BRPI0807256A2 - "composição com fórmula geral i, composto com a fórmula ii, anticorpo, método de produção de inibidor de metaloproteinase,composição farmacêutica, método de tratamento de doença associada a atividade incompatível ou anormal de metaloproteinas, método de inibição da atividade da metaloproteinase matriz em uma célula" - Google Patents

Description

"COMPOSTO COM A FÓRMULA GERAL I, COMPOSTO COM A FÓRMULA II, ANTICORPO, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE INIBIDOR DE METALOPROTEINASE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO DE DOENÇA ASSOCIADA A ATIVIDADE 5 INCOMPATÍVEL OU ANORMAL DE METALOPROTEINAS, MÉTODO DE INIBIÇÃO DA ATIVIDADE DA METALOPROTEINASE MATRIZ EM UMA CÉLULA"

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A presente invenção se 10 relaciona às moléculas hapteno e aos anticorpos direcionados contra elas, que se pode usar para inibir a atividade de metaloproteinas, tais como metaloproteases, e aos métodos que utilizem os anticorpos para tratar enfermidades - tais como câncer metastático - as quais estão associadas à 15 atividade anormal de uma metaloproteina.

As metaloproteinas de matriz (MMPs) são enzimas-chave que participam na remodelagem da matriz extra celular (MEC). Estas enzimas são capazes de destruir uma variedade de componentes de tecido conjuntivo de cartilagem articular ou de membranas basais.

A família do gene MMP humano consiste em, ao menos, 28 proteínas relacionadas estruturalmente (ver Figura 1), as quais compartilham uma topologia esférica geral similar (Figura 2 e Borkakoti, 25 1998) . Cada MMP é secretada como uma pró-enzima latente, inativa. 0 domínio do zinco catalítico é composto por cerca de 180 aminoácidos, onde a seqüência HE-GH-LGL-H altamente conservada proporciona os três resíduos de histidina (por ex. , H) os quais se ligam ao íon do metal Zn (2+) . 0 quarto local de ligação do ion de zinco catalítico na pró-enzima está ligado a um resíduo de cisteína (Morgunova et al, 1999) , que se dissocia, com a ativação da enzima, do local ativo (Van Wart e Birkedal-Hansen, 1990) . Como resultado, o quarto local de ligação nas MMPs ativadas é tomado por uma molécula de água, que também se liga, pelo hidrogênio, a um resíduo glutâmico conservado. Este processo facilita a hidrólise de uma ligação de peptídeo do substrato alvo com a molécula de água ativada.

A quebra descontrolada do tecido conjuntivo por metaloproteases é uma característica de muitas distúrbios patológicos, possivelmente resultantes de um excesso de atividade de MMP ou de uma proporção desequilibrada entre os inibidores de tecido de MMP naturais (IT-MMPs) e MMPs. Os IT-MMPs inibem as MMps formando complexos estequiométricos com o local de ligação de zinco ativo das MMPs (Gomez et al. , 1997; Henriet et al. , 1999; Bode et al., 1999; Will et al. , 1996) . Quando os níveis de IT-MMPs são insuficientes, uma degradação lenta, progressiva da MEC pode levar a perda da matriz de cartilagem na artrite reumatóide (Walakovits et al., Arthritis Rheum - Artrite Reum -, 35; 35-42, 1992) e osteoartrite (Dean et al. , J. Clin. Invest. 84: 678-685, 1989) ou degradação de matriz óssea na osteoporose (Hill et al., Biochem. J. 308: 167-175, 1995). Em outras situações, tais como insuficiência cardíaca congestiva, pode ocorrer a rápida degradação da MEC do coração (Armstrong et al. , Canadian J. Cardiol. - J.Canadense de Cardiol. - 10: 214-220, 1994) .

Ademais, sabe-se que as MMPs têm um papel na maturação de citocinas e quimiocinas tais como galectina 3 (Ochieng J., Biochemistry - Bioquímica 1994, 33 (47): 14109-14), plasminogênio (Patterson, BC. JBC, 1997, 272 (46): 28823-5), interleucina-8, peptídeo ativador de tecido conjuntivo III, fator plaquetário 4 (Van den Steen, 2000 Blood - Sangue. Out de 2000 15, 96 (8) : 2673- 81), pró-interleucina-ΐβ (Schonbeck, 1998), receptor de interleucina-2 da cadeia α [Sheu, B. C., Hsu, S. M., Lien,

H. C., Huang, S. C., Lin, R. H. A novel role of metalloproteinase in cancer-mediated immunosuppression - Um novo papel da metaloproteinase na imunossupressão mediada por câncer - Cancer Research - Pesquisas de Câncer - (2001) 61, 237-242] e o fator de crescimento pró-transformante-β [TGF- β, Yu, Q. Stamenkovic, I. Cell surface localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF- β and promotes tumor invasion and angiogenesis Metaloproteinase-9 de matriz localizada na superfície de célula I. ativa proteoliticamente o TGF- β e promove invasão tumoral e angiogênese - Genes Dev (2000) 14, 163-176].

Outros distúrbios patológicos, os quais também estão associados á atividade descontrolada de MMPs, incluem o rápido remodelamento da MEC por células tumorais metastáticas. Em tais distúrbios, as MMPs ativadas são expressas tanto pelas células de câncer como pelos tecidos vizinhos. Há evidência considerável de que as MMPs estejam envolvidas no crescimento e disseminação de tumores (por ex., ver Davidson et al. , Chemistry & Industry Química & Indústria - 258-261, 1997, e as referencias contidas ali). No processo de metástase tumoral, as MMPs são usadas para quebrar a MEC, permitindo que células de câncer primárias invadam os vasos sanguíneos vizinhos, onde são transportadas para diferentes órgãos e estabelecem tumores secundários. 0 crescimento invasivo nesses locais secundários é mediado pelas MMPs, as quais quebram o tecido. Além disso, a atividade de MMP contribui para o crescimento invasivo interno de novos vasos sanguíneos, também designado angiogênese, o qual é necessário para que os tumores cresçam além de determinado tamanho. Dentre os membros da família MMP, a MMP-9 humana secretada, também conhecida como gelatinase B, demonstrou ter papéis-chave não apenas no catabolismo de matriz extra celular (MEC) como, também, no processamento de substratos de proteína que são relevantes nas doenças neurológicas, tais como esclerose múltipla (EM) (Opdenakker, 2003) . Estudos recentes mostraram que a MMP-9 tem um papel crítico na promoção de doenças autoimunes, ao cortar o colágeno pré-processado do tipo II (Van den Steen, 2004) . Os produtos são fragmentos de colágeno do tipo II que, pensa-se, são epitopes restantes que gerem doenças autoimunes.

Dado o papel amplo das MMPs na fisiologia e patologia humanas, não é de surpreender que numerosos esforços hajam sido envidados para se projetar drogas que inibam a excessiva atividade das MMPs. Os esforços de descobrimento de drogas focaram-se nas classes inibidoras as quais contêm um grupo funcional que coordena o íon de zinco para, desta forma, inativar a MMP alvo. Uma classe de tais inibidores 5 são os inibidores de hidroxamato, pequenos análogos de peptídeos de colágenos fibrílares, os quais interagem especificamente de forma bidentada através dos oxigênios hidroxila e carbonila do grupo hidroxâmico com o íon de zinco no local catalítico [Grams et al., (1995), Biochem. 10 34: 1401-14020; Bode et al. , (1994), EMBO J., 13: 1263- 1269].

Os inibidores de MMP baseados em hidroxamato são normalmente compostos tanto por uma espinha dorsal de carbono (WO 95/29892, WO 97/24117, WO 97/49679 e EP 0780386), uma espinha dorsal de peptidila (WO 90/05719, WO 93/20047, WO 95/09841 E WO 96/06074) ou uma espinha dorsal peptidomimética [Scwartz et al., Progr. Med. Chem., 29: 271-334 (1992); Rasmussen et al., Pharmacol. Ther., 75: 69-75 (1997); Denis et al., Invest. New Drugs Invest. Novas Drogas -, 15: 175-185 (1997)]. Alternativamente, contêm um grupo sulfonil sulfonamida o qual está ligado, de um lado, a um anel fenil e nitrogênio sulfonamida, o qual está ligado a um grupo hidroxamato através da cadeia de um a quatro átomos de carbono (EP 0757984 Al).

Outros inibidores de MMP baseados em peptídeos são as amidas tiol, as quais exibem atividade de inibição da colagenase (U.S. Pat. No. 4,595,700), derivados de N-carboxi alquil contendo uma difenil-etil glicina, a qual inibe a MMP-3, MMP-2 e a colagenase (Durette, et al., WO-9529689), derivados lactâmicos que inibem as MMPs, TNF-α e agrecanase (ver US 6,495,699) e compostos de sulfonamida triciclica (ver 6,492,422).

Embora os inibidores de MMP baseados em peptídeos tenham um claro potencial terapêutico, seu uso na terapia clínica é limitado. Os hidroxamatos baseados em peptídeos são custosos de se produzir e possuem baixa estabilidade metabólica e biodisponibilidade oral [por ex. , batimastat (BB-94)]. Estes compostos são rapidamente glucoronidados, oxidados em ácido carboxílico e excretados na bile [Singh et al. , Bioorg. Med, Chem. Lett. 5: 337-342, 1995; Hodgson, "Remodelling MMPIs" - Remodelando MMPIs Biotecnologia 13: 554-557, 1995)]. Além do mais, os inibidores de MMP baseados em peptídeos exibem, com frequência efeitos inibitórios iguais os semelhantes contra cada uma das enzimas MMP. Por exemplo, relatou-se que o batimastat exibe valores IC50 de cerca de 1 a até cerca de nM contra cada MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 e MMP-9 [Rasmussen et al. , Pharmacol. Ther., 75 (1): 69-75 (1997)]. Mais adiante, o uso de vários inibidores de hidroxamato esteve associado a graves efeitos colaterais tais como problemas musculo-esqueléticos com marimastat (BB-2516), rash maculo-papular generalizado com CGS27023A (Novartis) [Levitt et al. , 2001, Clin, Cancer Res. 7: 1912-1922] e anormalidades do fígado, anemia, dores nos ombros e costas, trombocitopenia, náusea, fadiga, diarréia e trombose venal profunda com BAY12-9566 (Bayer) [Heath et al., 2001, Cancer Chemoter. Pharmacol. -Farmacolaogia da Quimioterapia do Câncer - 48: 269-274]. Ademais, estudos clínicos de fase III em pacientes de câncer avançado com marimastat, prinomastat (AG 3340, Agouron) e Bay 12-9566 demonstraram a inexistência de eficácia clínica em inibir a metástase (Zucker et al. ,

2000, Oncogene 19: 6642-50).

Outros inibidores de MMP são as tetraciclinas não microbiais quimicamente modificadas (CMTs) que demonstraram bloquear a expressão de várias MMPs in vitro. Contudo, descobriu-se que a eficácia in vitro destes compostos é limitada, por ex., o inibidor CMT, doxiciclina, reduziu os níveis de MMP-I nos tecidos, porém não os de MMP-2, 3, ou -9 nas placas carótidas ateroscleróticas de pacientes humanos (Axisa et al.,

2 002 , Stroke - Derrame - 33: 2858-2864).

Recentemente, um inibidor de MMP baseado em mecanismo, SB-3CT, foi desenhado de acordo com a informação cristalográfica dos raios-X do local ativo de MMP (Brown et al., 2000) . Os estudos da absorção de raios-X revelaram que a ligação desta molécula ao zinco catalítico reconstrói o ambiente

conf ormacional em torno do íon de metal do local ativo de volta ao da pró-enzima [Kleifeld et al.,

2001, J Biol. Chem. 2 7 6: 17125-31] . Contudo, ainda resta determinar a eficácia terapêutica obtida com este agente. Uma outra classe de inibidores naturais são os anticorpos monoclonais. Vários anticorpos foram erguidos contra seqüências específicas de peptídeos dentro do domínio catalítico MMP-I (Galvez et al., 2001, J.

5 Biol. Chem, 276: 37491-37500). Contudo, embora estes anticorpos pudessem inibir a atividade da MMP in vitro, ainda não foram demonstrados os resultados comprovando a eficácia in vivo de tais anticorpos.

Conforme descrito acima, o 10 local catalítico das MMPs inclui um íon de metal coordenado que se torna disponível para ligação de substrato seguindo a ativação da enzima (Ver Figuras 2a-c). É, assim, concebível que anticorpos convencionais dirigidos à seqüência primária de aminoácido da enzima não diferenciassem a forma ativa da 15 forma inativa da enzima e, logo, não serviriam como inibidores potentes de tais enzimas.

Os inventores presentes

mostraram previamente que os anticorpos que reconhecem as determinantes - tanto eletrônicas como as estruturais - do 20 local catalítico de MMPs são potentes inibidores em conseqüência e, como tais, podem ser usados para tratar doenças associadas ao desequilíbrio da atividade de MMP (ver Publicação de PCT WO 2004/087042).

Há, assim, uma necessidade amplamente reconhecida e seria altamente desejável ter compostos específicos de hapteno que imitassem as determinantes eletrônicas e estruturais do local catalítico de metaloproteinas - bem como anticorpos específicos que sejam direcionados contra tal local.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionado um composto que possui a fórmula geral (I) :

R

onde: m e n são, cada um, independentemente, um inteiro de 1 a 6; XI-X 3 e Y1-Y3 são, cada um, independentemente, O ou S; R1-R3 são, cada um, independentemente, selecionados a partir do grupo consistindo de hidrogênio, alquil e ciclo-alquil; e R é (CH2)x-Ç ( = O)NR'- (CH2)y-NR'R' ' onde: Xey são, cada um, independentemente, um inteiro de 1 a 6; e R' e R' ' são, cada um, independentemente, selecionados a partir do grupo que consiste de hidrogênio, alquil e cicloalquil .

De acordo com características lteriores nas configurações preferidas da invenção descritas abaixo, o composto tem a fórmula (II): R

Onde R = -CH2 -C(=0)NH-CH2-CH2-NH2

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, está proporcionado um composto que possui a fórmula (II):

Zn

R

onde R = -CH2-C(=0)NH-CH2-CH2-NH2

De acordo com ainda um outro aspecto da presente invenção, está proporcionado um anticorpo compreendendo um antígeno de reconhecimento de região, capaz de se ligar especificamente ao composto acima.

Ainda, de acordo com

características ulteriores nas configurações preferidas descritas, o antigeno de reconhecimento de região compreende uma seqüência de aminoácido CDR selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 e 12.

De acordo com ainda outras características nas configurações preferidas descritas, a seqüência de aminoácido CDR é codificada por uma seqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, e 18.

De acordo com, ainda,

características ulteriores nas configurações preferidas descritas, o anticorpo é capaz de inibir uma atividade da metaloproteína.

De acordo com ainda outras características nas configurações preferidas descritas, a metaloproteína é uma metaloprotease de matriz.

De acordo com ainda outras características nas configurações preferidas descritas, a metaloprotease de matriz é uma gelatinase.

De acordo com ainda outras características nas configurações preferidas descritas, a gelatinase é selecionada a partir do grupo MMP-2 e MMP-9.

De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para se produzir um inibidor de metaloproteína, consistindo, o método, em gerar anticorpos dirigidos contra o composto acima, produzindo, assim, o inibidor de metaloproteína.

De acordo com ainda outras características nas configurações preferidas descritas, os anticorpos são anticorpos policlonais.

De acordo com ainda outras características nas configurações preferidas descritas, os anticorpos são anticorpos monoclonais.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um método de se tratar uma doença associada à atividade desequilibrada ou anormal de metaloproteinas em um sujeito assim carente, compreendendo, o método, em se administrar - no sujeito - uma quantidade efetiva de anticorpos da reivindicação 4-10 tratando, assim, a doença associada à atividade desequilibrada ou anormal de metaloproteinas no suj eito.

Ainda de acordo com

características ulteriores nas configurações preferidas descritas, a doença é uma enfermidade inflamatória dos intestinos.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um método de se inibir a atividade da metaloprotease de matriz em uma célula, consistindo, o método, em se pôr a célula em contato com qualquer um dos anticorpos da reivindicação 4-10 inibindo, assim, a atividade de metaloprotease de matriz na A presente invenção aborda, com sucesso, as desvantagens das configurações conhecidas atualmente ao proporcionar uma nova composição de hapteno que pode ser usada para gerar anticorpos que reconhecem as determinantes - tanto eletrônicas quanto estruturais - do local catalítico de metaloproteinas.

Salvo se definido em

contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado e são comumente entendidos por alguém de habilidade mediana na arte á qual pertence a invenção. Embora se possam usar métodos e materiais semelhantes, ou equivalentes àqueles descritos aqui, na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo-se as definições, terá precedência. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são meramente ilustrativos e não devem ser limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção se encontra descrita, aqui, apenas pro meio de exemplo, com referência aos desenhos anexados. Com referência específica, a gora, aos desenhos em detalhe, enfatiza-se que os detalhes mostrados são apenas por força de exemplo e pelo propósito de discussão ilustrativa das configurações preferidas da presente invenção - e são apresentados no ensejo de proporcionar aquilo que, acredita-se, seja a descrição mais útil e prontamente entendida dos princípios e aspectos conceituais da invenção. A este respeito, não se faz qualquer tentativa de mostrar detalhes estruturais da invenção em mais detalhe do que é mister para a compreensão fundamental da invenção - a descrição tomada com os desenhos tornando aparente, aos doutos na arte, como as várias formas da invenção podem ser incorporadas na prática.

Nos desenhos:

as figuras IA-D são representações esquemáticas da estrutura molecular de Co/ZnTCPP - [mesoTetrakis (4- carboxifenil)-porfirinato]

cobalto/zinco (II) (Figuras Ia-B, Imisdp - [2- (2-amino etil carbomoil)-etoxi-metil] - tris[2-(N-(3-imidazol-l-il-propi1)) - etoxi metil] metano e a ligação conservada zinco-proteína no local catalítico de zinco nas MMPs; as figuras IE-H são esquemáticos tridimensionais das estruturas apresentadas nas Figuras 1A-D. Notem, o ZnTCPP retém uma conformação planar, ao passo que o CoTCPP exibe uma conformação de microciclo distorcida. Notavelmente, a estrutura Misdp é altamente análoga ao ambiente mais próximo do íon de zinco catalítico na MMP9, conforme demonstrado na Figura 1G; a figura 2A é uma sobreposição estrutural entre as estruturas calculadas tridimensionais de Imisdp (átomos de carbono verde) e as três histidinas conservadas no local ativo da MMP-9 (código PDB 1GKC, átomos de carbono cinza) . 0 íon de zinco catalítico é representado como uma bola laranja, a molécula .de água, como uma bola azul, os nitrogênios são de cor azul, os oxigênios são vermelhos;

5 a figura 2B é uma superposição estrutural entre o anel

porfirínico ZnTCPP (código CSD AKICOM) (átomos de carbono verde) e as três histidinas conservadas no local ativo de MMP-9 (átomos de carbono cinza código PDB 1GKC), o íon catalítico de zinco é representado como uma

bola laranja, os nitrogênios são de cor azul; as figuras 3A-C são imagens de western blot mostrando a habilidade de mAbs imobilizados de IgG Agarose de camundongos em puxar para baixo o domínio catalítico de MMP-2 recombinante (MMP

2cat) ou Pro-MMP-2 e Pro-MMP-9 da solução. Os anticorpos usados para cada experimento são 6C6, 13E11 E 13E15. Na Figura 3A - MMP-2cat (2 μg) foi incubado com IgG- Agarose anticamundongo (cntl, lanei) ou anti CoTCPP, ZnTCPP

e Imisdp mAb (10 μg) - IgG- Agarose anticamundongo por 2 horas a 20°C, os imunoprecipitados (lane 2, 3, 5) foram centrifugados e lavados três vezes, separados em gel SDS/PAGE e visualizados por tintura de

Coomassie. Na Figura 3 - Pro-MMP-2, Pro-MMP-9 foram incubados com IgG- Agarose mAbs -anticamundongo, da mesma forma que em A. Os imunoprecipitados (lane 2, 4, 6 esquerda e 1,

3, 5 direita)e fração não ligada (lane 1, 3, 5 esquerda e 2, 4, 6 direita) foram separados em gel SDS/PAGE e visualizados por tintura de Coomassie. Na Figura 3C - meio condicionado de células HT1080 que ou sofreram ativação com APMA (esquerda) ou não (direita), foi imunoprecipitada com anti CoTCPP mAb e analisada por western blot com anticorpos específicos contra MMP-2;

4A -B são esquemas Lineweaver-burk de inibição CoTCPP mAb de MMP-2 (A) e MMP-9 (B). As unidades de velocidade estão em μιηοΐ/ seg-1, e as unidades de substrato estão em μΜ-l. Na Figura 4A - as concentrações de MAb foram 6 (triângulos fechados), 18 (quadrados fechados),

24 (círculos abertos) e O μΜ (quadrados abertos). A concentração de MMP-2cat foi de 200 nM. Na figura 4B - Inibição de toda a extensão de APMA de MMP-9 ativada, as concentrações de mAb foram 6 (quadrados abertos), 12 (triângulos fechados), 24 (quadrados abertos) e 0 μΜ (quadrados fechados). A concentração de MMP-9 foi de 20nM. 0 padrão de inibição indica que o anti CoTCPP mAb atua como um inibidor competitivo de MMP-2 e MMP-9;

é um esquema mostrando a inibição de MMP-2 e MMP-9 pelo anti Imisdp mAb. Domínio catalítico de MMP-9 (20 nM) (círculos fechados) ou toda a extensão de APMA dos MMP-2 ativados (triângulos fechados, 5 nM) foi adicionado às misturas do substrato fluorogênico 0CAcPLGLA2pr(Dnp)-AR-NH2 5 (10 μΜ) em controlador de pH R contendo

concentrações cada vez mais elevadas de mAb. As linhas representam os ajustes de menos quadrados não-lineares à Equação:

vi/vo=(Km+[S])/(Km(1+[I]/Ki)+[S]), usando o programa Origin;

a figura 6A mostra os espectros da borda K do zinco de formas inibidas ativa e anti CoTCPP mAb de MMP2cat. São mostrados dados normalizados brutos de XAS da região da borda K do zinco complexos MMP-2cat-mAb (sólido) e ativo (pontilhado);

a figura 6B mostra a posição da borda o complexo MMP-2cat mAb (sólido) se muda para uma energia mais elevada relativa à MMP2-cat ativa (pontilhada); a figura 6C mostra os resultados de EXAFS para as formas ativa (preto) e inibida de MMP-2cat que são

mostradas. Os resultados são apresentados em espaço R e transformados de volta ao espaço K; as figuras 7A - B são fotografias mostrando a habilidade de anti CoTCPP mAb em inibir a atividade da gelatinase na superfície celular. As

mícrografias fluorescentes representativas das células HT1080 dispostas em lâminas de cobertura revestidas com gelatina-DQ na presença ou ausência de IuM de 13E11 mAb. A atividade gelatinolitica da superfície celular foi aferida como uma medida da fluorescência emitida pela gelatina degradada. Células não tratadas exibiram uma significante atividade de gelatinase na superfície celular, a qual foi significativamente inibida na presença de 1 uM de anti CoTCPP mAb. A tintura 4'-6-Diamidino-2- fenil-indol (DAPI) , em azul, indica a localização dos núcleos das células; é um esquemático mostrando a configuração dos vários locais ativos de MMP (bolsão SI); é o esquemático da síntese de Imisdp; mostra as seqüências de aminoácidos dos anticorpos da presente invenção com as regiões CDR em destaque;

IlA-D são fotografias e modelos ilustrando que 6C6 apenas se liga à conformação ativa de MMP-9 e MMP-2. Figura 11A: Detecção de MMP-9 ativa que co-purificou com 6C6 do fluído de ascitas de camundongos. MAb (IC^g) purificada de fluído de ascitas de camundongos contendo MMP-9 foi submetido a análise western blot (WB) usando anticorpo anti MMP-9 comercial. 0 IgG mAb não relativo que foi purificado da mesma maneira, serviu como controle negativo (Controle mAb) . A Pro-MMP-9 humana purificada de células HeLa transfectadas serviu como marcador de peso molecular para discernir as espécies ativas. A purificação foi feita por cromatografia de afinidade usando contas de proteína G, as quais se ligam a mAb mediante seu domínio constante, deixando o local de ligação do antígeno livre para interagir com o antígeno. As Figuras 11B, C: foi analisado 6C6 mAb imobilizado em contas de proteína A por sua habilidade em puxar para baixo a Pro-MMP-2, Pro-MMP-9, ou fragmento de MMP-2 catalítica (carecendo de hemopexina e domínios pro) da solução. MAbs 6C6 (10 μg) imobilizado em contas de Sepharose de proteína A foi incubado com fragmento de MMP-2 catalítica (^g) - Figura 11B, Pro-MMP-9 Figura IlC canto superior, ou ProMMP-2 (2μg) (Figura IlC canto inferior, pro 2 horas a 20°C. 0 complexo mAb ligado a contas foi separado por centrifugação e lavado três vezes, separado em gel SDS/PAGE e visualizado por tintura de Coomassie. Imunoprecipitados (6C6) e frações não ligadas foram separados em gel SDS/PAGE e visualizados por tintura de Coomassie. Como controle negativo para a absorção não específica, apenas enzima foi incubada com contas de Sepharose de proteína A. Figura 11D: É mostrada a estrutura tridimensional de MMP-2 carecendo do domínio hemopexina com (canto inferior) e sem (canto superior) o pro-domínio na representação de superfície (PDB ID: 1CK7). Os domínios catalítico e fibronectina estão mostrados na cor ciano e o pro-peptídeo em vermelho. 0 íon de zinco catalítico está representado como uma esfera laranja e ligado às três histidinas conservadas mostradas como palitos amarelos. Conforme mostrado, o domínio pro-peptídeo bloqueia estericamente o local ativo;

12A-B são gráficos e dados relativos ao mecanismo de inibição de MMP-9 pelo 6C6 mAb. Figura 12A: fragmento catalítico recombinante de MMP-9 (sem a hemopexina e o pro-domínio) foi pré-incubado com quantidades variantes de mAb. A atividade enzimática residual foi medida após a adição de substrato de peptídeo fluorogênico (10 μΜ). Ki foi avaliado ao se ajustar à equação de inibição competitiva (vi/vo = Km +

[ S ] / (Km (1 + I/Ki) + [S]) Km = 9,14 ± 0,8) (Inset) MMP-9 ativa (a uma concentração fixa de 2nM) foi pré-incubada por 60 minutos a 37° C na ausência (·) ou presença de 0,7 (*) ou 2μΜ (O) de Ab, em 100 mM de NaCl, 10 mM de CaC12, IOOmM de Tris pH 7,5. O substrato de peptídeo Flourogênico (Mca-Pro-Leu-GIy-Leu-Dpa_Ala-ArgNH2) foi, então acrescentado para se alcançar as concentrações finais indicadas (S) na variação de 0-30 μΜ, e a velocidade inicial de hidrólise do substrato foi determinada pela medição de fluorescência aumentada. Os valores de Km e Vmax aparentes forma derivados mediante o ajuste de dados experimentais à equação de 5 Michaelis-Menten. Os valores derivados foram

usados para reconstruir o esquemático de Linweaver-Burk reciproco, duplo - os pontos de intersecção indicam a inibição competitiva d e MMP-9 por 6C6. Figura 12b: As diferentes MMPs foram pré-incubadas com quantidades variantes

de mAb. A atividade enzimática residual foi medida após a adição de substrato peptídeo fluorogênico (10 μ) . Ki foi avaliado mediante ajuste à equação de inibição competitiva (vi/ vo = Km + [S] / 9Km (1 + I / Ki) + [S] ) Km =

2,46 ± 0,34 para a extensão total de MMP-2 purificada a partir de células HeLa, Km = 16 ± para o domínio catalítico de MTl - MMP) . A inibição efetiva de 6C6 também, foi detectada usando-se a total extensão da MMP-2 e MMP-9 (os

dados não estão mostrados); a figura 13 é uma sobreposição estrutural de diferentes MMPs mostrando a topologia geral conservada do local ativo com variações mormente dentro dos loops periferais. MMP-9 (PDB I GKC) - ciano,

MMP-2 (PDB I QIB) - magenta, MTl-MMP (PEDB 1BUV) - laranja, MMP7 (PDB I MMQ) - vermelho, TACE (PDB 2147) - amarelo. As histidinas conservadas são mostradas como pauzinhos, o ion de zinco catalítico é representado como uma bola laranja. Notavelmente, a topografia geral dos loops periféricos de MMP-2 e MMP-9 é semelhante. Isso pode explicar a seletividade de 6C6 para MMP-2 e MMP-9 no grupo testado de enzimas;

14A-C são micrografias fluorescentes ilustrando que o 6C6 inibe a atividade de gelatinase na superfície da célula. Micrografias

fluorescentes representativas (geradas por ensaio zimográfico in situ) de células HT1080 dispostas em placas de cobertura revestidas com gelatina-DQ na ausência (Figura 14A) ou presença (Figura 14B) de 5 μΜ de mAb ou 15 μΜ de inibidor de gelatinases nanomolar baseado em mecanismo, SB-3CT (Figura 14C). A atividade gelatinolítica na superfície celular foi aferida como uma medida da fluorescência emitida pela gelatina degradante. As células não tratadas exibiram significativa atividade da gelatinase na superfície celular (verde), a qual foi significativamente inibida pela presença de mAb;

A-C são gráfico ilustrando os efeito do tratamento com 6C6 sobre as várias manifestações de colite DSS aguda em camundongos C57BL/6, A doença foi induzida por 2% de DSS por 5 dias. O tratamento 6C6, 5 ou

1,5 mg / kg de camundongo, foi administrado por injeção i.p. diária, a começar pelo dia 0. A figura 15 A: 0 escore clinico foi avaliado pro monitoramento diário do DAI (o qual é o escore

combinado de peso corpóreo, sangramento retal e consistência das fezes, numa escala de 0 - 4) . Os dados são expressos como a distribuição de pontos de uma média para cada animal de dias 6 a 10. Figura 15B: Extensão do Cólon. Figura 15

C: Mortalidade. Os dados apresentados são os resultados combinados de dois experimentos, com um total de 15 camundongos por grupo *, efeito significativo sobre os camundongos não tratados de colite (p< 0,05); e

a figura 16 é um gráfico de resultados da espectroscopia de absorção de raios-X na borda K do zinco da MMP

9 ativa (preto) e do complexo MMP-9 - 6C6 inibida (vermelho). Os resultados são apresentados na forma de distribuição radial do

íon de zinco. A posição da borda do complexo domínio catalítico da MMP-9 - mAb (vermelho) muda para uma energia mais alta relativa à MMP

9 ativa (parte interior) indicando ligação com o íon de zinco catalítico. A análise dos dados

de espectroscopia dos raios-X indica que o 6C6 se liga diretamente ao íon de zinco e forma complexo de proteína de zinco penta-coordenada. Notavelmente, este modo de ligação é análogo à ligação de IT-MMPs no local ativo das MMPs. DESCRIÇÃO DAS CONFIGURAÇÕES PREFERIDAS

A presente invenção é de anticorpos e fragmentos derivados, os quais podem ser usados para inibir a atividade da metaloproteína. Especificamente, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para tratar de doenças associadas à atividade desequilibrada da metaloprotease de matriz, tal como esclerose múltipla, doenças auto-imunes e cânceres metastáticos.

Os princípios e operação da presente invenção podem ser mais bem compreendidos com referência aos desenhos e descrições anexadas.

Antes de explica ao menos uma configuração da invenção em detalhe, deve-se entender que a invenção não está limitada, em sua aplicação, aos detalhes delineados na descrição que se segue ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras configurações ou de ser praticada ou levada a cabo em várias formas. Também, deve-se entender que a fraseologia e terminologia empregadas aqui seguem o propósito da descrição e não deve ser considerada limitante.

As proteases de matriz participam em muitos processos biológicos, variando de proliferação celular, diferenciação e remodelagem da matriz extracelular (MEC) até vascularização e migração celular. Estes processos requerem um equilíbrio delicado entre as funções das metaloproteases de matriz (MMPs) e dos inibidores naturais de tecido resultantes (IT-MMPs). A perda deste equilíbrio é o marco de numerosos distúrbios patológicos - inclusive tumores metastáticos, doenças neurodegenerativas e osteoartrite.

São conhecidos numerosos inibidores de MMP na arte, inclusive pequenos inibidores de peptídeos, tais como hidroxamato, tetraciclinas não microbiais e anticorpos monoclonais. Enquanto os aqueles são limitados pelo alto custo de produção, alta degradabilidade, baixa biodisponibilidade oral e falta de especificidade, nenhum destes demonstraram eficácia terapêutica in vivo.

Os inventores presentes

revelaram, anteriormente, que anticorpos que reconhecem determinantes tanto estruturais quanto eletrônicas do local catalítico de metaloenzimas podem ser usados como potentes inibidores deste ponto em diante. O uso de haptenos imita o local catalítico de ligação metálica de metaloenzimas enquanto os imunogênios permitiram a geração de anticorpos terapêuticos altamente eficientes, os quais podem ser usados para tratar de distúrbios clínicos caracterizados pela elevada atividade de metaloproteína (ver W02004/087 042 para os presentes inventores).

Enquanto reduziam a presente invenção à prática, os presentes inventores desenharam um novo composto de hapteno que imita muito bem a estrutura local e conformação do local de zinco reativo nas MMPs. O composto [2-(2-amino etil carbomoil)-etoxi-metil] - tris-[2- (N-(3-imidazol-l-il-propil)) - etoxi metil] metano, chamado Imisdp (ver Figura 1), podem imitar uma geometria de 4- coordenação e um campo de força similar induzido pelo íon de zinco no leque de histidina coordenada-3 e água. Uma conformação aproximadamente tetraédrica é formada pelas três bases de imidazol e molécula de água como o quarto ligante. A Figura 2 A mostra uma superposição do modelo em 3D do construto do composto Imisdp com o local catalítico de MMP-9 (PD 1GKC) que foi modificado para representar a geometria tetraédrica dos ligantes de zinco. As modificações incluem substituir o ligante presente na estrutura de raiosX (um inibidor de hidroxamato) com uma molécula de água e otimização da enzima completa para um local mínimo por uma abordagem de multi-nível QM/MM (ver materiais e métodos). Existe alta semelhança entre o motivo calculado de zinco histidina na MMP-9 e o Imisdp em termos de distâncias do nitrogênio-ε das Histidinas do íon de zinco (2,04 ± 0,06 e 2,02 respectivamente) e a relativa orientação das três histidinas em direção ao metal.

Conforme ilustrado abaixo - e na seção de Exemplos que se segue, os presentes inventores imunizaram camundongos com Imisdp e isolaram um anticorpo de MMP reativo cruzado com MMP-2 e MMP-9. Esse anticorpo foi chamado 6C6 (ver Figura 10 e Exemplos 1-2 da seção de Exemplos que se segue) . Descobriu-se que o 6C6 se liga à MMP-2/9 e inibe, competitivamente, a atividade de MMP-9, MMP-2 (faixa Ki 1 μΜ - 5 μΜ) e MTl-MMP (Ki de 15 μΜ, ver Tabela 4 abaixo) . A ligação e a inibição de MMP-9 e MMP-2 foi demonstrada in vitro em in situ mediante uma variedade de ferramentas bioquímicas e biofísicas (ver Exemplos 4-7 e 9). De modo importante, o 6C6 se liga apenas à forma ativada de MMP-9 e MMP-2 (ver Exemplo 3 e Exemplo 8) . Esta 5 forma de enzima carece do pro-domínio que protege o complexo de zinco catalítico que reside dentro da porção enzimática. Os inventores presentes mostraram que os anticorpos gerados de acordo com o presente método são capazes de se ligar in vivo à MMP-9 10 (Figura 11 A) . Mais adiante, os inventores presentes mostraram que os anticorpos da presente invenção compreenderam potencial terapêutico para o

tratamento de doença inflamatória dos intestinos (Exemplo 10).

No todo, os achados presentes

apóiam o uso de Imisdp como um importante reagente (plataforma) para a produção de inibidores de metaloproteína e 6C6 e peptídeos e peptidomiméticos derivados como uma valiosa ferramenta

terapêutica.

Estes resultados demonstram o potencial de usar estes anticorpos como uma plataforma para o desenho de inibidores seletivos de peptídeos para MMPs individuais por meio de phage display e pontos de mutação nos mAbs ou em seus fragmentos.

Assim, de acordo com um aspecto d apresente invenção, está proporcionado um composto que possui a Fórmula geral (I): R

onde: m e n são, cada um, independentemente, um inteiro de 1 a 6; X1-X3 e Y1-Y3 são, cada um, independentemente, 0 ou S; R1-R3 são, cada um, independentemente, selecionados a partir do grupo consistindo de hidrogênio, alquil e ciclo-alquil; e Ré (CH2)x-C(=0)NRf -(CH2)y-NR'R' '

Onde :

Xey são, cada um, independentemente, um inteiro de 1 a 6; e R' e R' ' são, cada um, independentemente, selecionados a partir do grupo que consiste de hidrogênio, alquil e cicloalquil.

De acordo com uma configuração preferida de um aspecto da presente invenção, o composto é [2-(2-amino etil carbomoil)-etoxi-metil] - tris-[2-(N-(3- imidazol-l-il-propil)) - etoxi metil] metano, chamado Imisdp, o qual possui a Fórmula geral (II):

Zn

R onde R = -CH2-C(=0)NH-CH2-CH2-NH2

A síntese de Imisdp está descrita no Exemplo 7 da seção de Exemplos que se segue.

Uma vez que o Imisdp imita a estrutura local e a conformação transiente do local do zinco reativo na MMP-9 e MMP-2, este pode ser usado para a produção de inibidores de metaloproteína.

Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção, está proporcionado um método para se produzir um inibidor de metaloproteína.

0 método é levado a efeito mediante a geração de anticorpos ou de fragmentos de anticorpos direcionados ao composto descrito acima (por ex. , Imisdp) . Ver Exemplos 1-2 bem como a seção "Materiais e Métodos" da seção de Exemplos que se sugue.

A "metaloproteína" da presente invenção se refere a uma proteína ligada a um metal, na qual o local de ligação do metal forma uma parte de um domínio catalítico de uma enzima, a qual se parece, tanto eletrônica quanto estruturalmente, com a do Imisdp.

A metaloproteína deste aspecto da presente invenção é, de preferência, uma metaloproteinase

- MMP (por ex., gelatinase tal qual MMP-2 e MMP-9).

Será apreciado que todos os membros da família MMP sejam entendidos como enzimas latentes - as quais, na ativação, são convertidas em enzimas ativas nas quais o íon de metal no local ativo se encontra acessível para ligação de substrato. Por exemplo, sugeriuse, anteriormente, o "modelo interruptor de cisteína" para explicar a ativação in vitro da MMP. O modelo interruptor da cisteína sugere que, na ativação, o local de ligação de zinco latente é convertido em um local de ligação de zinco catalítico pela dissociação do pro-peptídeo que possui tiol (Cys) do átomo de zinco. O corte do pro-peptídeo resulta na quebra da estrutura do pro-domínio da enzima e a proteção do íon de zinco catalítico é removida. Em conseqüência, o íon de metal e o bolsão do local ativo ficam acessíveis para a ligação de substratos e hidrólise [Van Wart e BirkedalHansen (1990) Proc. Natl. Acad, Sei. USA 87, 5578-5582],

Os anticorpos e os fragmentos de anticorpos gerados de acordo com os ensinamentos da presente invenção servem como potentes inibidores de MMPs, devido a sua habilidade de se ligarem tanto com o íon do metal quanto com os amínoácidos coordenadores dentro do local de zinco catalítico, inibindo especificamente, desta forma, a conformação ativa destas enzimas que estão diretamente envolvidas nos processos patológicos conforme se descreveu acima.

Conforme usado aqui, o termo "anticorpo" se refere a uma molécula de anticorpo intacta e a frase "fragmento de anticorpo" se refere a um fragmento funcional resultante, tal como Fab, F(ab')2, e Fv, que são capazes de se ligarem a macrófagos. Estes fragmentos funcionais de anticorpos são definidos conforme segue: (i) Fab, o fragmento que contém um fragmento ligante a antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido pela digestão de todo o anticorpo com a enzima papaína para se colher uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada/ (ii) Fab', o fragmento de uma molécula de um anticorpo que pode ser obtida tratando-se um anticorpo 5 inteiro com pepsina, seguida de redução, para se colher uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada: dois fragmentos de Fab' são obtidos por molécula de anticorpo; (iii) (Fab') 2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido tratando-se o anticorpo inteiro com a enzima pepsina sem a 10 redução subsequente; (Fab') 2 é um dimero de dois fragmentos Fab' mantidos juntos por duas pontes dissulfido; (iv) Fv, definido como um fragmento geneticamente alterado que contém a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressa em duas cadeias; (v) Anticorpo de 15 cadeia única ("SCA"), uma molécula geneticamente alterada que contém a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada, ligada por um polipeptídeo ligador adequado, qual seja uma molécula de cadeia única geneticamente fusionada; e (vi) Codificação de peptídeos 20 para uma única região determinante de complementaridade (CDR).

Os métodos de se gerar anticorpos (por ex., monoclonais e policlonais) são bem conhecidos na arte. Os anticorpos podem ser gerados mediante 25 qualquer dos vários métodos conhecidos na arte, os quais podem empregar a indução de produção in vivo de moléculas de anticorpos, seleção em bibliotecas de imunoglobulina ou painéis de reagentes ligantes altamente específicos, conforme revelado [Orlandi D. R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. 86: 3833-3837, Winter G. et al. (1991) Nature Natureza - 349: 293-299] ou geração de moléculas de anticorpos monoclonais por linhas contínuas de células em cultura. Estas incluem, de forma não limitada, a técnica hibridoma, a técnica hibridoma de célula humana B, a técnica do Vírus Epstein-Bar (EBV)-hibridoma [Kohler G., et al. (1975) Nature -Natureza - 256: 495-497, Kozbor D., et al. (1985) J. Immunol. Methods 81: 31-42, Cote R. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 2026-2030, Cole S. P. et al (1984) Mol . Cell. Biol. 62: 109-120].

Nos casos em que os compostos da invenção sejam pequenos demais para provocar uma resposta imune forte, tais antígenos (haptenos) podem ser casados com veículos antigenicamente neutros, tais como os veículos hemocianina keyhole limpet (KHL) ou soro albumina [por ex., soro albumina bovino (BSA)] (ver patentes U.S. Nos. 5,189,178 e 5,239,078, e Exemplos 2 na seção de Exemplos). A união com um veículo pode ser realizada e, opcionalmente, seguida pela redução da ligação de imino formada. Alternativamente, o veículo pode ser unido usando-se agentes condensadores, tais como diciclohexil carbodiimida ou demais agentes carbodiimida desidratantes. Os compostos ligadores também podem ser usados para se levar a união a efeito; tanto ligadores homo-bifuncionais como hetero-bifuncionais são disponibilizados pela Pierce Chemical Company, Rockford, III. 0 complexo imunogênico resultantes pode ser injetado, então, em sujeitos mamíferos adequados, tais como camundongos, coelhos e afins. Os protocolos adequados envolvem a injeção repetida do imunogênio na presença de adjuvantes de acordo com o programa que acelera a produção de anticorpos no soro. As titulações do soro imune podem ser prontamente medidas usando-se procedimentos de imunoensaios, que são bem conhecidos na arte.

0 anti-soro obtido pode ser usado diretamente ou os anticorpos monoclonais podem ser obtidos conforme descrito acima.

Os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos usando-se métodos bem conhecidos na arte. (Ver, pro exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual - Anticorpos: Um Manual Laboratorial -, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, anexado aqui por referência). Por exemplo, fragmentos de anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser preparados pro hidrólise proteolítica do anticorpo ou pela expressão nas células de E. coli ou de mamíferos (por ex., cultura de células de ovário de hamster chinês ou demais sistemas de expressão de proteína) do DNA que codifica o fragmento.

Alternativamente, os

fragmentos de anticorpos podem ser obtidos pela digestão pepsina ou papaína de anticorpos inteiros por métodos convencionais. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos pelo corte enzimático de anticorpos com pepsina para proporcionar um fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento pode ser cortado mais além, usando-se um agente redutor tiol e, opcionalmente, um grupo bloqueador para os grupos sulfidrila, resultantes do corte de pontes dissulfido para produzir fragmentos 3. 5S Fab' monovalentes. Alternativamente, um corte enzimático usando pepsina produz dois fragmentos Fab' monovalentes e um fragmento Fc diretamente. Estes métodos são descritos, pro exemplo, por Goldenberg, U.S. Pat. Nos. 4,036,945 e 4, 331, 647 e referências contidas ali, cujas patentes estão incorporadas aqui, em sua inteireza, por referência. Ver também Porter, R. R., Biochem. J., 73: 119-126, 1959. Outros métodos de se cortar anticorpos, tais como a separação das cadeias pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadeia leve-pesada, também pode ser usados demais cortes de fragmentos, ou técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas, desde que os fragmentos se liguem ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

Os fragmentos Fv compreendem uma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode ser monovaiente, conforme descrito em Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69: 2659-62, 1972. Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ponte dissulfido intermolecular ou Iigada-X por produtos químicos como glutaraldeído. De preferência, os fragmentos Fv compreendem cadeias VH e VL ligadas por um peptídeo ligador. Estas proteínas de cadeia única que se ligam a antígenos (sFv) são preparadas pela construção de um gene estrutural compreendendo seqüências de DNA codificando os domínios VH e VL ligados por um oligonucleotídeo. 0 gene estrutural inserido em um vetor de expressão, o qual é subsequentemente introduzido em uma célula hospedeira, qual seja E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma única cadeia de polipeptídeo com um polipeptideo ligador fazendo a ponte entre os dois domínios V. Os métodos para se produzir sFvs são descritos, por exemplo, por Whitlow e Filpula, Methods - Métodos 2: 97-105, 1991; Bird et al., Science Ciência - 242: 423-426, 1998; Pack et al., Bio/Technology Bio/Tecnologia 11: 1271-77, 1993; e Ladner et al., U.S. Pat. No. 4.94 6.77 8.

Os peptídeos CDR ("unidades de reconhecimento mínimo") podem ser obtidos pela construção de genes codificando o CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, pelo uso de reação de polimerase em cadeia para sintetizar a região variável do RNA das células produtoras de anticorpos. Ver, por exemplo, Larrick e Fry, Methods -Métodos -, 2: 106-10, 1991.

Será apreciado que, para diagnóstico e terapia humanos, sejam usados, de preferência, anticorpos humanizados. As formas humanizadas de anticorpos não-humanos (por ex., murino) são moléculas quiméricas de imunoglobulinas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos derivados delas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outra subsequência de anticorpos que se ligam a antígenos), os quais contenham uma seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente), nas quais os resíduos de uma região determinante complementar (CDR) do recipiente sejam substituídos por resíduos de um CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) - qual seja o camundongo, rato, ou coelho tendo a especificidade,

afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos correspondentes não humanos. Os anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente, nem no CDR importado ou nas seqüências de estrutura. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente, pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis inteiros, nos quais todas, ou substancialmente todas as regiões CDR correspondam às de uma imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas as regiões FR sejam as de uma seqüência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também irá incluir, otimamente, ao menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fe), tipicamente, a da imunoglobulina humana [Jones et al., Nature - Natureza -, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature - Natureza -, 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

Os métodos para se humanizar os anticorpos não humanos são bem conhecidos na arte. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele, a partir de uma fonte não 25 humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são, com frequência, chamados de resíduos importados, os quais são tipicamente tirados de um domínio variável importado. A humanização pode ser essencialmente levada a cabo seguindose o método de Winter e colegas [Jones et al. , Nature Natureza 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature Natureza -, 332: 323-327 (1988); Verhoyen et al. , Science Ciência - 239: 1534-1536 (1988)], pela substituição de 5 seqüências CDR ou CDRs de roedores pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Em conseqüência, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (U.S. Pat. No. 4.816.567), onde foi substituído substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto pela

seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, nos quais alguns resíduos de CDR e, possivelmente, alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos provenientes de locais análogos em anticorpos de 15 roedores.

Os anticorpos humanos também podem ser produzidos usando-se várias técnicas conhecidas na arte, inclusive as bibliotecas de phage display [Hoogenboome Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al. , J. 20 Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. As técnicas de Cole et al e de Boerner et al também estão disponíveis para o preparo de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy - Os Anticorpos Monoclonais e a Terapia do Câncer -, Alan R. Liss, p. 77 (1985)e Boerner

2 5 et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)]. De forma semelhante, o humano pode ser feito pela introdução de Ioci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por ex., camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógena foram parcialmente ou completamente inativados. Na prática, a produção de anticorpos humanos é observada, a qual se assemelha bastante à vista em humanos em todos os aspectos, incluindo-se re-arranjamento de genes, montagem, e

5 repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, em U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545, 806; 5,569,825; 5,625,825; 5,65,126; 5,633,425; 5,661,016; e nas seguintes publicações científicas: Marks et al. Bio / Technology - Bio / Tecnologia - 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature

Natureza - 368 856-859 (1994); Morrison, Nature - Natureza 368 812-13 (1994); Fishwild et al. , Nature Biotechnology Biotecnologia Natureza - 14. 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology - Biotecnologia Natureza - 14, 826 (1996); Lonberg e Huszar, Intern. Revol. Immunol. 13 65-93 15 (1995).

Uma vez que se obtiveram os anticorpos, eles podem ser testados com relação à sua atividade inibitória da metaloproteína. As condições adequadas de ensaio para a atividade de inibição de 20 metaloproteína são descritas em Knight et al., FEBS Letters 296 (3): 263-266 91992), Cawston et al. , Anal. Biochem, 99: 340-345 (1979), Cawston et al. , Methods in Enzymology Métodos em Enzimologia - 80: 771 et seq. (1981); CAwston et al. , Biochem. J., 195: 159-165 (1981), Weingarten et al.,

Bichem. Biophys. Res. Comm., 139: 1184-1187 (1984) e U.S. Pat. Nos. 4.743.587 e 5.240.958.

Conforme mencionado, usando a metodologia citada, os presentes inventores puderam produzir um anticorpo inibidor de metaloprotease de matriz (MMP) para MMP-2e MMP-9, denominado 6C6, uma seqüência do qual é fornecida em SEQ ID NO: I. As seqüências CDR são fornecidas e SEQ ID Nos. 7, 8, 9, 10, 11 e 12.

Assim, a presente invenção proporciona qualquer seqüência de (poli)peptídeo que compreenda, ao menos, uma das seqüências CDR citadas acima, bem como homólogos e fragmentos derivados desde que sua atividade inibidora da metaloproteína seja mantida (inibição específica da atividade catalítica da metaloproteína). Um exemplo de tal polipeptídeo é um anticorpo (ver acima).

O termo "polipeptídeo",

conforme usado aqui, engloba peptídeos nativos (sejam produtos de degradação, peptídeos sintetizados

sinteticamente ou peptídeos recombinantes) e

peptidomíméticos (tipicamente, peptídeos sintetizados sinteticamente), bem como peptóides e semipeptóides, os quais são análogos de peptídeos que podem ter, por exemplo, modificações que tornem os peptídeos mais estáveis dentro de um corpo ou mais capazes de penetrar nas células. Tais modificações incluem, mas não de forma limitante, a modificação do terminal N, a modificação do terminal C, a modificação da ligação de peptídeo, inclusive - mas não de forma limitada - CH2-NH, CH2-S, CH2-S=0, O=C-NH, CH2-0, CH2- CH2, S=C-NH ou CF=CH, modificações na espinha dorsal e modificações de resíduos. Os métodos para se preparar compostos peptidomíméticos são bem conhecidos na arte e se encontram especificados, por exemplo, em Quantitative Drug Design - Desenho Quantitativo de Fármacos - C. A. Ramsden Gd., Capitulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), o qual é incorporado por referência, conforme disposto na íntegra adiante. Mais detalhes neste tocante são providenciados abaixo.

As ligações de peptídeos (-C0- NH-) dentro do peptídeo podem ser substituídas, por exemplo, por ligações N-metiladas (-N(CH3)-CO-), ligações de éster (C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), ligações de ceto-metileno (-C0-CH2-), ligações α-aza (-NH-N(R)-CO-) , onde R e qualquer alquil, por ex. , metil, ligações carba (-CH2-NH-) ligações de hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-) , ligações de tioamida (-CS-NH), ligações duplas de oleofínicos (-CH=CH-), ligações de retro amidas (-NH-C0-), derivados de peptídeos (-N(R)-CH2- CO-), onde R é a cadeia do lado "normal," naturalmente apresentada no átomo de carbono.

Estas modificações podem ocorrer am qualquer das ligações ao longo da cadeia de peptídeo e, mesmo, em várias (2-3) ao mesmo tempo.

Os aminoácidos aromáticos naturais, Trp, Tyr e Phe, podem ser substituídos por ácido sintético não-natural, tal como Fenilglicina, Tic, naftil alanina (Nal), fenil isoserina, treoninol, derivados anelmetilados de Phe, derivados halogenados de Phe ou 0-metilTyr.

Além do exposto acima, os peptídeos da presente invenção também podem incluir um ou mais aminoácidos modificados, ou um ou mais monômeros não aminoácidos (ácidos graxos, carboidratos complexos, etc.).

Conforme usado aqui, na especificação e na seção de reivindicações abaixo, entendese que o termo "aminoácido" ou "aminoácidos" inclui os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente; os aminoácidos frequentemente modificados pos-translacionalmente in vivo, inclusive, por exemplo, a hidroxiprolina, fosfo-serina e fosfotreonina; e outros aminoácidos incomuns, incluindo-se, mas não de forma limitante, o ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nora-valina, nora-leucina e ornitina. Ademais, o termo "aminoácido" inclui tanto os Laminoácidos quanto os D-aminoácidos.

As Tabelas 1 e 2 abaixo, listam os aminoácidos que ocorrem naturalmente (Tabela 1) e os aminoácidos não convencionais ou modificados (por ex., sintéticos, Tabela 2), os quais podem ser usados na presente invenção.

Tabela 1

Aminoácido Abreviação de Três Letras Simbolo de Uma Letra Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Acido aspártico Asp D Cisteína Cys C Glutamina Gln Q Acido glutâmico Glu E Glicina Gly G Histidina His H Iso-Ieucina Lie I Leueina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenil alanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Continuação da Tabela 1 Triptofano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Val V Qualquer aminoácido como acima Xaa X Tabela 2

Aminoácido não convencional Código Aminoácido não convencional Código Acido a-aminobutírico Abu L-N-metil alanina mala a-amino-a-metilbutirato Mgabu L-N-metil arginina Nmarg aminociclopropano Cpro L-N-metil asparagina Nmasn carboxilato ácido L-N-metil aspártico Nmasp Acido amino isobutírico Aib L-N-metil cisteína Nmcys Amino norbornil Norb L-N-metil glutamina Nmgin carboxilato ácido L-N-metil glutâmico Nmglu ciclo hexil alanina Chexa L-N-metil histidina Nmhis ciclopentil alanina Cpen L-N-metil isoleucina Nmile D-alanina Dal L-N-metil Ieucina Nmleu D-arginina Darg L-N-metil Iisina Nmlys ácido D-aspártico Dasp L-N-metil metionina Nmmet D-cisteína Dcys L-N-metil nora Ieucina Nmnle D-glutamina Dgln L-N-metil nora valina Nmnva ácido D-glutâmico Dglu L-N-metil ornitina Nmorn D-histidina Dhis L-N-metil fenil alanina Nmphe D-isoleucina Dile L-N-metil prolina Nmpro D-Leucina Dleu L-N-metil serina Nmser D-Iisina Dlys L-N-metil treonina Nmthr D-metionina Dmet L-N-metil triptofano Nmtrp D-ornitina Dorn L-N-metil tirosina Nmtyr D-fenil alanina Dphe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N-metil etil glicina Nmetg D-serina Dser L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug D-treonina Dthr L-noraleucina Ie D-triptofano Dtrp L-noravalina Nva D-tirosina Dtyr a-metil-aminoisobutirato Maib D-valina Dval a-metil-aminobutirato Mgabu D-a-metil alanina Dmala α-metil-ciclo hexil alanina Mchexa D-a-metil arginina Dmarg α-metil-ciclo pentil alanina Macpen D-a-metil-asparagina Dmasn a-metil-a-naftil alanina Manap D-a-metil-aspartato Dmasp a-metil-penicilamina Mpen D-a-metil cisteína Dmcys N-(4-aminobutil)glicina Nglu D-a-metil glutamina Dmgln N-(2-aminoetil)glicina Naeg D-a-metil histidina Dmhis N-(3-aminopropil)glicina Norn D-a-metil isoleucina Dmile N-amino-a-metil butirato Nmaabu D-a-metil Ieucina Dmleu α-metil alanina Anap D-a-metil Iisina Dmlys N-benzilglicina Nphe D-a-metil metionina Dmmet N-(2-carbamil etil)glicina Ngln D-a-metil ornitina Dmorn N-(carbamil-metil)glicina Nasn D-a-metil-fenil-alanina Dmphe N-(2-carboxi etil)glicina Nglu D-a-metil prolina Dmpro N-(carboxi metil)glicina Nasp D-a-metil-serina Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut D-a-metil-treonina Dmthr N-ciclo-heptilglicina Nchep D-a-metil-triptofano Dmtrp N-ciclo-hexilglicina Nchex D-a-metil-tirosina Dmty N-ciclodecil-glicina Ncdec D-a-metil-valina Dmavl N-ciclo-dodecil-glicina Nedod D-a-metil-alanina Dnmala N-ciclo-octil-glicina Neoct D-a-metil-arginina Dnmarg N-ciclo-propil-glicina Ncpro D-a-metil-asparagina Dnmasn N-ciclo-undecil-glicina Ncund D-a-metil-aspartato Dnmasp N-(2,2-difenil etil)glicina Nbhm Continuação da Tabela 2 D-a-metilcisteína Dnmcys N-(3,3-difenil propil)glieina Nbhe D-N-metil Ieucina Dnmleu N-(3-indolili-etil) glicina Nhtrp D-N-metil-lisina Dnmlys N-metil-y-aminobutirato Nmgabu N-metil-ciclo-hexil-alanina Nmehexa D-N-metil metionina Dnmmet D-N-metil-ornitina Dnmorn N-metil-ciclo-pentil-alanina Nmcpen N-metilglicina Nala D-N-metil-fenil-alanina Dnmphe N-metil-amino-isobutirato Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro N-(1-metil propil)glicina Nile D-N-metil-serina Dnmser N-(2-metil propil)glicina Nile D-N-metil-serina Dnmser N-(2-metil propil)glicina Nleu D-N-metil-treonina Dnmthr D-N-metil-triptofano Dnmtrp N-{1 -metil etiljglicina Nva D-N-metil-tirosina Dnmtyr N-metíla-naftil-alanína Nmanap D-N-metil-valina Dnmval N-metil-penicilamina Nmpen ácido γ-aminobutírico Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr L-x-butil glicina Tbug N-(tiometil)glicina Ncys L-etilglicina Etg penicilamina Pen L-homofenil alanina Hphe L-a-metil alanina Mala L-a-metil arginina Marg L-a-metil asparagina Masn L-a-metil aspartato Masp L-a-metil-T-butil glicina Mtbug L-a-metil cisteína Mcys L-metil-etil glicina Metg L-a-metil glutamina Mgln L-a-metil glutamato Mglu L-a-metil histidina Mhis L-a-metil homofenil alanina Mhphe L-a-metil isoleucina Mile N-(2metil tio etil) glicina Nmet D-N-metil glutamina Dnmgln N-(3-guanidinopropil) glicina Narg D-N-metil glutamato Dnmglu N-(1 -hidroxi etil) glicina Nthr D-N-metil histidina Dnmhis N-(hidroxi etil) glicina Nser O-N-metil isoleucina Dnmile N-(imidazol-il etil) glicina Nhis D-N-metil Ieucina Dnmleu N-(3-indolili etil)glicina Nhtrp D-N-metil Iisina Dnmlys N-metil-y-aminobutirato Nmgabu N-metil-ciclo hexil alanina Nmchexa D-N-metil metionina Dnmmet D-N-metil ornitina Dnmorn N-metil-ciclopentil alanina Nmcpen N-metil glicina Nala D-n-metil-fenil alanina Dnmphe N-metil amino isobutirato Nmaib D-N-metil prolina Dnmpro N-(1-metil propil) glicina Nile D-N-metil serina Dnmser N-(2-metil propil) glicina Nleu D-n-metil treonina Dnmthr D-N-metil triptofano Dnmtrp N-(1-metil etil) glicina Nval D-N-metil tirosina Dnmtyr N-metila-naftil alanina Nmanap D-N-metil valina Dnmval N-metil penicilamina Nmpen ácido γ-aminobutirico Gabu N-(p-hdroxi fenil) glicina Nhtyr L-T-buíil glicina Tbug N-(tio metil) glicina Ncys L-etil glicina Etg penicilamina Pen L-homofenil alanina Hphe L-a-metil alanina Mala L-a-metil arginina Marg L-a-metil asparagina Masn L-a-metil aspartato Masp L-a-metil-x-butil glicina Mtbug L-a-metil cisteína Mcys L-a-metil-etil glicina Metg L-a-metil glutamina Mgln L-a-metil glutamato Mglu L-a-metil histidina Mhis L-a-metil-homofenil alanina Mhphe L-a-metil isoleucina Mile N-(2-metil-tio-etil)glicina Nmet L-a-metil Ieucina Mleu L-a-metil Iisina Mlys L-a-metil metionina Mmet L-a-metil nora Ieucina Mnle L-a-metil nora valina Mnva L-a-metil ornitna morn L-a-metil-fenil alanina Mphe L-a-metil prolina Mpro L-a-metil serina Mser L-a-metil treonina Mthr L-a-metil valina Mtrp L-a-metil tirosina Mtyr L-a-metil Ieucina Mval Nnbhm L-N-metil-homofenil-alanina Nmhphe N-(N-(2,2-difenil-etil) N-(N-(3,3-difenil propil) carbamil-metil-glicina Nnbhm carbamil-metil(l) glicina Nnbhe 1 -carboxi-1 -(2,2-diferil etil amino)ciclo Nmbe propano Os peptídeos com afinidade melhorada para uma metaloprotease de interesse ou atividade biológica aumentada podem ser gerados por métodos bem conhecidos na arte, incluindo phage display e biologia computacional.

Os peptídeos da presente invenção podem ser sintetizados mediante quaisquer técnicas que sejam conhecidas pelos doutos na arte da sintese de peptídeos. Para a síntese de peptídeos de fase sólida, um 10 sumário das muitas técnicas pode ser encontrado em: Stewart, J. M. and Young, J. D. (1963), "Solid Phase Peptide Synthesis" - "Síntese de Peptídeos de Fase Sólida" -, W. H. Freeman Co. (San Francisco); e Meienhofer, J (1973). "Hormonal Proteins and Peptides" - "Proteínas hormonais e 15 Peptídeos" -, vol. 2, p. 46, Academic Press (New York). Para uma revisão de síntese de solução clássica, veja Schroder, G. e Lupke, K. (1965). The Peptides - Os Peptídeos vol. I, Academic Press (New York). Para técnicas recombinantes, veja as referências mais abaixo.

As seqüências ácidas que

codificam as seqüências de polipeptídeos descritas acima também são contempladas (veja SEQ ID Nos. 13, 14, 15, 16, 17, e 18) .

Conforme mencionado acima, um uso específico para os anticorpos da presente invenção é a prevenção ou tratamento de doenças associadas à atividade desequilibrada ou anormal de metaloproteínas tais como as metaloproteases. Exemplos de tal doença incluem, mas não de forma limitante, doenças artríticas, tais como osteoartrite (AO), artrite reumatóide (AR) , artrite séptica, reumatismo de tecidos moles, policondrite e tendinite; tumores metastáticos, doenças periodontais; ulceração corneana, tal como a induzida por álcalis ou outras queimaduras, por radiação, por deficiência de vitamina E ou retinóide; doenças glomerulares, tais como proteinúria, epidermólise bolhosa distrófica; doenças de reabsorção óssea, tais como osteoporose, doença de Paget, hiperparatiroidismo e colesteatoma; controle da natalidade através da prevenção da ovulação ou implantação, angiogênese relativa a crescimento tumoral ou à neovascularização associada com retinopatia diabética e degeneração macular; trombose coronária associada à ruptura de placa aterosclerótica; enfisema pulmonar, cicatrização e infecção por HIV.

Conforme ilustrado no Exemplo 10, os presentes inventores demonstraram que os anticorpos da presente invenção podem ser usados para tratar uma doença de intestinos irritáveis.

As doenças inflamatórias dos intestinos (IBD) são distúrbios gastro intestinais severos caracterizados pela inflamação intestinal e remodelagem dos tecidos, que aumenta em frequência e pode se revelar desabilitante para o paciente. As principais formas de IBD, colite ulcerativa (UC) e doenças de Crohn são distúrbios crônicos, recidivos, que são clinicamente caracterizados por dor abdominal, diarréia, sangramento retal e febre.

Assim, conforme um outro aspecto da presente invenção, fica disponibilizado um método para se inibir a atividade da metaloprotease de matriz em um sujeito com tal carência.

Os sujeitos individuais

preferidos, de acordo com a presente invenção, são animais tais quais os mamíferos (por ex,, cães, felinos, ovinos, porcinos, eqüinos, bovinos, primatas), de preferência, humanos.

0 método compreende

proporcionar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente efetiva do inibidor de MMP da presente invenção (por ex., o anticorpo ou fragmentos de anticorpo, descritos acima).

Conforme detalhado abaixo, o inibidor de MMP pode ser proporcionado mediante administração direta (por ex. , administração oral ou injeção) ou pode ser expressado a partir de um construto de polinucleotídeo administrado para atacar as células do indivíduo.

Os inibidores de MMP da presente invenção podem ser proporcionados a um indivíduo per se, ou como parte de uma composição farmacêutica, onde esteja misturado a um veículo farmaceuticamente aceitável.

Conforme usado aqui, o termo "composição farmacêutica" se refere a um preparado de um ou mais princípios ativos descritos aqui junto com outros componentes químicos, tais como veículos fisiologicamente adequados e excipientes. O propósito de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto em um organismo.

Aqui, o termo "princípio ativo" se refere ao preparado de anticorpos, o qual é responsável pelo efeito biológico.

Mais adiante, as frases "veículo fisiologicamente aceitável" e "veículo farmaceuticamente aceitável", as quais podem ser usadas alternadamente, s referem a um veículo ou a um diluente que não cause irritação significativa em um organismo e não abrogue a atividade biológica e as propriedades do composto administrado. Está incluído um adjuvante sob estas frases. Um dos ingredientes incluídos no veículo farmaceuticamente aceitável pode ser, pro exemplo, polietileno glicol (PEG) , um polímero biocompatível com amplo espectro de solubilidade tanto em meios orgânicos como aquosos (Mutter et al. (1979) ) .

Aqui, o termo "excipiente" se refere a uma substância inerte acrescentada a uma composição farmacêutica para facilitar a administração de um princípio ativo ainda mais. Os exemplos sem limitação, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicóis.

As técnicas para formulação e administração de drogas podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences" - "A Ciência Farmacêutica de Remington" Mack Publishing Co., Easton, PA, edição mais recente, a qual está incorporada aqui por referência.

As vias de administração adequadas podem incluir, por exemplo, a oral, retal, transmucosal, especialmente transnasal, administração intestinal ou parenteral, inclusive injeções

intramusculares, subcutâneas e intramedulares, bem como injeções intratecais, intraventriculares diretas,

intravenosas, intraperitoneais, intranasais ou intraoculares.

Alternativamente, pode-se

administrar o preparado diretamente em uma região específica, ao invés de maneira sistêmica, por exemplo, via injeção do preparado diretamente em uma região específica do corpo do paciente.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser manufaturadas por processos bem conhecidos na arte, por ex. , por meio dos processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, produção de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulamento, aprisionamento ou Iiofilização.

As composições farmacêuticas para uso em conformidade com a presente invenção podem ser formuladas de maneira convencional, usando-se um ou mais de um veículo fisiologicamente aceitável, compreendendo excipientes e auxiliares, os quais facilitem o processamento dos princípios ativos em preparados que possam ser utilizados farmaceuticamente. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida.

Para injeção, os princípios ativos as invenção podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência, em reguladores de pH fisiologicamente compatíveis, tais como a solução de Hank, a solução de Ringer ou regulador de sal fisiológico. Para a administração transmucosal, os penetrantes adequados à barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na arte.

Para administração oral, os compostos podem ser formulados prontamente mediante a recombinação dos compostos ativos com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na arte. Tais veículos permitem que os compostos da invenção sejam formulados em tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e afins, para ingestão oral pelo paciente. Preparados farmacológicos para uso oral podem ser feitos usando-se um excipiente sólido, moendo-se - opcionalmente - a mistura resultante e processando-se a mistura de grânulos, depois de se acrescentar os auxiliares adequados caso desejado, para se obter os núcleos de tabletes ou drágeas. Os excipientes adequados são, em particular, avolumantes tais como açúcares, inclusive lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparados de celulose, tais como, por exemplo, maisena, amido de trigo, de arroz, de batata, gelatina, goma tragacante, metil celulose, hidroxipropil metil-celulose, carbometi1-celulose de sódio; e/ ou polímeros fisiologicamente aceitáveis, quais sejam polivinil pirrolidona (PVP). Se desejado, pode-se acrescentar agentes desintegrantes, tais como polivinil pirrolidona ligada-X, ágar, ou ácido algínico ou um sal derivado, tal como alginato de sódio.

Os núcleos de drágea são proporcionados com revestimentos adequados. Com este propósito, podem ser usadas soluções concentradas de açúcares que podem conter, opcionalmente, goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietileno glicol, dióxido de titânio, soluções de laca e solvente orgânicos adequados ou misturas de solventes. Colorantes ou pigmentos podem ser acrescentados aos revestimentos dos tabletes ou drágeas para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doseamento do composto ativo.

As composições farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas de duas peças feitas de gelatina, bem como cápsulas seladas, moles, feitas de gelatina e um piasticizador, tal como glicerol ou sorbitol. AS cápsulas de duas peças podem conter os princípios ativos misturados a um avolumante, tal como lactose, ligantes tais como amidos, lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Nas cápsulas moles, os princípios ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Ademais, podem ser acrescentados estabilizantes. Todas as formulações para administração oral devem vir em doseamento adequado à via de administração escolhida.

Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de tabletes ou pastilhas formulados de maneira convencional.

Para administração por

inalação nasal, os princípios ativos para isso em conformidade com a presente invenção são disponibilizados convenientemente na forma de apresentação em spray aerossol a partir de um invólucro pressurizado ou um nebulizador com o uso de um propelente adequado, por ex., biclorobifluorometano, triclorofluorometano, bicloro

tetrafluorometano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de doseamento pode ser determinada providenciando-se uma válvula que libere uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por ex., gelatina para uso em um dispenser podem ser formulados contendo uma mistura em pó e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

Os preparados descritos aqui podem ser formulados para administração parenteral, por ex., por injeção única ou infusão contínua. As formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de doseamento unitário, por ex., em ampolas ou em invólucros de múltiplas doses com a adição opcional de um conservante. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou líquidos, e podem conter agentes formulatórios tais como suspensores, estabilizadores e/ ou dispersantes.

As composições farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas do preparado ativo na forma solúvel em água. De forma adicional, as suspensões dos princípios ativos podem ser preparadas na forma de suspensões para injeção baseadas em água ou óleo. Os solventes lipofílicos adequados ou veículos incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos, tais como etil oleato, triglicérides ou lipossomos. As suspensões aquosas de injeção podem conter substâncias que aumentem a viscosidade da suspensão, tais como carboxi-metil celulose, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores adequados ou agentes que aumentem a solubílidade dos princípios ativos para permitir o preparo de soluções altamente concentradas.

Alternativamente, o princípio ativo pode vir na forma em pó para constituição, antes do uso, com um veículo adequado, por ex., uma solução em base de água estéril, livre de pirogênios.

O preparado da presente invenção também pode ser formulado para composições retais, tais como supositórios ou enemas de retenção, usando-se, por ex., bases de supositórios convencionais tais como manteiga de cacau ou demais glícerídeos.

As composições farmacêuticas adequadas para uso no contexto da presente invenção incluem compostos em que os princípios ativos estão contidos em quantidade suficiente para se alcançar o propósito almejado. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente efetiva significa uma quantidade de princípios ativos efetiva para prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas de doença ou prolongar a vida do paciente sob tratamento.

A determinação de uma quantidade terapeuticamente efetiva encontra-se bem dentro da capacidade dos doutos na arte.

Para quaisquer preparados usados nos métodos da invenção, a quantidade ou dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada, inicialmente, a partir de ensaios ín vítro. Por exemplo, uma dose pode sr formulada em modelos animais e tal informação pode se utilizada para se determinar, mais precisamente, as doses úteis em humanos.

A eficácia terapêutica e toxicidade dos princípios ativos descritos aqui podem ser determinadas mediante procedimentos farmacêutico padrão in vítro, em culturas de células ou animais experimentais. Os dados obtidos a partir destes ensaios in vitro e de cultura de células e de estudos animais podem ser usados na formulação de um espectro de doseamento para uso em humanos. 0 doseamento pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual em vista das condições do paciente. [Veja, por ex., Fingl et al. , (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics" - "A Base Farmacológica da Terapêutica" -Cap. I p. 1].

Dependendo da severidade e da resposta do distúrbio a ser tratado, o doseamento pode ser de uma única ou de uma pluralidade de administrações, com o curso de tratamento durando desde vários dias até várias semanas, ou ate que a cura seja levada a efeito ou a diminuição do estado da doença seja alcançada.

A quantidade de uma composição a ser administrada será dependente, claro, do sujeito sob tratamento, da severidade da aflição, da forma de administração, do julgamento do médico atendente, etc.

As composições que incluam o preparo da presente invenção formulada em um veículo farmaceuticamente compatível também podem ser preparadas, acondicíonadas em um invólucro apropriado e rotuladas para o tratamento de uma condição indicada.

Caso desejado, as composições da presente invenção podem ser apresentadas em um instrumento de embalagem ou dispenser, qual seja um kit aprovado pelo FDA, o qual pode conter uma ou mais unidades de formas de dosagem contendo o princípio ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender folha de plástico ou metal, tal como embalagem blíster. 0 instrumento de embalagem ou dispenser pode vir acompanhado pelas instruções de administração. A embalagem ou dispenser também pode incluir um aviso associado à embalagem, em uma forma indicada por uma agência governamental reguladora da fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, em que tal aviso reflita a aprovação, por parte da agência, da forma das composições ou da administração humana ou veterinária. Tal aviso, por exemplo, pode ser de rotulação aprovada pela U.S. Food and Drug Administration (Agência Americana para Alimentos e Fármacos) para remédios controlados ou de uma inserção aprovada de produto.

Conforme descrito acima, os inibidores de anticorpos da presente invenção podem ser expressados a partir de um construto de ácido nucléico.

Será apreciado que os polinucleotídeos que codifiquem os anticorpos da presente invenção codifiquem ademais, de preferência, um sinal de peptídeo que permita a secreção ou trânsito de anticorpos até uma localização sub-celular ou extracelular de interesse. Por exemplo, quando a metaloproteína alvo for uma MMP, um peptídeo de sinal secretor estará conjugado, de preferência, dentro da estrutura do polinucleotídeo que codifica o segmento do anticorpo.

Será apreciado,, ademais, que fragmentos de Fv recombinante de cadeia única (ScFv) sejam expressados de preferência, devido a sua estrutura consideravelmente menos complicada - quando comparada às moléculas de anticorpos inteiros. Conforme descrito acima, as ScFvs são proteínas que consistem de cadeias de polipeptídeos de anticorpos VH e VL sintetizados como uma cadeia única com a extremidade carboxila de VL ligada por uma ponte de peptídeo á extremidade de VH. Os métodos para se produzir estes peptídeos de forma recombinante são bem conhecidos na arte [veja Bird et al. Science -Ciência - 242: 423-426 (1988)/ Houston et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 85: 879-5883 (1988); e Kruif et al . , J.Mol. Biol. 248: 97- 105 (1995)]. Em conformidade com as configurações deste aspecto da presente invenção, após a imunização com os compostos da presente invenção, mRNA esplênico é colhido no animal imunizado e usado para produzir uma biblioteca cDNA em um bacterióf ago, o qual possui os fragmentos ScFv. As partículas de fago são isoladas, então, para se determinar quais interagem especificamente e, de preferência, com a forma ativada da metaloproteína de interesse. Os segmentos de ScFv são recuperados a partir destas partículas de fagos e clonados em um construto de expressão (ver U.S. Pat. No. 5.800. 814) .

Os construtos de ácido nucléico deste aspecto da invenção podem ser administrados para atacarem células do sujeito individual (por ex. , terapia de genes in vivo).

Alternativamente, o construto de ácido nucléico é introduzido numa célula adequada através de um veículo/ método adequado de entrega de gene (transfecção, transdução, recombinação homóloga, etc.) e um sistema de expressão conforme necessário e, em seguida, as células modificadas são expandidas em cultura e devolvidas ao indivíduo (por ex., terapia de gene in vivo).

Para permitir a expressão celular dos anticorpos ou dos fragmentos de anticorpos da presente invenção, o construto de ácido nucléico da presente invenção inclui, ademais, ao menos um elemento regulatório de ação cis. Conforme usada aqui, a frase "um elemento regulatório de ação cis" se refere a uma seqüência de 5 polinucleotideo, provavelmente um promotor, a qual se liga a um regulador de ação trans e regula a transcrição de uma seqüência de codificação localizada ao longo da cadeia ali.

Qualquer promotor disponível pode ser usado pela presente metodologia. Em uma 10 configuração preferida da presente invenção, o promotor usado pelo construto de ácido nucléico da presente invenção é ativo na população de células específicas transformadas. Exemplos de promotores de tipo específico de célula e/ ou de tecido específico incluem promotores tais quais a albumina, 15 que é específica do fígado [Pinkert et al. , (1987) Genes dev. 1: 268-277], promotores específicos da linfóide [Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275]; em particular, os promotores dos receptores das células-T [Winoto et al. , (1989) EMBO J. 8: 729-733] e imunoglobulinas; [Banerji et 20 al . (1983) Cell - Célula - 33: 729-740], promotores específicos de neurônios, tal como o promotor de neurofilamento [Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad, Sei. USA 86: 5473-5477], promotores específicos do pâncreas [Edlunch et al. , (1985) Science -Ciência - 230: 912-916] ou 25 promotores específicos das glândulas mamárias, tais como o promotor do soro do leite (U.S. Pat. No. 4,873,316 e European Application Publication (Publicação de Aplicação Européia) No. 264,166). 0 construto de ácido nucléico da presente invenção pode, ademais, incluir um aumentador, que pode ser adjacente ou distante da seqüência do promotor e pode agir regulando a transcrição daí para cima.

De preferência, os construtos da presente metodologia incluem, ademais, um marcador selecionável adequado e/ ou uma origem de replicação. De preferência, o construto utilizado é um vetor de transporte, o qual pode propagar tanto em E. coli (onde o construto compreende um marcador selecionável adequado e/ uma origem de replicação) e ser compatível para propagação em células, ou integração em um gene ou tecido de escolha. 0 construto, em conformidade com a presente invenção, pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um fagomídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

Atualmente, as técnicas de transferência de ácido nucléico in vivo preferidas incluem transfecção com construtos virais e não virais, tais como adenovírus, lentivírus, vírus Herpes simplex I, ou vírus adeno-associado (AAV) e sistemas baseados em lipídeos. Lipídeos úteis para transferência de gene mediada por lipídeo são, por exemplo, DOTMA, DOPE e DC-CHOL [Tonkinson et al. , Cancer Investigation -Investigação do Câncer - 14 (1): 54-65 (1996)]. Os construtos mais preferidos para uso em terapia de genes são vírus, mais preferivelmente adenovírus, AAV, lentivírus o retrovírus. Um construto viral, qual seja um construto retroviral, inclui ao menos um elemento transcricional promotor/ aumentador ou definidor de lócus, ou demais elementos que controlam a expressão genética através de outros meios, tais como divisão alternada, exportação de RNA nuclear, ou modificação póstranslacional de mensageiro. Tais construtos vetores incluem um sinal de empacotamento, repetições terminais longas (LTRs) ou porções derivadas, e locais de ligação de cadeias primárias positivas e negativas adequados ao vírus usado, a menos que já estejam presentes no construto viral. Ademais, tal construto inclui, tipicamente, uma seqüência de sinal par aa secreção do peptídeo ou anticorpo a partir de uma célula hospedeira na qual esteja colocado. De preferência, a seqüência de sinal para este fim é uma seqüência de sinal mamária. Opcionalmente, o construto também pode incluir um sinal de conduza a poliadenilação, nem como um ou mais de um local de restrição e seqüência de terminação da translação. Como forma de exemplo, tais construtos incluem, tipicamente, LTR5', um local de ligação tRNA, um sinal de empacotamento, uma síntese de segunda cadeia de DNA e 3' LTR ou uma porção derivada. Outros vetores não virais podem ser usados, tais como lipídeos catiônicos, poli-lisina e dendrímeros.

Os modos preferidos para se executar os protocolos de terapia genética são fornecidos em Somia e Verma [(2000) Nature Reviews - Revisões de Natureza 1: 91-99], Isner (2002) Terapia genética miocárdica. Nature - Natureza - 415: 234-239; High (2001) Gene Therapy: a 2001 perspective - Terapia Genética: uma perspectiva de 2001. Haemophilia - Hemofilia - 7: 23-27; e Hammond e McKirnan (2001) Angiogenic gene therapy for heart disease: a review of animal studies and clinicai trials - Terapia genética angiogênica para doença do coração: uma revisão de estudos animais e estudos clínicos 49: 561-567.

Devido à habilidade dos anticorpos da presente invenção em reconhecer di ferencialmente a forma ativada de metaloproteína (ver Exemplo 3 da seção de Exemplos), eles podem ser usados como poderosas ferramentas diagnosticas e prognósticas, tais como pelo monitoramento da atividade de MMP em uma amostra biológica [por ex. , qualquer amostra do corpo, tal qual sangue (soro ou plasma), cuspe, fluídos de ascitas, efusões pleurais, urina, espécimes de biópsia, células isoladas e/ ou preparado de membrana celular]. Isto é de significância especial ao se avaliar as características metastáticas de células de câncer, onde a ativação desequilibrada das MMPs facilita a invasão tumoral. De forma semelhante, os anticorpos da presente invenção podem ser usados no monitoramento terapêutico de dosagem de inibidores de MMP. Para tais aplicações, os anticorpos da presente invenção são rotulados, de preferência, com cada uma de qualquer das placas ou rótulos radioativos, fluorescentes, biológicos ou enzimáticos de uso padrão na arte. As atentes norteamericanas relativas ao uso de tais rótulos incluem a U.S. pat. No. 3.817.837; 3.850.752; 3.996.345; 4.277.437;

4.275.149 e 4.366.241 .

Será apreciado que tais métodos de detecção também possam ser usados para a identificação em larga escala de novas MMPs. Em resumo, múltiplas amostras biológicas podem ser postas em contato com os anticorpos da presente invenção, com os quais as MMPs ativadas podem se ligar. As medidas são tomadas para usar amostras biológicas, as quase incluem MMPs ativadas, tais como as derivadas de linhas celulares derivadas de tumores. Tipicamente, uma etiqueta radioativa é usada para reduzir o volume do ensaio.

Alternativamente, os

anticorpos da presente invenção podem ser usados para purificar as metaloenzimas ativas a partir de amostras biológicas.

Vários métodos de purificação de proteínas são conhecidos na arte. Por exemplo, os anticorpos ou fragmentos de anticorpos da presente invenção podem ser usados em cromatografia de afinidade para isolar as metaloenzimas. Podem se preparar colunas onde os anticorpos estejam ligados a um substrato sólido, pro ex. , partículas, tais como a agarose, Sephadex e afins, e a amostra biológica, tal como um lisado celular podem ser passadas através da coluna, sendo a coluna lavada, seguida de concentrações cada vez maiores de um leve denaturante, onde a metaloenzima purificada será liberada.

Os anticorpos ou fragmentos derivados gerados de acordo com os ensinamentos da presente invenção podem ser incluídos em um kit terapêutico ou diagnóstico. Os anticorpos fragmentos de anticorpos podem ser empacotados em um ou mais receptáculos com reguladores de pH e conservantes adequados e usados para diagnóstico ou para se direcionar tratamento terapêutico. Assim, os anticorpos ou fragmentos derivados pode ser, cada qual, misturados em um único invólucro ou dispostos em invólucros individuais. De preferência, os invólucros incluem uma etiqueta. Invólucros adequados incluem, pro exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os invólucros podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico.

Ademais, podem ser

acrescentados outros aditivos, tais como estabilizantes, reguladores de pH, bloqueadores e afins. Os anticorpos de tais kits também podem estar presos a um suporte sólido, tais como contas, substrato de varredura (por ex. , chips) e afins, usados com fins diagnósticos. O kit também pode incluir instruções para se determinar se o sujeito examinado está sofrendo de, ou tem risco de desenvolver uma condição, desordem ou enfermidade associada à expressão da MMP de interesse.

Objetos adicionais, vantagens, e novas características da presente invenção tornar-se-ão aparentes àqueles de habilidade mediana na arte, após o exame dos seguintes exemplos, os quais não se pretende que sejam limitantes. Adicionalmente, cada uma das várias configurações e aspectos da presente invenção, conforme delineados acima, e reivindicados na seção de reivindicações abaixo, encontra suporte experimental nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS

Faz-se, aqui, uma referência aos seguintes modelos, os quais, juntamente com as descrições acima, ilustram a invenção de maneira não limitante.

Em geral, a nomenclatura usada aqui e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas de DNA recombinante, microbiológicas, bioquímicas, e moleculares. Tais técnicas são explicadas em detalhe na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" - "Clonagem Molecular: Um Manual de Laboratório" - Sambrook et al (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" "Protocolos Atuais em Biologia Molecular" - Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al . , "Current Protocols in Molecular Biology" - "Protocolos Atuais em Biologia Molecular", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" - "Um Guia Prático à Clonagem Molecular" - John Wiley and Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA" - "DNA Recombinante" -, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genoma Analysis: A Laboratory Manual Series" - Análise de Genoma: Uma Série de Manuais Laboratoriais" - Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); as metodologias conforme descritas em U.S. Pat. Nos. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook"

"Biologia Celular: Um Guia Laboratorial" - Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology"

- "Protocolos Atuais em Imunologia" - Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinicai Immunology" - "Imunologia Clinica e Básica" - (8a. Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology" - "Métodos 5 Selecionados em Imunologia Celular", W. H. Freeman and Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são descritos extensivamente na literatura científica e de patentes, veja, por exemplo, U.S. Pat. Nos. 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.57 8; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.2 62; 3.901.654; 10 3.935.074; 3.894.074; 3.984.533; 3.966.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771; e 5.281.521;

"Oligonucleotide Synthesis" -"Síntese de Oligonucleotídeos"

- Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" "Hibridização de Ácido Nucléico" - Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation"

"Transcrição e Translação" - Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" - "Cultura de Células Animais" - IRL Press. (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" - "Um Guia Prático à Clonagem Molecular" 20 - Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" - "Métodos em Enzimologia" - Vol. 1 - 317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications" - "Protocolos PCR: Um Guia aos Métodos e Aplicações" -, Academic Press, san Diego, CA (1990); Marshak et al. , "Strategies for Protein 25 Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" - "Estratégias para Caracterização e Purificação de Proteínas - Um Manual de Curso laboratorial" - CSHL Press (1996); todos os quais estão incorporados aqui por referência em sua integra, adiante. Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento. Crê-se que os procedimentos contidos ali sejam bem conhecidos na arte e são fornecidos para a conveniência do leitor. Toda informação contida ali é incorporada, neste, para referência.

Materiais e Métodos

Enzimas Recombinantes - 0 domínio catalítico de MMP-2 (aminoácidos 110- 467 do Acesso ao GenBank No. NP_032636.1) foi expresso sob o promotor T7 nas células BL-21. As células foram induzidas com 1 mM de isopropil-B-D-tio galacto-piranosídeo por 5 horas. A massa da célula foi re-suspensa em 50 mM de Tris, pH de 8,0; 0,5 mM de EDTA, 50 mM de NaCl, 5% de glicerol e 1% de Triton X100 a uma razão de 1:25 do regulador de pH para o volume de cultura original. A suspensão foi centrifugada por 10 minutos a 15.000 rpm, e a massa foi dissolvida em 50 mM Tris, pH 8,0; 0,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% glicerol e 0,2% Sarcosil seguidos de incubação no gelo por 30 minutos. A fração sobrenadante foi carregada em uma coluna de 5 ml de gelatina-Sefarose (pré-empacotada, Amersham Biosciences), pré-equilibrada e lavada com regulador de diálise (50 mM Tris, pH 8,0; 50 mM NaCl, 5 mM CaC12, 10 μΜ ZnC12, 0,02% Brij) . A proteína foi eludida com 50 mM Tris, pH 8,0; I M NaCl; 5 nM CaC12, 10 μΜ ZnCl2, 0,02% Bri j , e 15% Me2S0 [Rosen, O., inhíbition of MMPs by Monoclonal Antibodies. Inibição de MMPs por Anticorpos Monoclonais -. 2001] e analisados usando SDS-PAGE, e sua atividade catalítica foi medida pela degradação do peptídeo fluorogênico [Knight, C. G., F. Willenbrock, e G. Murphy, A novel coumarin-labelled peptide for sensitive continuous assays of the matrix metalloproteinases - Um novo peptídeo marcado com cumarina para análises sensíveis e contínuas das metaloproteinases de matriz FEBS Lett, 1992. 296 (3): p. 263-6].

Pro-MMP-9 [sem a região de dobra e o domínio hemopexina, precursor Alal-Gly424 |P14780|MMP-9_metaloproteinase-9 de matriz HUMANA (MMP-9) (EC 3.4.24.35)] foi expressa em Escherichia coli ER 2566 em um vetor da expressão pTWIN e foi purificado até a homogeneidade a partir da inclusão de corpos conforme descrito anteriormente [Bjorklund, M., P. Heikkila e E. Koivunen, Peptide inhibition of catalytic and noncatalytic activities of matrix proteinase-9 blocks tumor cell migration and invasion. (A inibição do peptídeo das atividades catalíticas e não catalíticas da metaloproteinase-9 de matriz bloqueia a migração e invasão de células de tumor. J. Biol Chem, 2004. 279 (28): p. 29589- 97] . A Pró-MMP-9 foi ativada com 1 mM de acetato paminofenil mercúrico (ΑΡΜΑ, ICN Biomedicals Inc., Ohio, USA), dissolvida em 200 mM Tris, por 30 min a 31° C.

A pro-MMP-2 e pro-MMP-9 recombinante humana foram expressas em células HeLa S3 infectadas com os correspondentes vírus recombinantes de vacínia e purificados até a homogeneidade conforme descrito anteriormente [ Olson, M. W., Gervasi, D. C., Mobashery, S., e Fridman, R. (1977) J. biol. Chem. 272, 29975-29983; Fridman, R., Fuerst, T. R., Bird, R.E., Hoyhtya, M., Oelkuct, T. M., Kraus, S. Komarek, D. Liotta, L. A., Berman, M. L.; e Stetler-Stevenson, W.G. (1992) J. Biol. Chem. 267, 15398-15405] .

Tetra-carboxi fenil porfirina Co (II)/Zn (II) (CoTCPP/ZnTCPP) - 0 ZnTCPP foi sintetizado pela reação de ZnC12, e TCPP em Ν,Ν-dimetil formamida (DMF) conforme descrito [Harada, A. et al. , Control of Photoinduced electron transfer from zinc-porphyrin to methyl viologen by supramolecular formation between monoclonal antibody and zinc-porphirin. Controle da transferência fotoinduzida de elétrons a partir de zinco-porfirina para metil viologênio pela formação supramolecular entre o anticorpo monoclonal e a zinco-porfirina. Photochem Photobiol, 1999, 70 (3): p. 298 - 302]. A CoTCPP foi sintetizada pela reação de Co (OAC) 2 * 4H20 e TCPP em DMF conforme descrito [Harada, A. et al., Control of Photoinduced electron transfer from zinc-porphyrin to methyl viologen by supra molecular formation between monoclonal antibody and zinc-porphirin. Controle da transferência fotoinduzida de elétrons a partir de zinco-porfirina para metil viologênio pela formação supramolecular entre o anticorpo monoclonal e a zinco-porfirina. Photochem Photobiol, 1999, 70 (3): p. 298 - 302] e purificada.

Sintese de Imisdp - Descrita no Exemplo 7 abaixo.

Conjugação de hapteno em proteína - Os haptenos (4 mg) foram ativados para conjugação acrescentando-se 1,1'-carboni-di-imidazol em DMF (a uma proporção molar de 1:1) e incubação por 1 hora. De um a 50 μπιοΐεε de hapteno ativado foram acrescentados a 20mg/mL de BSA ou hemocianina de keyhole limpet (KLH) em 0, IM de carbonato regulador pH 8. A solução foi misturada à temperatura ambiente por 3 horas e, então, extensivamente dialisada para retirar PBS.

Imunização e fusão - Cada adjuvante (KLH) conjugado CoTCPP, ZnTCPP ou Imisdp foi usado para imunizar camundongos BALB/c. A imunização e subsequente fusão com a linha celular do mieloma NSO foi levada a cabo de acordo com procedimentos padrão [ Harlow, E., e Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual Portable Protocol Usando Anticorpos: Um Protocolo Portátil do Manual Laboratorial - No. I. 1998].

Identificação de anticorpos

ELISA - Foram examinados os sobrenadantes dos hibridomas em crescimento em busca de anticorpos reativos com ZnTCPP, CoTCPP ou Imisdp usando ELISA direto, no qual o respectivo hapteno -BSA (3μ/ιη1 em PBS) foi revestido em placas Nunc maxisorp. 0 revestimento foi realizado a 4° C ao longo de uma noite e a incubação com os anticorpos a 20° C por 1 hora. Foi usado mAb anticamundongo HRP-conjugado (Sigma) como o anticorpo secundário e o ácido 2,2'-azino-bis (3-etil-benzil tiazolina-6- sulfônico, ABTS, Sigma) foi usado como substrato. PBS contendo 0,005% v/ v Tween 20 (PBST) foi usado como reagente de lavagem. 0 regulador de diluição foi PBS. Foi gravado Ag02 por leitora de microplaca em espectrômetro SPECTRAFluor Plus (Tecan, Áustria). Como controle, os sobrenadantes foram incubados com placas revestidas em BSA, da mesma forma. Os valores de absorção acima de 0,5 de densidade milióptica foram considerados positivos.

ELISA Competitivo - Diluições

diferentes de hibridoma sobrenadante foram incubadas com placas revestidas de hapteno-BSA em seguida aos passos descritos anteriormente. A curva de titulação foi traçada e a diluição do título foi determinada em 50% da ligação. Os 10 sobrenadantes diluídos na concentração do título foram préincubados com ZnTCPP solúvel, CoTCPP ou compostos de Imisdp por 30 minutos e, a seguir, transferidos para placas de microtitulação revestidas em hapteno conforme os passos descritos anteriormente. A dissociação estimada constante 15 foi a concentração do hapteno solúvel requerida para se alcançar 50% de ligação.

Produção e Purificação - Os hibridomas selecionados foram sub-clonados duas vezes por diluições limitadas, seguidos de uma produção em larga 20 escala por tumores de ascita preparados com (2, 6, 10, 14 tetrametil pentadecano) prístino injetado em camundongos BALB/c. Os mAb foram purificados pela cromatografia de afinidade na proteína G Sefarose 4 com Fast Flow (Amersham Biosciences). As ascitas foram centrifugadas a 12.OOOg pro 25 15 min para remover as partículas insolúveis e lipídios. 0 ImL de ascitas foi diluído em volume cinco vezes maior com PBS e, em seguida, carregado no volume da coluna de 5mL de proteína G Sefarose. 0 pico de eluição foi analisado por SDS-PAGE.

Determinação de Isotipo - A cultura de sobrenadantes obtida a partir de hibridomas clonados nos tubos de cultura foi usada como fonte de mAb. Cada anticorpo foi isotipado por um Kit de Isotipamento de Anticorpos Monoclonais de Camundongos (Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit, HyCult biotechnology b.v., Holanda).

Análise do imunoblot dos anticorpos purificados - Os anticorpos purificados foram separados em gel SDS-poli-acrilamida 8%, transferidos a membranas NC (Bio-Rad) e, em seguida, submetidos a análise do imunoblot utilizando-se anticorpo anti MMP-9 (Sigma). O IgG anti camundongo de cabra conjugado com peroxidase de raiz-forte (Armoracia rusticana) (Sigma) foi usado como anticorpo secundário. Os sinais forma detectados usando-se ECL (Pierce).

Análise de ligação mediante proteínas purificadas - Os mAbs (IOg) foram incubados com contas de IgG Agarose anti camundongo (Sigma) por uma noite a 4 °C, em PBS. Após a lavagem de anticorpos não direcionados, Pro-MMP-2, Pro-MMP-9 domínio catalítico MMP-2, domínio catalítico MTl purificados ou TACE (2g), foram acrescentados seguindo-se 2 horas de incubação em RT. As contas foram coletadas por centrifugação e lavadas três vezes com PBS. As proteínas que restaram presas às contas foram eluídas com regulador de amostra SDS, fracionadas por SDS-PAGE e detectadas por tintura com azul de Coomassie. Imunoprecipitação e Western Blot - As células HT1080 foram semeadas em placas de petri. Após alcançar 80% de confluência, o meio (DMEM suplementado com FCS 10%, aminoácidos não essenciais, penicilina, estreptomicina, piruvato de sódio e L-glutamina) foi mudado para um meio isento de soro (sem FCS) . Após outras 24 horas de incubação, foi feita a colheita de células aderentes do meio condicionado (CM) que foi, em seguida, concentrado usando-se Millipore Centricon-10 (Bedford, MA). Os sobrenadantes concentrados foram usados para

imunoprecipitações. 0 CM foi incubado com anti-1 (CoTCPP) mAb (15pg/ml) por uma noite a 4°C. Foi acrescentada Proteína A Sefarose (CL-4B Amersham Biosciences) às amostras e misturadas por 2 horas em RT. As contas foram lavadas 3 vezes com PBS, suspensas em regulador de amostras SDS e aquecidas a 95°C por 3 min. Os imunoprecipi tados foram recuperados por centrifugação e submetidos a SDS/PAGE. Após a separação, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (NC) e sondadas com anticorpo anti MMP-2.

Para ativar a Pro-MMP-2 produzida pelas células HT1080, foi acrescentado InM de acetato mercúrico 4-aminofenil (APMA) ao CM concentrado seguido por 6 horas de incubação a 37 C. Após a ativação, o CM foi dialisado (3 vezes) contra PBS a 4°C, para se remover ο ΑΡΜΑ. A imunoprecipitação com o meio ativado foi levada a cabo conforme descrito acima.

Ligação com MMP-9 ativa usando ELISA direto - 0 domínio catalítico MMP-9 (2yg/ml) foi imobilizado em poços de microtitulação. Os mAbs (lmg/ml) foram acrescentados aos poços segundo o mesmo procedimento conforme descrito para a análise de ELISA. 0 anticorpo anti MMP-9 (Sigma) serviu como controle positivo e IgG de 5 afinidade não relacionado, purificado a partir de ascitas, serviu de controle negativo.

Análise Cinética - A atividade enzimática da MMPs foi medida conforme descrito anteriormente [Solomon, A., et al. , Pronounced diversity in electronic and chemical properties between the catalytic zinc sites of tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme and matrix metalloproteinases despite their high structural similarity - Diversidade acentuada entre as propriedades eletrônicas e químicas dos locais de zinco catalítico da enzima conversora do fator alfa de necrose tumoral e das metaloproteinases de matriz apesar de sua elevada semelhança estrutural. J. Biol Chem, 2004. 279 (30) : p. 31646-54] . A atividade de MMP-9, MMP-2 e MTl-MMP foi medida pelo monitoramento da degradação do peptídeo fluorogênico McaPro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2 at Aex = 340 nm e Aem - 390 nm conforme descrito por Knight et al. [FEBS Lett, 1992. 296

(3) : p. 263-6] comprado de Calbiochem-Novabiochem AG. A mistura de análise padrão continha 50 nM de regulador Tris, pH de 7,5; 200 nM de NaCl, e nM de CaCl2, 20 μΜ de ZnCl2, e 25 0,05% de Brij . A atividade enzimática de TACE foi medida pelo monitoramento da degradação do peptídeo fluorogênico QF-45 (Mca-Ser-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-ArgLys (dinitrofenil)-NH2) comprado de Calbiochem-Novabiochem AG.

Zimografia in situ - Para localizar a atividade gelatinolítica neta das MMPs mediante zimografia in situ, foi utilizada, como substrato para 5 degradação pelas gelatinases, a gelatina DQ marcada com fluoresceína isotiocianato, a qual é intramolecularmente extinta (Molecular Probes). A proteólise pelas gelatinases produz peptídeos de gelatina-fluoresceína isotiocianato e a localização dessa fluorescência indica os locais de 10 atividade gelatinolítica neta. Em resumo, células HT1080 de fibro sarcoma humanas (que produzem MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP) foram dispostas em lâminas de 12 mm, do tipo cover slip. Após 24 h de incubação, a s células foram tratadas com 1 uM de 13E11 mAb, por 30 min a 37° C. Células não tratadas 15 serviram de controle negativo para este experimento. As células foram lavadas com PBS e, em seguida, incubadas com regulador de reação de zimografia (0,05 M Tris-HCL; 0,15 M NaCl; 5 nM CaCl2; e 0,2 mM NaN3, pH 7,6; a alta concentração de azida impediu a gelatina de ser fagocitada e, assim, 20 permitiu que ocorresse a atividade gelatinolítica da superfície celular) contendo 60 ug/ ml de gelatina DQ a 37° C por uma noite. O regulador de zimografia continha 1 uMd e CoTCPP mAb para as células tratadas. Ao final do período de incubação, sem fixação ou lavagens posteriores, a atividade 25 gelatinolítica das MMPs foi localizada e fotografada por microscópio de fluorescência e as imagens adquiridas por câmera digital Spot.

EXEMPLO 1 Mimetismo conformacional do local ativo do zinco por pequenos compostos organometálicos.

0 ion de zinco do local ativo das MMPs é coordenado uniformemente por três resíduos de histidina conservados. Durante a ativação do zimogênio e a proteólise do substrato, a coordenação do zinco varia de coordenação-4, geometria tetraédrica, nos estágios não catalíticos, para coordenação-5, geometria trigonal bipiramidal [Aud, D. S., Zinc coordination sphere in biochemical zinc sites - Esfera de coordenação do zinco em locais de zinco bioquímico. Biometals, 2001. 14 (3-4): p. 271-313] nos estágios catalíticos. As histidinas conservadas podem, portanto, assumir diferentes geometrias com relação ao íon de zinco. Para tirar amostras destas conformações, dois compostos foram selecionados como modelo para o mimetismo do ambiente de zinco: Imisdp e Co/ZnTCPP (Figura 1) . 0 composto Imisdp (a síntese é fornecida no exemplo 7, abaixo) pode mimetizar a geometria da coordenação-4. Neste caso, uma conformação quase tetraédrica é formada pelas três bases de imidazol e a molécula de água como o quarto ligante.

A Figura 2A mostra uma superposição do modelo construído em 3D da molécula de Imisdp com o local catalítico de MMP-9 (PDB 1GKC) [Rowsell, S., et al., Crystal structure of human MMP9 in complex with a reverse hydroxamate inhibitor - A estrutura cristalina da MMP-9 humana em complexo com um inibidor reverso de hidroxamato. J Mol Biol, 2002. 319 (1) : p. 173-81] que foi modificado para representar a geometria tetraédrica dos ligantes de zinco. As modificações incluem a substituição do ligante presente na estrutura de raios-X (um inibidor de hidroxamato) com uma molécula de água e a otimização da enzima completa para um local minimo mediante uma abordagem em multi-níveis QM/MM (veja em materiais e métodos). Há elevada semelhança entre o motivo de zinco histidina calculado na MMP-9 e o Imisdp, em termos de distâncias do εnitrogênio do ion de zinco da Histidina (2,04 + 0,06 e 2,02, respectivamente) e a orientação relativa das três histidinas em direção ao metal. A segunda molécula -Zn/CoTCPP tem quatro bases de imidazol em coordenação com o zinco, ou seu metal análogo, o cobalto, numa conformação co-planar em relação ao ion de metal [Stevens, E. D., Electronic Structure of Metalloporphyrins. A Estrutura Eletrônica das Metaloporfirinas. 1. Experimental Electron Density Distribution of (meso-Tetraphenylporphinato) cobalt (II). J. Am, Chem, S0C, 1981. 103 (17) : p. 5087-5095] . Esta configuração imita a conformação de duas das três histidinas em geometria trigonal bipiramidal de coordenação-5, onde o metal está quase coplanar com as duas histidinas que formam a base da pirâmide. A Figura 2B mostra a estrutura cristalina de MMP-9 (PDB 1GKC), onde o zinco é coordenado por cinco ligantes (dois ligantes adicionais são fornecidos pelo inibidor de hidroxamato), a orientação das duas histidinas na base da pirâmide e suas distâncias do ion de zinco (2.2μ 0,02; 2,03μ 0,04 e 1,95 para MMP-9, ZnTCPP e CoTCPP, respectivamente) são comparáveis à molécula Co/ZnTCPP.

EXEMPLO 2

Geração e seleção de anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais contra CoTCPP, ZnTCPP e Imisdp (Figura 1) foram produzidos mediante a imunização de camundongos e a seleção de anticorpos específicos por um teste de ELISA com o respectivo composto como antígeno revestido. Três anticorpos foram selecionados para estudo extensivo. Notadamente, esses clones foram escolhidos por apresentarem a melhor afinidade em relação a seus respectivos haptenos imunizantes, baseado no exame de ELISA competitivo. Suas constantes de ligação, variando de 0,01 a 0,09 μΜ, (Tabela 3, abaixo), são características de mAbs de alta afinidade. Os mAbs foram propagados como ascitas em camundongos e purificados com contas de proteína G.

Tabela 3 - sumário da análise

do isotipo e da competição de ELISA dos anticorpos monoclonais anti- CoTCPP, ZnTCPP e Imisdp.

Hapteno Imunizante Isotipo do Anticorpo Kd [μΜΙ * Nome CoTCPP lgG2b 0,09 13E11 ZnTCPP lgG2a 0,01 15E12 Imisdp lgG2a 0,09 6C6 * - As afinidades de ligação (Kd) dos anticorpos em relação a seus haptenos imunizantes foram determinadas mediante ELISA competitivo (para detalhes, veja Materiais e Métodos). 2 0 EXEMPLO 3

Anticorpos monoclonais têm reação cruzada com MMP-2 e MMP-9

Para determinar se os mAbs cultivados em compostos sintéticos que mimetizam a conformação de zinco histidina no local catalítico das MMPs, têm reação cruzada com o motivo zinco histidina exposto dentro dos locais ativos de MMP-2 e MMP-9, os anticorpos monoclonais foram analisados, primeiro, para ligação com MMP-9 mediante ELISA direto.

Os três mAbs ligados ao domínio catalítico MMP-9 absorveram diretamente para os poços das placas de microtitulação (anticorpos anti MMP-9 comerciais serviram de controle positivo e IgG não relativo serviu de controle negativo). De maneira interessante, os mAbs que foram propagados como ascitas em camundongos co purificaram com as MMP-9 presentes no fluido de ascitas dos camundongos. A análise de Western blot, apenas dos anticorpos purificados, com anticorpo anti MMP-9 por anticorpo primário, revelou uma clara nada correspondente à massa molecular esperada de cerca de 82 KDa por MMP-9 ativa. Assim, os mAbs formaram um complexo in vivo com a enzima nativa.

Os anticorpos monoclonais foram analisados, em seguida, para ligação com MMP-2 usando análise baseada em Imuno Afinidade (Immuno Affinity). Os anticorpos foram incubados com o domínio catalítico MMP-2 (MMP-2cat) in vitro, seguida da redução com contas de IgG Agarose anti camundongo. Como ilustra a Figura 3 A, todos os mAbs se ligaram a MMP-2cat.

Para estabelecer que a ligação ocorre através de interação direta com o local ativo, os mAbs foram analisados em sua habilidade de se ligarem à ProMMP-2 e Pro-MMP-9. Nas enzimas latentes, a estrutura do domínio pro recobre o vão catalítico. Assim, o bloqueio do local ativo pela estrutura do domínio pro deveria impedir a ligação dos mAbs, desde que reconheçam o motivo zinco histidina dentro do local ativo. Sob as mesmas condições, 5 não se detectou ligação com as pro enzimas (Figura 3 B) . Este modo de ligação com a MMP-2, mas não com a Pro-MMP-2 foi desafiado mais além, em um ambiente de simulação in vivo com toda a extensão de MMP-2 nativos humanos secretados por culturas de células de fibro-sarcoma humano (HT1080). A 10 imunoprecipitação de HT1080 condicionou o meio com anticorpo anti CoTCPP, seguida de análise de Western blot, que revelou a ligação com MMP-2 ativa, mas não com Pro-MMP-2 (Figura 3 C). Estes resultados demonstram que todos os três anticorpos têm reação cruzada com a MMP-2 e MMP-9. a exposição do vão 15 do local ativo é essencial para a ligação do anticorpo, confirmando que os mAbs interagem diretamente com os locais ativos de MMP-2 e MMP-9.

EXEMPLO 4

mAbs Anti CoTCPP e anti Imisdp inibem a MMP-2 e MMP-9 in vitro

Os mAbs anti Imisdp e anti CoTCPP inibiram a atividade proteolítica de MMP-2 e MPP-9 no espectro micromolar 9Figura 5). A análise cinética da inibição de MMPs pelos mAbs foi realizada mediante 25 análise fIuorométrica contínua com um substrato de peptídeo fluorescente neutralizado. De forma surpreendente, o mAb anti ZnTCPP não demonstrou efeito inibidor. Para determinar a natureza da inibição pelo mAb anti CoTCPP, experimentos forma levados a cabo usando-se enzimas na presença - ou na ausência - de mAb com diferentes concentrações de substrato de peptídeo fluorescente. Os dados apresentados num gráfico LineweaverBurk, mostrado nas Figuras 4 A - B são característicos do perfil competitivo de inibição com valores Ki de 13 μΜ e 24 μΜ por MMP-9 e MMP-2, respectivamente. O perfil competitivo de inibição indicou que o mAb se ligava ao mesmo local que o substrato de peptídeo. Este modo de inibição é uma verificação ulterior da interação direta com o local ativo. De forma notável, mAb anti Imisdp apresentou um efeito inibidor dependente de concentração em relação à MMP-2 e MMP-9, assumindo inibição competitiva, os Ki calculados são 5, 8 μΜ e 3 μΜ em direção a MMP-9 e MMP-2, respectivamente (Figura 5) . Umas vez que os mAbs reconhecem o local de ligação de MMP-2 e MMP-9, é exeqüível uma otimização ulterior das complementaridades de interface entre os mAbs e as MMPs, tanto estruturalmente quanto eletrostaticamente, através de métodos de maturação de afinidade (Paul J. Carter Nature Reviews Immun. Vol 6, 2006, 343-357) . O uso desta abordagem pode levar a inibidores altamente específicos, que tirarão vantagem das características de especificidade que se encontram tanto dentro como fora do local ativo.

EXEMPLO 5

Zimografia in situ

Para confirmar a atividade inibidora do mAb anti CoTCPP no nível celular, o efeito do anticorpo foi examinado na atividade gelatinolítica de células HT1080 de fibro-sarcoma humanas que secretam, constitutivamente, Mp-2 e MMP-9 por zimografia in situ. Para localizar a atividade gelatinolítica de MMPs por zimografia in situ, foi usada, como substrato, gelatina marcada com fluoresceína isotiocianato, a qual é intramolecularmente extinta (gelatina DQ). A proteólise pelas gelatinases produz peptídeos cortados de gelatina-fluoresceína isotiocianato e a localização dessa fluorescência indica os locais de atividade gelatinolítica netauu .

Células HT1080 de fibrosarcoma humanas (Figura 7 A) apresentaram uma significativa atividade gelatinolítica de superfície celular. Na presença de 1 μΜ de mAb (Figura 7 B) , a atividade foi reduzida em comparação com o observado nas células controle. Estes resultados demonstram que o mAb anti CoTCPP inibiu a MMP-2 e MMP-9 no nível celular.

EXEMPLO 6

A seletividade dos mAbs da presente invenção

A seletividade do anticorpo foi testada mediante o exame do efeito inibidor e de ligação de mAbs anti CoTCPP e anti Imisdp em relação á MMP-14 (MT1- MMP) e à enzima conversora de TNF-α (TACE) , uma metaloproteinase pertencente à família ADAM relacionada (uma desintegrina e metaloproteinase) (ADAM-17). O efeito inibidor em relação a MTl-MMP e TACE foi examinado mediante análise in vitro da atividade da fluorescência enzimática com os substratos de petídeos adequados. O mAb anti CoTCPP não revelou efeito inibidor em relação a MTl-MMP ou TACE. Para determinar se este se liga à TACE e MTl-MMP sem conseqüente inibição,foram realizados experimentos baseados em imuno afinidade coma s enzimas purificadas e, contudo, não se detectou ligação. Em contraste com o mAb anti CoTCPP, o mAb anti Imisdp inibiu a MT1-MMP, com valor Ki igual a 10 μΜ, mas não apresentou efeito inibidor em relação a TACE. Os resultados estão listados na Tabela 4, abaixo.

Tabela 4

MMP 6C6 (IC50 μΜ) 13E11 (IC50 μΜ) 15E12(IC50 μΜ) MMP-2 3 ±0,2 24 ±1 NI MMP-9 4,5 ±0,2 15 ±0,8 NI MT1-MMP 14,4 ±0,7 NI NI TACE NI NI NI NI, “não inibidor" em concentrações de até A elevada semelhança

estrutural no local ativo existe entre os membros da família MMP e TACE, especificamente, os elementos estruturais tridimensionais vizinhos ao local de ligação do zinco são quase idênticos, devido à necessidade de se acomodar a espinha dorsal do peptídeo dos substratos e à presença do motivo conservado de ligação do zinco EXXHXXGXXH [Solomon, A., et al., Solomon, A., et al., Pronounced diversity in electronic and chemical properties between the catalytic zinc sites of tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme and matrix metalloproteinases despite their high structural similarity - Diversidade acentuada entre as propriedades eletrônicas e químicas dos locais de zinco catalítico da enzima conversora do fator alfa de necrose tumoral e das metaloproteinases de matriz apesar de sua elevada semelhança estrutural. J. Biol Chem, 2004. 279 (30): p. 31646-54; Lukacova, V., et al. , A comparison of the binding sites of matrix metalloproteinases and tumor necrosis factor-alfa converting enzime: implications for selctivity. Uma comparação entre os locais de ligação das metaloproteinases de matriz e a enzima conversora do fator alfa de necrose tumoral: implicações para seletividade. J Med Chem, 2005. 48 (7) : p. 2361-70] . Portanto, a seletividade de mAb entre as MMPs não é esperada com base, apenas, no reconhecimento do motivo zinco histidina. Entretanto, de forma diferente dos inibidores sintéticos de baixo peso molecular, um anticorpo, sendo uma molécula de proteína grande, deve ter acesso limitado em relação a um vão de local ativo que esteja mais profundamente localizado na estrutura da proteína. Em particular, uma vez que os mAbs provaram interagir especificamente com o ion do zinco catalítico, o grau de exposição do ion de zinco à solução deve ser crítico para a ligação com o anticorpo. A MTl-MMP e, em maior grau, a TACE são distinguidas por um bolsão Sl profundo, correlacionado com o ion de zinco catalítico relativamente aprofundado, conforme exibido por suas estruturas cristalinas. Esta diferença na profundidade do local ativo pode ser responsável pela falta de efeito inibidor dos anticorpos em relação à TACE. Estes resultados sugerem que a seletividade pode ser alcançada com base no grau de exposição do ion de zinco catalítico. Um outro fator importante, que deveria ser levado em consideração ao se comparar MMPs e TACE, são as diferenças no bolsão do local ativo em termos de química, tais como hidrofobicidade e polaridade (Veja a Figura 8). O local ativo da TACE, por exemplo, é significativamente mais polar do que os locais ativos da maioria das MMPs. Solomon et al demonstrou que tal variação na polaridade do local ativo influencia a orientação dos anéis de histidina imidazol do local ativo em relação ao ion de zinco catalítico [Solomon, A., et al., Pronounced diversity in electronic and chemical properties between the catalytic zinc sites of tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme and matrix metalloproteinases despite their high structural similarity - Diversidade acentuada entre as propriedades eletrônicas e químicas dos locais de zinco catalítico da enzima conversora do fator alfa de necrose tumoral e das metaloproteinases de matriz apesar de sua elevada semelhança estrutural. J. Biol Chem, 2004. 279 (30): p. 31646-54].

A seletividade do anti CoTCPP e anti Imisdp foi desafiada mais adiante, ao se testar sua reatividade cruzada com enzimas dependentes de zinco não relacionadas - Anidrase Carbônica (CA) e álcool dehidrogenase de brockii (TbADH). De forma semelhante às MMPs ativas, a CA contém um ion de zinco que é tetraedralmente coordenado aos três resíduos de histidina e a uma molécula de água, a TbADH contém um ion de zinco catalítico que é tetraedralmente coordenado a quatro resíduos de aminoácidos diferentes, histidina, cisteína, aspartato e glutamato. Foram levados a cabo experimentos adequados de inibição funcional in vitro, bem como experimentos similares com base na imuno afinidade, para se examinar a reatividade cruzada com estas enzimas; contudo, não se observou ligação ou inibição. 0 mAb anti CoTCPP também foi examinado em relação à sua reatividade cruzada com porfirinas fisiológicas relacionadas, tais como o grupo 5 Heme dentro da Mioglobina e Hemoglobina e vitamina. Não foi detectada reação cruzada no ELISA competitivo, bem como na análise de imuno afinidade.

A anidrase carbônica e a álcool dehidrogenase têm, ambas, locais ativos bem 10 aprofundados; de forma semelhante, a porção de porfirina na Mioglobina e Hemoglobina não fica exposta. A Vitamina B12 contém metal no centro da estrutura imidazol planar. Contudo, os ligantes axiais podem interferir com a ligação do mAb. No todo, estes resultados substanciam que o mAb anti 15 CoTCPP reconhece a configuração do metal-imidazol exposta sem a interferência dos resíduos axiais coordenadores do metal.

EXEMPLO 7

A síntese de [2-(2-amíno etil carbomoil)-etoxi-metil]-tris-[2-(N-(3-imidazol-1-il-propil)) etoxi metil] metano de Zinco (II) (3), Figura 9 (i) Síntese de Tetra(2-pentacloro-fenoxi carbonil-etoxi metil)metano:

A síntese de éster tetra ativo de substituição pentaclofenol foi levada a cabo no procedimento de Haim Weizmann et al., JACS 1996, 118, 12368- 12375.

(a) 0 preparo de éster tri-ativo mono substituído: Foram dissolvidos éster tetra ativo 91) (1 g, 0,69 mmol) e BocNHCH2CH2NH2 (100 mg, 0,62 mmol) em 20 ml de diclorometano seco. A solução foi misturada por uma noite enquanto se mantinha o pH~8 com trietilamina. A solução foi concentrada 5 e purificada por cromatografia flash com CHC13: etil-acetato (90:10) para dar (152 mg, 15% produzidos) . Ή NMR 250 MHz (CDC13) δ : 1,4 (s, 9H, Boc) ; 2,4 (t, 2H, J=6 Hz, -CH2-CH2- CONH); 2,9 (t, 6H, J=6 Hz, -CH2-CH2-COOPCP); 3,2 (q, 2H, J=6 Hz, CONH-CH2-CH2-NHBoc); 3,31 (t, 2H, J=6 Hz, CONH-CH2-CH2- 10 NHBoc); 3,38 (S, 2H, -C-CH2-0-CH2-CH2-C0NH-); 3,42 (s, 6H, C-CH2-0-CH2-CH2-C00PCP); 3,61 (t, 2H, J=6 Hz -C-CH2-0-CH2- CH2 -CONH-) ; 3,78 (t, 6H, J=6 Hz, -C-CH2-0-CH2-CH2-C0NH-);

5.03 (t, 1H, NH); 6,7 (t, 1H, NH).

(b) Preparo do tris (imidazol): 0 éster triativo mono substituído (150 mg, 0,11 mmol) e l-(3-amino propil)imidazol (33 μΐ^ 0,39 mmol) foram dissolvidos em THF seco (20 ml) e misturado por uma noite ã temperatura ambiente. A solução de cor branca foi concentrada e purificada pela coluna de cromatografia usando sílica (0,063 - 0,200 mm) com CHC13: metanol (50 - 90%) para dar (45 mg 44% de produto) . Ή NMR 250 MHz (CDC13/MeOD) δ : l,45(s, 9H, Boc);2,0 (m, 6H, J= 6 Hz, -CONH-CH2-CH2- CH2-imi); 2,4 (t, 6H, J=6 Hz, -0-CH2- CH2-CONH-) ; 2,5 (t, 2H, J=6 Hz, -CH2-CH2-CONH- CH2-CH2- NHBoc) ; 3,0 (m, 8H, J= 6 Hz, CONH- CH2-CH2-CH2-imi, - CH2- CH2-CONH-CH2-NHBoc); 3,1 (t, 2H, J=6 Hz CONH-CH2-CH2-NHBoc);

3.4 (b, 8H, -C-CH2-0-CH2-CH2- CONH-CH2-CH2-NHBoc, - C-CH2-0- CH2-CONH-) ; 3,6 (m, 8H, J=6 Hz, -C-CH2-0-CH2-CH2-C0NH-, -CCH2-0-CH2-CH2-C0NH-CH2-CH2-NHBoc); 4,0 (t, 6H, J=6 Hz, CONHCH2-CH2-CH2-imi) ; 5,5 (t, 1H, NH); 6,98 (s, 3H, imi) ; 7,06 (s, 3H, Imi); 7,32 (t, 3H, NH); 7,57 (s, 3H, Imi). ESI-MS: 910,87 [M+Na]+, 925,98 [M+K]+.

(c) Preparo do tris (imidazol) com amina livre (2): 5 Tris (imidazol) (40 mg, 0,045 mmol) foi dissolvido em uma mistura de 6 ml de dicloro etano e ácido tri-fluoro-acitico (2:1) e misturado por uma hora. A mistura de reação foi concentrada e evaporada várias vezes com tetracloreto de carbono e secada sob alto vácuo para remover TFA da mistura 10 para se obter (30 mg, 85% de produto, b) . Ή NMR 250 MHz (CDC13/MeOD) δ : 1,9 (m, 6H, J=6 Hz, -CONH-CH2-CH2-CH2-imi);

2,3 (m, 8H, J= 6 Hz, -0-CH2-CH2-C0NH-, -CH2-CH2-CONH-CH2- CH2- NH2) ; 2,9 (t, 2H, J= 6 Hz, CONH-CH2-CH2-CH2-imi) ; 3,0 (t, 2H, J = 14Hz, -CONH-CH2-CH2-NH2) ; 3,31 (t, 2H, J = 6 Hz, 15 -CH2-CH2-CONH-CH2-CH2-NH2) ; 3,4 (b, 8H, -C- CH2-0- CH2- CH2- CONH- CH2- CH2- NH2-, -C- CH2-0- CH2- CH2-CONH-) ; 3,6 (M, 8h, j = 6 Hz, -C- CH2-0- CH2- CH2-C0NH-, -C- CH2-0- CH2- CH2-CONH- CH2- CH2- NH2) ; 4,0 (T, 6H, J= 6 Hz, -CONH- CH2- CH2- CH2- imi); 7,26 (s, 3H, Imi); 7,32 (s, 3H, Imi); 8,82 20 (s, 3H, Imi) .

3. Preparo do complexo (3) tris (imidazol) - Zn (II) : 0 composto 2 (30 mg, 0, 038 mmol) foi dissolvido em 1 ml de metanol. Acrescentou-se de 2 a 3 gotas de solução de IN NaOH e ZnCH2 (5 mg, 0,04 mmol) e se misturou por meia hora. 0 25 precipitado de cor branca foi filtrado para se obter (12 mg, 37% de produto). Ή NMR 250 MHz (MeOD/ D20) δ: 1,8 (m, 6H, J = 6 Hz, -CONH- CH2- CH2- CH2-imi); 2,4 (m, 8H, J = 6 Hz, -0- CH2- CH2-C0NH-, CH2-CH2-CONH- CH2- CH2-NH2); 3,0 (t, 2H, J= = 6 Hz, CONH- CH2- CH2- ΝΗ2) ; 3,31 (b, 2Η, CH2- CH2-C0NHCH2- CH2- ΝΗ2) ; 3,4 (b, 8Η, -C- CH2-0- CH2- CH2-CONH- CH2- CH2- ΝΗ2, -C- CH2-0- CH2- CH2-CONH-); 3,6 (m, 8Η, -C CH2-0- CH2- CH2-C0NH-, -C- CH2-0- CH2- CH2-C0NH- CH2- CH2- ΝΗ2) ; 4,2 (b, 6Η, -CONH- CH2- CH2- CH2-imi); 7,19 (s, 3H, Imi); 7,28 (s, 3H, Imi); 8,55 (s, 3H, Imi). ESI-MS: 852, 09 [M+l] + .

Zn

/I X

* I >

* \ '

/ « \

HN

R=O- CH2- CH2-C0NH- CH2- CH2- NH2 [2-(2-amino etil carbomoil)-etoxi-metil] - tris-[2-(N-(3- imidazol-l-il-propil)) - etoxi metil] metano.

EXEMPLO 8

6C6 teve reação cruzada com os locais catalíticos de gelatinases

Descobriu-se que certa

quantidade de 6C6 se co-purificou com a MMP-9 do fluído ascítico. A presença de quantidades detectáveis de MMP9 no tumor ascítico, induzido em camundongos para propagar mAbs foi revelada por Western blot e zimografia de gelatina (dados não mostrados). 0 complexo do anticorpo - MMP-9 foi purificado a partir do fluido de ascitas de camundongo usando-se cromatografia de afinidade da Proteína G (a Proteína G se liga ao domínio constante do anticorpo, deixando o domínio variável livre para interagir com o antígeno) . Conforme mostrado na Figura 11 A, a MMP-9 copurificada foi detectada ao se proceder a análise de Western blot no complexo 6C6-MMP9 mediante o uso de anticorpo anti MMP-9 comercialmente disponível. Foi identificada uma banda com peso molecular de ~82 kDa, correspondente à MMP-9 ativa se o domínio pro-. Esta banda não foi detectada no controle irrelevante de mAb de camundongo que foi purificado e analisado da mesma maneira. Estes resultados mostraram que o 6C6 formou um complexo específico in vivo com a MMP-9 de camundongo, ativa, endógena.

Para se checar, mais adiante, a ligação com a forma ativa da enzima MMP2 altamente homóloga, foram conduzidos experimentos análogos de imunoprecipitação in vitro. 0 6C6 foi incubado com fragmento catalítico de MMP2 purificado, na proporção molar de 3:1. A análise SDS-PAGE dos imunoprecipitados da proteína A sefarose, revelaram a formação de um complexo específico de 6C6 com o fragmento catalítico de MMP2 ativo (Figura 11 B) . As contas de Proteína A por si só não imunoprecipi taram a MMP2. A seguir, testou-se a ligação com as formas zimogênicas (latentes) inativas de MMP2 e MMP9. Como todas as MMPs são produzidas como zimogênios inativos, elas têm os propeptídeos do terminal N de aproximadamente 80 a 90 aminoácidos que bloqueiam os locais ativos [Bode, W. e K. Maskos, BIol Chem, 2003. 384 (6): p. 863 -72] (Figura 11D). Os experimentos de imunoprecipitação com pro-MMP-2 e 9 foram levados a cabo de forma similar. De maneira importante, o anticorpo não se ligou à enzima latente (Figura 11 C) . De forma significativa, o 6C6 se ligou apenas ã conformação de enzima na qual estava exposto, à solução, o complexo de proteína no local do zinco ativo.

Estes resultados confirmaram que o anticorpo 6C6, cultivado e testado contra haptenos bio-inorgânicos que mimetizam o local ativo, teve reação cruzada com os locais de proteína ativa de MMP2 e 9. Aparentemente, o hapteno de tripé de zinco foi capaz de mimetizar a estrutura tridimensional do respectivo epitope zinco - histidina na proteína nativa. Notadamente, o reconhecimento desta mínima epitope estrutural de metaloproteína foi o suficiente para causar a reatividade cruzada coma enzima nativa. A ligação apenas com as enzimas ativadas - e não com sua forma latente, na qual o domínio pro bloqueou o acesso ao epitope da proteína do zinco catalítico (Figura 11 D), indicou a interação direta de 6C6 com o local catalítico do zinco. Notadamente, o 6C6 se ligou à MMP9 in vivo, demonstrando que o anticorpo pode formar um complexo específico com a enzima em um ambiente de proteína complexo.

Discernir entre a espécie de enzima ativada e a forma latente constitui uma propriedade funcional única e valiosa de 6C6. Esta atividade é exclusiva do 6C6, em oposição aos demais anticorpos cultivados contra ΜΜΡ9. Isso ocorre porque a imunização com proteínas gera, tipicamente, epitopes dirigidos aos loops de superfície, ao passo que os aminoácidos catalíticos estão, em sua maioria, enterrados dentro de um vão na superfície da enzima. Esta parte da molécula é considerada como de baixa imunogenecidade. Assim, anticorpos monoclonais

neutralizadores cultivados por meio de métodos convencionais (contra proteínas nativas ou fragmentos de proteína) geralmente interagem com as regiões contíguas ou adjacentes ao local ativo, mais do que com os resíduos catalíticos do local ativo, e inibem através de um mecanismo de impedimento estérico. Tais anticorpos, tipicamente, se ligam ao precursor inativo, bem como á forma ativa. A abordagem única de imunização atual do hapteno que mimetiza o local ativo pode haver permitido a produção de anticorpos que reconhecem os resíduos de proteína de metal catalítico nas MMPs, o que não é possível de se obter mediante uma abordagem de imunização de proteína convencional.

EXEMPLO 9

0 6C6 inibe gelatinases seletivamente in vitro e in situ

Para se determinar a

capacidade inibidora de enzimas por parte do 6C6 em relação à MMP9 e MMP2, análises de inibição foram levadas a cabo usando-se pequenos substratos de peptídeos fluorogênicos (7 aminoácidos) que abrem o vão do local ativo das gelatinases. As velocidades de reação iniciais foram medidas por várias concentrações de mAb. 0 606 inibiu a atividade catalítica de ambas enzimas (Figuras 12 A e B) . O mecanismo de inibição competitiva foi determinado através da análise da atividade da MMP9 na presença de várias concentrações de anticorpos inibidores, como uma função de concentração do substrato. Os dados mostrados na Figura 12 A, na forma de um gráfico duplo, recíproco de Linweaver - Burk, demonstra o perfil de inibição competitiva. Ajustando-se os dados de inibição á equação de sistemas de inibição competitiva, foi obtido Ki de 1 ± 0,1 μΜ e 1,4 ± 0,16 μΜ para MMP9 e 2, respectivamente. Também foi determinado que o 6C6 não foi fendido pela MMP-9 após incubações de uma noite em altas concentrações de MMP-9 (30 μΜ) , demonstrando que a inibição observada de MMP9 por 6C6 não ocorreu em virtude do corte do substrato concorrente. A análise cinética de MMP9 foi tomada como sendo representativa do mecanismo de inibição do 6C6, uma vez que este foi projetado para reconhecer a mesma epitope em diferentes MMPs. 0 efeito inibidor foi consistente para espécies de fragmento catalítico de MMP2 e 9, bem como formas enzimáticas de gelatinases de comprimento total. Especificamente, a MMP9 recombinante e os fragmentos catalíticos de MMP2, contendo o domínio catalítico, bem como o domínio fibronectina, embora não o domínio hemopexina; bem como a unidade catalítica mínima de MMP9 recombinante contendo apenas o domínio catalítico e carecendo tanto do domínio fibronectina quanto do domínio hemopexina, foram todas inibidas de forma semelhante até gelatinases completas (de acetato p-amino-fenil merecúrico (APMA) ativadas) purificadas a partir do meio de células HeLa S3 infectadas com vírus de vacínia recombinante codificando o cDNA completo de pro-MMP2 e 9 humanas, conforme descrito anteriormente [Olson, M.W., et al. , J Biol Chem, 2000. 275

(4) : p. 2661 - 8] . Estes resultados confirmaram que a inibição é mediada pela interação direta com o domínio catalítico e não é dependente de interação nem com o domínio hemopexina e nem com o domínio fibronectina. 0 perfil de inibição competitiva proporcionou uma indicação ulterior de interação direta com o local do zinco catalítico. Um mAb não relevante, preparado de forma similar, não interferiu com a atividade fotolítica da enzima. Assim, a inibição observada não se deu em virtude de quantidades residuais de contaminantes co-purifiçados. Os anticorpos para estes experimentos foram purificados a partir de tecidos de cultura não continham quantidades detectáveis de MMP9 ativa na fração do anticorpo purificado.

Para explorar a seletividade de 6C6, testou-se sua reatividade com relação a diferentes sub-grupos de metaloproteinases de matriz, inclusive matrilisina (MMP7), MMP do tipo de membrana (MTl-MMP) e a enzima conversora do fator alfa de necrose tumoral (TACE) relativa à desintegrina (ADTiLMs) . As estruturas do núcleo destas enzimas são altamente similares, variando, em sua maior parte, dentro dos loops periféricos. Especificamente, a plataforma de zinco - histidina é bem conservada, mostrando uma hélice comum seguida de um loop, o qual serve de plataforma para os três resíduos de histidina que coordenam o ion de zinco catalítico (Figura 13) . Análises similares de inibição foram levadas a cabo com substratos de peptídeo fluorogênico adequados. De maneira interessante, nem a MMP-7, nem a TACE foram inibidas em qualquer proporção mensurável durante a incubação com 6C6 a concentrações de até 30 μΜ, indicando um nível substancial de seletividade em relação às gelatinases. A MTl-MMP foi inibida pelo 6C6 de forma menos potente, com Ki de 14,4 ± 0,75 μΜ. De forma interessante, a origem desta seletividade não pode ser elucidada com base exclusivamente no desenho do anticorpo para reconhecer a plataforma de zinco - histidina, uma vez que as estruturas de núcleo, em particular, no local ativo, são altamente similares. As variações de seqüência, em sua maior parte, dentro dos loops periféricos, ditam diferenças na extensão de exposição do motivo zinco - histidina, na forma do local ativo - e sua superfície eletrostática pode ser responsável por este padrão inibidor seletivo.

0 6C6 também foi testado para reação cruzada com diferentes metaloproteases dependentes de zinco, Anidrase Carbônica e Álcool Dehidrogenase. De forma análoga às MMPs, a Anidrase Carbônica (CA) tem um ion de zinco catalítico, coordenado tetraedralmente a três histidinas ligantes e uma molécula de água. Em consequencia, vários inibidores de MMP (do tipo hidroxamato sulfonilado de aminoácido) de moléculas pequenas, potentes, também agem como eficientes inibidores de CA e vice versa. Certas Nhidroxi sulfonamidas, investigadas anteriormente como inibidores de CA, também exibem propriedades inibidoras contra as MMPs [Scozzafava, A. e C. T. Supuran, J MEd Chem, 2000. 43 (20): p. 3677-87]. O local ativo da Álcool Dehidrogenase a partir do bacterium termofílico (TbADH), inclui uma porção de proteína de zinco diferente, na qual o zinco está ligado à histidina, cisteína, aspartato e glutamato, localizadas dentro de uma re-entrância. Experimentos adequados de inibição funcional, na presença de concentrações de mAb de até 30 μΜ, não exibiram qualquer efeito em relação a ambas enzimas. Notadamente, o local ativo da CA, localizado na região central de uma folha-β torcida, de 10 cantos, é composto por um vão em forma de cone, com 15 Â de profundidade, com o íon tetraédrico Zn2 + no fundo do vão. Diferentemente dos inibidores de molécula pequena, o íon de zinco deve estar localizado muito profundamente para a interação com um anticorpo. De forma importante, estes experimentos demonstram o perfil inibidor seletivo do 6C6.

No ambiente celular, o efeito inibidor do 6C6 em relação às gelatinases foi testado mais além, usando-se o substrato natural das gelatinases gelatina, mediante zimografia in situ. Células HT1080,d e fibro-sarcoma humanas, cultivadas em cultura, expressando membrana ligada a MTl-MMP e secretando MMP2 e 9 [Giambernardi, T.A., et al. , Matrix Biol, 1998. 16 (8) : p. 483-96] foram superpostas com gelatina de fluoresceína conjugada (gelatina DQ). Conforme mostrado nas figuras 14 AC, as células HT1080 não tratadas exibiram significativa atividade gelatinolítica na superfície da célula. O tratamento com 5 μΜ de mAb reduziu, significativamente, a atividade gelatinolitica na superfície da célula, de forma análoga ao observado com o mecanismo baseado no inibidor de gelatinase, SB-3CT. 0 SB-3CT possui um perfil inibidor análogo, uma vez que inibe tanto as gelatinases quanto as MTl-MMP (Os valores Ki são 28, 400 e 110 nM para MMP2, MMP9 e MTI-MMP, respectivamente).

Em resumo, o 6C6 inibiu tanto o corte de peptídeo sintético in vitro quanto o substrato macromolecular in situ. O 6C6 apresentou um modo de inibição competitiva em relação à MMP-9, de forma análoga ao mecanismo de inibição da IT-MMP. O perfil de inibição competitiva é mais uma indicação da interação direta com a porção do zinco catalítico. De forma importante, o 6C6 exibiu um perfil de inibição seletiva em relação às gelatinases. A origem desta seletividade não pode ser explicada pelo targeting do motivo histidina - zinco conservado. Estes resultados sugerem que o anticorpo interage com determinantes adicionais na superfície da enzima, os quais são responsáveis pela especificidade observada.

EXEMPLO 10

O Efeito do Tratamento com 6C6 mAb na Colite Induzida por DSS em Camundongos

Há cada vez mais evidências de que as MMPs estão implicadas na remodelagem de tecidos e na destruição associada a várias condições inflamatórias, inclusive a doença inflamatória dos intestinos (IBD) [Baugh, M. D., et al., Gastroenterology - Gastroenterologia -, 1999. 117 (4) : p. 814-22; Heusschkel, R. B., et al. , Gut -Tripa 2000, 47 (1): p. 57-62; von lampe, B., et al., Gut -Tripa 2000, 47 (1): p. 63-73; Kirkegaard, T., et al., Gut -Tripa 5 2004, 53 (5): p.701-9].

Portanto, os inventores

presentes examinaram o efeito inibidor anti gelatinase de 6C6 in vivo, em camundongos, no modelo experimental de doença inflamatória dos intestinos.

Para explorar a atividade

inflamatória d e 6C6, foi examinada a habilidade do tratamento com mAb de melhorar a colite aguda induzida por DSS. Especificamente, foi administrado DSS a 2% durante 5 dias á linhagem de camundongos C57BL/6, altamente 15 suscetível. O tratamento com 6C6 foi ministrado diariamente por meio de injeções intraperitoneais de 1,5 ou 5 mg/ kg de camundongo, com início no dia da indução. Os camundongos expostos a DSS a 2% desenvolveram os sintomas de colite aguda, com diarréia, sangramento retal e grave perda de 20 peso.

0 efeito do tratamento com mAb sobre o índice de atividade da doença, monitorado diariamente (DAÍ), (escore combinado de peso corpóreo, sangramento e consistência das fezes) é mostrado na Figura 25 15 A. Os camundongos tratados com mAb diminuíram a atividade da doença em comparação com o controle (significativo a partir do dia 6). Uma manifestação macroscópica adicional da colite induzida por DSS é a redução da extensão do cólon (Figura 15 B) . Assim, encontrou-se uma redução de 30% na extensão do cólon dos camundongos não tratados em comparação aos camundongos virgens de tratamento, 11 dias após a indução com DSS. Em contraste, apenas uma redução média de 22% a 16% foi obtida nos camundongos tratados com 6C6 nas doses de 1,5 e 5 mg/ kg de camundongo, respectivamente. Os efeitos protetores do 6C6 também foram confirmados pela taxa de mortalidade da doença. A taxa de mortalidade de 60% foi encontrada nos camundongos não tratados, 11 dias após a indução, ao passo que se observou uma taxa de mortalidade de 33% nos camundongos tratados com 6C6 (Figura 15 C). Assim, o tratamento dos camundongos C57BL/6 com 6C6 resultou numa taxa de sobrevivência melhorada, além das manifestações reduzidas de colite induzida por DSS.

De forma geral, esses

resultados demonstraram o potencial terapêutico de 6C6 como inibidor da gelatinase.

EXEMPLO 11

Caracterização do Complexo MMP9 - 6C6

mAbatravésdaEspectrocopia de Absorção de raios-X

De forma a estudar mais as diferenças entre a MMP9 ativa e o complexo inibido MMP9 6C6, realizou-se uma espectroscopia de absorção de raios-X. A Figura 16 mostra os dados de fluorescência XAS coletados. Os dados são apresentados na forma de espectro da transformada rápida de Fourier (Fourier transform, FT), para fornecer a distribuição radial dos vários átomos dentro das primeira e segunda camada de coordenação do íon de zinco catalítico na MMP9. A mudança aparente na distribuição radial dos espectros da enzima livre e inibida pode ser observada acima do nível de ruído. Estas mudanças espectrais indicam que o ambiente local do íon de zinco catalítico passa por mudanças estruturais resultantes da ligação com o 6C6. O desvio observado, tanto nas características de distribuição espacial, como nas de intensidades de pico de FT espectral, entre a enzima ativa e inibida indicam, de maneira inequívoca, que a estrutura local do zinco catalítico muda em virtude da formação do complexo com mAb.

É apreciado que certas características da invenção, as quais são descritas, por motivo de clareza, no contexto de configurações separadas, também possam ser fornecidas em combinação com uma única configuração. Assim, várias características da invenção, que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única configuração, também podem se proporcionadas separadamente ou em qualquer sub-combinação adequada.

Embora a invenção haja sido descrita em conjunto com as configurações específicas resultantes, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações se farão aparentes aos doutos na arte. Neste sentido, pretende-se abraçar todas as alternativas, modificações e variações que caibam dentro do espírito e amplo escopo das reivindicações anexadas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente, citados nesta especificação, estão incorporados aqui, em sua íntegra, por referência dentro da especificação, na mesma medida em que cada publicação individual, patente, ou pedido de patente seria, especifica e individualmente, indicada para ser incorporada a este para referência. Ademais, a citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve 5 constituir admissão de que tal referência estivesse disponível como arte anterior à presente invenção.

LISTA DE REFERÊNCIAS

(Referências adicionais estão citadas no texto)

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Legenda das Figuras Figura IA

A) [meso-tetraquis(4-carboxifenil)-porfirinato]zinco (II) Figura IB

B) meso-tetraquis(4-carboxifenil)-porfirinato]cobalto (II) Figura IC

C) [2 - (2-minoe ti lcarbamoi 1) -etoximetil] -tris-[2-(N-(3- imidazol-1 -il-propil))-etoximetil]metano

Figura ID

D) Motivo ligante de zinco da MMP-9 Figuras 2A-B E) Água Figuras 3A-C

F) Cadeia Pesada

G) MMP-2 Catalítica 5 H) PROMMP-2

I) PROMMP-9 J) ANTIMMP-9 Figura 7A K) HT 1080 Figura 7B

L) HT1080+IOAB Figura 8

M) Tipo de bolsa Sl N) Intermediária 0) Profunda

P) Superficial Figura 10

Q) Seqüência das CDR dos mAbs 13E11, 15E12 e 6C6 alinhado Figuras IlA-D 20 R) Mab Controle S) Pró-MMP9 T) Controle U) MMP2 ativa V) Pró-MMP2 25 X) MMp ativa Y) Pró-MMP Z) MMP 9 ativa Al) WB- Anti-MMP9 Figura I2A-B

BI) Valores de Ki para inibição de MMPs por 6C6 Cl) NI, "não inibe" concentrações de até 30μΜ Figuras 14A-C 5 Dl) Não tratado El) 6C6 a 5μΜ Fl) SB3CT a 15μΜ

Claims (17)

1. "COMPOSTO COM A FÓRMULA <formula>formula see original document page 107</formula> caracterizado pelo fato de que: m e n são independentemente um número inteiro de Ia 6: Xi - X3 e Yi - Y3 são independentemente 0 ou S; Ri - R3 são selecionados independentemente do grupo composto por hidrogênio, alquila e cicloalquila; e R é (CH2) x-C (=0) NR' - (CH2) y-NR' R" enquanto que: x e y são independentemente um número inteiro de 1 a 6; e R' e R" são independentemente selecionados do grupo composto por hidrogênio, alquila e cicloalquila.

2. "COMPOSTO COM A FÓRMULA GERAL I", de acordo com a reivindicação 1, com a Fórmula (II) : <formula>formula see original document page 107</formula> caracterizado pelo fato de que R = -CH2-C (=0) NH-CH2-CH2-NH2.

3. "COMPOSTO COM A FÓRMULA II, <formula>formula see original document page 108</formula> caracterizado pelo fato de que R = -CH2-C (=0) NH-CH2-CH2-NH2

4. "ANTICORPO", caracterizado por incluir a região de reconhecimento de antígeno capaz de se ligar especificamente ao composto da reivindicação 1, 2 ou 3.

5. "ANTICORPO", caracterizado por incluir a região de reconhecimento de antígeno que inclui seqüências de aminoácidos CDR apresentados na ID SEQ N0: 7, 8, 9, 10, 11 e 12.

6. "ANTICORPO", de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos CDR supracitada é codificada por um seqüência de acido nucléico selecionada do grupo composto por ID SEQ N°: 13, 14, 15, 16, 17 e 18.

7. "ANTICORPO", de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser capaz de inibir a atividade de uma metaloproteína.

8. "ANTICORPO", de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a metaloproteína supracitada é uma metaloproteinase matriz.

9. "ANTICORPO", de acordo com a a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a metaloproteinase matriz supracitada é uma gelatinase.

10. "ANTICORPO", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a gelatinase supracitada é selecionada do grupo de MMP-2 e MMP-9.

11. "MÉTODO DE PRODUÇÃO DE INIBIDOR DE METALOPROTEINASE", caracterizado por incluir a criação de anticorpos direcionadas ao composto da reivindicação 1, 2 ou 3, com isso produzindo um inibidor de metaloproteína.

12. "MÉTODO DE PRODUÇÃO DE INIBIDOR DE METALOPROTEINASE", de acordo com a reivindicação11, caracterizado pelo fato de que os anticorpos supracitados são anticorpos policlonais.

13. "MÉTODO DE PRODUÇÃO DE INIBIDOR DE METALOPROTEINASE", de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os anticorpos supracitados são anticorpos monoclonais.

14. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", caracterizada por incluir o anticorpo da reivindicação 4 e um portador farmaceuticamente aceitável.

15. "MÉTODO DE TRATAMENTO DE DOENÇA ASSOCIADA A ATIVIDADE INCOMPATÍVEL OU ANORMAL DE METALOPROTEÍNAS", caracterizado por incluir administrar no paciente uma quantidade terapeuticamente eficiente de um dos anticorpos das reivindicações 4-10, tratando com isso uma doença associada à atividade incompatível ou anormal das metaloproteínas no paciente.

16. MÉTODO DE TRATAMENTO DE DOENÇA ASSOCIADA A ATIVIDADE INCOMPATÍVEL OU ANORMAL DE METALOPROTEÍNAS", de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença é uma doença inflamatória no intestino.

17. "MÉTODO DE INIBIÇÃO DA ATIVIDADE DA METALOPROTEINASE MATRIZ EM UMA CÉLULA", caracterizado por incluir contatar a célula com um dos anticorpos das reivindicações 4-10, inibindo com isso a atividade da metaloproteinase matriz na célula.