的。因此，通过常规方法产生的中和单克隆抗体(抗天然蛋白质或蛋白质片段)一般与活性部位的邻接区或邻近区而不是与活性部位催化性残基相互作用，并通过空间位阻机制抑制。这类抗体除与活性形式结合外，通常还与无活性的前体结合。本发明独特的活性部位模拟半抗原免疫方法能够产生识别MMP中的催化性金属蛋白质残基的抗体，这不是通过常规蛋白质免疫方法可获得的。
                      实施例9
          6C6在体外和原位选择性抑制明胶酶
为了确定6C6针对MMP9和MMP2的酶抑制能力，采用跨明胶酶活性部位裂隙的小荧光肽底物(7个氨基酸)，进行了抑制实验。测定了数个浓度mAb的初始反应速度。6C6抑制两种酶的催化活性(图12A-B)。通过分析在不同浓度的抑制性抗体存在下随底物浓度而变化的MMP9活性，来确定竞争性抑制机制。图12A中所示的双倒数Linweaver-Burk图形式的数据，展现出竞争性抑制曲线。将抑制数据拟合到竞争性抑制系统方程式，分别得到MMP9和MMP2的Ki为1±0.1μM和1.4±0.16μM。还确定了在与高浓度(30μM)的MMP9一起温育过夜后，6C6不被MMP-9裂解，这就表明所观察到的6C6抑制MMP9不是由竞争剂底物的裂解所致。MMP9的动力学分析被视作代表性的6C6抑制机制，因为它是被设计来识别不同MMP中的相同表位的。抑制作用对于MMP2和MMP9的催化性片段种类以及明胶酶的全长酶形式都是一致的。准确地讲，含有催化结构域以及纤连蛋白结构域但是不含血红素结合蛋白结构域的重组MMP9和MMP2催化性片段；以及仅含有催化结构域并缺乏纤连蛋白和血红素结合蛋白结构域两者的MMP9重组最小催化单元都同样抑制全长(对氨基苯乙酸汞(APMA)激活的)明胶酶，如前所述，从被重组痘苗病毒感染的HeLa S3细胞的培养基中纯化出明胶酶，所述重组痘苗病毒编码人proMMP2和pro MMP9的全长cDNA[Olson，M.W.等，J Biol Chem，2000.275(4)：第2661-8页]。这些结果证实，抑制是由与催化结构域的直接相互作用介导的，不依赖于与血红素结合蛋白或纤连蛋白结构域的相互作用。竞争性抑制曲线提供了与催化性锌部位直接的相互作用的又一依据。以相同方式制备的非相关mAb不干扰酶的光解活性。因此，所观察到的抑制不是由痕量的共纯化的污染物所产生的。这些实验的抗体由组织培养物中纯化，在纯化的抗体组分中不含可检测量的活性MMP9。
为了考察6C6的选择性，测定了其针对不同基质金属蛋白酶亚类的反应性，所述亚型包括溶基质蛋白(MMP7)、膜型MMP(MT1MMP)和相关的解联蛋白(ADAM)、肿瘤坏死因子-α-转化酶(TACE)。这些酶的核心结构非常相似，变化大多在周边环内发生。特异性锌-组氨酸支架结构非常保守，显示出一个共有螺旋之后接着一个环，该环用作与催化性锌离子配位的3个组氨酸残基的支架结构(图13)。
用合适的荧光肽底物进行了类似的抑制试验。有趣的是，在按高达30μM的浓度与6C6一起温育时，MMP-7或TACE两者都没有在任何可测量的程度上受到抑制，这就表明了针对明胶酶选择性的实质上的水平。MT1 MMP被6C6抑制，效价强度较低，Ki为14.4±0.75μM。有趣的是，不能只根据抗体识别保守锌-组氨酸支架结构的设计来说明这种选择性的起源，因为核心结构，尤其是活性部位非常相似。大多在周边环内的序列改变规定了锌-组氨酸模体的暴露程度，活性部位的形状及其表面静电上的差异，可以解释这种选择性抑制模式。
还测定了6C6与不同的锌依赖性金属蛋白酶即碳酸酐酶和醇脱氢酶的交叉反应性。与MMP类似，碳酸酐酶(CA)具有与3个组氨酸配体和1个水分子四面体形式配位的催化性锌离子。因此，若干强效的小分子MMP抑制剂(磺酰化氨基酸异羟肟酸类型的MMP抑制剂)也可用作有效的CA抑制剂，反之亦然。之前研究的作为CA抑制剂的一些N-羟基磺酰胺也具有针对MMP的抑制特性[Scozzafava，A.和C.T.Supuran，J Med Chem，2000.43(20)：第3677-87页]。得自嗜热菌(TbADH)醇脱氢酶的活性部位包括不同的锌-蛋白部分，其中锌与裂隙内的组氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸结合。在浓度高达30μM的mAb存在下，适当的功能抑制实验显示，针对两种酶都无抑制作用。需要注意的是，位于10链、扭型β折叠中心区的CA的活性部位，由锥形裂隙构成，深其中四面体Zn2+离子位于裂隙底部。与小分子抑制剂不同，锌离子必需包埋得非常深以致不与抗体相互作用。重要的是，这些实验进一步展现6C6的选择性抑制曲线。
在细胞环境中，通过原位酶谱法，使用明胶酶的天然底物-明胶，进一步测定了6C6针对明胶酶的抑制作用。将生长在培养基中表达膜结合的MT1 MMP并分泌MMP-2和MMP-9的人纤维肉瘤HT1080细胞[Giambernardi，T.A.等，Matrix Biol，1998.16(8)：第483-96页]用荧光素缀合的明胶(DQ明胶)覆盖。如图14A-C中所示，未处理的HT1080细胞具有显著的细胞表面明胶分解活性。用5μM mAb处理显著降低表面明胶分解活性，与基于机制的明胶酶抑制剂即SB-3CT所观察到的抑制类似。SB-3CT具有类似的抑制曲线，因为它既抑制明胶酶，又抑制MT1MMP(对于MMP2、MMP9和MT1MMP，Ki值分别为28nM、400nM和110nM)。总之，6C6既体外抑制合成肽裂解，又原位抑制天然大分子底物。6C6针对MMP9显示竞争性抑制模式，与抑制的TIMP机制类似。竞争性抑制曲线是与催化性锌部分直接相互作用的又一个依据。重要的是，6C6显示针对明胶酶的选择性抑制曲线。该选择性的起源无法通过保守锌-组氨酸模体的抗体靶向作用来解释。这些结果表明，抗体
与另外的酶表面决定子相互作用，这可解释所观察到的特异性。
                    实施例10
         6C6MAb治疗对小鼠中DSS诱发的结肠炎的作用
有越来越多的证据表明，MMP参与组织重塑和与几种炎症性疾病(包括炎性肠病(IBD))有关的破坏[Baugh，M.D.等，Gastroenterology，1999.117(4)：第814-22页；Heuschkel，R.B.等，Gut，2000.47(1)：第57-62页；von Lampe，B.等，Gut，2000.47(1)：第63-73页；Kirkegaard，T.等，Gut，2004.53(5)：第701-9页]。
因此，本发明的发明人研究了炎性肠病小鼠实验模型中6C6的体内抗明胶酶抑制作用。
为了探测6C6的抑制活性，研究了mAb治疗改善DSS诱发的急性结肠炎的能力。具体地讲，向高易感性小鼠品系C57BL/6提供2％DSS达5天。通过腹膜内注射，1.5或5mg/kg小鼠，从诱导当天起每日给予6C6治疗。暴露于2％DSS的小鼠出现急性结肠炎的症状，伴有腹泻、直肠出血和体重严重下降。
在每日监测疾病活性指数(DAI)的基础上(体重、出血和大便粘稠度的综合评分)，mAb治疗的作用如图15A所示。与对照相比，MAb治疗的小鼠具有降低疾病活性(从第6天起十分明显)。DSS诱发的结肠炎的另一种肉眼可见的表现是结肠长度缩短(图15B)。因此，与幼稚小鼠相比，在DSS诱导后11天，发现未治疗小鼠的结肠长度缩短30％。相比之下，分别给予1.5和5mg/kg小鼠的6C6治疗小鼠仅平均缩短22％或16％。由该病的死亡率也证实了6C6的保护作用。诱发疾病后11天，发现未治疗小鼠的死亡率为60％，而在6C6治疗小鼠中观察到的死亡率仅为33％(图15C)。因此，C57BL/6小鼠用6C6治疗，除了减轻DSS诱发的结肠炎出现的症状外，还使存活率得到提高。
总的来说，这些结果表明6C6作为明胶酶抑制剂的治疗潜力。
                   实施例11
     通过X射线吸收光谱法表征MMP9-6C6mAb复合物
为了进一步研究活性MMP9和受抑制的MMP9-6C6复合物间的差异，进行了X射线吸收光谱测定。图16显示采集的荧光XAS数据。该数据以傅里叶变换(Fourier transform，FT)光谱的形式表示，以提供MMP9催化性锌离子中第一和第二配位壳内各个原子的径向分布。可以在噪音水平之上观察到游离酶和受抑制酶径向分布光谱的表观变化。这些光谱变化表明催化性锌离子的局部环境在与6C6结合时经历了结构变化。在活性酶和受抑制酶间观察到的FT光谱特征的空间分布和峰强度两者的差异明确表明在mAb复合物形成时催化性锌的局部结构发生了改变。
应当了解的是，为了清楚起见，在不同的实施方案内容中加以描述的本发明的某些特征，同样也可合并起来在一个实施方案中提供。相反，为简明起见在一个实施方案内容中加以描述的本发明的各种特征，同样也可单独或以任何合适的再合并方式予以提供。
尽管已结合其具体的实施方案对本发明加以描述，但是十分明显的是，许多替换、修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，本发明意在包括所有落入所附权利要求书的精神和广大范围内的这些替换、修改和变动。本说明书所提及的所有出版物、专利、专利申请都通过引用全部结合到本说明书中，其程度与每个独立出版物、专利、专利申请具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。另外，在本申请中，任何参考文献的引用或标示都不得解释为承认这样的参考文献都可用作本发明现有技术。
                     参考文献一览
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Figure IYZ000006608443300011
Figure IYZ000006608443300021
Figure IYZ000006608443300041
Figure IYZ000006608443300051
Figure IYZ000006608443300061

Claims (9)

1.具有下式(II)的化合物：
Figure FSB0000112502720000011
其中R＝O-CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2。
2.一种抗体，所述抗体包含抗原识别区，其中所述抗体轻链上CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO：7；其中所述抗体轻链上CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO：8；其中所述抗体轻链上CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO：9；其中所述抗体重链上CDR1的氨基酸序列是SEQID NO：10；其中所述抗体重链上CDR2的氨基酸序列是SEQ IDNO：11；其中所述抗体重链上CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO：12，所述抗体能够结合权利要求1的化合物。
3.权利要求2的抗体，其中所述轻链上CDR1的氨基酸序列由核酸序列SEQ ID NO：13编码，其中所述轻链上CDR2的氨基酸序列由核酸序列SEO ID NO：14编码，其中所述轻链上CDR3的氨基酸序列由核酸序列SEQ ID NO：15编码，其中所述重链上CDR1的氨基酸序列由核酸序列SEQ ID NO：16编码，其中所述重链上CDR2的氨基酸序列由核酸序列SEQ ID NO：17编码，以及其中所述重链上CDR3的氨基酸序列由核酸序列SEQ ID NO：18编码。
4.权利要求2的抗体，所述抗体能够抑制MMP-2和MMP-9。
5.一种产生基质金属蛋白酶抑制剂的方法，该方法包括制备抗权利要求1的化合物的抗体，从而产生基质金属蛋白酶抑制剂。
6.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求2的抗体和药学上可接受的载体。
7.权利要求2的抗体在制备治疗与基质金属蛋白酶活性失调或异常有关的疾病的药物中的用途。
8.权利要求7的用途，其中所述疾病是炎性肠病。
9.权利要求2的抗体，其与固体支持体连接。
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