KR20090113908A

KR20090113908A - 금속단백질 활성 억제용 항체 및 이를 함유하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20090113908A
Application number: KR1020097019866A
Authority: KR
Inventors: 아이릿 사기; 타마르 다논; 네타 셀라; 아브라함 산저; 리나 아라드-옐린; 라그하벤드라 키케리
Original assignee: 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2008-02-21
Publication date: 2009-11-02
Also published as: EP2155691A1; US8324355B2; US20100233188A1; RU2009132006A; IL224120A; WO2008102359A1; US9416195B2; IL224121A; US20160257765A1; US20180134808A1; CN101702906A; JP5792231B2; BRPI0807256A2; WO2008102359A9; US20130224225A1; US9902783B2; JP2013241435A; CN101702906B; MX2009008914A; RU2503682C2

Abstract

본 발명은 하기 일반식(I)을 갖는 화합물, 및 상기 화합물과 특이적으로 결합할 수 있는 항원 인지 영역을 포함하는 항체에 관한 것이다.

[화학식 I]

상기 식에서,

m과 n은 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;

X₁ -X₃과 Y₁ -Y₃는 각각 독립적으로 O 또는 S이고;

R₁ -R₃는 각각 독립적으로 수소, 알킬 및 시클로알킬로 구성되는 군으로부터 선택되며; 및

R은 (CH₂)x-C(=O)NR'-(CH₂)y-NR'R''이며

(여기서 x와 y는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;

R'와 R''는 각각 독립적으로 수소, 알킬 및 시클로알킬로 구성되는 군으로부터 선택된다)

금속단백질, 기질 금속단백질분해효소(MMPs), 합텐, 항원 인지 영역, 항체

Description

금속단백질 활성 억제용 항체 및 이를 함유하는 약학적 조성물{ANTIBODIES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING SAME USEFUL FOR INHIBITING ACTIVITY OF METALLOPROTEINS}

본 발명은 금속단백질분해효소(metalloprotease)와 같은 금속단백질의 활성 억제에 사용될 수 있는 합텐(hapten) 분자 및 항체, 및 금속단백질의 비정상 활성과 관련된 전이성 암(metastatic cancer)과 같은 질병 치료용 항체의 사용방법에 관한 것이다.

기질 금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP)는 세포외 기질 (Extracellular matrix, ECM)의 리모델링에 관여하는 핵심 효소이다. 이들 효소는 관절 연골 또는 기저막의 다양한 결합조직 부분을 파괴할 수 있다.

인간의 MMP 유전자군은 적어도 28개의 구조적으로 연계된 단백질(도 1 참조)로 구성되며, 유사한 총괄 구면 토폴로지(도 2 및 Borkakoti, 1998 참조)를 공유한다. 각각의 MMP는 불활성이며, 잠재적 프로-효소로 분비된다. 촉매성 아연 도메인은 약 180개의 아미노산으로 구성되며, 고도의 보존 서열 HE-GH-LGL-H는 금속 Zn(2⁺)이온에 결합된 3개의 히스티딘(즉, H) 잔기를 제공한다. 전효소의 촉매성 아 연 이온의 4번째 결합 부위는 시스테인 잔기(Morgunova 등, 1999)에 결합되며, 효소 활성화에 의해 활성부위(Van Wart and Birkedal-Hansen, 1990)로부터 분리된다. 그 결과, 활성화된 MMPs의 4번째 결합 부위는 물 분자로 채워지고, 보존 글루타민 잔기에 수소 결합된다. 이러한 공정은 목표 기질과 활성화된 물 분자의 펩티드 결합의 가수분해를 용이하게 한다.

금속단백질분해효소에 의해 결합조직의 비제어된 파괴는 많은 병리학적 증상의 특징으로, 아마 과잉의 MMP 활성 또는 자연 MMP 조직 억제제(TIMPs) 및 MMPs 사이의 불균형으로부터 야기된다. TIMPs는 MMPs의 활성 아연 결합 부위로 화학량적인 착화합물을 생성하여 MMP를 억제한다.(Gomez et al., 1997; henriet et al., 1999; Bode et al., 1999; Will et al., 1996). TIMPs 농도가 충분하지 않을 때, ECM의 점진적인 느린 분해는 류머티스성 관절염(Walakovits et al., Arthritis Rheum, 35:35-42, 1992)에서의 연골 기질의 손실 및 골관절염(Dean et al., J. Clin. Invest. 84:678-685, 1989) 또는 골다공성(Hill et al., Biochem. J. 308: 167-175, 1995)에서 골 기질 분해를 가져올 수 있다. 울혈성 심부전과 같은 다른 상황에서, 심장 ECM의 급속한 분해가 일어날 수 있다.(Armstrong et al., Canadian J. Cardiol. 10:214-220, 1994).

부가적으로, MMPs는 갈렉틴-3(Ochieng J., Biochemistry, 1994 33(47): 14109-14), 플라스미노겐(Patterson, BC., JBC, 1997 272(46):28823-5, 인터루킨-8, 연결조직 활성 펩티드 III, 혈소판 인자-4(van den Steen, 2000 Blood. 2000 Oct 15;96(8):2673-81), 프로인터루킨-1β(Schonbeck, 1998), 인터루킨-2 수용체 α 체인[Sheu, B.C, Hsu, S.M., Ho., Lien, H.C., Huang. S. C. Lin, R. H. A novel role of metalloproteinase in cancer-mediated immunosuppresion Cancer Reserach(2001) 61, 237-242], 및 프로-형질변환 성장 인자-β[TGF-β, Yu, Q. Stamenkovic, I Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis Genes Dev (2000) 14, 163-176]와 같은 세포질 분열(cytokines) 및 화학운동성(chemokines)의 성숙에 역할을 하는 것으로 공지되어 있다.

MMPs의 조절되지 않은 활성과 관련된 다른 병리학적 질환은 전이성 종양 세포에 의한 ECM의 급격한 리모델링을 포함한다. 이러한 질환에서, 활성화된 MMPs는 암 세포 또는 주변 조직에 의해 발현된다. MMPs가 종양의 증식 및 전이에 관여한다는 상당한 증거가 있다.(예, Davidson et al., Chemistry & Industry, 258-261, 1997 참조, 본문에 참고로 인용함). 종양의 전이과정에서, MMPs는 ECM을 파괴하여 종양 세포가 주변 혈관으로 침범하도록 하며, 이들 종양 세포는 별개의 기관으로 전이되어 제 2 종양을 생성한다. 이들 제 2 부위에서 침범적인 증식은 조직을 파괴하는 MMPsdp 의해 조정된다. 더욱이, MMP 활성은 종양이 일정 크기 이상으로 증식하는데 필요한 신생혈관 생성(angiogenesis)이라고 칭하는 새로운 혈관의 침략적 성장에 기여한다. MMP군의 개체 중에서, 젤라티나제 B로 알려진 분비된 인간 MMP-9은 세포외 기질(ECM) 이화작용뿐만 아니라 다발성 경화증(mutilple sclerosis, MS)(Opdenakker)과 같은 신경계 질환과 관련된 단백질 기질의 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 최근의 논문은 예비-처리한 II형 콜라겐(Van den Steen, 2004)을 분절(cleaving)하여 자동면역 질환을 촉진하는데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 생성물은 자동면역 질환을 발생하는 잔존 에프토프인 콜라겐 II형 단편이다.

인간 생리학 및 병리학에서 MMPs의 광범위한 역할이 주어진다는 것은 MMP 과잉 활성을 억제하는 의약을 설계하는데 많은 노력을 하도록 영향을 끼친 것에 놀랄 일은 아니다.

의약을 발견하고자 하는 노력은 아연 이온과 배위결합하여 표적 MMP를 비활성화시키는 기능 기를 함유하는 억제제 종류에 집중하였다. 이러한 억제제 종류 중 하나는 촉매성 부위에서 아연 이온과 히드록사믹 기를 갖는 히드록실 및 카르보닐 산소를 경유하여 이좌배위자 방법으로 특이적으로 상호작용하는 원섬유성(fibrillar) 콜라겐의 작은 펩티드 유사물인 히드록사메이트 억제제이다. [Grams et al., 1995), Biochem. 34: 14012-14020; Bode et al., (1994), EMBO J., 13: 1263-1269].

히드록사메이트 주제의 MMP 억제제는 통상 탄소 골격(WO 95/29892, WO 97/24117, WO 97/49679 및 EP 0780386), 펩티딜 골격(WO 90/05719, WO 93/20047, WO 95/09841 및 WO 96/06074) 또는 펩티도미메틱 골격[Schwartz et al., Progr. Med. Chem., 29:271-334(1992); Rasmussen et al., Pharmacol. Ther. 75:69-75(1997); Denis et al., Invest. New Drugs, 15:175-185(1997)]으로 구성된다. 양자택일하여, 이들은 페닐 고리의 한 면에 결합된 설폰아미도 설포닐 기 및 1 내지 4개의 탄소원자(EP 0757984 A1)를 갖는 사슬을 통해 히드록사메이트 기에 결합 된 설폰아미도 니트로겐을 함유한다.

다른 펩티드-주제 MMP 억제제로는 콜라게나제(collagenase) 억제활성을 나타내는 티올 아미드(미국특허 제4,595,700호), MMP-3, MMP-2 및 콜라게나제를 억제하는 바이페닐에틸글리신을 함유하는 N-카르복시알킬 유도체(Durette, et al., WO-9529689), MMPs, TNF-알파 및 아그래카나제(미국특허 제6,495,699호 참조) 및 트리사이클릭 설폰아미드 화합물(미국특허 제6,492,422호)을 억제하는 락탐 유도체가 있다.

비록 펩티드-주제 MMP 억제제가 뚜렷한 치료학적 잠재성이 있지만, 임상치료에의 사용은 제한적이다. 펩티드-주제 히드록사메이트는 제조비용이 고가이고, 낮은 신진대사 안전성 및 경구 생체이용가능성[예, 바티매스타트(BB-94)]를 가지고 있다. 이들 화합물은 빠르게 글루쿠로니데이트(glucuronidate)되어 카르복실산으로 산화하여 담즙에서 분비된다.[Singh et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 337-342, 1995; Hodgson, "Remodeling MMPIs", Biotechnology 13: 554-557, 1995)]. 더욱이, 펩티드-주제 MMP 억제제는 종종 각각의 MMP 효소에 대해 동일하거나 유사한 억제효과를 나타낸다. 예를 들어, 바티매스타트(batimastat)는 각각의 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 및 MMP-9에 대해 약 1 내지 약 20 nM의 IC₅₀값을 나타내는 것으로 보고되었다.[Rasmussen et al., Pharmacol. Ther., 75(1): 69-75(1997)]. 게다가, 몇몇 히드록사메이트 억제제의 사용은 마리마스타트(BB-2516)로 인한 머스콜로켈레탈(muscoloskeletal) 문제, CGS27023A(Novartis)로 인한 광범위한 반점상구 진(masculopapular rash)[Levitt et al., 2001, Clin. cancer Res. 7:1912-1922] 및 BAY12-9566(Bayer)로 인한 신장 이상, 빈혈, 견통 및 요총, 혈소판감소증,증(thrombocytopenia), 구역질, 피로, 설사 및 심부 정맥 혈전증(Deep Vein Thrombosis)[Heath et al., 2001, cancer Chemother. Pharmacol. 48:269-274]과 같은 심각한 부작용과 관련이 있다. 더욱이, 메리마스타트(marimastat), 프리노마스테트(prinomastat)(AG 3340, Agouron) 및 Bay 12-9566로 진행성 암 환자에 대한 파제 III 임상실험은 전이 억제에 임상효과가 입증되지 않았다(Zucker et al., 2000, Oncogene 19:6642-50).

다른 MMP 억제제는 생체외에서 몇몇 MMPs의 발현을 차단하는 것으로 나타난 화학적으로 변성된 비세균성 테트라사이클린(CMTs)이다. 그러나, 이들 화합물의 생체내 효능이 제한적인 것으로 나타났다. 예를 들어 CMT 억제제인 독시사이클린은 MMP-1의 조직 농도를 감소시켰으나 인간 환자의 죽상판 경동맥 플라크에서 MMP-2, MMP-3, 또는 MMP-9의 농도는 감소시키지 않았다.(Axisa et al., 2002, Stroke 3:2858-2864).

최근에 메커니즘-주제 MMP 억제제인 SB-3CT가 MMP 활성 부위의 X-선 결정학 정보에 따라 설계되었다.(Brown et al., 2000). X-선 흡수 논문은 촉매성 아연과 이 분자의 결합은 프로-효소의 뒤에 활성 부위 금속 이온 주위로 형태학적 환경을 재구성하는 것으로 밝혀졌다. [Kleifeld et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 17125-31]. 그러나, 이 약으로 얻어진 치료 효능은 아직 측정된 바 없다.

천연 억제제의 다른 종류로는 단일클론 항체이다. 촉매성 도메인 MMP-1내에 특정 펩티드 서열에 대해 몇몇 항체들이 제안되었다.(Galvez et al., 2001, J. Biol. Chem., 276: 37491-37500). 그러나, 이들 항체가 비록 MMP의 생체외 활성을 억제할 수 있다 하더라도, 이러한 항체의 생체내 효과를 입증하는 결과가 입증된 바 없다.

상술한 바와 같이, MMPs의 촉매부위는 기질 결합에 이은 효소 활성화(도 2A-C 참조)에 이용가능한 배위결합된 금속 이온을 포함한다. 그래서, 효소의 제1 아미노산 서열로 유도된 종래의 항체는 비활성 형태의 효소로부터 활성 형태를 구별할 수 없어, 이러한 효소의 강력한 억제제로 작용하지 못하였다.

본 발명자들은 이전에 MMPs의 촉매 부위의 전자 및 구조적 결정자를 모두 인식하는 항체가 강력한 억제제이고, 불균형 MMP 활성과 연관된 질병을 치료하는데 사용될 수 있다고 개시한 바 있다.(PCT 공개 WO 2004/087042 참조).

그래서, 금속단백질의 촉매 부위의 전자적 및 구조적 결정자를 모방하는 특정 합텐 화합물뿐만 아니라 이것에 관련된 특정 항체의 필요성이 광범위하게 인식되었고, 매우 바람직한 일이다.

발명의 요약

본 발명의 하나의 관점에 따르면, 하기 일반식(I)을 갖는 화합물이 제공된다.

[화학식 I]

상기 식에서,

m과 n은 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;

X₁ -X₃과 Y₁ -Y₃는 각각 독립적으로 O 또는 S이고;

R은 (CH₂)x-C(=O)NR'-(CH₂)y-NR'R''이며

(여기서 x와 y는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;

R'와 R''는 각각 독립적으로 수소, 알킬 및 시클로알킬로 구성되는 군으로부터 선택된다.)

본 발명의 바람직한 실시양태의 다른 특징에 따르면, 하기 일반식(II)을 갖는 화합물이 제공된다.

[화학식 II]

상기 식에서,

R은 -(CH₂)-C(=O)NH-CH₂-CH₂-NH₂이다.

본 발명의 또다른 관점에 따르면, 하기 일반식(II)을 갖는 화합물이 제공된다.

[화학식 II]

상기 식에서,

R은 -(CH₂)-C(=O)NH-CH₂-CH₂-NH₂이다.

본 발명의 또다른 관점에 따르면, 상기 화합물과 특별히 결합할 수 있는 항원 인지영역을 포함하는 항체가 제공된다.

상술한 바람직한 양태에서 또다른 특징에 따르면, 상기 항원 인지영역은 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 구성되는 군으로부터 선택된 CDR 아미노산 서열을 포함한다.

상술한 바람직한 양태에서 또다른 특징에 따르면, 상기 CDR 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산서열에 의해 암호화(인코딩)된다.

상술한 바람직한 양태에서 또다른 특징에 따르면, 상기 항체는 금속단백질의 활성을 억제할 수 있다.

상술한 바람직한 양태에서 또다른 특징에 따르면, 상기 금속단백질은 기질 금속단백질분해효소이다.

상술한 바람직한 양태에서 또다른 특징에 따르면, 상기 금속단백질분해효소는 젤라티나제(gelatinase)이다.

상술한 바람직한 양태에서 또다른 특징에 따르면, 상기 젤라티나제는 MMP-2 및 MMP-9로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또다른 관점에 따르면, 금속단백질 억제제의 제조방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 화합물에 유도된 항체를 생성하여 금속단백질 억제제를 생산하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또다른 관점에 따르면, 상기 항체는 다클론성(polyclonal) 항체이다.

본 발명의 또다른 관점에 따르면, 단일클론(monoclonal) 항체이다.

본 발명의 추가적인 관점에 따르면, 항체 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 추가적인 관점에 따르면, 치료를 요하는 피검자의 금속단백질의 불균형 또는 비정상활동과 연관된 질병의 치료방법이 제공되며, 상기 방법은 청구항 3-10항 중 어느 한 항의 항체를 약학적으로 유효한 함량으로 투여하고, 피검자의 금속단백질의 불균형 또는 비정상활동과 연관된 질병의 치료하는 단계를 포함한다.

상술한 바람직한 태양의 또다른 특징에 따르면, 상기 질병은 염증성 장질환이다.

본 발명의 추가적인 관점에 따르면, 세포중의 기질 금속단백질분해효소 활성의 억제방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 세포를 청구항 4-10 중 어느 한 항의 항체와 접촉시켜, 세포중의 기질 금속단백질분해효소 활성을 억제하는 단계를 포함한다.

본 발명은 금속단백질의 촉매 부위의 전자 및 구조적 결정자를 인식하는 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 신규한 합텐 조성물을 제공함으로써 현재 공지된 형상의 결점을 성공적으로 처리하였다.

달리 정하지 않는 한, 본원 명세서에서 사용되는 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에서 기술된 것과 유사하거나 균등한 방법이나 물질이 본 발명의 실시나 시험에 사용될 수 있음에도 불구하고, 적당한 방법 및 물질은 후술하기로 한다. 분쟁이 있는 경우, 정의를 포함하는 특허명세서가 지배하 곳이다. 더욱이, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

본 발명은 첨부도면을 참고하여 실시예만을 통해서 기술된다. 특히 상세 도 면과 관련하여 본 발명의 바람직한 실시양태를 예시적으로 논의할 목적으로 실시예를 통해 구체적인 사항을 나타내었으며, 본 발명의 원리 및 개념을 가장 유용하고 쉽게 이해할 수 있는 것으로 생각되는 방법으로 제공하도록 하였다. 이러한 관점에서, 본 발명에 대한 기본적인 이해가 필요하기에 본 발명의 구조적 상세함을 나타내려는 어떠한 시도도 하지 않았으며, 상세한 설명은 본 발명의 여러 형태가 어떻게 구체적으로 실시될 수 있는지 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확한 도면을 기초로 기술하였다.

도면에서;

도 1A-D는 Co/ZnTCPP - [메조-테트라키스-(4-카르복시페닐)-포르피리나토]코발트/아연(II)(도 1A-B, Imisdp- [2-(2-미노에틸카르보모일)-에톡시메틸]-트리스-[2-(N-(3-이미다졸-1-일-프로필))-에톡시메틸]메탄 및 MMPs의 촉매성 아연 부위에서 보존 아연-단백질 연결반응(ligation)의 분자구조를 나타낸 개략도이다.

도 1E-H는 도 1A-D에 나타낸 구조식의 3차원 도면이다. ZnTCPP는 극성 형태를 보유하지만, CoTCPP는 변성된 마이크로사이클 형태를 나타내는 것에 주목하라. 현저히, Imisdp 구조는 도 1G에 나타낸 바와 같이 MMP-9의 촉매성 아연 이온의 가장 가까운 환경과 매우 유사하다.

도 2A는 3차원으로 계산한 Imisdp(녹색 탄소원자)의 구조와 MMP-9(PDB 코드 1GKC, 회색 탄소원자) 사이의 구조적 오버레이이다. 촉매성 아연 이온은 오렌지 볼로 도시되어 있으며, 물 분자는 청색 볼로 도시되었으며, 질소는 청색으로, 질소는 적색으로 도시되었다.

도 2B는 ZnTCPP 포르피닌 고리(CSD 코드 AKICOM(녹색 탄소원자) 및 MMP-9(회색 탄소원자 PDB 코드 1GKC)의 활성 부위에서 3개의 보존 히스티딘 사이의 구조적 오버레이로, 촉매성 아연 이온은 오렌지 볼로 도시되어 있으며, 질소는 청색으로 도시되었다.

도 3A-C는 용액으로부터 재조합 MMP-2 촉매성 도메인(MMP-2cat) 또는 Pro-MMP-2 및 Pro-MMP-9을 내리기 위해 마우스 IgG-아가로스 고정화 mAbs의 능력을 나타낸 웨스턴 블럿(Western blot) 사진이다. 각각의 실험에 사용된 항체는 6C6, 13E11 및 13E15이다. 도 3A- MMP-2cat(2㎍)를 항-마우스 IgG-아가로스(cntl, l lane) 또는 항 CoTCPP, ZnTCPP 및 Imisdp mab(10㎍)-항-마우스-IgG-아가로스와 함께 20℃ 에서 2시간 배양하고, 면역침전물(2,3,5lane)을 원심분리하고, 3회 세척하고, SDS/PAGE 겔상에서 분리하고,쿠마시 염색(coomassie staining)으로 시각화하였다.

도 3B- Pro-MMP-2, Pro-MMP-9을 3A와 동일한 방법으로 mAbs-항-마우스 IgG-아가로스와 함께 배양하였다. 면역침전물(2,4,6lane 좌측 및 1,3, 5 lane 우측)과 결합되지 않은 분획(1,3, 5 lane 죄측 및 2,4,6lane 우측)을 SDS/PAGE 겔상에서 분리하고, 쿠마시 염색으로 시각화하였다. 도 3C- APMA으로 활성화 시킨(좌측) 것과 활성화시키지 않은(우측) HT1080 세포의 조건배지(conditioned medium)를 항 CoTCPP mAb로 면역침전화하고, MMP-2에 대한 특정 항체에 대하여 웨스턴 블럿으로 분석하였다.

도 4A-B는 MMP-2(A) 및 MMP-9(B)의 항 CoTCPP mAb억제를 나타낸 라인위버-버 크 플롯(Lineweaver-Burk plot)이다. 속도 단위는 ㎛ol.sec^-1이고, 기질 단위는 μM^-1이다. 도 4A- MAb농도는 6(▲), 18(■), 24(○) 및 0μM(□)이었다. MMP-2cat 농도는 200nM이었다. 도 4B- 전길이 APMA의 억제는 MMP-9를 활성화하였으며, mAb 도는 6(□), 12(▲), 24(□) 및 0μM(■)이었다. MMP-9 농도는 20NM이었다. 억제 페턴은 항 CoTCPP mAb가 MMP-2 및 MMP-9의 경쟁적 억제제로서 행동하였음을 나타내었다.

도 5는 항 Imisdp mAb에 의한 MMP-2 및 MMP-9 억제를 나타낸 플롯이다. MMP-9 촉매성 도메인(20 nM)(●) 또는 전길이 APMA로 활성화된 MMP-2(▲, 5 nM)를 농도가 증가하는 mAb를 함유하는 완충액 R중의 형광성 기질 OCAcPLGLA2pr(Dnp)-AR-NH2(10 μM)의 혼합물에 첨가하였다.

선은 프로그램을 원점을 이용한 하기 방정식에 맞는 비선형 최소자승법을 나타낸다:

vi / vo= (Km+[S])/(Km(1+[I]/Ki)+[S])

도 6A는 MMP-2cat의 억제된 형태인 활성 및 항 CoTCPP의 아연 k-에지 스펙트라를 나타낸다. 활성화된(점선) 아연 k-에지 영역의 정상 raw XAS 데이터와 MMP-2cat-mAb(굵은선) 착화합물을 나타내었다.

도 6B는 MMP-2cat-mAb 착화합물(굵은 선)의 에지 위치가 활성 MMP-2cat(점선)에 비례하여 높은 에너지로 변경되었음을 나타낸다.

도 6C는 활성(검정) 및 억제된(녹색) 형태의 MMP-2cat에 대한 EXAFS 결과를 나타낸다. 결과를 R-공간 및 백-변환된 k-공간에 존재한다.

도 7A-B는 세포면 젤라티나제 활성을 억제하는 항 CoTCPP의 능력을 나타내는 사진이다. 1 μM의 13E11 mAb의 존재 또는 부존재하에 DQ-젤라틴으로 코팅한 커버 슬립상에서 평판배양한 HT1080 세포의 대표적인 형광 현미경 사진이다. 세포면의 젤라틴융해성 활성은 분해된 젤라틴에서 방출되는 형광성의 측정으로 분석된다. 비처리된 세포는 1μM의 항 CoTCPP mAb의 존재하에 크게 억제된 커다란 세포면 젤라티나제 활성을 나타내었다. 4'-6-디아미인디노-2-페닐인돌(DAPI) 염색결과 세포의 핵종의 위치가 청색으로 나타났다.

도 8은 다양한 MMP 활성 부위(SI 포켓)의 형태를 나타낸 개략도이다.

도 9는 Imisdp의 합성 과정이다.

도 10은 CDR 영역이 하이라이트된 본 발명 항체의 아미노산 서열을 나타낸다.

도 11A-D는 MMP9과 MMP2의 활성 형태에만 결합하는 66을 설명하는 사진 및 모델이다. 도 11A: 마우스 복수로부터 채취한 6C6으로 공-정제한 활성 MMP9의 검출 사진이다. MMP9을 함유하는 마우스 목수로부터 정제한 MAb(10㎍)을 상업용 항 MMP 9항체를 사용하여 웨스턴 블럿(WB)을 실시하였다. 동일한 방법으로 정제된 비관련 IgG mAb가 음성 대조군(MAb 대조군)의 역할을 하였다. 힐라 형질전환 세포(Hilla transfected cell)로부터 정제한 인간 ProMMP9은 활성 종을 식별하기 위한 분자량 마커(marker)로서 역할한다. 정제는 일정한 도메인을 경유하여 mAb를 결합하고, 항원과 자유롭게 상호작용하는 항원 결합 부위를 남기는 단백질 G 비드 를 사용한 친화성 크로마토그래피로 정제를 실시하였다. 도 11B,C: 단백질 A에 고정화된 6C6 mAb를 사용하여 용액으로부터 ProMMP2, ProMMP9, 또는 MMP2 촉매성 단편(헤모펙신 및 프로 도메인이 결핍된)을 끌어내리는 능력을 분석하였다. 단백질 A 세파로즈 비드에 고정화된 MAbs 6C6(10㎍)을 MMP2 촉매성 단편(1㎍) - 도 11B, ProMMP9 - 도 11C 상단, 또는 ProMMP2(2㎍) - 도 11C 하단, 으로 20℃에서 2시간 동안 배양하였다. 비드-결합된 mAb 착화합물을 원심분리로 분리하고, 3회 세척하고, SDS/PAGE 겔상에서 분리하고, 쿠마씨-염색(Coomassie-staining)으로 시각화하였다. 면역침전물(6C6) 및 미결합 분획을 SDS/PAGE 겔상에서 분리하고, 쿠마씨-염색(Coomassie-staining)으로 시각화하였다. 비특이성 흡수 효소에 대한 음성 대조군만을 단백질 A 세파로즈 비드로 배양하였다. 도 11D: 프로-도메인이 있는(상단) 및 없는(하단) 헤모펙신 도메인이 결핍된 MMP2의 3차원 구조를 표면 대표(PDB ID: 1CK7)로 도시하였다. 촉매성 도메인 및 피브로넥틴(fibronectin) 도메인은 청록색으로, 프로-펩티드는 적색으로 나타내었다. 촉매성 아연은 오렌지 구(球)로 묘사하였으며, 3개의 보존 히스티딘과의 결합은 노란색 막대기(스틱)로 나타내었다. 도시된 바와 같이, 프로-펩티드 도메인은 활성 부위를 공간적으로 차단한다.

도 12A-B는 6C6 mAb에 의한 MMP-9의 억제 메커니즘에 관한 그래프 및 데이터이다. 도 12A: MMP-9 재조합 촉매성 단편(헤모펙신 및 프로 도메인이 없이)을 mAb의 함량을 변화시키면서 미리 배양하였다. 형광 펩티드 기질(10μM)의 첨가한 후에 잔여 효소 활성을 측정하였다. ki값은 다음 경쟁적 억제 방정식에 맞추어 계산하였다.(vi/vo=Km+[S]/(Km(1+I/Ki)+[S]) Km=9.14±0.8) (Inset). 활성 MMP-9(2 nM 의 농도로 고정된)를 0.7(■) 또는 2μM(O) mAb의 부재(●) 또는 존재하에 100 mM의 MaCl, 10 mM의 CaCl₂, 100mM의 트리스, pH 7.5중에서 37℃로 60분간 미리 배양하였다. 이어서, 형광 펩티드 기질(Mca-Pro-leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Nh2)를 첨가하여 0-30μM 범위의 최종 농도를 얻었으며, 초기 기질 가수분해 속도는 증가된 형광성을 측정하여 결정하였다. 명백한 Km과 Vmax 값은 실험데이터를 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 방정식에 맞추어 유도하였다. 유도된 값은 이중 역수 린위버-버크 플롯을 재구성하는데 사용하였으며, 교차점은 6C6에 의한 MMP-9의 경쟁적 억제를 나타낸다. 도 12B: 별개의 MMPs를 mAb의 함량을 달리하여 미리배양하였다. 잔여 촉매 활성은 형광 펩티드 기질(10μM)을 첨가한 후에 측정하였다. Ki값은 MT1-MMP의 촉매 도메인에 대해선 Km=16±1로, 힐라 세포로부터 정제한 전길이 MMP2에 대해선 Km=2.46±0.34로 하여 경쟁적 억제 방정식(vi/vo=Km+[S]/(Km(1+I/Ki)+[S]) Km=9.14±0.8)에 맞추어 계산하였다. 6C6의 효과적인 억제는 전길이(full lenghth) MMP-2 및 MMp-9(데이터는 나타내지 않음)를 사용하여 검출하였다.

도 13은 주변 루프내에 변화를 가진 활성 부위의 보존된 총괄 토폴로지를 나타낸 별개의 MMPs의 구조적 오버레이(overlay)이다. MMP9(PDB 1GKC)- 청록색, MMP2(PDB 1QIB)- 자홍색, MT1-MMP(PDB 1BUV)- 오렌지색, MMP7(PDB 1MMQ)- 적색, TACE(PDB 2I47)- 노란색. 보존된 히스티딘은 막대로 나타냈으며, 촉매성 아연 부위를 오렌지 볼로 묘사하였다. 뚜렷이, MMP-2 및 MMP-9의 주변 루프의 총괄 토폴 로지는 유사하다. 이것은 시험한 효소 군중의 MMP-2 및 MMP-9에 대한 6C6의 선택도를 설명한다.

도 14A-C는 6C6이 세포 표면 젤라티나제 활성을 억제하는 것을 설명하는 형광 현미경 사진이다. 젤라티나제의 나노몰랄 억제제(도 14C)에 기반한 5μM mAb 또는 15μM SB-3CT 메커니즘의 부재(도 14A), 존재(도 14B)하에 DQ-젤라틴으로 코팅한 커버-슬립상에서 평판 배양한 HT1080 세포의 대표적인 형광 현미경 사진(원위치 자이모그래피에서 생성)이다. 세포 표면 젤라틴 융해성 활성은 젤라틴 분해시 방출되는 형광을 측정하여 분석한다. 비처리된 세포는 mAb의 존재시 크게 억제되었던 커다란 세포 표면 젤라티나제 활성(녹색)을 나타내었다.

도 15A-C는 C57BL/6 마우스에 급성 DSS 대장염을 여러 개 발현시켜 6C6의 치료 효과를 설명한 그래프이다. 5일간 2% DSS로 질병을 유도하였다. 5 또는 1.5 mg/mouse로 6C6 치료는 0일째부터 시작하여 5일간 복강내 주사로 투여하였다, 임상 수치는 DAI(이것은 0-4의 저울로, 체중, 장출혈 및 배변 지속을 결합한 수치)를 매일 모니터링하여 측정하였다. 데이터는 각각의 동물의 6 내지 10일간의 도트 평균 분포도로 표시하였다. 도 15B: 콜론 길이. 도 15C: 사망률. 제시된 데이터는 총 15mice/group으로 2개의 실험 결과치를 합친 것이다.^*, 대장염을 치료받지 않은 마우스에 대한 중요한 효과(p<0.05).

도 16은 활성 MMP9(흑색선)와 억제된 MMP9-6C6 착화합물(적색선)의 아연 K-에지(edge)에서 X-선 흡수 분광법으로부터 나온 결과를 도시한 그래프이다. 결과 는 아연 이온으로부터 방사형 분포로 존재한다, MMP-9 도메인 -mAb 착화합물(적색선)의 에지 위치는 촉매성 아연 이온과 결합을 나타내는 활성 MMP-9(삽입부)에 비례하여 높은 에너지로 옮겨간다. X-선 분광 자료의 구조적 분석은 6C6이 직접 아연 이온과 결합하고, 펜타코디네이트 아연-단백질 착화합물을 생성하는 것을 나타낸다. 현저하게, 결합 형태는 MMPs의 활성 부위에서 TIMPs의 결합과 유사하다.

바람직한 실시양태의 기술

본 발명은 금속단백질 활성을 억제하는데 사용될 수 있는 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 다발성 경화증, 자가면역 질환 및 전이성 암과 같은 불균형 기질 금속단백질분해효소와 연관된 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 원리 및 실시는 도면 및 첨부된 상세한 설명을 참조하면 더욱 이해가 잘될 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 실시양태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 다음의 상세한 설명 및 실시예에서 예시한 기술에 의해 본 출원이 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 다른 실시양태나 여러 방법으로 실행 또는 실시될 수 있다. 또한 본 발명에서 사용된 어구 및 용어는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명을 제한하려는 것이 아님을 이해하여야 한다.

기질 금속단백질분해효소는 세포증식, 분화 및 외부세포 기질(ECM)의 리모델링에서부터 혈관신생 및 세포 이동에 이르기까지 많은 생물학적 공정에 참여한다. 이들 공정은 기질 금속단백질분해효소(MMPs)의 기능과 이의 자연적인 조직 억제제(TIMPs) 사이의 섬세한 균형을 요한다. 이러한 균형이 깨지면 전이성 종양, 신경퇴행성 질환 및 관절염을 포함하는 수많은 병리학상 질환의 특징이다.

많은 MMP 억제제는 히드록소메이트, 비-미생물 테트라사이클린 및 단일클론 항체와 같은 작은 펩티드 억제제를 포함하며 기술분야에 공지되어 있다. 전자는 높은 생산단가, 높은 분해성, 낮은 경구 생체이용률, 및 특이성의 부족에 의해 제한을 받지만, 후자는 어느 것도 생체내 치료 효과자 입증된 것은 없다.

본 발명자들은 금속효소의 촉매 부위의 전자 및 구조적 결정자를 인식하는 항체는 효능 있는 억제제로 사용가능하다는 것을 이전에 밝혀냈다. 면역원으로서 금속 효소의 금속결합된 촉매부위를 모방한 합텐을 이용하면 상승한 금속단백질 활성을 특징으로 하는 임상질환의 치료에 사용될 수 있는 매우 효과적인 치료학적 항체를 생성할 수 있다.(참조: 본 발명자들의 WO2004/087042).

본 발명의 실시를 줄이면서, 본 발명자들은 MMPs에서 반응성 아연 부위의 국소 구조 및 형태를 비슷하게 모방한 신규의 합텐 화합물을 설계하였다. Imisdp( 도 1 참조)fkrh 호칭한 화합물 [2-(2-미노에틸카르보모일)-에톡시메틸]-트리스-[2-(n-(3-이미다졸-1-일-프로필)은 4-배위 기하 및 배위된 3개의 히스티딘 배열과 물에서 아연 이온에 의해 유도된 유사한 힘의 장(force field)을 모방할 수 있다. 거의 4면체인 형태는 4번째 리간드로서 3개의 이미다졸 염기와 물 분자로 형성된다. 도 2A는 아연 리간드의 4면체 기하를 나타내기 위해 us성된 MMP-9(PDB 1GKC)의 촉매부위를 갖는 Imisdp 화합물의 추론된 3D 모델의 오버레이이다. 변성은 X- 선 구조(히드록사메이트 억제제)에 존재하는 리간드를 물 분자로 치환하고, 다층 QM/MM 접근(물질 및 방법 참조)에 의해 국소 최소화로 전효소를 최적화하는 것을 포함한다. 높은 유사성은 MMP-9중의 계산된 히스티딘 아연 모티프와 아연 이온(가각 2.04±0.06 및 2.02)으로부터 히스티딘의ε-질소와 금속을 배향한 3개의 히스티딘의 상대 배위의 거리를 환산한 Imisdp 사이에 존재한다.

후술되는 설명 및 이하의 실시예에 기술하였듯이, 본 발명자들은 마우스를 Imisdp로 면역하고, MMP-2 및 MMP-9으로 교차반응한 MMP 항체를 위해 스크리닝하였다. 그 항체를 6C6이라 호칭하였다(도 10 및 이하 실시예의 실시예 1-2 참조). 6C6은 MMP-2/9와 결합하고, MMP-9, MMP-2(Ki 범위 1 μM~5μM) 및 MT1-MMP(15μM의 Ki, 하기 표4 참조)의 활성을 억제하는 것으로 나타났다. MMP-9 및 MMP-2의 결합 및 억제는 생화학 및 생물물리학 도구(실시예 4-7 및 9 참조)를 다양하게 하여 생체외 및 원위치에서 입증되었다. 중요한 것은 6C6은 MMP-9 및 MMP-2의 활성화된 형태만 결합한다는 것이다.(실시예 3 및 8 참조). 이러한 효소 형태는 효소 부분내에 존재하는 촉매성 아연 착화합물을 보호하는 프로-도메인이 부족하다.

본 발명자들은 본 방법에 따라 생성된 항체는 생체내에서 MMP-9과 결합할 수 있다는 것을 보여 주었다.(도 11A). 더욱이, 본 발명자들은 본 발명의 항체가 염증성 장질환의 치료에 치료학적 잠재성을 포함하고 있음을 보여 주었다.(실시예 10).

이와 함께, 본 발견은 금속단백질 억제제, 및 6C6 및 가치있는 치료도구로서 유도된 펩티드 및 펩티드 모방체의 생산에 중요한 시약(플랫폼)으로서 Imisdp의 사 용을 뒷받침한다.

이들 결과는 파즈 디스플레이 및 Mabs 또는 그 단편의 점 돌연변이(point mutations)에 의해 개개인의 MMps의 선택적 펩티드 억제제를 설계하기 위한 플랫폼으로서 이들 항체 사용의 가능성을 입증하였다.

그래서, 본 발명의 하나의 관점에 따라, 하기 일반식(I)을 갖는 화합물이 제공된다.

[화학식 I]

상기 식에서,

m과 n은 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;

X₁ -X₃과 Y₁ -Y₃는 각각 독립적으로 O 또는 S이고;

R은 (CH₂)x-C(=O)NR'-(CH₂)y-NR'R''이며

(여기서 x와 y는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;

본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 하기 일반식(II)을 가지며, Imisdp로 호칭되는 [2-(2-미노에틸카르보모일)-에톡시메틸]-트리스-[2-(N-(3-이미다졸-1-일-프로필))-에톡시메틸]메탄 화합물이 제공된다.

[화학식 II]

상기 식에서,

R은 -(CH₂)-C(=O)NH-CH₂-CH₂-NH₂이다.

Imisdp의 합성은 하기 실시예의 실시예 7에 기술되어 있다.

Imisdp 금속단백질 억제제의 생산에 사용될 수 있는 MMP-9 및 MMP-2의 반응성 아연 부위의 국소 구조 및 형질변환 형태를 모방한다.

그래서, 본 발명의 하나의 관점에 따르면 금속단백질 억제제의 제조방법이 제공된다.

본 방법은 상술한 화합물(즉, Imisdp)에 배향된 항체 또는 항체 단편을 생성함으로써 실시된다. 실시예 1-2뿐만 아니라 하기의 실시예의 "물질 및 방법"을 참조.

본 발명의 "금속단백질'이란 금속-결합된 단백질로, 금속결합 부위는 전자적 및 구조적으로 Imisdp의 도메인을 닮은 효소의 촉매성 도메인의 일부를 형성한다.

본 발명의 관점인 금속단백질은 바람직하게는 금속단백질분해효소-MMP(예 MMP-2 및 MMP-9과 같은 젤라티나제)이다.

MMP군의 모든 일원은 활성화시 활성 효소로 전환되며, 활성부위의 금속이온이 기질결합을 위해 접근이 가능한 잠재적인 효소로 해석하여야 한다. 예를 들어, "시스테인 스위치 모델"은 이전에 생체외 활성화에서 MMP를 설명하는 것으로 암시되어 왔다. 시스테인 스위치 모델은 활성화시 잠재성 아연-결합 부위가 아연 원자 로부터 티올(Cys)-보유 프로펩티드의 분리에 의해 촉매성 아연-결합부위로 전환되는 것을 암시한다. 펩티드의 분리는 효소의 프로-도메인 구조의 분열을 야기시켜 촉매성 아연 이온의 보호가 철회된다. 그 결과 금속이온과 활성 부위 포켓은 기질결합 및 가수분해가 접근 가능하다.[Van Ward and Birkedal-hansen(1990)Proc. natl.AcadSci: USA 87, 5578-5582].

본 발명의 교시에 따라 생성된 항체 및 항체 단편은 금속이온고을 결합하고, 촉매성 아연 부위에서 아미노산을 배위결합하고, 상술한 병리학상 공정에 직접 관련된 이들 효소의 활성 형태를 특히 억제한다는 능력 때문에 MMPs의 강력한 억제제로서 작용한다.

본원에서 사용된 용어 "항체"는 무균 항체분자를 말하며, 구 "항체 단편"은 대식세포와 결합가능한 Fab, F(ab')₂, 및 Fv와 같은 가능성 단편을 의미한다. 이들 기능성 항체 단편은 다음과 같이 정의된다: (i) Fab: 효소 파파인을 가진 전 항체의 소화에 의해 무균 경쇄와 하나의 중쇄 일부분을 수득하는 항체분자의 1가 항원-결합 단편을 함유하는 단편을 말한다.; (ii) Fab': 펩신을 지닌 전 항체를 처리하고, 환원하여 무균 경쇄 및 중쇄의 일부분을 수득할 수 있는 항체 분자의 단편으로, 하나의 항체 분자당 2개의 Fab' 단편이 얻어진다.; (iii) (Fab')₂: 뒤이은 환원없이 효소 펩신을 지닌 전항체를 처리하여 수득되는 항체의 단편으로, (Fab')₂는 2개의 디설파이드 결합에 의해 함께 결합된 2개의 Fab'단편의 2량체이다.; (iv) Fv: 2개의 사슬로 표현되는 경쇄의 가변영역과 중쇄의 가변영역을 함유하는 유전학 적으로 설계된 단편이다.; (v) 단쇄 항체("SCA"): 유전학적으로 융해된 단쇄분자로 적당한 폴리펩티드 링커(linker)에 의해 결합된 경쇄의 가변영역과 중쇄의 가변영역을 함유하는 유전학적으로 설계된 단편이다.; 및 (vi) 단일 상보적 결정영역 (Complementarity Determining Region, CDR)용 펩티드 코딩.

항체(예, 단일클론 및 다클론) 생성방법은 기술분야에 공지되어 있다. 항체는 기술분야에 공지된 여러 방법 중 어느 한 방법에 의하여 생성될 수 있으며, 상기 방법은 [Orlandi D.R. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837, Winter G. et al., (1991) Nature 349:293-299]에 기재된 항체분자의 생체내 생산, 면역글로불린 라이브러리(immunoglobulin libraries) 또는 고도의 특이성 결합제의 판넬의 스크리닝 또는 배양중 연속 세포 라인에 의한 단일클론 항체 분자의 생성을 도입할 수 있다. 이들 방법은 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마(hybridoma) 기술, 및 엡스테인 바 바이러스(Epstein-Bar-Virus, EBV)-하이브리도마 기술[Kohler G., et al.,(1975) Nature 256:495-497, Kozbor D., et al.(1985) J. Immunol. Mthods 81:31-42, Cote R.J. et al.,(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030, Cole S.P. et al., (1984) Mol. Cell. Biol.62:109-120]을 포함하나 이에 한정하진 않는다.

본 발명의 화합물이 너무 작아 강한 면역원성 응답을 이끌어 낼 수 없는 경우, 이러한 항원(합텐)은 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH) 또는 혈청 알부민[예, 소혈청 알부민(BSA)] 담체(미국 특허 5,189,178호 및 5,239,078호 및 실시예란의 실시예 2 참조)와 같은 항원적으로 중립 담체에 커플링 될 수 있다. 담체와의 커플링은 예를 들어 아미노기에 직접 커플링하거나 선택적으로 생성된 이미노 결합의 환원과 같은 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 실시될 수 있다. 양자택일하여, 담체는 디사이클로헥실 카르보디이미드 또는 기타 카르보디이미드 탈수제와 같은 축합제를 사용하여 커플링될 수 있다. 또한 링커 화합물을 이용하여 커플링을 할 수 있는데 동종양작용성(homobifunctional)과 이종양작용성(heterobifunctional) 링커는 Pierce Chemical Company, Rockford, III로 부터 이용가능하다. 이어서, 최종 면역성 착화합물은 생쥐, 토끼 등과 같은 포유류 피검체에 주입될 수 있다. 적당한 프로토콜은 혈청내 항체의 생성을 증가시킬 수 있는 스케줄에 따라 보조제의 존재하에 면역원의 반복된 주입을 포함한다. 면역 혈청의 역가는 기술분야에 공지된 면역분석 절차를 이용하여 쉽게 측정이 가능하다.

수득한 면역혈청(항혈청)은 직접 사용되거나, 상기에서 수득한 단일클론 항체 단편은 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 얻을 수 있다(참조: 예, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, 참고로 본원에 포함되었다). 예를 들어, 본 발명에 따른 항체는 항체의 단백질 가수분해 또는 대장균 또는 단편을 DNA 암호화한 포유류 세포(예, 중국 햄스터 난소 세포 배양 또는 기타 단백질 발현 시스템)의 발현에 의해 제조될 수 있다.

양자택일하여, 항체 단편은 종래방법에 의해 항체 전부를 펩신 또는 파파인 소화하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 펩신으로 항체의 효소적 절단 에 의해 F(ab')₂로 표시되는 5S 단편을 생산할 수 있다. 이러한 단편은 티올 산화제를 사용하여 추가로 절단하고 및 임의로 설프히드릴기의 차단기로 디설파이드 결합을 절단하여 3.5S Fab' 1가 단편을 생산할 수 있다. 양지택일하여 펩신을 이용한 효소적 절단은 2개의 1가 Fab' 단편 및 Fc 단편을 직접 생산한다. 이러한 방법은 예를 들어 Goldenberg의 미국특허 4.036,945호 및 4,331,647호에 기술되었으며 이들 특허는 본원에서 참고로 포함하였다. 또한 Porter, R.R., Biochem. J., 73: 119-126, 1959를 참조. 중쇄를 분리하여 1가 경-중쇄 단편을 생성하고, 추가로 단편의 절단, 또는 기타 효소학적, 화학적 또는 유전학적 기술과 같은 항체 절단의 기타 방법들은 단편이 무균항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한 사용될 수 있다.

Fv 단편은 V_H와 V_L 사슬의 회합을 포함한다. 이러한 회합은 Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62, 1972에 기술된 바와 같이 비공유일 수 있다. 양자택일하여, 가변 사슬은 분자간 디설파이드 결합에 의해 연결되거나 글루타르알데히드와 같은 화학제에 의해 가교결합될 수 있다. 바람직하게는, Fv 단편들은 펩티드 링커에 의해 연결된 V_H와 V_L 사슬을 포함한다. 이들 단일 사슬 항원 결합 간백질(sFv)는 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 V_H와 V_L 도메인을 암호화한 DNA 서열을 포함하는 구조적 유전자를 구성하여 제조될 수 있다. 구조적 유전자는 발현 벡터로 삽입되며, 이어서 대장균(E. coil)과 같은 숙주세포 도입된다. 재조합 숙주세포는 2개의 V 도메인으로 연결한 링커 펩티드로 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. sFvs의 제조방법은 예를 들어 Whitlow and Filpula, Methods, 2:97-105, 1991: Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77, 1993 및 Landner et al.,의 미국특허 4,946,778호에 기술되어 있다.

CDR 펩티드("최소 인식 단위")는 관심 있는 항체의 CDR을 암호화한 유전자를 구축함으로서 얻어진다. 이러한 유전자는 예를 들어, 중합효소연쇄반응을 이용하여 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변영역을 합성하여 제조할 수 있다. Larrick and Fry, Methods, 2:100-10, 1991 참조.

인간치료 또는 진단을 위해서는 인간화 항체(humanized antibody)를 사용하는 것이 바람직하다. 비-인간(예, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 그 단편(예, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 서열)의 키메라 분자이다. 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수혜자 항체)을 포함하며, 잔기 형태에서 수혜자의 상보적 결정영역(CDR)은 소망하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 레트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(기여자 항체)로부터 나온 잔기로 대체된다. 몇몇의 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 수혜자의 항체나 수입 CDR 또는 골격 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다.

일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나 이상 및 전형적으로 2개 이상의 가변 도메인을 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통서열의 영역에 상응한다. 인간화 항체는 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 영역인 면역글로불린 일정 영역(Fc)을 적어도 일부분 포함한다. [Jones et al., Nature, 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)].

비-인간 항체의 인간화 방법은 기술분야에 공지되어 있다.

일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 원천으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 전형적으로 수입 가변 영역으로부터 얻어진 수입 잔기(import residues)라고 칭하기도 한다. 인간화는 실질적으로 인간 항체에 상응하는 서열을 위해 설치류 CDRs 또는 CDR 서열로 치환하는 Winter and co-workers 방법[Jones et al., Nature, 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988); Verhoeyen et al., Sience, 239:1534-1536(1988)]을 수반할 수 있다. 따라서, 이러한 인간화 항체는 키메라 항체(미국특허 4,816,567호)로, 실질적으로 무균 인간 가변 영역은 비-인간 종으로부터 얻은 상응하는 서열로 치환되어 왔다. 실질적으로, 인간화 항체는 전형적으로 인간항체로, 여기서 일부 CDR 잔기 및 일부 FR 잔기는 설치류 항체의 유사한 위치에서 얻은 잔기로 치환된다.

또한 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 포함하는 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 생산될 수 있다.[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381(1991); Marks et al., J. Mol Biol., 222:581(1991)]. 또한, 인간 단일클론 항체의 제조에 Cole et al., 및 Boerner et al.,의 기술이 이용가능하다.(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. 유사하게, 인간 항체는 내생적 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 마우스와 같은 형질전환 동물에 인간 면역글로불린을 도입하여 제조할 수 있다. 일단 시작하면, 유전자 재배열, 조합, 및 항체 레퍼토리를 포함하는 모든 면에서 인간과 매우 밀접하게 닮은 인간 항체의 생성이 관찰된다. 이러한 접근은 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호 및 다음의 과학 간행물에 기술되어 있다. Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature BiBiotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

일단 항체가 얻어지면, 금속단백질 억제활성에 대해 시험할 수 있다. 금속단백질 억제 활성의 적절한 분석 조건은 Kinight et al., FEBS Letters 296(3):263-266(1992), Cawston et al., Anal. Biochem, 99:340-345 (1979), Cawston et al., Methods in Enzymology 80:771 et seq. (1981); Cawston et al., Biochem, J., 195:159-165 (1981), Weingarten et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 139:1184-1187 (1984) 및 미국특허 제4,743,587호 및 제5,240,958호에 기술되어 있다.

언급하였듯이, 상기 방법론을 이용하여 본 발명자들은 6C6로 부르는 MMP-2 및 MMP-9에 대해 기질 금속단백질분해효소(Matrix metalloproteinase, MMP) 억제활성을 생산할 수 있었고, 이것의 서열은 SEQ ID NO:1에 제공되며, CDR 서열은 SEQ ID NOs. 7,8,9,10, 11 및 12에 제공된다.

그래서, 본 발명은 금속단백질 억제활성(금속단백질의 촉매활성의 특이성 억제)이 유지되는 한 적어도 하나의 상술한 CDR 서열뿐만 아니라 동족체 및 그 단편을 포함하는 (폴리)펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드의 예는 항체이다.(상기 참조).

본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 천연 펩티드(분해 생성물, 합성적으로 합성된 펩티드 또는 재조합 펩티드) 및 펩티드 모방체(전형적으로 합성적으로 합성된 펩티드) 뿐만 아니라 펩티드가 신체 내에서 쉽게 안정화하거나 세포내로 침투할 수 있도록 하는 변성물을 갖는 펩티드 유사물인 펩토이드 및 세미펩토이드를 포함한다. 이러한 변성물은 N 단말 변성물, C 단말 변성물, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH를 포함하나 이에 한정하지 않는 펩티드 결합 변성물, 백본 변성물 및 잔기 변성물을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 펩티드 모방체 화합물의 제조방법은 기술분야에 공지되어 있는데 예를 들면 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press(1992)에 기술되어 있으며 본원에 참고로 포함하였다. 이러한 관점에 대한 추가적인 상세내용은 이하에 제공된다.

펩티드내의 펩티드 결합(-CO-NH-)은 예를 들어 N-메틸화 결합(-N(CH3)-CO-), 에스테르 결합(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), 케토메틸렌 결합(-CO-CH2-), α-aza 결합(-NH-N(R)-CO-) (여기서 R은 메틸같은 알킬임), 탄소결합(-CH2-NH-), 히드록시에틸렌 결합(-CH(OH)-CH2-), 티오아미드 결합(-CS-NH-), 올레핀 이중결합(-CH=CH-), 레트로 아미드 결합(-NH-CO-), 펩티드 유도체(-N(R)-CH2-CO-)(여기서 R은 "노말" 측쇄로 탄소원자에 자연적으로 존재한다)로 치환될 수 있다.

이들 변성물은 펩티드 사슬을 따라 어느 결합에서 발생하며, 심지어 동일시간에 몇몇(2-3)에서 발생할 수 있다. 천연 방향족 아미노산, Trp, Tyr 및 Phe는 페닐글리신, Tic, 나프틸아랄린(Nal), 페닐리소세린, 테오니놀, Phe의 고리-메틸화 유도체, Phe 또는 o-메틸-Tyr의 할로겐화 유도체와 같은 합성-비천연 산으로 치환될 수 있다.

상기 이외에도, 본 발명의 펩티드는 하나 이상의 변성 아미노산 또는 하나 이상의 비-아미노산 모노머(예: 지방산, 착화합물 카르보히드레이트 등)을 포함할 수 있다.

명세서 및 하기 청구범위에서 사용되는 "아미노산" 또는 "아미노산류"는 20개의 천연적으로 생성되는 아미노산류를 포함하며, 이들 아미노산류는 종종 생체내에서 번역 후 변성되며, 히드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌; 및 2-아미노아디프산, 히드록시리신, 이소데스모신, nor- 발린, nor-류신 및오르니틴을 포함하나 이에 한정하지 않는다. 추가로, 용어 "아미노산"은 D- 및 L-아미노산을 포함한다.

하기 표 1 및 2에 본 발명에 사용될 수 있는 천연적으로 생성되는 아미노산 (표 1) 및 비-종래적 또는 변성된 아미노산(예., 합성, 표 2)을 열거하였다.

표 1

아미노산	3-글자 약어	1-글자 약어
알라닌	Ala	A
아르기닌	Arg	R
아스파라긴	Asn	N
아스파라긴산	Asp	D
시스테인	Cys	C
글루타민	Gln	Q
글루타민산	Glu	E
글리신	Gly	G
히스티딘	His	H
이소류신	Lie	I
류신	Leu	L
리신	Lys	K
메티오닌	Met	M
페닐알라닌	Phe	F
프롤린	Pro	P
세린	Ser	S
트레오닌	Thr	T
트립토판	Trp	W
티로신	Tyr	Y
발린	Val	V
상기의 어떤 아미노산	Xaa	X

표 2

비-종래 아미노산	코드	비-종래 아미노산	코드
α-아미노부티르산	Abu	L-N-메틸알라닌	Nmala
α-아미노-α-메틸부티레이트	Mgabu	L-N-메틸아르기닌	Nmarg
아미노시클로프로판-	Cpro	L-N-메틸아스파라긴	Nmasn
카르복실레이트		L-N-메틸아스파라긴산	Nmasp
아미노이소부티르산	Aib	L-N-메틸시스테인	Nmcys
아미노노르보닐	Norb	L-N-메틸글루타민	Nmgin
카르복실레이트		L-N-메틸글루타민산	Nmglu
시클로헥실알라닌	Chexa	L-N-메틸히스티딘	Nmhis
시클로펜틸알라닌	Cpen	L-N-메틸이소류신	Nmile
D-알라닌	Dal	L-N-메틸류신	Nmleu
D-아르기닌	Darg	L-N-메틸리신	Nmlys
D-아스파라긴산	Dasp	L-N-메틸메티오닌	Nmmet
D-시스테인	Dcys	L-N-메틸노르류신	Nmnle
D-글루타민	Dgln	L-N-메틸노르발린	Nmnva
D-글루타민산	Dglu	L-N-메틸오르니틴	Nmorn
D-히스티딘	Dhis	L-N-메틸페닐알라닌	Nmphe
D-이소류신	Dile	L-N-메틸프롤린	Nmpro
D-류신	Dleu	L-N-메틸세린	Nmser
D-리신	Dlys	L-N-메틸트레오닌	Nmthr
D-메티오닌	Dmet	L-N-메틸트립토판	Nmtrp
D-오르니틴	Dorn	L-N-메틸티로신	Nmtyr
D-페닐알라닌	Dphe	L-N-메틸발린	Nmval
D-프롤린	Dpro	L-N-메틸에틸글리신	Nmetg
D-세린	Dser	L-N-메틸-t-부틸글리신	Nmtbug
D-트레오닌	Dthr	L-노르류신	Nle
D-트립토판	Dtrp	L-노르발린	Nva
D-티로신	Dtyr	α-메틸-아미노이소부티레이트	Maib
D-발린	Dval	α-메틸-γ-아미노부티레이트	Mgabu
D-α-메틸알라닌	Dmala	α-메틸시클로헥실알라닌	Mchexa
D-α-메틸아르기닌	Dmag	α-메틸시클로펜틸알라닌	Mcpen
D-α-메틸아스파라긴	Dmasn	α-메틸-α-나프틸알라닌	Manap
D-α-메틸아스파르테이트	Dmasp	α-메틸페닐실라민	Mpen
D-α-메틸시스테인	Dmcys	N-(4-아미노부틸)글리신	Nglu
D-α-메틸글루타민	Dmgln	N-(2-아미노에틸)글리신	Naeg
D-α-메틸히스티딘	Dmhis	N-(3-어미노프로필)글리신	Norn
D-α-메틸이소류신	Dmile	N-아미노-α-메틸부티레이트	Nmaabu
D-α-메틸류신	Dmleu	α-나프틸알라닌	Anap
D-α-메틸리신	Dmlys	N-벤질글리신	Nphe
D-α-메틸메티오닌	Dmmet	N-(2-카르바밀에틸)글리신	Ngln
D-α-메틸오르니틴	Dmorn	N-(카르바밀에틸)글리신	Nasn
D-α-메틸페닐알라닌	Dmphe	N-(2-카르복시에틸)글리신	Nglu
D-α-메틸프롤린	Dmpro	N-(카르복시메틸)글리신	Nasp
D-α-메틸세린	Dmser	N-시클로부틸글리신	Ncbut
D-α-메틸트레오닌	Dmthr	N-시클로헵틸글리신	Nchep
D-α-메틸트립토판	Dmtrp	N-시클로헥실글리신	Nchex
D-α-메틸티로신	Dmty	N-시클로데실글리신	Ncdec
D-α-메틸발린	Dmval	N-시클로도데실글리신	Ncdod
D-α-메틸알린	Dnmala	N-시클로옥틸글리신	Ncoct
D-α-메틸아르기닌	Dnmarg	N-시클로프로필글리신	Ncpro
D-α-메틸아스파라긴	Dnmasn	N-시클로운데실글리신	Ncund
D-α-메틸아스파라테이트	Dnmasp	N-(2,2-디페닐에틸)글리신	Nbhm
D-α-메틸시스테인	Dnmcys	N-(3,3-디페닐프로필)글리신	Nbhe
D-N-메틸류신	Dnmleu	N-(3-인도리리에틸)글리신	Nhtrp
D-N-메틸리신	Dnmlys	N-메틸-γ-아미노부티레이트	Nmgabu
N-메틸시클로헥실알라닌	Nmchexa	D-N-메틸메티오닌	Dnmmet
D-N-메틸오르니틴	Dnmorn	N-메틸시클로펜틸알라닌	Nmcpen
N-메틸글리신	Nala	D-N-메틸페닐알라닌	Dnmphe
N-메틸아미노이소부티레이트	Nmaib	D-N-메틸프롤린	Dnmpro
N-(1-메틸프로필)글리신	Nile	D-N-메틸세린	Dnmser
N-(2-메틸프로필)글리신	Nile	D-N-메틸세린	Dnmser
N-(2-메틸프로필)글리신	Nleu	D-N-메틸트레오닌	Dnmthr
D-N-메틸트립토판	Dnmtrp	N-(1-메틸에틸)글리신	Nva
D-N-메틸티로신	Dnmtyr	N-메틸라-나프틸알라닌	Nmanap
D-N-메틸발린	Dnmval	N-메틸페니실아민	Nmpen
γ-아미노부티르산	Gabu	N-(p-히드록시페닐)글리신	Nhtyl
L-t-부틸글리신	Tbug	N-(티오메틸)글리신	Neys
L-에틸글리신	Etg	페니실아민	Pen
L-호모페닐알라닌	Hphe	L-α-메틸알라닌	Mala
L-α-메틸아르기닌	Marg	L-α-메틸아스파라긴	Masn
L-α-메틸아스파라테이트	Masp	L-α-메틸-t-부틸글리신	Mtbug
L-α-메틸시스테인	Mcys	L-메틸에틸글리신	Metg
L-α-메틸글루타민	Mgln	L-α-메틸글루타민	Mglu
L-α-메틸히스티딘	Mhis	L-α-메틸호모 페닐알라닌	Mhphe
L-α-메틸이소류신	Mile	N-(2-메틸티오에틸)글리신	Nmet
D-N-메틸글루타민	Dnmgln	N-(3-구아니디노프로필)글리신	Narg
D-N-메틸글루타메이트	Dnmglu	N-(1-히드록시에틸)글리신	Nthr
D-N-메틸히스티딘	Dnmhis	N-(히드록시에틸)글리신	Nser
D-N-메틸이소류신	Dnmile	N-(이미다졸리에틸)글리신	Nhis
D-N-메틸류신	Dnmleu	N-(3-인돌일에틸)글리신	Nhtrp
D-N-메틸리신	Dnmlys	N-메틸-γ-아미노부티레이트	Nmgabu
N-메틸시클로헥실알라닌	Nmchexa	D-N-메틸메티오닌	Dnmmet
D-N-메틸오르니틴	Dnmorn	N-메틸시클로펜틸알라닌	Nmcpen
N-메틸글리신	Nala	D-N-메틸페닐알라닌	Dnmphe
N-메틸아미노이소부티레이트	Nmaib	D-N-메틸프롤린	Dnmpro
N-(1-메틸프로필)글리신	Nile	D-N-메틸세린	Dnmthr
N-(2-메틸프로필)글리신	Nleu	D-N-메틸트레오닌	Dnmthr
D-N-메틸트립토판	Dnmtrp	N-(1-메틸에틸)글리신	Nval
D-N-메틸티로신	Dnmtyp	N-메티라-나프틸알라닌	Nmanap
D-N-메틸발린	Dnmval	N-메틸페니실아민	Nmpen
γ-아미노부티르산	Gabu	N-(p-히드록시페닐)글리신	Nhtyr
L-t-부틸글리신	Tbug	N-(티오메틸)글리신	Ncys
L-에틸글리신	Etg	페니실아민	Pen
L_호모페닐알라닌	Hphe	L-α-메틸알라닌	Mala
L-α-메틸아르기닌	Marg	L-α-메틸아스파라긴	Masn
L-α-메틸아스파르테이트	Masp	L-α-메틸-t-부틸글리신	Mtbug
L-α-메틸시스테인	Mcys	L-메틸에틸글리신	Metg
L-α-메틸글루타민	Mgln	L-α-메틸글루타민	Mglu
L-α-메틸히스티딘	Mhis	L-α-메틸호모페닐알라닌	Mhphe
L-α-메틸이소류신	Mile	N-(2-메틸티오에틸)글리신	Nmet
L-α-메틸류신	Mleu	L-α-메틸리신	Mlys

L-α-메틸메티오닌	Mmet	L-α-메틸노르류신	Mnle
L-α-메틸노르발린	Mnva	L-α-메틸오르니틴	Morn
L-α-메틸페닐알라닌	Mphe	L-α-메틸프롤린	Mpro
L-α-메틸세린	mser	L-α-메틸트레오닌	Mthr
L-α-메틸발린	Mtrp	L-α-메틸티로신	Mtyr
L-α-메틸류신	Mval Nnbhm	L-N-메틸호모페닐알라닌	Nmhphe
N-(N-(2,2-디페닐에틸)		N-(N-3,3-디페닐프로필)
카르바밀메틸-글리신	Nnbhm	카르바밀메틸(1)글리신	Nnbhe
1-카르복시-1-(2,2-디페닐에틸아미노)시클로프로판	Nmbc

금속단백질분해효소에 개선된 친화성 또는 향상된 생물학적 활성을 갖는 펩티드는 상 표시(Phase display) 또는 생물정보학을 포함하는 기술분야의 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 펩티드 합성 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다. 고상(solid phase) 펩티드 합성의 경우, 많은 기술들의 요약이 다음 문헌에서 발견된다: Stewart, J. M. and Young, J. D.(1963), "Solid Phase Petide Synthesis," W. H. Freeman Co.(San Francisco); 및 Meienhofer, J(1973). "Hormonal Proteins and Peptides," vol.2 p. 46, Academic Press(New York). 고전적 합성 해결의 고찰은 Schroder, G. and Lupke, K..(1965), The Peptides, vol. 1, Academic Press(New York)를 참조. 재조합 기술에 대해서는 이하의 문헌을 참조.

또한 고려할 사항은 상술한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산 서열이다.(SEQ ID NOs. 13, 14, 15, 16, 17 및 18) 참조).

상술한 바와 같이, 본 발명의 항체에 대한 하나의 특정한 사용은 금속단백질분해효소와 같은 금속단백질의 불균형 또는 비정상 활성과 관련된 질병의 예방 및 치료이다.

이러한 질병의 예로는 골관절염(OA), 류머티스성 관절염(RA), 폐혈성 관절염, 연질조직 류머티즘, 다발성 연골염, 및 건염과 같은 관절염 질병; 전이성 암, 치주질환; 알칼리 또는 기타 상해, 방사선, 비타민E 또는 레티노이드 결핍으로 유도된 각막 궤양; 단백뇨, 수포성 표피박리증과 같은 사구체 질환; 골다공증, 파젯병(Paget's disease), 부갑상선기능항진증 및 진주종과 같은 골흡수 질환; 배란 또는 착상을 막는 산아 제한; 당뇨 망막병증 및 황반 변성과 관련된 종양 증식 또는 신혈관생성과 관련된 혈관생성; 죽상판경화성 플라크 파열, 폐기종, 상처 치료 및 HIV감염과 관련된 관상동맥혈전증을 포함하나 이에 한정하지는 않는다.

실시예 10에 설명하였듯이, 본 발명자들은 본 발명의 항체가 과민성 대장질환 치료에 사용될 수 있다는 것을 보여주었다.

염증성 장질환(IBD)는 장염 및 조직 리모델링으로 특징되는 심한 위장 장해로, 발생 빈도가 증가하면 환자가 무력해질 수 있다. IBD, 궤양성 대장염(UC) 및 크론씨병(Crohn's disease)의 주요한 형태는 복통, 설사, 장출혈 및 발열 등으로 임상학적으로 특징되는 만성적, 재발성 질환(relapsing conditions)이다.

그래서, 본 발명의 하나의 관점에 따르면, 필요로 하는 피검체의 기질 단백질분해효소 활성을 억제하는 방법에 제공된다.

본 발명에 따른 바람직한 개체의 피검체로는 포유동물(개, 고양이, 양, 돼지, 말, 소, 영장류)과 같은 동물이며, 바람직하게는 사람이다.

상기 방법은 약학적으로 효과적인 함량의 본 발명의 MMP 억제제(즉, 상술한 항체 또는 항체 단편)를 피검체에 제공하는 것을 포함한다.

추가로 후술하는 바와 같이, MMP 억제제는 직접투여(예, 경구투여 또는 주사)로 제공되거나 개체의 표적세포에 투여된 폴리뉴클레오티드 구조체로부터 발현될 수 있다.

본 발명의 MMP 억제제는 그 자체로 개체에 제공되거나 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 약학적 조성물로 제공될 수 있다.

본원에서 사용된 "약학적 조성물"이란 본원에 기술된 하나 이상의 활성 성분과 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제(excipient)의 제제를 말한다. 약학적 조성물의 목적은 유기체에 화합물의 투여를 용이하게 하기 위함이다.

본원에서 사용된 용어 "활성 성분"이란 생리학적 효과를 책임지는 항체 제제를 말한다.

이하, 교대로 사용가능한 구문 "생리학적으로 허용가능한 담체" 및 "약학적으로 허용가능한 담체"란 투여된 화합물의 생리학적 활성을 없애거나 유기체(기관)에 커다란 자극을 유발하지 않는 담체나 희석제를 말한다. 보조제는 이 구문에 포함된다. 약학적으로 허용가능한 담체에 포함되는 성분 중 하나는 유기 및 수용액 매체에 광범위한 용해도를 갖는 생체친화성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG)이다.(Mutter et al.,(1979).

본원에 사용되는 "부형제"란 활성 성분의 투여를 용이하게 하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. 한정없이, 부형제의 예로는 탄산염칼슘, 인산염칼슘, 여러 가지 당류 및 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜의 형태를 포함한다.

약의 제제화 및 투여 기술은 "Remington's Pharmaceutical Science," Mack Publishing Co., Easton, PA의 최근판에 있으며, 본원에서 참고로 포함하였다.

적당한 투여 경로는 예를 들어, 경구, 경점막, 특히 경비, 장내 또는 근육내, 피하주사 및 척수내 주사를 포함하는 장관외 전달뿐만 아니라 경막내 주사, 뇌실내 직접 주사, 정맥내 주사, 복강내 주사, 목안내 주사 또는 안구내 주사를 포함한다.

양자택일하여, 체계적인 방법이 아닌 국소적인 방법 예를 들어, 환자의 신체 특정 부위에 직접 제제를 주입하는 방법으로 제제를 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 기술분야에 공지된 방법 예를 들어, 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 포집화 또는 동결건조 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 약학적 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 제제내로 활성성분의 진행을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 생리학적으로 허용가능한 담체를 하나 이상 사용하는 종래의 방법으로 제제(제형)화 할 수 있다.

주사의 경우, 본 발명의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는, 항크액(Hank's solution), 링거액, 또는 생리식염수와 같은 생리학적으로 상용성 완충에서 제제(제형)화 할 수 있다. 경점막 투여의 경우 스며드는 베리어에 적절한 침투제가 제제에 사용될 수 있다. 이러한 침투제는 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다.

경구투여의 경우, 활성성분과 기술분야에 공지된 약학적으로 허용가능한 담체와 결합하여 쉽게 제제화할 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 화합물을 정제, 알약, 캡슐, 액상, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등과 같이 환자의 경구 섭취가 가능한 형태로 제제화가 가능하게 한다. 경구용 약리학적 제제는 고체 부형제를 사용하여 임의로 최종 혼합물을 분쇄하고, 과립 혼합물을 처리하고, 적당한 보조제를 첨가하여 정제나 당의정 코아를 얻을 수 있다. 적당한 부형제는 특히, 락토스(유당), 슈크로스(자당), 만니톨 또는 솔비톨을 포함하는 당류와 같은 충진제; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸스검(Tragacanth Gum), 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 소디움 카르보메틸셀룰로스과 같은 셀룰로스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 약리학적으로 허용가능한 중합체가 있다. 필요하다면, 가교 폴리비닐피롤리돈, 아가(한천), 알긴산 또는 그 염(알긴산나트륨)과 같은 붕해제(disintegrating agent)를 첨가할 수 있다.

당의정 코아(core)는 적당한 코팅물로 제공된다. 이러한 목적을 위해 임의로 아라비아 고무, 탈크(활석), 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔(carbopol gel), 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티타늄, 락커(lacquer)액, 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함하는 진한 설탕 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물의 서로 다른 결합을 특정하거나 구별하기 위해 염료 또는 안료를 정제나 당의정 코팅물에 첨가할 수 있다.

경구 사용되는 약학적 조성물은 젤라틴 및 연질로 만든 푸쉬-핏(push-fit) 캡슐, 젤라틴 및 글리세롤이나 솔비톨과 같은 가소제로 만든 밀봉캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 락토스, 전본과 같은 바인더, 탈크나 스테아린산마그네슘과 같은 윤활제, 및 임의로 안정제와 같은 추진제와 혼합한 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캅셀의 경우, 활성 성분은 지방 오일, 액상 파라핀 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 액상에 용해되거나 현탁될 수 있다. 이외에 안정제가 첨가될 수 있다. 경구투여용 모든 제제는 선택한 투여경로에 적합한 복용량이어야 한다.

구강 투여의 경우 조성물은 종래의 방법으로 제제화된 정제나 마름모꼴 정제 형태일 수 있다.

비강(코) 흡입의 경우, 본 발명의 활성 성분은 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소와 같은 적당한 추진제를 사용한 압력 팩 또는 네블라이저(nebuilizer)로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달된다. 압력 에어로졸 경우, 투여량 단위는 계량된 함량으로 전달하는 밸브를 제공함으로써 측정할 수 있다.

디스펜서에 사용하는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 분말 혼합물과 락토스나 전분과 같은 적당한 분말 베이스를 함유하는 형태로 제제화될 수 있다

본원에 기술된 제제는 볼루스(bolus) 주입 또는 연속 주입과 같은 비경구 투여로 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 방부제가 첨가된 앰플 또는 다량-투여 용기와 같은 투여 단위로 제공될 수 있다. 조성물은 오일이나 수용액 매체 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로 현탁액, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제제용 성분를 함유할 수 있다.

비경구 투여용 약학적 조성물은 수용성 형태인 활성 제제 수용액을 포함한다. 추가적으로, 활성 성분의 현탁액은 적당한 오일성 물 주성분의 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적당한 친유성 용매 또는 매체로는 참기름과 같은 지방 오일, 또는 에틸 올레이트, 트리글리세러이드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테를를 포함한다.

주사 현탁액은 소디움 카르복시메틸 셀룰로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로 현탁액은 고도의 농축액을 제조하기 위해 활성 성분의 용해도를 증가시키는 적당한 안정제나 물질을 함유할 수 있다.

양자택일하여, 활성 성분은 사용하기에 앞서 무균의 발열인자가 없는 물 주성분의 용액과 같은 적당한 매체로 구성하기 위해 분말 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 제제는 코코아 버터나 기타 글리세라이드와 같은 종래의 좌약제를 이용하여 좌약 또는 유지 관장액과 같은 직장투여용 조성물로 제제화될 수 있다.

본 발명에 사용하기에 적합한 약학적 조성물은 의도하는 목적을 달성하기에 효과적인 함량의 활성 성분을 함유하는 조성물을 포함한다. 좀더 구체적으로, 치료학적으로 효과적인 함량이란 치료받는 피검체의 질병 증세를 예방, 경감하거나 개선하거나, 생존을 연장하는데 효과적인 활성성분의 함량을 의미한다.

치료학적으로 효과적인 함량의 결정은 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 방법에 사용된 제제의 경우, 치료학적으로 효과적인 함량 또는 투여량은 생체내 분석으로부터 초기에 평가할 수 있다. 예를 들어, 동물에서 투여량을 공식화하고 이러한 정보는 보다 정확한 사람의 투여량을 결정하는데 사용될 수 있다.

상술한 활성 성분의 독성 및 치료학적 효능은 생체외, 세포조직 또는 실험동물에서 표준 약학적 절차에 의해 결정된다. 이들 생체외 및 세포 조직 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간의 투여량 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 투여량은 도입한 투여 형태 및 이용한 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제제, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 보고 개개의 내과의사가 선택할 수 있다.[참조 Fingl et al., (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1].

치료받는 상태의 가혹도 및 응답에 따라 달라지지만, 투여량은 수일에서 수주 간에 걸친 치료기간에 따라, 또는 치료가 효과를 발휘하거나 질병상태의 감소가 얻어질때까지 1회 또는 다수 투여가 될 수 있다.

물론, 투여되는 조성물의 함량은 치료받는 피검체, 고통의 가혹도, 투여방법, 내과의사의 처방 판단에 따라 달라질 수 있다.

상용성 있는 약학적 담체에 제형화된 본 발명의 제제를 포함한 조성물이 제조될 수 있으며, 적당한 용기에 보관되며, 지시된 질환의 치료를 위해 라벨링된다.

본 발명의 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여량을 함유하는 FDA 승인 키트와 같은 팩(pack)이나 디스펜서 기구로 제공될 수 있다. 예를 들어 팩은 금속 또는 블리스터 팩(blister pack)과 같은 플라스틱 포일을 포함한다. 팩이나 디스펜서 기구에는 투여 지침서가 동봉되어 있다. 또한 팩이나 디스펜서 기구에는 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 통제하는 정부기관이 규정한 형태로 용기와 관련된 통지(고시)가 수용될 수 있으며, 이러한 통지는 조성물의 형태 또는 사람이나 동물 투여의 정부기관의 승인을 반영한 것이다. 예를 들어 이러한 통지는 처방 의약 또는 승인제품에 대한 미국식품의약국의 승인을 받은 라벨일 수 있다.

상술하였듯이, 본 발명의 항체 억제제는 핵산 구조체(nucleic acid construct)로부터 발현될 수 있다. 본 발명의 항체를 암호화(인코딩)한 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 세포외 또는 세포외 국소부위로 항체의 분비 또는 통행을 허용하는 단일 펩티드를 암호화한다. 예를 들어, 표적 금속단백질이 MMP인 경우, 분비성 단일 펩티드는 바람직하게는 항체 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 공역되는 것으로 생각된다.

재조합 단쇄 Fv(ScFv) 단편은 항체 분자에 비교하여 상당히 덜 복잡한 구조때문에 발현되는 것으로 생각된다. 상술하였듯이, ScFvs는 V_H의 아미노 말단에 펩티드가 가교결합된 V_L의 카르복실 말단을 갖는 단쇄로 합성된 V_L과 V_H 항체 폴리펩티드 사슬로 구성되는 단백질이다. 이들 펩티드의 재조합 생산방법은 기술분야에 공지되어 있다. [Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); and de Kruit et al., J. Mol. Biol. 248:97-105 (1995) 참조].

본 발명의 이러한 관점의 실시양태에 따르면, 본 발명의 화합물로 면역한 후 비성 mRNA를 면역한 동물로부터 채취하였으며, ScFv를 나타내는 박테리아파지에서 cDNA 라이브러리를 생산하는데 사용하였다. 이어서, 파지 입자를 스크리닝하여 구 체적으로 상호작용하는지, 바람직하게는 관심 있는 금속단백질의 활성 형태를 보유하는지 정하였다. ScFv 단편을 이들 파지 입자로부터 회수하소 발현 구조체로 클로닝하였다.(미국특허 제5,800,814호 참조).

본 발명의 핵산 구조체는 개개의 피검체(즉, 생체내 유전자 치료)의 표적세포로 투여될 수 있다.

양자택일하여 핵산 구조체는 적당한 유전자-전달 매체/방법(트랜스펙션, 트랜스덕션, 동종 재결합 등) 및 필요 시 발현시스템을 통해 적당한 세포내로 도입되며, 변성 세포는 조직에서 확장된 후 개체(즉, 생체외 유전자 치료)로 돌아간다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편의 세포 발현을 위해 본 발명의 핵산 구조체는 추가로 적어도 하나 이상의 시스-작용(cis-acting) 조절요소를 포함한다. 본원에서 사용된 구 "시스-작용 조절요소"란 트랜스(trans)-작용 조절제를 결합하는 프로모터(promoter)인 폴리뉴클레오티드를 말하며, 다운스트림에 위치한 코딩 서열의 전사(transcription)를 조절한다.

이용가능한 어떤 프로모터도 본 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 바람지한 실시양태에서 본 발명의 핵산 구조체가 이용된 프로모터는 변형된 특이성 세포 개체군에서 활성적이다, 세포형-특이성 및/또는 조직-특이성 프로모터의 예로는 간 특이성이 있는 알부민과 같은 프로모터[Pinker et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277], 임파계 특이성 프로모터[Calame et al., (1987) Adv. Immunol. 43:235-275]; T-세포 수용체의 특정 프로모터[Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733] 및 면역글로불린; [Banerji et al.,(1983) Cell 33729-740], 뉴론필라멘트와 같은 뉴론 특이성 프로모터[Byrne et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], 췌장-특이성 프로모터[Edlunch et al., (1985) Science 230:912-9160 또는 우유 유청 프로모터와 같은 유선-특이성 프로모터(미국특허 제4,873,316호 및 유럽 출원공개번호 제264,166호)를 포함한다. 본 발명의 핵산 구조체는 부가적으로 프로모터에 인접하거나 가까이 있으면서 전사를 조절하는 기능을 갖는 인헨서(enhancer)를 포함할 수 있다.

본 방법의 구조체는 바람직하게는 부가적으로 적절한 선택가능한 마커(marker) 및/또는 복제 개시점(origin of replication)을 포함한다. 바람직하게는 이용한 구조체는 대장균(E. coli, 여기서 구조체는 적절한 선택가능한 마커 및 복제 개시점을 포함한다)에서 증식할 수 있는 셔틀 벡터(shuttle vector)로, 세포 증식 또는 유전자 통합 및 선택한 조직과 상용성이 있다. 본 발명에 따른 구조체는 플라스미드, 박미드(bacmid), 파지미드(phagemid), 코스미드(cosmid), 파지, 바이러스 또는 인공 염색체일 수 있다.

현재 생체내에서 바람직한 핵산 전달 기술은 아데노바이러스, 렌티바이러스, 허페스 심플렉스 I 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스(AAV) 및 리피드계 시스템과 같은 바이러스성 또는 비-바이러스성 구조체를 갖는 트랜스펙션을 포함한다. 유전자의 지질-매개 전달의 유용한 지질로는 DOTMA, DOPE, 및 DC-Chol이 있다[Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14(I): 54-65(1996)]. 유전자 치료에 사용하기에 가장 바람직한 구조페는 바이러스이며, 가잘 바람직하게는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스, 레트로바이러스이다. 레트로바이러스 구조체와 같은 바이러스 구조체는 하나 이상의 전사 프로모터/인헨서 또는 로커스-한정 요소, 또는 얼터네이트 스플라이싱(alternate splicing), 핵RNA 엑스퍼트, 또는 전사 후 메신저의 변형과 같은 다른 수단에 의해 유전자 발현을 조절하는 다른 요소를 포함한다. 이러한 벡터 구조체는 또한 패키징 시그널, 장형반복말단 (LTR: long terminal repeats) 또는 그 부분, 및 바이러스 구조체에 이미 존재하지 않는 한 사용된 바이러스에 적절한 양성 및 음성 스트렌드 프라이머 결합부위를 포함한다. 더욱이, 이러한 구조체는 전형적으로 숙주세포로부터 펩티드 또는 항체의 분비를 위한 시그널 서열을 포함한다. 바람직하게는 이러한 목적의 시그널 서열은 포유류의 시그널 서열이다. 임의로 구조체는 또한 폴리데닐레이션(polydenylation)을 탐지하는 시그널뿐만 아니라 하나 이상의 억제 부위 및 번역 말단 서열을 포함한다. 실시예를 통해 이러한 구조체는 전형적으로 5'LTR, tRNA 결합부위, 패키징 시그널, 제 2-스트랜드 DNA 합성의 개시점 및 3'LTR 또는 그 부분을 포함한다. 양이온 지질, 폴리리신 및 덴드리머(Dendrimer)와 같은 비-바이러스성인 다른 벡터가 사용될 수 있다.

유전자 치료 프로토콜을 시행하는 바람직한 방법은 Somia and Verma[(2000) Nature Reviews 1:91-99], Isner(2002) Myocardial gene therapy. Nature 415:234-239; High(2001) Gene therapy: a 2001 perspective. Haemophilia 7:23-27; and Hammond and McKirnan(2001) Angiogenic gene therapy for heart disease: a review of animal studies and clinical trials. 59:561-567에서 제공된다.

금속단백질의 활성 형태(실시예의 실시예 3 참조)를 미세하게 인식하게 인식 하는 본 발명의 항체의 능력때문에, 이들은 생물학적 샘플[즉, 혈액(혈청 또는 플라즈마), 객담, 복수, 흉막 삼출, 소변, 생체검사 견본, 분리된 세포 및/또는 세포막 제제와 같은 혈액 샘플]에서 MMP 활성을 모니터링함으로써, 효과적인 진단 및 예후 도구로 사용될 수 있다. 이것은 특히 종양 침범을 촉진하는 MMP의 불균형 활성화가 있는 암세포의 전이 특성을 평가하는데 중요하다. 마찬가지로, 본 발명의 항체는 MMP 억제제의 치료 투여량을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 이러한 응용 때문에 본 발명의 항체는 바람직하게는 기술분야의 표준사용에 관한 방사성, 형광성, 생물학적, 또는 효소학적 태그나 라벨 중 하나로 라벨링된다. 이러한 라벨에 관한 미국특허로는 미국특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호가 있다.

이러한 검출방법은 신규한 MMPs의 초고속약효탐색(High Throughput Screening, HTS)에 사용될 수 있다. 간단히 말해, 다수의 생물학적 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키면 활성화된 MMPs가 결합된다. 측정은 종양 세포라인으로부터 유도된 활성 MMPs를 포함하는 생물학적 샘플을 사용하여 이루어진다. 전형적으로, 분석 볼륨을 줄이기 위해 방사성 라벨이 사용된다.

양자택일하여, 본 발명의 항체는 생물학적 샘플로부터 활성 금속효소를 정제하는데 사용될 수 있다.

수많은 단백질 정제방법이 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 금속효소를 분리하기 위해 친화성 크로마토그래피가 사용된다. 칼럼을 제조하고, 아가로스, 세파덱스(Sephadex)등과 같은 입자인 고형상 기질, 세포 라이세이트(cell lysate)와 같은 생물학적 샘플에 결합된 항체를 칼럼에 통과시키고, 칼럼을 세척한 후, 중성 변성제의 농도가 증가하면 정제된 금속효소가 배출된다.

본 발명의 교시에 따라 생성된 항체 또는 그 단편은 진단키트나 치료키트에 포함될 수 있다. 항체 또는 그 단편은 적절한 완충제 및 보존제로 채워진 하나 이상의 용기에 포장되어 진단 또는 직접적인 치료에 사용된다.

그래서, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 하나의 단일 용기에 각각 혼합되거나 개별 용기에 저장된다. 바람직하게는 용기는 라벨을 포함한다. 적당한 용기로는 병, 유리병(vial), 주사기 및 시험관을 포함한다, 용기는 유리나 플라스틱과 같은 여러 형태의 재질로 형성될 수 있다.

게다가, 안정제, 완충제, 차단제등과 같은 다른 첨가제가 추가될 수 있다. 이러한 키트의 항체는 비드, 어레이 기판(예, 칩) 고체 지지체 부착되어 진단 목적으로 사용될 수 있다. 키트는 또한 대상 피검체 MMP의 발현과 연관된 상태, 질환 또는 질병으로 고생하거나 발전할 가능성이 있는 경우 측정을 위한 안내지침서를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 목적, 신규한 특징들은 다음의 실시예를 통해 해당 기술분야의 당업자에게 명백할 것이며, 이들 실시예로 한정하진 않는다. 추가로, 상술한 내용 및 하기 청구항에서 청구한 본 발명의 각각의 실시양태는 다음 실시예에서 실험적으로 지지한다.

[실시예]

다음 실시예 및 상기의 상세한 설명을 참고하여 지금부터 본 발명을 비제한적인 방법으로 설명하고자 한다.

일반적으로, 본원에서 사용된 명명법 및 본 발명에서 사용된 실험절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예를 들어 이하의 문헌을 참조, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocol in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed.(1994); Ausubel et al., "Current Protocol in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Marryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley and Sons, New York(1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al., (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998); 미국특허 제4,666,828호; 제4,801,531호; 제5,192,652호 및 제5,272,057호에 설명된 방법; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed.(1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed.(1994); Stites et al., (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi(eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 이용가능한 면역분석법은 하기 특허 및 과학논문에 광범위하게 기술되어 있다. 예를 들어 참조, 미국특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제 4,879,219호; 제5,011,771호 및 제5,281,521호; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., ed.(1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds.(1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds.(1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed.(1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); MarShak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization -A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); 모든 문헌은 본원에서 참고로 인용하였다. 기타 일반적인 참고문헌은 본 서류를 통해 제공된다. 본원의 방법은 기술분야에 공지된 것으로, 독자의 편의를 위해 제공된다. 여기에 함유된 모든 정보는 참고로 인용되었다.

물질 및 방법

재조합 효소 - MMP-2(Genbank Accession NO. NP_032636.1의 아미노산 110-467)의 촉매성 도메인을 BL-21 세포중의 T7 프로모터하에서 발현하였다. 세포를 1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드로 5시간 유도하였다. 세포 펠릿을 완충액과 오리지날 조직 부피를 1:2.5의 비율로 50mM Tris, pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 50mM NaCl, 5% 글리세롤과 1% Triton X-100중에서 다시 현탁하였다. 현탁액을 1,500rpm으로 10분간 원심분리하고, 펠릿을 50 mM Tris, pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 50 mM NaCL, 5% 글리세롤, 및 0.2%의 사코실(Sarkosyl)중에 용해시킨 후, 얼음상에서 30분간 배양하였다. 상등액 분획을 5-ml 젤라틴-세파로즈 칼럼(선포장된, Amersham Biosciences)에 올리고, 미리 평형을 이루고, 투석 완충액(50 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 10 μM ZnCl₂, 0.02% Brij)으로 세척하였다. 단백질을 50 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl, 5 mM 5 mM CaCl₂, 10 μM ZnCl₂, 0.02% Brij 및 15% Me2SO로 용출하고[Rosen, O., Inhibition of MMPs by Monoclonal Antibodies, 2001]), SDS-PAGE로 분석하고, 그 촉매성 활성을 형광생성 펩티드 분해로 측정하였다.[Knight, C.G., F. Willenbrock, and G. Murphy, A novel coumarin-labelled peptide for sensitive continuous assays of the matrix metalloproteinase. FEBS Lett, 1992. 296(3): p. 263-6].

Pro-MMP-9[힌지 영역 및 헤모펙신 도메인이 결핍, Alal-Gly424｜P14780｜MMP0_인간 기질 단백질분해효소-9-전구체(MMP-9)(EC 3.4.24.35)]를 pWIN 발현벡터 중의 대장균(Escherichia coli) ER2566에 발현하고, 상술한 봉입체로부터 균질성을 위해 정제하였다.[Bjorklund, M., P. Heikkila, and E. Koivunen, Peptide inhibition of catalytic and noncatalytic activities of matrix metallpproteinase-9 blocks tumor cell migration and invasion . J Biol Chem, 2004. 279(28): p. 29589-97]. 1 mM p-아미노페닐머큐릭 아세테이트(APMA, ICN Biomedicals Inc., Ohio, USA)로 활성화시킨 Pro-MMP-9을 200 mM Tris중에 37℃에서 30분간 용해하였다.

인간 재조합 pro-MMP-2 및 pro-MMP-9를 대응 재조합 백시니아(vaccinia) 바이러스로 감염시킨 HeLA S3세포에 발현한 후 상술한 균질성을 위해 정제하였다.[Olson, M. W., Gervasi, D. C., Mobashery, S., and Fridman, R.(1997) J. Biol. Chem. 272, 29975-29983; Fridman, R., Fuerst, T. R., Bird, R. E., Hoyhtya, M., Oelkuct, T. M., Kraus, S., Komarek, D., Liotta, L. A., Berman, M. L.,; and Stetler-Stevenson, W. G.(1992) J. Biol. Chem. 267, 15398-15405].

테트라 - 카르복시 페닐 포르피린 Co ( II )/ Zn ( II ) ( CoTCPP / ZnTCPP ) - ZnCl₂와 N,N-디메틸포름아마이드(DMF)중의 TCPP를 반응시켜 ZnTCPP를 합성하였다.[Harada, A., et al., Control of photoinduced electron transfer from zinc-porphyrin to methyl viologen by supramolecular formation between monoclonal antibody and zinc-porphyrin. Photochem Photobiol, 1999. 70(3): p. 298-302]. Co(OAc)₂.4H₂O와 DMF중의 TCPP를 반응시켜 CoTCPP를 합성하고 정제하였다.[Harada, A., et al., Control of photoinduced electron transfer from zinc-porphyrin to methyl viologen by supramolecular formation between monoclonal antibody and zinc-porphyrin. Photochem Photobiol, 1999. 70(3): p. 298-302].

Imisdp 의 합성 - 하기 실시예 7에 기술되었다.

단백질에 합텐 접합- DMF중의 1,1'-카르보닐디이미다졸(1:1 몰랄비)를 첨가 하여 접합을 위해 합텐을 활성화하고 1시간 동안 배양하였다. 1-50 μmole의 활성화된 합텐을 20mg/mL BSA 또는 0.1 M 탄산염 완충액(pH 8)중의 키홀 림펫 헤모시아닌(KNH)에 첨가하였다. 용액을 실온에서 3시간 교반하고 PBS에 대해 광범위하세 투석하였다.

면역 및 융해 - BALB/c 마우스를 면역하기 위해 각각의 보조제(KLH) 접합 CoTCPP, ZnTCPP 또는 Imisdp를 사용하였다. 표준절차에 따라 NSO 골수종 세포 라인에 면역 및 융해를 실시하였다.[Harlow, E., and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual Portable Protocol No. 1998].

항체 스크리닝

ELISA ( 엘리사 , 효소 면역분석법) - ZnTCPP, CoTCPP 또는 직접 ELISA를 이용한 Imisdp와 반응하는 항체를 얻기 위해 증식하는 하이브리도마의 상등액을 스크리닝하고, 각각의 헵텐-BSA(PBS중 3㎍/ml)을 Nunc maxisorp 플레이트에 코팅하였다. 코팅을 4℃에서 밤새 실시하고, 항체와 함께 20℃에서 1시간 배양하였다. HRP-접합 항-마우스 mAb(시그마)를 제 2 항체로 사용하였으며, 2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산, ABTS, 시그마)를 기질로 사용하였다. 0.005% v/v Tween 20(PBST)를 함유하는 PBS를 세정제로 사용하였다. 완충희석액은 PBS이다. A602를 SPECTRAFluor Plus 스펙트라미터(Tecan, Austria)에서 마이크로플레이트 리더로 기록하였다. 동일한 방법으로 대조군 상등액을 BSA 코팅 플레이트로 배양하였다. 0.5 밀리옵티칼 밀도 이상의 흡수치가 양성으로 나타났다.

경쟁적 ELISA - 별개의 하이브리도마 상등액 희석액을 합텐-BSA 코팅 플레이 트로 배양한 후 상술한 단계를 실시하였다. 적정량 곡선을 플로팅하고 역가 희석을 50%의 결합에서 측정하였다. 역가 농도로 희석된 상등액을 가용성 ZnTCPP, CoTCPP 또는 Imisdp 화합물로 30분간 미리 배양하고, 합텐-코팅된 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)로 옮기고 이전에 기술한 단계를 밟았다. 측정된 해리상수(dissociation constant)는 50% 결합을 얻는데 필요한 가용성 합텐의 농도이다.

생산 및 정제 - 선택한 하이브리도마를 한정된 희석액으로 2회 서브클로닝한 후 프리스틴(2,6,10,14 테트라메틸펜타데칸) 주입한 BALB/c 마우스로 프라임퍼리한 복수종양으로 대량생산하였다. 단백질 G 세파로즈 4 페스트 플로(Amersham Bioscience) 상에서 친화성 크로마토그래피로 MAb를 정제하였다. 복수를 12,000g에서 15분간 원심분리하여 불용성 입자 및 지질을 제거하였다 1-mL 복수를 PBS로 5배의 부피로 희석한 후 5-mL의 칼럼 부피 단백질 G-세파로즈에 충전하였다. 용출 피크를 SDS-PAGE로 분석하였다.

아이소타이프 ( ISOTYPE ) 측정 - 배양 플라스크에서 증식한 클론화 하이브리도마로부터 수득한 배양 상등액을 mAb의 원천으로 사용하였다. 각각의 항체를 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(HyCult biotechnology b. v., The Netherlands)로 아이소타이프하였다.

정제된 항체의 면역블롯 분석 - 정제한 항체를 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔 중에서 분리한 후 NC 멤브레인(Bio-Rad)로 옮긴 후 항MMP-9 항체(Sigma)를 사용하여 면역블롯 분석하였다. 양고추냉이 페록시디아제(Sigma)와 접합시킨 염소 항-마 우스 IgG를 제 2 항체로 사용하였다. ECL(Pierce)를 사용하여 시그널을 검출하였다.

정제 단백질을 이용한 결합 분석 - MABs(10㎍)를 PBS중의 항 마우스 IgG 아가로스 비드(Sigma)로 4℃에서 밤새 배양하였다. 결합되지 않은 항체를 세척한 후, 정제된 Pro-MMP-2, Pro-MMP-9, MMP-2 촉매성 도메인, MT1 촉매성 도메인 또는 TACE(2㎍)를 가한 후 RT(실온)에서 2시간 배양하였다. 원심분리로 비드를 회수한 후, PBS로 3회 세척하였다. 비드에 결합되어 남아있는 단백질을 SDS 샘플 안충액으로 용출하고, SDS-PAGE로 분획하고, 쿠마씨 블루(Coomassie blue)로 염색하여 검출하였다.

면역침전 및 웨스턴 블럿 - HT1080 세포를 페트리 접시에 종균하였다. 80% 합류에 접근한 후, 배지(10% FCS, 중요치 않은 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이시, 소디움 피루베이트, 및 L-글루타민으로 보충한 DMEM)를 혈청이 없는 배지(FCS가 없는)로 교환하였다. 추가로 24시간 배양한 후, 조건 배지(CM)를 유착세포로부터 수득하고, Millipore Centricon-10(Bedford, MA)를 사용하여 농축하였다. 농축한 상등액을 면역침전물로 사용하였다. 항-1(CoTCPP) mAb(15㎍/ml)로 배양한 CM을 4℃에서 밤새 배양하였다. 단백질 A 세파로즈(CL-4B Amersham Bioscience)를 샘플에 가하고, RT(실온)에서 2시간 혼합하였다. 비드를 PBS로 3회 세척하고, SDS 샘플 완충액에 현탁하고, 95℃로 3시간 가열하였다. 원심분리로 면역침전물을 회수하고, SDS/PAGE하였다. 분리 후, 단백질을 니트로셀룰로즈(NC) 멤브레인으로 옮긴 후 항-MMP-2 항체로 탐침하였다.

HT1080 세포에 의해 생산된 ProMMP-2를 활성시키기 위해 1 mM의 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트(APMA)를 농축된 CM에 첨가한 후, 37℃에서 6시간 배양하였다. 활성화 후, CM을 PBS에 대해 4℃에서 투석(x3)하여 APMA를 제거하였다. 활성화된 배지의 면역침전을 상기에 기술한 대로 실시하였다.

직접 ELISA 를 이용한 활성 MMP -9에 결합 - MMP-9 촉매성 도메인(2㎍/ml)를 마이크로타이터 웰(microtiter well)에 고정화하였다. mAbs(1mg/ml)를 웰에 가한 후 ELISA 스크리닝과 동일한 방법으로 실시하였다. 항 MMP-9 항체(Sigma)는 양성 대조군으로 작용하고, 복수로부터 정제된 관련없는 마우스 IgG 친화성은 음성으로 대조군으로 작용하였다.

운동에너지 분석 - MMPs의 효소학적 활성은 상술한대로 측정하였다.[Solomon, A. et al., Pronounced diversity in electronic and chemical properties between the catalytic zinc sites of tumor necrosis factor - alpha -converting enzyme and matrix metalloproteinase despite their high structural similarity, J Biol Chem. 2004. 279(30): p. 32646-54]. MMP-9, MMP-2 및 MT1-MMP의 활성은 Calbiochem-Novabiochem AG로부터 구입한 형광성 펩티드(Knight et al.,[FEBS Lett, 1992. 296(3): p. 263-6]에 기술된 λ_ex= 340 nm 및 λ_em= 390에서 Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂)의 분해를 모니터링하여 측정하였다. 표준 분석 혼합물은 50 mM의 Tris 완충액, pH 7.5, 200 mM의 NaCl, 5 mM의 CaCl₂, 20μM의 ZnCl₂ 및 0.05%의 Brij를 함유하였다. TACE의 효소학적 활성은 Calbiochem- Novabiochem AG로부터 구입한 형광성 펩티드QF-45(Mca-Ser-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Arg-Lys(디니트로페닐)-NH2)의 분해를 모니터링하여 측정하였다.

원위치에서 자이모그래피 ( Zymography ) - 원위치 자이모그래피에 의한 MMPs의 젤라틴 융해성 활성을 국소화하기 위해, 분자내 급냉시킨(Molecular Probes) 플루오레세인(fluorescein) 이소티오시아네이트-라벨 DQ 젤라틴을 젤라티나제 분해용 기질로 사용하였다. 젤라티나제에 의한 단백질 분해는 쪼개진 플루오레세인 이소티오시아네이트-젤라틴 펩티드를 산출하며, 이러한 플루오레세인의 국소화는 젤라틴 융해성 활성의 부위를 나타낸다. 간단히, 인간 섬유육종 HT1080 세포(이것은 MMP-2, MMP-9 및 MT1-MMP를 생산한다.)를 12 mm 커버슬립에 올려놓는다. 24시간 배양 후, 세포를 37℃에서 30분간 1μM의 13E11 mAb로 처리한다. PBS로 세포를 세척하고, 60㎍/ml의 DQ 젤라틴을 함유하는 자이모그래피 반응 완충액(0.05 M Tris-HCl, 0.15 M naCl, 5 mM CaCl2 및 0.2 mM NaN3, pH 7.6, 고농도의 아지드는 젤라틴이 식세포 작용을 막아서 세포 표면이 젤라틴 융해성 활성이 일어나도록 한다)을 37℃에서 밤새 배양한다. 자이모그래피는 치료된 세포에 대해 1 μM의 CoTCPP mAb를 함유한다. 배양기간이 끝나갈 시점에, 고정화 또는 추가 세척 없이 MMPs의 젤라틴 융해성 활성을 국소화하고, 형광 현미경으로 사진을 찍은 후에 그 이미지를 스팟 디지털 카메라로 얻었다.

실시예 1

작은 유기금속 화합물에 의한 아연 활성 부위의 형태 모방

MMPS의 활성부위에서 아연 이온은 3개의 보존 히스티딘 잔기에 의해 균일하게 배위결합된다. 자이모겐(zymogen) 활성화 및 기질 단백질분해 아연 배위는 비촉매성 단계에서 4-배위, 4면체 기하학적 형상부터 촉매성 단계에서 5-배위, 삼각쌍뿔 형상까지 변화한다. [Auld, D.S., Zinc Coordination sphere in biochemical zinc sites. Biometals, 2001. 14(3-4): p. 271-313]. 그러므로 보존된 히스티딘은 아연 이온에 대해 다른 기하학적 형상을 갖는 것으로 생각된다. 이러한 형상을 샘플링하기 위해 아연 환경 모방체 Imisdp 및 Co/ZnTCPP(도 1)에 대한 모델로 선택하였다. Imisdp(합성은 하기 실시예 7에 제공된다.) 화합물은 4-배위 기하학적 형상을 모방할 수 있다. 이 경우, 거의 4면체 형상이 4번째 리간드로 3개의 이미다졸 염기와 물 분자에 의해 생성된다.

도 2A는 아연 리간드의 4면체 기하학적 형상을 나타내기 위해 변형된 MMP-9(PDB 1GKC)의 촉매부위를 갖는 Imisdp 분자의 구성된 3D 모델의 오버레이이다. [Rowsell, S., et al., Crystal structure of human MMP9 in complex with a reverse by hydroxamate inhibitor . J. Mol Biol, 2002. 319(1): p. 173-81]. 변형은 X-선 구조에 존재하는 리간드(히드록사메이트 억제제)를 물 분자로 치환하고, 다층 QM/MM 접근(물질 및 방법 참조)에 의해 국소 최소화까지 전효소로 최적화하는 것을 포함한다. 높은 유사성은 아연 이온으로부터 히스티딘의 ε-질소의 거리(각각 2.04±0.06 및 2.02) 및 금속을 향한 3개의 히스티딘의 상대 배위로 환산하여 MMP-9과 계산된 히스티딘 아연 모티프와 Imisdp 사이에 존재한다. 제 2 분자-Zn/CoTCPP는 아연과 배위한 4개의 이미다졸 염기, 또는 금속이온에 대해 공-평면 형상을 갖는 유사한 금속 코발트를 갖는다. [Stevens, E.D., Electronic Structure of Mettaloporphyrins. I. Experimental Electron Density Distribution of (meso-Tetraphenylporphinato)cobalt(II). J. Am. Chem. SOC, 1981. 103(17): p. 5087-5095]. 이 형상은 5-배위 삼각쌍뿔 형상으로 3개의 히스티딘 중 2개의 형상을 모방하며, 여기서 금속은 피라미드의 기저를 형성하는 2개의 히스티딘과 거의 공-평면 형상이다. 도 2B는 MMP-9(PDB 1GKC)의 결정구조를 나타내며, 여기서 아연은 5개의 리간드(2개의 추가 리간드는 히드록사메이트 억제제에 의해 기여된다)에 의해 배위결합되며, 피라미드 기저에 있는 2개의 히스티딘의 배향과 아연과의 거리(2.2±0.02, 2.03±0.04 및 MMP-9, ZnTCPP 및 CoTCPP에 대해 1.95)는 Co/ZnTCPP 분자에 비교할만하다.

실시예 2

단일클론 항체 생성 및 선택

CoTCPP, ZnTCPP 및 Imisdp(도 1)에 대한 단일클론 항체는 마우스를 면역화하고, 코팅한 항원으로 각 화합물로 ELISA 스크리닝에 의해 특정 항체를 선택하여 제조하였다. 광범위한 연구를 위해 3개의 항체를 선택하였다. 특히 이들 콜론이 경쟁적 ELISA 스크리닝에 기초ㅎ여 면역 합텐에 대해 최상의 친화성을 나타내었기에 선택하였다. 이들의 결합 상수는 0.01-0.09 μM(하기 표3)의 범위이며, 높은 친화성 mAbs를 갖는 특징이 있다. MAbs는 마우스의 복수로 증식하였으며 단백질 G 비드로 정제하였다.

표 3 - 항- CoTCPP , ZnTCPP 및 Imisdp 단일클론 항체의 아이소타이프 및 ELISA 경쟁 분석 요약

면역 합텐 항체 아이소타이프 Kd[μM]^* 이름

CoTCPP IgG2b 0.09 13E11

ZnTCPP IgG2b 0.01 15E11

Imisdp IgG2a 0.09 6C6

^* 면역성 합텐에 대한 항체의 결합 친화도(Kd)는 경쟁적 ELISA(상세한 내용은 물질 및 방법 참조)로 측정하였다.

실시예 3

MMP _2 및 MMP -9와 교차반응하는 단일클론 항체

MMPs의 촉매부위에서 아연 히스티딘 형상을 모방하는 합성 화합물에 대해상승된 mAbs가 MMP_2 및 MMP-9의 활성부위에서 노출된 아연 히스티딘 모티프와 교차반응하는지 측정하기 위해 먼저, 단일클론 항체를 직접 ELISA를 사용하여 MMP-9 결합에 대해 스크리닝하였다. 3개의 mABs 결합한 MMP-9 촉매성 도메인을 마이크로타이터 플레이트 웰(상업용 양성 대조군의 MMP-9 항체 및 음성 대조군의 비관련 IgG)에 흡수시켰다. 재미있게도, mAbs는 마우스 복수에 존재하는 활성 MMP-9으로 공-정제한 마우스의 복수와 같이 증식하였다, 정제된 항체 단독, 제 1 항체로 MMP-9항 체로 한 웨스턴 블럿 분석결과 활성 MMP-9에 대해 예측한 약 82KD의 분자량에 상당하는 투명한 밴드가 나타났다. 그래서, mAbs는 천연 효소와 함께 생체내 착화합물을 형성하였다.

다음에, 면역친화성에 기초한 분석을 이용하여 MMP-2 결합을 위해 단일클론 항체를 스크리닝하였다. 항체를 생체외에서 MMP-2 촉매성 도메인(MMP-2cat)으로 배양하고, 항 마우스 IgG 아가로스 비드로 내렸다. 도 3은 모든 mAbs 및 결합한 MMP-2cat을 나타낸다.

활성부위와 직접 상호작용을 통한 결합이 일어나는지 확증하기 위해, Pro-MMP-2 및 Pro-MMP-9와 결합하는 mAbs의 능력에 대해 분석하였다. 잠재적인 효소에서, 프로 도메인 구조는 촉매 틈새를 보호한다. 즉, 프로-도메인 구조에 의한 활성부위의 차단은 활성부위내 히스티딘 아연 모티프를 인식하면 mAbs 결합을 막아야 한다. 동일한 조건하에서, 프로 효소에 대한 어떠한 결합도 검출되지 않았다.(도 3B). 프로-MMP-2가 아닌 활성 MMP-2에 대한 이러한 결합방식은 인간 섬유 육종(HT1080) 세포 조직에 의해 분비된 전길이 천연 MMP-2의 환경과 같은 생체내에서 추가로 도전을 받는다. 항-CoTCPP 항체로 HT1080 조건화된 배지의 면역침전 후 웨스턴 블럿 분석결과 활성적이나 Pro-MMP-2(도 3C 참조)가 아닌 것에 결합을 나타내었다. 이들 결과는 모든 3개의 항체는 MMP-2 및 MMP-9과 교차반응함을 입증한다. 활성 부위 틈새의 노출은 항체결합에 필수적이며, mAbs가 MMP-2 및 MMP-9의 활성부위와 직접 상호작용함을 확증한다,

실시예 4

생체외에서 MMP _2 및 MMP -9를 억제하는 항 CoTCCP 및 항 Imisdp mAbs

항 Imisdp 및 항 CoTCCP는 마이크로몰랄 범위에서 MMP-2 및 MMP-9의 단백질 가수분해 활성을 억제한다.(도 5). mAbs에 의한 MMPs 억제에 대한 운동에너지 분석은 급냉시킨 형광 펩티드 기질로 연속식 형광측정법으로 실시한다. 놀랍게도, 항 ZnTCPP mAb는 억제효과를 나타내지 못하였다.

항 CoTCCP mAb에 의한 억제 특성을 측정하기 위해, 다른 농도를 갖는 형광 펩티드 기질의 존재 또는 부존재하에 효소를 사용하여 실시하였다.도 4A-B에 도시된 라인위버 버크 플롯(Loneweaver-Burk plot)에 존재하는 데이터는 MMP-9 및 MMP-2에 대해 각각 13μM 및 24μM의 Ki값을 갖는 경쟁적 억제 프로파일을 갖는 특징이 있다. 경쟁적 억제 프로파일은 mAb가 펩티드 기질과 동일한 부위에 결합된는 것을 나타낸다. 이러한 억제 방식은 활성부위와 직접적인 상호작용에 대한 또다른 확신이다. 이는 mAbs가 MMP-2 및 MMP-9의 결합 부위를 인식하고, 나아가 mAbs 및 MMPs 사이의 계면 상보성의 최적화는 구조적으로 및 정전기적으로 친화성 숙성법에 의해 달성될 수 있다.(Paul J. Carter Nature Reviews Immun. Vol. 6 2006 343-357). 이 접근법을 사용하면, 고도의 특정 억제제로 이끌 수 있으며, 활성부위 안팎으로 특이성 장점을 갖게 된다.

실시예 5

원위치에서 자이모그래피

세포 레벨에서 항 CoTCPP mAb의 억제활성을 확인하기 위해, 항체의 효과는 원위치 자이모그래피에 의해 MMP-2, MMP-9 및 MT1-MMP를 구성적으로 분비하는 인간 섬유육종 HT1080 세포의 젤라틴 융해성 활성을 시험하였다. 원위치 자이모그래피에 의한 MMPs의 젤라틴 융해성 활성을 국소화하기 위해 분자내 급냉시킨 플루오레세인(fluorescein) 이소티오시아네이트-라벨 젤라틴(DQ-젤라틴)을 기질로 사용하였다. 젤라티나제에 의한 단백질 분해는 쪼개진 플루오레세인 이소티오시아네이트-젤라틴 펩티드를 산출하며, 이러한 플루오레세인의 국소화는 젤라틴 융해성 활성의 부위를 나타낸다.

처리하지 않은 인간 섬유육종 HT1080 세포(도 7A)는 커다란 젤라틴 융해성 활성을 나타내었다. 1μM의 mAb(도 7B)의 존재시, 젤라티나제 활성은 대조군 세포에서 관찰된 것과 비교할 때 감소하였다. 이들 결과는 항 CoTCPP mAb가 세포 레벨에서 MMP-2 및 MMP-9을 억제하였음을 증명한다.

실시예 6

본 발명의 mAbs 의 선택도

MMP-14(MT1-MMP) 및 관련 ADAM(a disintegrin and metalloproteinase)군(ADAM-17)에 속하는 아연-의존 금속단백질분해효소인 TNF-α-전환효소(TACE)에 대해 항 CoTCPP 및 항 Imisdp mAb의 결합 및 억제활성을 조사하여 항체의 선택도를 시험하였다. MT1-MMP 및 TACE에 대한 억제효과는 적당한 펩티드 기질을 가지고 생체외 형광 효소활성 분석으로 시험하였다. 항 CoTCPP mAb는 MT1-MMP 및 TACE에 대해 어 떠한 억제효과를 나타내지 못하였다. 결과적 억제 없이 TACE 및 MT1-MMP를 결합하는지 여부를 측정하기 위해 정제된 효소로 면역친화성 기반 실험을 행하였지만 어떠한 결합도 검출되지 않았다. 항 CoTCPP mAb와 대조적으로 항 Imisdp mAb는 MT1-MMP를 억제하였으며, 10μM의 Ki값을 나타냈으나, TACE에 대해서는 억제효과를 나타내지 않았다. 결과를 하기 표 4에 기재하였다.

표 4

활성부위에서 고도의 구조적 유사성은 MMP군 요소 및 TACE 중에 존재하며, 특히 아연-결합 부위를 둘러싼 3차원의 구조 요소는 기질의 펩티드 결합을 수용할 필요성 및 보존 아연-결합 모티프 EXXHXXGXXH의 존재에 기인하여 거의 동일하다. [Solomon, A., et al., Pronounced diversity in electronic and chemical properties beetween the catalytic zinc sites of tumor necrosis factor - alpha -converting enzyme and matrix mettaloproteinases despite their high structural similarity. J Biol Chem, 2004. 279(30): p. 31646-54; Lukacova, V., et al., A comparison of the binding sites of matrix mettaloproteinases and tumor necrosis factor - alpha - converting enzyme : implication for selectivity . J Med Chem, 2005. 48(7): p. 2361-70]. 그러므로, MMPs중의 mAb 선택도는 보존 히스티딘 아연 모티프의 인식에 유일하게 기대되지 않는다. 소분자량 합성 억제제와는 달리 큰 단백질 분자인 항체는 단백질의 구조에 갇힌 활성부위 자리로 접근가능성을 제한하였어야 한다. 특히, mAbs는 촉매성 아연 이온과 특이적으로 상호작용하므로, 용액에 아연 이온의 노출 정도는 항체결합을 위해 중요하다. MT1-MMP 및 보다 큰 TACE는 결정구조에 의해 나타나는 비교적 갇힌 촉매성 아연 이온과 상호관련된 깊은 S1 포켓에 의해 구별된다. 이러한 활성부위의 깊이 차이는 TACE에 대한 억제 효과의 항체 결핍 때문이다. 이러한 결과는 선택도가 촉매성 아연 이온의 노출정도에 기초하여 달성될 수 있음을 암시한다. MMP와 TACE를 비교할 때 고려하여야 하는 또 다른 중요한 요소는 소수성 및 극성과 같은 화학과 관련하여 활성부위 포켓의 차이이다.(도 8 참조). 예를 들어 TACE의 활성부위는 대부분의 MMPs의 활성부위보다 극성이 매우 높다. Solomon 등은 활성부위의 극성에서 이러한 변수는 촉매성 아연 이온에 대한 활성부위 히스티딘 이미다졸 고리의 배향에 직접 영향을 준다는 것을 입증하였다. [Solomon, A., et al., Pronounced diversity in electronic and chemical properties beetween the catalytic zinc sites of tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme and matrix mettaloproteinases despite their high structural similarity . J Biol Chem, 2004. 279(30): p. 31646-54].

항 CoTCPP 및 항 Imisdp mAb의 선택도는 비관련 아연 의존 효소 - 탄산 탈수 효소(Carbonic anhydrase, CA) 및 브록키(brockii) 알코올 탈수소효소(TbADH)와의 상호 반응성을 시험함으로써 도전받는다. 활성 MMP와 유사하게 CA는 3개의 히스티딘 잔기 및 물 분자와 4면체 배위결합된 아연 이온을 함유하며, TbADH는 4개의 다른 아미노산 잔기, 히스티딘, 시스테인, 아스파테이트 및 글루타메이트와 4면체 배위결합된 촉매성 아연 이온을 함유한다. 적절한 생체외 기능 억제 실험뿐만 아니라 유사한 면역 친화성 주제 실험은 실시하여 이들 효소와의 상호반응성을 조사하였으나 어떠한 결합이나 억제도 관찰되지 않았다. 미오글로빈 및 헤모글로빈, 및 비타민내의 헴 그룹(Heme group)과 같은 생리학적 포르피린과의 상호반응성을 알아보기 위해 항 CoTCPP mAb를 시험하였다. 경쟁적 ELISA 및 면역친화성 분석에서도 상호반응성이 검출되지 않았다.

탄산 탈수효소 및 알코올 탈수소효소는 모두 활성부위를 묻어버렸지만, 미오글로빈 및 헤모글로빈의 포르피린 부분은 노출되지 않았다. 비타민 B12는 플래너 이미다졸 구조의 중심에 금속을 함유하나, 축 리간드는 mAb의 결합을 방해할 수 있다. 이러한 결과는 항 CoTCPP mAb가 축 금속-배위결합 잔기의 방해 없이 비교적 노출된 금속-이미다졸 형태를 인식함을 입증한다.

실시예 7

[2-(2- 미노에틸카르보모일 )- 에톡시메틸 ]- 트리스 -[2-(N-(3- 이미다졸 -1-일-프로필)- 에톡시메틸 ]메탄 아연( II ), 도 9

(i) 테트라(2- 펜타클로로 - 페녹시카르보닐 - 에톡시메틸 )메탄의 합성:

펜타클로로페놀-치환 테트라-활성 에스테르의 합성을 Haim WEizmann 등의 JACS 1996, 118, 12368-12375.에 기술된 방법으로 수행하였다.

(a) 모노-치환 트리 활성 에스테르의 제조 :

테트라 활성 에스테르(1)(1g, 0.69 mmol)과 BocNHCH₂CH₂NH₂(100mg, 0.62 mmol)을 20ml의 무수 디클로로메탄에 용해하였다. 용액을 트리에틸 아민으로 pH ~8로 유지하면서 밤새 교반하였다. 용액을 농축하고, CHCl₃:에틸아세테이트(90:10)가 있는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 (152mg, 15%수율)을 수득하였다. ¹HNMR 250MHz(CDCl₃)δ : 1.4(s, 9H, Boc); 2.4(t, 2H, J=6Hz, -CH₂-CH ₂ -CONH); 2.9(t, 6H, J=6Hz, -CH₂-CH ₂ -COOPCP); 3.2(q, 2H, J=6Hz, -CONH-CH ₂ -CH₂-NHBoc); 3.31(t, 2H, J=6Hz, -CONH-CH₂-CH ₂ -NHBoc); 3.38(s, 2H, -C-CH ₂ -O-CH₂-CH₂-CONH-); 3.42(s, 6H, -C-CH ₂ -O-CH₂-CH₂-COOOPCP); 3.61(t, 2H, J=6Hz, -C-CH₂-O-CH ₂ -CH₂-CONH-); 3.78(t, 6H, J=6Hz, -C-CH₂-O-CH ₂ -CH₂-CONH-); 5.03(t, 1H, NH); 6.7(t, 1H, NH).

(b) 트리스(이미다졸)의 제 조 :

모노-치환된 트리엑티브 에스테르(150 mg, 0.11 mmol) 및 1-(3-아미노프로필)-이미다졸(33 μlt, 0.39 mmol)을 20ml의 무수 THF에 용해시킨 후, 실온에서 밤 새 교반하였다. 희색의 용액을 농축하고, CHCl₃:메탄올(50-90%)가 있는 실리카(0.063-0.200 nm)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 (45mg, 44%수율)을 수득하였다. ¹HNMR 250MHz(CDCl₃/MeOD)δ : 1.45(s, 9H, Boc); 2.0(m, 6H, J=6Hz, -CONH-CH₂-CH ₂ -CH₂-imi); 2.4(t, 6H, J=6Hz, -O-CH₂-CH ₂ -CONH-); 2.5(t, 2H, J=6Hz, -CH₂-CH ₂ -CONH-CH₂-CH₂-NHBoc); 3.0(m, 8H, J=6Hz, -CONH-CH ₂ -CH₂-CH₂-imi, -CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH ₂ -NHBoc); 3.1(t, 2H, J=6Hz, -CONH-CH ₂ -CH₂-NHBoc); 3.4(b, 8H, -C-CH ₂ -O-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NHBoc, -C-CH ₂ -O-CH₂-CH₂-CONH-);3.6(m, 8H, J=6Hz, -C-CH₂-O-CH ₂ -CH₂-CONH-, -C-CH₂-O-CH ₂ -CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NHBoc,); 4.0(t, 6H, J=6Hz, -CONH-CH₂-CH₂-CH ₂ -imi); 5.5(t, 1H, NH); 6.98(s, 3H, Imi); 7.06(s, 3H, Imi); 7.32(t, 3H, Imi); 7.57(s, 3H, Imi). ESI-MS:910.87[M+Na]⁺,925.98[M+K]⁺.

(c) 유리아민(2)을 갖는 트리스(이미다졸)의 제조 :

트리스(이미다졸) (40mg, 0.045mmol)을 6ml의 디클로로메탄 및 트리플루오로아세트산(2:1) 혼합물에 용해시킨 후 1시간 교반하였다. 반응혼합물을 농축하고, 탄소 테트라클로라이드로 수차례 증발시키고 고압하에 건조하여 혼합물로 부터 TFA를 제거하여 (30mg, 85% 수율, b)을 수득하였다. ¹HNMR 250MHz(CDCl₃/MeOD)δ : 1.9(m, 6H, J=6Hz, -CONH-CH₂-CH ₂ -CH₂-imi); 2.3(m, 8H, J=6Hz, -O-CH₂-CH ₂ -CONH-, -CH₂-CH ₂ -CONH-CH₂-CH₂-NH₂); 2.9(t, 2H, J=6Hz, -CONH-CH ₂ -CH₂-CH₂-imi); 3.0(t, 2H, J=14Hz, -CONH-CH ₂ -CH₂-NH₂); 3.31(t, 2H, J=14Hz, -CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH ₂ -NH₂); 3.4(b, 8H, -C-CH₂-O-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂, -C-CH ₂ -O-CH₂-CH₂-CONH-); 3.6(m, 8H, J=6Hz, -C-CH₂-O-CH ₂ -CH₂-CONH-, -C-CH₂-O-CH ₂ -CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂); 4.0(t, 6H, J=6Hz, -CONH-CH₂-CH₂-CH ₂ -imi); 7.26(s, 3H, Imi); 7.32(s, 3H, Imi); 8.82(s, 3H, Imi).

3. 트리스 ( 이미다졸 )-아연( II ) 착화합물(3)의 제조 :

화합물 2(30mg, 0.038 mmol)를 1ml의 메탄올에 용해하였다. 여기에 2-3 방울의 1N NaOH용액과 ZnCl2(5mg, 0.04 mmol)을 가하고, 30분간 교반하였다. 백색의 침전물을 여과하여 (12 mg, 37% 수율)을 수득하였다. ¹HNMR 250MHz(MeOD/D₂O)δ : 1.8(m, 6H, J=6Hz, -CONH-CH₂-CH ₂ -CH₂-imi); 2.4(m, 8H, J=6Hz, -O-CH₂-CH ₂ -CONH-, -CH₂-CH ₂ -CONH-CH₂-CH₂-NH₂); 3.0(t, 2H, J=6Hz, -CONH-CH ₂ -CH₂-CH₂-imi); 3.0(t, 2H, J= 6Hz, -CONH-CH ₂ -CH₂-NH₂); 3.31(b, 2H, -CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH ₂ -NH₂); 3.4(b, 8H, -C-CH ₂ -O-CH₂-CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂, -C-CH ₂ -O-CH₂-CH₂-CONH-); 3.6(m, 8H, -C-CH₂-O- CH ₂ -CH₂-CONH-, -C-CH₂-O-CH ₂ -CH₂-CONH-CH₂-CH₂-NH₂); 4.2(b, 6H, -CONH-CH₂-CH₂-CH ₂ -imi); 7.19(s, 3H, Imi); 7.28(s, 3H, Imi); 8.55(s, 3H, Imi). ESI-MS:8.52.09[M+1]⁺.

[2-(2-미노에틸카르보모일)-에톡시메틸]-트리스-[2(N-(3-이미다졸-1-일-프로필))-에톡시메틸)메탄.

실시예 8

젤라티나제의 촉매부위와 교차반응하는 6 C6

일정량의 6C6을 복수로부터 얻은 활성 MMP-9으로 공-정제하였다. mAbs를 증식시키기 위해 마우스에 유도된 복수 종양에서 검출가능한 함량의 MMP-9의 존재 여 부는 웨스턴 블럿 및 젤라틴 자이모그래피로 나타난다.(데이터는 도시하지 않음). 프로틴 G 친화성 크로마토그래피를 사용하여 마우스 복수로부터 MMP-9 항체 착화합물을 정제하였다.(단백질 G는 항체의 일정한 도메인에 결합하여, 항원과 자유롭게 상호작용하는 가변 도메인을 남긴다). 도 11A에 도시되었듯이, 공-정제된 MMP-9는 상업적으로 이용가능한 항-MMP-9 항체를 이용하여 정제된 6C6-MMP9 착화합물을 웨스턴 블롯팅하여 검출된다. 프로-도메인이 결핍한 MMP9을 활성하는데 상응하는 ~82 kDa의 분자량을 갖는 밴드가 확인되었다. 이 밴드는 동일한 방법으로 정제 및 분석한 무관계한 마우스 mAb 대조군에서는 검출되지 않았다. 이러한 결과는 6C6은 생체내 내생적(endogenous)이고, 활성있는 마우스 MMP9을 갖는 생체내 특이성 있는 착화합물을 생성한다.

고도의 동족 MMP2 효소의 활성 형태와의 결합을 추가로 검사하기 위해 유사한 면역침강 실험을 생체외에서 실시하였다. 6C6을 3:1 몰랄비의 정제 MMP2 촉매 단편으로 배양하였다. 단백질 A 세파로즈 면역침전물을 SDS-PAGE로 분석한 결과 활성 MMP2 촉매성 단편(도 11B)을 갖는 6C6의 특정 착화합물이 형성되었다. 단백질 A 비드는 단독으로 MMP2를 면역침강하지 못하였다. 다음에, 비활성 효소원(잠재성) 형태의 MMP2와 MMP9에 대한 결합을 시험하였다. 모든 MMPs는 비활성 효소원(zymogen)으로 생산되기 때문에, 이들은 활성부위를 차단하는 약 80-90개의 아미노산을 갖는 N-단말 폴리펩티드를 갖는다.[Bode, W. and K. Maskos, Biol Chem, 2003. 384(6): p. 863-72](도 11D). 프로-MMP2 및 MMP9으로 면역침강 실험을 동일한 방법으로 실시하였다. 중요하게, 6C6는 활성부위 아연 단백질 착화합물이 용액 에 노출된 활성 효소 형태에만 결합하였다.

이들 결과는 6C6 항체가 MMP2 및 MMP9의 단백질 활성 부위로 교차반응한 활성부위-모방 생물무기물 합텐에 대해 증가 및 스크리닝하였다. 명백하게, 아연-트리포드 합텐은 순수(비접촉)한 단백질 중의 개별 아연-히스티딘 에피토프의 3차원 구조를 모방할 수 있다. 주목할 것은, 이러한 최소 금속-단백질 구조 에피토프의 인식이 순수한 효소와 교차 반응성을 유도하기에 충분하다는 것이다. 프로도메인이 촉매성 아연 단백질 에피토프에의 접근을 차단하는 활성화된 효소에만 결합하는 것은 아연 촉매 부위와 6C6의 직접적인 상호작용을 암시한다. 명백히, 생체내에서 순수한 MMP와 결합한 6C6은 항체가 착화합물 단백질 환경에서 효소와 특정 착화합물을 생성할 수 있다는 것을 입증하는 것이다.

잠재성 형태로부터 활성화된 효소 종(species)을 식별하는 것은 독특하고 가치있는 6C6의 기능적 특성이다. 이러한 활성은 MMP9에 대해 제기된 다른 항체와는 달리 6C6에서 독특한 것이다. 이는 단백질로 면역화하면 전형적으로 표면 루프 쪽으로 배향된 에피토프를 산출하지만, 촉매성 아미노산은 대개 효소의 표면상의 틈새(cleft)로 묻히기 때문이다. 이러한 분자 일부분은 낮은 면역학적 성질을 갖는 것으로 생각된다. 즉, 종래 방법(순수한 단백질 또는 단백질 단편에 대해)에서 제시된 단일클론 항체의 중화는 일반적으로 활성 부위 촉매성 잔기 보다 활성부위와 이웃하거나 인접한 영역과 상호작용하여 공간적 방해 메커니즘을 억제한다. 이러한 항체는 전형적으로 비활성 전구체(precursor)뿐만 아니라 활성형태와 결합한다. 본 독특한 활성-부위 모방 합텐 면역 접근방법은 종래의 단백질 면역 접근방식으로 는 달성할 수 없는 MMPs중의 촉매성 금속 단백질 잔기를 인식하는 항체의 생산이 가능케 한다.

실시예 9

생체외 및 원위치에서 젤라티나제를 선택적으로 억제하는 6 C6

MMP9 및 MMP2에 대한 6C6의 효소-억제 능력을 측정하기 위하여 젤라티나제의 활성 부위 틈새를 연결한 작은 형광성 펩티드 기질(9개의 아미노산)을 사용하여 억제 분석을 실시하였다. 여러 농도를 갖는 mAb에 대해 초기 반응속도를 측정하였다. 6C6은 양 효소의 촉매활성을 억제하였다(도 12A-B). 기질 농도의 함수로서, 여러 농도를 갖는 억제성 항체의 존재하에 MMP9 활성을 분석하여 경쟁적 억제 메커니즘을 측정하였다. 이중 역수 린위버-버크(Linweaver-Burk) 플롯의 형태로 도 12A에 나타낸 데이터는 경쟁적 억제 프로파일을 입증한다. 경쟁적 억제 시스템 방정식에 데이터를 맞추면, MMP9 및 2에 대해 1±0.1μM 및 1.4±0.16μM 의 Ki값이 얻어진다. 높은 농도(30μM)의 MMP9으로 밤새 배양한 이후 6C6은 MMP-9에 의해 분절되지 않았는데 이는 6C6에 의한 MMP9의 관찰된 억제가 경쟁자 기질의 분절 때문이 아니라는 것을 증명한다. MMP9의 운동에너지는 별개의 MMPs에서 동일한 에피토프를 인식하도록 설계될 때 6C6에 의해 억제 메커니즘의 대표자로 간주된다. 억제효과는 MMP2 및 9의 촉매성 단편 종뿐만 아니라 젤라티나제의 전길이 효소 형태에 대해서 일관적이다. 특히, 헤모펙신 도메인없이 피브로넥틴 도메인뿐만 아니라 촉매성 도메인을 함유하는 재조합 MMP9 및 MMP2 촉매성 단편과 피부로넥틴과 헤모펙 신 없이 촉매성 도메인만을 함유하는 MMP9 재조합 최소 촉매 유니트는 모두 상술한 바와 같이 인간 프로-MMP2 및 9dml 전길이를 암호화(인코딩)하는 재조합 백신 바이러스로 감연된 헬라 S3 세포의 배지로부터 정제된 전길이(p-아미노페닐머큐릭 아세테이트(APMA)활성화된) 젤라티나제에 유사하게 억제된다.[Olson, M. W., et al., J Biol Chem, 2000. 275(4): p. 2661-8]. 이들 결과로부터 억제는 촉매성 도메인과의 상호작용에 의해 조정되며 헤모펙신이나 피브로넥틴 도메인과의 상호작용에 좌우되지 않는다는 것을 확인하였다. 경쟁적 억제 프로파일은 촉매 아연 부위와 직접적인 상호작용의 또 다른 지침을 제공한다. 동일한 방법으로 제조된 비관련 mAb는 효소의 광분해 활성을 방해하지 않았다. 그래서, 관찰된 억제는 미량의 공-정제된 오염물질에 의한 것은 아니다. 이들 실험용 항체는 조직 배양에서 정제되었으며, 정제된 항체 분획중에 검출할만한 함량의 활성 MMP9을 함유하지 않았다.

6C6의 선택도를 조사하기 위해 메트리신(MMP7), 멤브레인 타입 MMP(MT1-MMP) 및 관련 디스인테그린(ADAMs) 조양 괴사 인자-α-전환효소(TACE)를 포함하는 별개의 기질 단백질분해효소 하위그룹에 대해, 6C6의 반응성을 조사하였다. 이들 효소의 코아 구조는 매우 유사하며, 주변 루프에서 대개 변화한다. 특히, 아연-히스티딘 스캐폴드(scaffold)는 잘 보존되었으며, 촉매 아연 이온(도 13)을 배위하는 3개의 히스티딘 잔기에 대해 스캐폴드로서 작용하는 루프에 의해 컨센서스 헬릭스(consensus helix)를 나타낸다.

적당한 형광 펩티드를 사용하여 유사한 억제 분석을 실시하였다. 흥미있게도, MMP-7이나 TACE도 30μM까지의 농도로 6C6으로 배양시 어떤 측정가능한 범위로 억제되지 않았는데 이는 젤라티나제에 대한실질적인 수준의 선택도를 나타낸다. MT1-MMP는 14.4±0.75μM의 Ki값 정도로 덜 강하게 6C6에 의해 억제되었다. 흥미롭게도, 이러한 성택도의 원천은 보존된 아연-히스티딘 스캐폴드를 인식하기 위해 설계된 항체로는 명료해질 수 없는데 이는 활성부위에서 특히, 코아구조가 매우 유사하기 때문이다. 주변 루프내에서 서열 변화는 활성부위 형상에서 아연-히스티딘 모티프의 노출정도의 차이점을 지시하며, 및 그 표면 정전기는 이러한 선택적 억제 패턴을 설명할 수 있다.

별개의 아연 의존성 금속단백질분해효소, 탄산무수화효소 및 알코올탈수소효소를 가지고 6C6의 교차 반응성을 시험하였다. MMPs와 유사하게, 탄산무수화효소는 3개의 히스티딘 리간드 및 물 분자에 4년체 배위결합된 촉매성 아연 이온을 갖는다. 그 결과로, 여러 강한 소분자 MMP 억제제(설포닐화 아미노산 히드럭사메이트 타입)는 효능있는 CA 억제제로서 및 그 반대로도 작용한다. CA 억제제가 MMPs에 대해 억제성질을 나타낼 때 몇몇 N-히드록시설폰아미드를 조사하였다.[Scozzafava, A. and C.T. Supuran, J Med Chem, 2000. 43(20): p. 3677-87]. 호혈성 박테리아(TbADH)로부터 알코올탈수소효소의 활성 부위는 별개의 아연-단백질 부분을 포함하며, 여기서 아연은 틈새 안에 위치한 히스티딘, 시스테인, 아스파테이트 및 글루타메이트와 결합한다. 30μM까지의 mAb 농도로 적당한 기능적 억제실험 결과 양 효소에 대해 억제효과를 나타내지 못하였다. 특히, 10-stranded, twisted β-시트의 중심 영역에 위치한 활성 부위는 원뿔형 틈새를 구성하며, 15Å 깊이에, 틈새 바닥에 4면체 Zn² ⁺ 이온을 갖고 있다. 소분자 억제제와는 달리, 아연 이온은 항체와 상호작용하기에는 너무 깊이 묻혀 있다. 중요하게는 이들 실험은 6C6의 선택적 억제 프로파일을 추가로 입증한다.

세포환경에서, 젤라티나제의 천연 기질인 젤라틴을 사용하여 원위치 자이모그래프로 젤라티나제에 대한 6C6의 억제효과를 추가로 시험하였다.MT1-MMP와 결합한 멤브레인을 발현하고 MMP-2 및 9[Giambernardi, T.A., et al., Matrix Biol, 1998. 16(8): p. 483-96]를 분비하는 배지에서 증식한 인간 섬유육종, HT1080 세포를 형광-공역 젤라틴(DQ 젤라틴)으로 오버레이하였다. 도 14A-C에 도시한 바와 같이, 비처리한 HT1080 세포는 상당한 세포 표면 젤라틴 융해성 활성을 나타내었다. 5μM mAb로 처리하자 젤라티나제 억제제인 SB-3CT 기반의 메커니즘에서 관찰되는 억제와 유사한 표면 젤라틴 융해성 활성이 크게 감소하였다. SB-3CT는 젤라티나제와 MT1-MMP를 억제할 때, 유사한 억제 프로파일을 나타냈다.(Ki값은 MMP2, MMP9 및 MT1-MMP 각각에 대해 28,400 및 110nM이다).

요약하여, 6C6는 생체외 합성 펩티드의 분절(clevage) 및 원위치에서 천연 거대분자 기질을 억제한다. 6C6은 MMP9에 대해 경쟁적 억제 방식을 나타냈는데 이는 TIMP의 억제 메커니즘과 유사하다. 경쟁적 억제 프로파일은 촉매성 아연 부분과 직접적인 상호작용을 지시하는 것이다. 중요하게, 6C6은 젤라티나제에 대해 선택적 억제 프로파일을 나타내었다. 이러한 선택도의 원천은 보존된 아연-히스티딘 모티프의 항체 표적에 의해 설명될 수 없다. 이들 결과는 항체가 관찰된 특이성을 설명하는 효소의 표면상에서 추가적인 결정자와 상호작용하고 있음을 시사한다.

실시예 10

마우스에서 DDS -유도된 대장염에 대한 6 C6 MAb 치료효과

MMPs가 염증성 장질환(IBD)을 포함하는 여러 염증성 질병과 연관된 조직 리모델링 및 파괴와 연루되어 있다는 증거가 증가하고 있다. [Baugh, M.D., et al., Gastroenterology, 1999. 117(4): p. 814-22; Heuschkel, R.B., et al., Gut, 2000. 47(1): p. 57-62; von Lampe, B., et al., Gut 2000. 47(1): p. 63-73; Kirkegaard, T., et al., Gut, 2004. 53(5): p.701-9].

그러므로, 본 발명자는 염증성 장질환을 앓는 마우스 실험용 모델에서 생체내 6C6의 항 젤라티나제 억제효과를 조사하였다.

6C6의 억제효과를 조사하기 위해 DDS 유도된 급성 대장염을 개선하기 위한 mAb의 치료능력을 조사하였다. 구체적으로, 극히 민감한 마우스 균주 C57BL/6에 5일간 2% DDS를 투여하였다. DDS 도입한 날로부터 1.5 또는 5 mg/mouse로 복강내 주사를 매일 투여하였다. 2% DDS에 노출된 마우스는 설사, 장출혈 및 심각한 체중감소와 함께 급성 대장염 증세로 발전하였다.

mAb 치료효과를 매일 모니터링하여 질병 활성 지수(DAI)(체중, 출혈 및 배변지속을 합친 수치)를 도 15A에 나타내었다. MAb 치료한 마우스는 대조군(6일째부터 차이가 큼)과 비교하여 질병활성이 감소하였다. DSS-유도한 대장염의 추가적인 거시적 징후가 콜론 길이(도 15B)에서 발견되었다. 그래서, DSS 유도 후 11일째에 순수한(미접촉) 마우스와 비교하여 콜론 길이의 30% 감소가 치료받지 않은 마우스에서 발견되었다. 대조적으로 1.5 및 5 mg/mouse로 각각 투여한 6C6-치료한 마우스에서는 단지 평균 22% 또는 16%의 감소가 얻어졌다. 또한 6C6의 보호효과는 질병 사망률로 확인되었다. 치료받지 않은 마우스에서는 사망률이 60%이었으나, 유도 후 11일째에 6C6 치료받은 마우스에서는 단지 33%의 사망률이 관찰되었다(도 15C). 그래서, 6C6으로 C57BL/6 마우스의 치료는 DSS-유도된 대장염의 감소 징후와 함께 생존율이 증가되었다.

총괄적으로, 이들 결과는 젤라티나제 억제제로서 6C6의 치료학적 잠재성을 입증한 것이다.

실시예 11

X-선 흡수분광법에 의한 MMP9 mAb 착화합물의 특성화

활성 MMP9 및 억제된 MMP9-6C6 착화합물 사이의 차이점을 추가적으로 연구하기 위해, X-선 흡수 분광법을 실시하였다. 도 16은 회수한 형광 XAS 데이터를 나타낸다. MMP9중의 촉매성 아연 이온의 제 1 및 제 2 배위 쉘(shell)내에 여러 원자의 방사형 분포도를 제공하기 위해 데이터는 푸리에 변환(Fourier transform) 스펙트라의 형태로 제공된다. 자유 및 억제된 효소의 방사형 분포 스펙트라에서 뚜렷한 변화는 노이즈 레벨 이상으로 관찰될 수 있다. 이들 스펙트라 변화는 촉매성 아연 인자의 국소 환경이 6C6과 결합할 때 구조적 변화를 겪는다는 것을 의미한다. 활성 및 억제된 효소 사이의 FT 스펙트라의 공간 분포 및 피크 분포에서의 관측된 편차는 촉매성 아연 인자의 국소 구조가 mAb 착화합물 형성시 변화한다는 것을 명확히 나타낸다.

별개의 실시양태로 본원에 기술된 본 발명의 특징들은 명확성을 위해 하나의 실시양태와 결합하여 제공될 수도 있다. 역으로, 간결성을 위해 하나의 실시양태로 기술된 본 발명의 여러 특징은 별개로 또는 어느 적당한 하위결합을 제공될 수 있다.

비록 본 발명을 특정 실시양태와 결합하여 기술하였지만, 많은 대안, 변경 및 변화는 기술분야의 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 모든 이러한 대안, 변경, 수정 및 변화는 첨부된 청구범위의 정신 및 광범위한 범위에 속하는 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 각각의 간행물, 특허 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로, 본 명세서에 포함하려고 하는 동일한 정도까지 본 명세서에 참고로 인용하였다. 더욱이, 본 출원서에서 인용하거나 확인한 어떤 참고문헌은 이러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술로서 이용가능한 것으로 허가를 필요로 하는 것으로 생각되지는 않는다.

참고문헌 목록

(추가 문헌은 본문에 인용되었다)

1. Nagase, H. and Woessner, J.F.Jr. (1999). Matrix metalloproteiases.Minireview.J. Biol. Chem. 274:21491-21494

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SEQUENCE LISTING <110> Yeda Research And Development Co. Ltd. SAGI, Irit DANON, Tamar SELA, Netta SHANZER, Abraham ARAD-YELLIN, Rina KIKKERI, Raghavendra <120> ANTIBODIES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING SAME USEFUL FOR INHIBITING ACTIVITY OF METALLOPROTEINS <130> 42577 <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 6c6 mAb light chain <400> 1 Cys Met Glu Thr Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Cys Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln 85 90 95 Ala Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 15E12 mAb light chain <400> 2 Glu Met Glu Thr Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 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Claims

하기 일반식(I)을 갖는 화합물.

[화학식 I]

상기 식에서,

m과 n은 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;

X₁ -X₃과 Y₁ -Y₃는 각각 독립적으로 O 또는 S이고;

R₁ -R₃는 각각 독립적으로 수소, 알킬 및 시클로알킬로 구성되는 군으로부터 선택되며; 및

R은 (CH₂)x-C(=O)NR'-(CH₂)y-NR'R''이며

(여기서 x와 y는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고;

R'와 R''는 각각 독립적으로 수소, 알킬 및 시클로알킬로 구성되는 군으로부터 선택된다)
하기 일반식(II)을 갖는 제 1 항의 화합물.

[화학식 II]

상기 식에서,

R은 -(CH₂)-C(=O)NH-CH₂-CH₂-NH₂이다.
하기 일반식(II)을 갖는 제 1 항의 화합물.

[화학식 II]

상기 식에서,

R은 -(CH₂)-C(=O)NH-CH₂-CH₂-NH₂이다.
제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항의 화합물과 특이적으로 결합할 수 있는 항원 인지영역을 포함하는 항체.
SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 및 12의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 상기 항원 인지영역을 포함하는 항체.
제 5 항에 있어서,

상기 CDR 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 및 18로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 항체.
제 4 항에 있어서,

상기 항체는 금속단백질의 활성을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체.
제 7 항에 있어서,

상기 금속단백질은 기질 금속단백질분해효소인 것을 특징으로 하는 항체.
제 7 항에 있어서,

상기 기질 금속단백질분해효소는 젤라티나제인 것을 특징으로 하는 항체.
제 9 항에 있어서,

상기 젤라티나제는 MMP-2 및 MMP-9로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항의 화합물에 유도된 항체를 생성하여 금속단백질 억제제를 생산하는 단계를 포함하는 금속단백질 억제제의 생산방법.
제 11 항에 있어서,

상기 항체는 다클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서,

상기 항체는 단일클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
피검체에 치료학적으로 효과적인 함량의 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 항체를 투여하여, 피검체에서 금속단백질의 불균형 또는 비정상 활동과 연관된 질병을 치료하는 것을 포함하는 필요로 하는 피검체에서 금속단백질의 불균형 또는 비정상 활동과 연관된 질병을 치료하는 방법.
제 15 항에 있어서,

상기 질병은 염증성 장질환인 것을 특징으로 하는 방법.
세포를 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 항체와 접촉시켜, 세포내 기질 금속단백질분해효소의 활성을 억제하는 것을 포함하는 세포내 기질 금속단백질분해효소의 활성을 억제하는 방법.