ES2288757T3

ES2288757T3 - Derivados sinteticos de bacterioclorofila sustituidos con metales y uso de los mismos.

Info

Publication number: ES2288757T3
Application number: ES96938445T
Authority: ES
Inventors: Avigdor Scherz; Yoram Salomon; Hugo Scheer; Gerhard Hartwich; Alexander Brandis
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1995-11-24
Filing date: 1996-11-24
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2016-11-24
Also published as: DK0863903T3; DE69637149D1; HUP9903582A3; WO1997019081A1; DE69637149T2; MX9804143A; HU223379B1; PT863903E; AU718961B2; CN1207741A; PL188811B1; US6333319B1; RU2193038C2; EP0863903B1; JP2000500763A; ATE365741T1; NO323478B1; HUP9903582A2; CN1085211C; AU7585796A

Abstract

SE PREPARAN CLOROFILAS BACTERIANAS METALADAS DE FORMULA [M] BCHL, DONDE M ES UN ATOMO METALICO SELECCIONADO DE ENTRE PD, CO, NI, CU, ZN Y MN DIVALENTES, FE, MN Y CR TRIVALENTES, Y SN Y PT TETRAVALENTES, Y BCHL REPRESENTA EL RESIDUO DE UN DERIVADO NATURAL O SINTETICO DE CLOROFILA BACTERIANA DESMETALADO, POR TRANSMETALACION DE LOS CORRESPONDIENTES DERIVADOS [CD] - BCHL QUE PORTAN EN LA POSICION 17 3 UN GRUPO COOR 1 , DONDE R 1 ES UN RESIDUO HIDROCARBILO C 1 - C 25 , Y OPCIONALMENTE TRANSESTERIFICACION SUBSIGUIENTE DEL 17 3 CO OR 1 DEL [M] - BCHL OBTENIDO. LOS COMPUESTOS SON PARA SU USO EN DIAGNOSIS Y TERAPIA FOTODINAMICA Y PARA MATAR CELULAS Y AGENTES INFECCIOSOS, P.EJ: BACTERIAS Y VIRUS, TANTO EN PRODUCTOS BIOLOGICOS COMO EN TEJIDO VIVO. COMPUESTOS PREFERIDOS SON LOS DE FORMULA (I'') DONDE R'' 1 ES UN RESIDUO SELECCIONADO DE ENTRE (I) HIDROCARBILO OPCIONALMENTE SUSTITUIDO; (II) PEPTIDO O AMINOACIDO QUE CONTENGA GRUPOS HIDROXI O UN DERIVADO DE LOS MISMOS; Y (III) PEPTIDO CON GRUPOS HIDROXI O LIGANDO DE ESPECIFICIDAD CELULAR, P.EJ. PEPTIDO O PROTEINA, UNIDO AL GRUPO COO- VIA UN ESPACIADOR SEGUN SE DEFINE EN (I).

Description

Derivados sintéticos de bacterioclorofila sustituidos con metales y uso de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento de preparación de derivados de bacterioclorofila metalados para su uso en procedimientos de terapia fotodinámica (PDT) in vivo y diagnosis y muerte fotodinámica de virus y microorganismos in vitro, y a algunos nuevos derivados de bacterioclorofila sustituidos con metales.

Definiciones y abreviaturas

BChl = bacterioclorofila a (la 7,8,17,18-tetrahidroporfirina que contiene Mg con la fórmula I a continuación en la que M es Mg, R_{1} es fitilo o geranilgeranilo, R_{2} es COOCH_{3}, R_{3} es H, R_{4} en posición 3 es acetilo y en posición 8 es etilo).

Derivado de BChl = un derivado de BChl con modificaciones en el macrociclo, el átomo metálico central y/o en la periferia, incluyendo los derivados con las fórmulas I, II, III y I', II', III' a continuación.

BPhe = bacteriofeofitina a (BChl en la que el Mg central se sustituye por dos átomos de H).

Chl = clorofila (un derivado de 17,18-dihidroporfirina que contiene Mg compuesto de un macrociclo que consiste en 4 anillos pirrol y un anillo isocíclico que están conjugados entre sí y unidos al átomo de Mg). La clorofila a tiene la fórmula I a continuación en la que R_{1} es fitilo, R_{2} es COOCH_{3}, R_{3} es H, R_{4} en posición 3 es vinilo y en posición 8 es etilo.

[M]-BChl = derivado de BChl en el que el átomo de Mg central se ha sustituido por un metal M como se define a continuación.

PDT = terapia fotodinámica.

Phe = feofitina a (Chl en la que el Mg central se sustituye por dos átomos de H).

Antecedentes de la invención

Las (bacterio)clorofilas ((B)Chl) que contienen Mg y sus bases libres, las (bacterio)feofitinas ((B)Phe), son esenciales para la fotosíntesis. Actúan como antenas o pigmentos redox permitiendo la separación de cargas inducida por luz dentro del centro de reacción. Los pigmentos también son fotosensibilizadores potencialmente útiles, por ejemplo, en terapia tumoral fotodinámica.

Se ha demostrado que las porfirinas se acumulan en el tejido tumoral y, después de la irradiación del tejido tumoral, absorben luz in situ, proporcionando un medio para detectar tumores mediante localización de la fluorescencia. Se ha propuesto un derivado en bruto de la hematoporfirina, conocido como derivado de hematoporfirina o HPD, tanto para la detección como para terapia fotodinámica de tumores. Una forma de la HPD que se dice que es más eficaz comprende una fracción de HPD con un peso agregado por encima de 10 kDa y es el objeto de la patente de EE.UU. Nº 4.649.151. La HPD o sus componentes activos se han descrito en la patente de EE.UU. Nº 4.753.958 para el tratamiento tópico de enfermedades cutáneas, y en Matthews y col., 1988, para la esterilización de muestras biológicas que contienen organismos infecciosos tales como bacterias y virus.

Para optimizar el comportamiento de los fármacos de porfirina en terapia y diagnosis, se han propuesto varios derivados de porfirina en los que, por ejemplo, hay un átomo metálico central complejado a los cuatro anillos pirrol, y/o los sustituyentes periféricos de los anillos pirrol se modifican y/o el macrociclo se dihidrogena a derivados de Chl (clorinas) o se tetrahidrogena a derivados de BChl (bacterioclorinas).

Los complejos de tetrapirroles cíclicos con metales distintos al Mg se estudiaron en la porfirina y la serie 17,18-dihidroporfirina para comprender sus propiedades espectroscópicas y redox (Hynninen, 1991). Las bacterioclorofilas son de una ventaja potencial comparadas con las clorofilas debido a que presentan bandas en el infrarrojo cercano intensas, es decir, a unas longitudes de onda considerablemente más largas que los derivados de clorofila. No obstante, actualmente hay poca información disponible sobre bacterioclorofilas con metales centrales distintos del Mg.

La publicación de solicitud PCT internacional Nº WO 90/12573 de Dougherty describe derivados de bacterioclorofila a o b o de las bacterioclorinas correspondientes desprovistas del átomo metálico central o en las que el átomo metálico central puede ser un metal no paramagnético seleccionado entre Mg^{2+}, Sn^{2+} y Zn^{2+}, y el grupo C-17^{3}-carboxilo está esterificado con un residuo hidrocarbilo saturado o insaturado de 8-25 C, para la fabricación de una composición para su uso en un procedimiento para llevar a cabo la destrucción o deterioro de sustratos biológicos diana no deseados, cuyo procedimiento comprende la fotosensibilización de dicho sustrato con una cantidad eficaz de dicho derivado, seguido de la irradiación del sustrato diana con radiación en una banda de longitud de onda absorbida por dicho derivado durante un tiempo eficaz para deteriorar o destruir el sustrato. Además, se dice que los compuestos son útiles en terapia fotodinámica y diagnosis. Nótese que aunque se reivindican complejos de Sn^{2+} y Zn^{2+} de bacterioclorofila a o b, estos derivados metálicos no han sido ejemplificados ni había ningún procedimiento para su preparación descrito en la memoria descriptiva de dicha solicitud de patente WO 90/12573.

Losev y col., 1990, describe complejos de [Pd]-BChl y [Cu]-BChl que se dice que se preparan por metalación directa de BPhe con benzonitrilo de Pd en benceno en una corriente de nitrógeno o con una disolución concentrada de CuCl_{2} en metanol, respectivamente. No obstante, esta publicación carece de detalles del procedimiento de preparación y caracterización de los complejos metálicos. Además, la preparación del complejo de [Pd]-BChl según Losev no pudo ser repetida por nosotros.

En condiciones de administración normales, es decir, en presencia de oxígeno a temperatura ambiente y en condiciones de luz normales, los restos de BChl son lábiles y tienen rendimientos cuánticos un tanto inferiores para la formación del estado triplete, cuando se comparan con, por ejemplo, el derivado de hematoporfirina (HPD). No obstante, su posible iniciación de las reacciones redox biológicas, las características espectrales favorables y su fácil degradación in vivo dan como resultado la superioridad potencial de las bacterioclorofilas sobre otros compuestos; por ejemplo, porfirinas y clorofilas, para terapia PDT y diagnosis y para la muerte de células, virus y bacterias en muestras y en tejidos vivos. La modificación química de las bacterioclorofilas se espera que mejore adicionalmente sus propiedades, pero esto ha estado muy limitado debido a la falta de procedimientos adecuados para la preparación de esas bacterioclorofilas modificadas (Hynninen, 1991).

La solicitud de patente europea publicada con el Nº 0584552 del mismo solicitante de la presente solicitud describe nuevos conjugados de Chl y BChl con aminoácidos, péptidos y proteínas para su uso en terapia PDT y diagnosis. El residuo de aminoácido, péptido o proteína está unido directamente o a través de un espaciador al grupo C-17^{3}-carboxilo de la molécula de Chl o BChl. Estos conjugados se preparan mediante procedimientos que son suficientemente suaves para retener el átomo de Mg central lábil a ácidos. Los complejos de Zn y Cu de clorofila a-17^{3}-éster metílico de serina también se describen en ese documento, pero ahí no se describen bacterioclorofilas metaladas ni un procedimiento para su preparación.

La solicitud de patente alemana Nº DE 4121876 describe derivados de bacterioclorofila en los que se obtienen ésteres modificados en las posiciones C-13^{2} y C-17^{3} en condiciones suaves mediante transesterificación alcalina rápida, permitiendo cambios adicionales en el anillo isocíclico mientras retiene el Mg central, por lo que la absorción del pigmento se desplaza más allá de los 800 nm. La solicitud también menciona complejos metálicos de dichos derivados de BChl con Zn o Ni, pero no se ejemplifican dichos complejos ni se describe allí un procedimiento para su
preparación.

Sería deseable preparar nuevos complejos metalados de BChl para su uso en PDT, para mantener o incluso mejorar las propiedades ópticas y fisiológicas favorables de las BChl mientras se optimiza su fotosensibilidad potencial así como se mejora su estabilidad química y se optimizan sus tiempos de vida fisiológicos. La transmetalación da como resultado distintos cambios en la reactividad y estabilidad química de las BChl, que son importantes para nuevas modificaciones del macrociclo y los sustituyentes periféricos, y en particular para optimizar su transporte, fijación de dianas y tiempo de vida biológico y para minimizar efectos secundarios tóxicos. La transmetalación también da como resultado diferentes cambios en las propiedades del estado excitado, incluyendo el rendimiento triplete y el tiempo de vida, la accesibilidad de estados excitados superiores, y la producción de especies de oxígeno citotóxicas.

Se conocen varios procedimientos para la variación del átomo metálico central en porfirinas (véase Buchler, 1975). Las porfirinas son fácilmente accesibles y químicamente estables, pero espectral y fisiológicamente desfavorables.

Se conocen pocos procedimientos para la metalación directa o indirecta de clorofilas. Strell y Urumow, 1977, describen complejos de [Cr]-Chl y [Mn]-Chl preparados por transmetalación del complejo de [Cd]-Chl (obtenido por reacción del derivado de Chl desmetalado con acetato de cadmio en metanol o piridina) con el acetato de Cr^{2+} o Mn^{2+} en metanol en atmósfera de N_{2}. Se dice que este procedimiento de transmetalación también es adecuado para complejos de Cu, Zn, Co y Pb de derivados de clorofila, pero no para Fe^{3+}, Ni y Mg. No obstante, puesto que los complejos de Cu, Zn, Co y Pb se pueden preparar por metalación directa en Phe, el procedimiento sólo sería ventajoso para Cr y Mn. Los autores también describen la preparación del complejo de [Mg]-Chl por metalación directa de Phe en acetona con acetato de Mg en dimetilsulfóxido.

Actualmente hay poca información disponible sobre bacterioclorofilas con metales centrales distintos al Mg. Es sabido que la metalación de bacterioclorofilas es más difícil que la de clorofilas debido a su reactividad reducida para la metalación y su reactividad incrementada para reacciones secundarias. Se ha descrito un procedimiento específico para la inserción de Mg en bacteriofeofitina (Wasielewsky, 1977). Los presentes inventores han intentado la metalación directa y procedimientos de transmetalación para derivados de clorofila descritos por Strell y Urumow para la preparación de complejos metálicos de derivados de bacterioclorofila, pero todos los intentos fueron infructuosos. La metalación directa de derivados de bacteriofeofitina no funcionó con ningún metal probado, excepto para el Cu y Zn, y aparte de eso dio como resultado una mezcla de bacteriofeofitina sin reaccionar y productos de oxidación metalados del tipo 3-acetil-clorofila a.

Resumen de la invención

Ahora se ha encontrado, de acuerdo con la presente invención, que se pueden obtener complejos metálicos de derivados de bacterioclorofila mediante una modificación del procedimiento de transmetalación para la metalación de derivados de clorofila publicado por Strell y Urumow, usando las sales metálicas y disolventes apropiados.

La presente invención así se refiere a un nuevo procedimiento para la preparación de derivados de bacterioclorofila metalados sintéticos con la fórmula:

[M]-BChl

en la que el derivado [M]-BChl se selecciona de un compuesto con la fórmula general I, II o III:

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en la que

R_{1} es un residuo hidrocarbilo C_{1}-C_{25};

R_{2} es H, OH o COOR_{5}, cuando el compuesto es con la fórmula I, o R_{2} es H o R_{5}, cuando el compuesto es con la fórmula II, en la que R_{5} es alquilo C_{1}-C_{12} o cicloalquilo C_{3}-C_{12};

R_{3} es H, OH o alquilo o alcoxi C_{1}-C_{12}, cuando el compuesto es con la fórmula I, o R_{3} es H o alquilo o alcoxi C_{1}-C_{12} cuando el compuesto es con la fórmula II;

R_{4} se selecciona cada uno independientemente del grupo constituido por vinilo, etilo, acetilo, 1-hidroxietilo y éteres y ésteres de los mismos; y

M representa un metal con un radio iónico más pequeño al del Cd (r = 95 pm), siendo dicho metal M seleccionado del grupo constituido por un metal divalente seleccionado del grupo constituido por Pd, Co, Ni, y Mn, un metal trivalente seleccionado del grupo constituido por Fe, Mn y Cr, y un metal tetravalente seleccionado del grupo constituido por Sn y Pt; cuyo procedimiento comprende:

(i) reacción de un derivado de bacteriofeofitina correspondiente a dicha BChl, disuelto en dimetilformamida con acetato de Cd deshidratado en atmósfera de Ar y recuperación del complejo de [Cd]-BChl de la mezcla de reacción por cromatografía en condiciones reductoras;

(ii) reacción del complejo de [Cd]-BChl producido en la etapa (i) disuelto en acetona seca con una sal de un metal M deshidratada apropiada seleccionada entre un cloruro de un metal M, acetato y acetil-acetonato en atmósfera de Ar; y

(iii) recuperación del derivado de [M]-BChl metalado deseado de la mezcla de reacción.

De los derivados de [M]-BChl anteriores con las fórmulas I, II y III se pueden obtener derivados adicionales por reacción con un compuesto con la fórmula R_{1}'-OH en condiciones de transesterificación en posición 17^{3} tales como los compuestos con las fórmulas I', II' y III':

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en la que R_{1}' se selecciona del grupo constituido por:

(i) un residuo hidrocarbilo C_{1}-C_{25} opcionalmente sustituido por halógeno, oxo (=O), OH, CHO, COOH, o NH_{2}, o un residuo interrumpido por uno o más heteroátomos seleccionados entre O, S y NH, o por un anillo fenilo;

(ii) un residuo de un aminoácido o de un péptido que contiene un grupo hidroxi o uno de sus derivados seleccionados del grupo constituido por ésteres y derivados N-protegidos, y en el que dicho aminoácido hidroxilado o uno de sus derivados está unido al residuo COO- a través del grupo hidroxi;

(iii) un residuo de un péptido como se ha definido en (ii) unido al residuo COO- a través de un residuo hidrocarbilo C_{1}-C_{25} opcionalmente sustituido por halógeno, oxo, OH, CHO, COOH, o NH_{2}, o un residuo interrumpido por uno o más heteroátomos seleccionados entre O, S y NH, o por un anillo fenilo, está sustituido adicionalmente por un grupo funcional terminal seleccionado entre OH, COOH, o NH_{2}; y

(iv) un residuo de un ligando específico de célula seleccionado de un péptido y una proteína directamente unido al residuo COO- o a través de un residuo hidrocarbilo C_{1}-C_{25} opcionalmente sustituido por halógeno, oxo, OH, CHO, COOH, o NH_{2}, o interrumpido por uno o más heteroátomos seleccionados entre O, S y NH, o por un anillo fenilo, está sustituido adicionalmente por un grupo funcional terminal seleccionado entre OH, COOH, o NH_{2};

R_{2} es H, OH o COOR_{5}, cuando el compuesto es con la fórmula I', o R_{2} es H o R_{5}, cuando el compuesto es con la fórmula II', en la que R_{5} es alquilo C_{1}-C_{12} o cicloalquilo C_{3}-C_{12};

R_{3} es H, OH o alquilo o alcoxi C_{1}-C_{12}, cuando el compuesto es con la fórmula I', o R_{3} es H o alquilo o alcoxi C_{1}-C_{12} cuando el compuesto es con la fórmula II';

M representa un metal con un radio iónico más pequeño al del Cd (r = 95 pm), siendo dicho metal M seleccionado del grupo constituido por un metal divalente seleccionado del grupo constituido por Pd, Co, Ni, y Mn, un metal trivalente seleccionado del grupo constituido por Fe, Mn y Cr, y un metal tetravalente seleccionado del grupo constituido por Sn y Pt.

En una forma de realización preferida, el derivado de [M]-BChl es con la fórmula I en la que R_{1} es fitilo o geranilgeranilo, R_{2} es COOCH_{3}, R_{3} es H u OH, R_{4} en posición 3 es acetilo y en posición 8 es etilo y el metal M es Pd, Ni, Co, o Mn. En otra forma de realización preferida, la sal de un metal M empleada en la etapa (ii) es un cloruro metálico.

En otra forma de realización adicional, las etapas (i) y (ii) se pueden combinar en una sola etapa, es decir, el derivado de bacteriofeofitina se hace reaccionar con un exceso de la sal de un metal M deshidratada apropiada, por ejemplo, un cloruro metálico, en presencia de cantidades catalíticas de la sal de Cd deshidratada, por ejemplo, acetato de Cd, en dimetilformamida o acetona.

Los nuevos derivados de metalobacterioclorofila de la invención con las fórmulas I, II y III y los compuestos derivados de ellos por transesterificación en posición 17^{3} como se ha descrito anteriormente son para su uso como fotosensibilizadores como agentes terapéuticos y diagnósticos, y para matar células, virus y bacterias en muestras y tejidos vivos, como es bien conocido en la técnica para la HPD y otros fotosensibilizadores.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la fototoxicidad de [Pd]-BChl-17^{3}-éster metílico de serilo ([Pd]-BChl-Ser) y BChl-17^{3}-éster metílico de serilo (BChl-Ser) sobre suspensiones bacterianas de S. aureus.

La Fig. 2 muestra la fototoxicidad de [Pd]-BChl-Ser sobre células de melanoma M2R en cultivo por incorporación de [^{3}H]-timidina.

Descripción detallada de la invención

En contraste a porfirinas y clorofilas, la metalación directa de bacterioclorofilas es difícil. El procedimiento de la presente invención permite la obtención de derivados de bacterioclorofilas metalados con propiedades mejoradas para su uso como fotosensibilizadores por transmetalación de los derivados de [Cd]-BChl correspondientes.

Según la presente invención, los complejos de [Cd]-BChl, que son fácilmente accesibles mediante el procedimiento de acetato/dimetilformamida, se pueden transmetalar con un rendimiento excelente a los otros complejos metálicos en condiciones suaves. La transmetalación sencilla usando [Cd]-BChl como precursor es sorprendente y probablemente debida en parte al gran radio iónico (r_{M}) del Cd^{2+} (95 pm) comparado con el Mg^{2+} (r_{M} = 72 pm). Un segundo factor es el disolvente (acetona) en combinación con los contraiones del metal (cloruros) usados para la reacción. Durante la transmetalación, se forma CdCl_{2} y [M]-BChl en equilibrio con los aductos, y la muy baja solubilidad del CdCl_{2} en acetona desplaza el equilibrio hacia el lado de los productos.

En una forma de realización de la presente invención, R_{1} es cualquier radical lineal o ramificado, saturado o insaturado, incluyendo un radical hidrocarbilo aromático, preferentemente de 1-25 átomos de carbono, tal como alquilo, alquenilo, fenilo, preferentemente un alquilo inferior de C_{1}-C_{4} átomos, lo más preferentemente etilo, o un radical procedente de compuestos BChl naturales, por ejemplo, geranilgeranilo (2,6-dimetil-2,6-octadienilo) o fitilo (2,6,10,14-tetrametilhexadec-14-en-16-ilo); y R_{1}' es como se ha definido para R_{1} o es una cadena hidrocarbonada sustituida por un átomo de halógeno seleccionado entre F, Br, Cl y I, o por OH, oxo, CHO, COOH o NH_{2}, o una cadena hidrocarbilo opcionalmente sustituida interrumpida por O, S o NH, preferentemente O, por ejemplo, R_{1}' es un residuo oligooxietilenglicol de 4 a 10 átomos de carbono, preferentemente pentaoxietilenglicol. Cuando R_{1}' sirve como espaciador para un péptido o una proteína como se define en el presente documento, tendrá un grupo funcional terminal seleccionado entre OH, COOH y NH_{2}, a través de cuyo grupo funcional terminal está unido el péptido o la proteína mediante un enlace éster o amida.

En otra forma de realización, R_{1}' es el residuo de un aminoácido o de un péptido que contiene un grupo hidroxi, tal como serina, treonina y tirosina, o péptidos conteniéndolos, o un derivado de dicho aminoácido o péptido seleccionado entre ésteres, por ejemplo, ésteres de alquilo y derivados N-protegidos en los que el grupo N-protector es por ejemplo terc-butoxi, carbobenzoxi o tritilo, y dicho aminoácido o péptido hidroxilado o uno de sus derivados está unido al grupo COO- a través del grupo hidroxi. Los ejemplos de esos derivados de aminoácidos son éster metílico de serina, éster metílico de N-tritil-serina, éster metílico de tirosina, y éster metílico de N-terc-butoxi-tirosina, y un ejemplo de ese péptido es el éster metílico de N-carbobenzoxi-serilserina, todos ellos preparados como se describe en el documento EP 0584552. En una forma de realización más preferida, el derivado [M]-BChl es [Pd]-BChl esterificado con el éster metílico de L-serina.

En otra forma de realización, R_{1}' es el residuo de un ligando específico de célula seleccionado entre péptidos y proteínas, que está ejemplificado por, pero no limitado a, péptidos de hormona, por ejemplo, hormonas estimuladoras de melanocitos (melanotropinas), y anticuerpos, por ejemplo, inmunoglobulinas y anticuerpos específicos de tumor.

Los derivados de [M]-BChl con la fórmula I' en la que M es Zn o Cu también se pueden preparar por metalación directa del derivado BChl desmetalado como se describe a continuación en los Ejemplos 1 a 4.

Algunos de los complejos metálicos de bacterioclorofilas son muy estables y así se pueden usar para modificaciones adicionales en la periferia del sistema anular tetrapirrol que suponen condiciones fuertes tales como el uso de ácido acético o de un ácido mineral fuerte como ácido clorhídrico o sulfúrico. Así, se pueden formar ésteres, por ejemplo, ésteres de alquilo o arilo opcionalmente sustituidos, por reacción de grupos hidroxi, por ejemplo en posición 3^{1} o 13^{2}, con los ácidos alifáticos o aromáticos correspondientes, cloruros de ácido o aminoácidos, y se obtienen éteres en las mismas posiciones por reacción con los alcoholes alifáticos o aromáticos correspondientes. Los compuestos con un grupo hidroxi en posición 3^{1}, por ejemplo, derivados de 3-hidroxietil-BChl, o en posición 13^{2}, por ejemplo, derivados de 13^{2}-OH-BChl, están disponibles mediante procedimientos clásicos (véase, Struck y col., 1992, e Hinninen, 1991). Además, los ésteres de fitilo y geranilgeranilo en posición 17^{3} de origen natural se pueden transesterificar por catálisis ácida a otros ésteres, por ejemplo, al éster etílico, por reacción con el alcohol correspondiente. Se pueden introducir otros sustituyentes en el anillo macrociclo por reacción de Wittig de grupos CO naturales, tales como 3-acetilo en BChl a, o grupos introducidos químicamente como cetoalcoholes esterificados a C-17^{3} así como por acoplamiento oxidativo de grupos OH para formar enlaces éster en C-13^{2}, o por esterificación catalizada por ácidos de grupos OH, por ejemplo, en C-3^{1}, C-13^{1}, C-13^{2}, con ácidos carboxílicos.

En una forma de realización alternativa, las modificaciones en la periferia del sistema anular tetrapirrol se llevan a cabo en el derivado natural de BChl que contiene Mg antes de la desmetalación.

Los derivados de BChl con las fórmulas II y III en el presente documento se pueden obtener a partir de los derivados de BChl correspondientes de origen natural con la fórmula I como se ha descrito previamente (Struck, 1990).

Los compuestos de la invención en la que R_{1}' es un residuo de un aminoácido, un péptido o una proteína, por ejemplo, un anticuerpo, se preparan después del procedimiento de transmetalación de la presente invención, por transesterificación enzimática con la enzima clorofilasa o por condensación catalítica de la bacterioclorofilida apropiada (el ácido libre BChl-17^{3}-COOH) con el aminoácido, péptido o proteína hidroxilado usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) o 4-dimetilaminopiridina (DMAP) como se describe en el documento EP 0584552, o mediante reacciones catalizadas por ácido no toleradas por complejos de Mg como BChl nativa.

Los nuevos derivados de metalobacterioclorofila de la invención son para su uso como fotosensibilizadores como agentes terapéuticos y diagnósticos, y para matar células, virus y bacterias de muestras y tejidos vivos, como es bien conocido en la técnica para la HPD y otros fotosensibilizadores. Estos compuestos son útiles, por ejemplo, en la sensibilización de células neoplásicas u otros tejidos anormales para la destrucción por irradiación ya sea in vivo o ex vivo usando luz de la longitud de onda apropiada. Se cree que la energía de fotoactivación se transfiere al oxígeno endógeno para convertirlo en oxígeno singlete, cuyo oxígeno singlete se considera que es el responsable del efecto citotóxico. Además, las formas fotoactivadas de las bacterioclorofilas fluorescen, cuya fluorescencia puede ayudar en la localización de tumores u otros sitios a los cuales se administran las bacterioclorofilas metaladas.

Los ejemplos de indicaciones, conocidas en la materia, que se pueden tratar con los nuevos derivados de metalobacterioclorofila de la invención, incluyen la destrucción de tejidos tumorales en tumores sólidos, la disolución de placas en vasos sanguíneos (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. Nº 4.512.762), el tratamiento de afecciones tópicas tales como acné, pie de atleta, verrugas, papiloma, y psoriasis, y el tratamiento de productos biológicos (tales como sangre para transfusión) para agentes infecciosos.

Los derivados de metalobacterioclorofila de la presente invención se formulan en composiciones farmacéuticas finales para su administración al paciente o se aplican a una diana in vitro usando técnicas muy conocidas en la materia, por ejemplo, como se resume en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Penna., última edición. Las composiciones se pueden administrar sistémicamente, en particular mediante inyección, o se pueden usar tópicamente.

Para el diagnóstico, los derivados de metalobacterioclorofila se pueden usar solos o se pueden marcar con un radioisótopo u otros medios de detección conocidos en la técnica.

La cantidad de derivado de metalobacterioclorofila a administrar estará de acuerdo con la experiencia acumulada con otras porfirinas usadas en PDT, por ejemplo, y variará dependiendo de la elección del derivado usado como principio activo, la dolencia a tratar, el modo de administración, la edad y condición del paciente, y la valoración del facultativo.

La longitud de onda de luz irradiada se escoge preferentemente para coincidir con la máxima absorbancia del fotosensibilizador metalobacterioclorofila. La longitud de onda adecuada para cualquiera de los compuestos se puede determinar fácilmente a partir de su espectro de absorción.

Además de su uso in vivo, los derivados de metalobacterioclorofila de la invención se pueden usar en el tratamiento de materiales in vitro para matar virus o agentes infecciosos nocivos, tales como bacterias nocivas. Por ejemplo, la sangre y el plasma sanguíneo a usar para futuras transfusiones se pueden tratar con un compuesto de la invención y se pueden irradiar para llevar a cabo la esterilización.

La invención así se refiere adicionalmente a composiciones farmacéuticas que comprenden los derivados de bacterioclorofila metalados con las fórmulas I', II' y III' en el presente documento para terapia fotodinámica y diagnosis de tumores y para la muerte fotodinámica de células, bacterias y virus.

Para estos propósitos, las composiciones se prepararán y administrarán mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. Nº 4.649.151, Nº 4.753.958, Nº 5.256.840 y Nº 5.238.940, la solicitud de patente europea Nº 0584552, y la solicitud PCT Nº WO 90/12573, todas ellas incorporadas en el presente documento por referencia.

La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

En los Ejemplos y la Tabla 1 los compuestos de partida y los complejos metálicos obtenidos estarán identificados mediante los siguientes números en negrita:

1a - Bphe: 1b - BPhe-13^{2}-OH

2a - [Pd]-BChl: 2b - [Pd]-BChl-13^{2}-OH

3a - [Co]-BChl: 3b - [Co]-BChl-13^{2}-OH

4a - [Ni]-BChl: 4b - [Ni]-BChl-13^{2}-OH

5a - [Cu]-BChl: 5b - [Cu]-BChl-13^{2}-OH

6a - [Zn]-BChl: 6b - [Zn]-BChl-13^{2}-OH

7a - BChl: 7b - BChl-13^{2}-OH

8a - [Cd]-BChl: 8b - [Cd]-BChl-13^{2}-OH

9a - [Mn]-BChl: 9b - [Mn]-BChl-13^{2}-OH

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Materiales y procedimientos

(i) Aislamiento de BChl. Se aisló BChl [compuesto 7a] a partir de bacterias fotosintéticas como Rhodobacter (Rb) sphaeroides o Rhodospirillum rubrum según Scherz y Parson, 1984, Struck y col., 1992, o Svec, 1991. La purificación se realizó sobre DEAE-sefarosa según Omata y Murata, 1983.

(ii) Preparación de 13^{2}-hidroxibacterioclorofila a [BChl-13^{2}-OH]. La BChl-13^{2}-OH [compuesto 7b], un compuesto con la fórmula I en la que R_{1} es fitilo, R_{2} es COOCH_{3}, R_{3} es OH, R_{4} en posición 3 es acetilo y en posición 8 es etilo, se preparó por hidroxilación de BChl [7a] en posición C-13^{2} por almacenamiento de 7a en metanol durante 5-7 días en oscuridad a 4ºC (Struck y Scheer, 1990). Alternativamente, se usó el procedimiento de LiBr según Schaber y col., 1984, que dio como resultado menos subproductos. La purificación se realizó en cada caso sobre placas (Silica gel 60 H, Merck) o columnas de gel de sílice preparativa (20 x 20 cm^{2}) con tolueno/acetona (9:1, v:v) como eluyente. La banda azul verdosa que contiene el producto del título (R_{f} \sim0,4) se separó mecánicamente y la BChl a sin reaccionar se extrajo del SiO_{2} con acetona.

(iii) Desmetalación de BChl y BChl-13^{2}-OH. La BPhe [compuesto 1a] y la BPhe-13^{2}-OH [compuesto 1b] se obtuvieron por desmetalación de BChl [7a] y BChl-13^{2}-OH [7b], respectivamente, según Rosenbach-Bellan, 1988, con una pequeña cantidad de ácido acético (el pigmento está recién disuelto). Después de la desmetalación, que ocurre inmediatamente, el ácido acético se elimina mediante una corriente de N_{2}, y se recuperó la BPhe y la BPhe-13^{2}-OH como productos sólidos.

(iv) Clorofilasa (Chlasa). Se preparó polvo de acetona de Chlasa a partir de hojas del árbol L. China Melia azedarach como se describe en el documento EP 0584552.

(v) Cultivo celular. Se cultivaron células de melanoma de ratón M2R en forma de monocapas en medio Eagle modificado de Dulbecco/F12 que contiene HEPES 25 mM a pH 7,4, suero fetal bovino al 10%, glutamina 2 mM, 0,06 mg/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 8% como se ha descrito previamente (Gerst y col., 1986).

(vi) Estudios de fototoxicidad celular. Se cultivaron células de melanoma de ratón M2R (1 x 10^{5} células/pocillo) en microplacas de 24 pocillos y se crecieron durante 24 h hasta 2 x 10^{5} células/pocillo, una confluencia del 70-80% aproximadamente. El derivado de [M]-BChl se disolvió en medio de cultivo y se dispersó por sonicación. Se diluyó Photosan-3 (HPD disponible comercialmente) hasta su concentración final en medio de cultivo. El medio se reemplazó con medio exento de suero y las células se incubaron en oscuridad con la concentración deseada de fotosensibilizadores. Después de 2 h de incubación las células se irradiaron a temperatura ambiente durante 5 min desde la parte inferior de la placa. El medio se reemplazó por medio con suero y las placas de cultivo se volvieron a poner en la incubadora durante 24 h. La eficacia citotóxica en el cultivo celular se determinó por (i) examen microscópico de la morfología celular, (ii) microscopia de fluorescencia de las células después del tratamiento con tinte vital (yoduro de propidio [PID] yoduro metioduro de [2,7-diamino-9-fenil-10-(dietilaminopropil)-fenatridinio]), que se acumula selectivamente en los núcleos de células dañadas, y (iii) la incorporación de [^{3}H]-timidina como se describe adicionalmente a continuación. Los experimentos control incluyen (1) células no tratadas mantenidas en oscuridad, (2) células no tratadas iluminadas, y (3) células tratadas con el fármaco pero mantenidas en oscuridad.

(vii) Fuente de luz. La fuente de luz para la irradiación es una lámpara halógena de 250 W de construcción propia enfocada a través de un filtro de agua de 10 cm sobre un soporte de vidrio y equipada con un filtro líquido (DO de la clorofila a = 10,00 a 660 nm). La dosis de luz se ajusta a 45 mW/cm^{2} en todos los casos.

(viii) Incorporación de [^{3}H]-timidina. Veinticuatro horas después de la PDT, los cultivos celulares se sometieron a pulsos con 1 \muCi/ml de [^{3}H]-timidina durante 2 h a 37ºC. A continuación los cultivos se lavaron dos veces con tampón fosfato salino, se trataron con ácido trifluoroacético frío al 7,5% durante 30 min a 4ºC y se lavaron dos veces con etanol. Se añadió hidróxido sódico (1 N, 300 \mul/pocillo) y las placas se mantuvieron durante 10 minutos a 37ºC. Las muestras de 100 \mul se transfirieron a viales de centelleo, se neutralizaron con 100 \mul de HCl 1 N y la radiactividad se midió por recuento de centelleo en líquidos en 4 ml (20:8 [vol/vol]) de la mezcla lumax de centelleo de xileno según Chen y col., 1988.

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Ejemplo 1 Preparación de [Zn]-BChl y [Zn]-BChl-13^{2}-OH por metalación directa

Se prepararon [Zn]-BChl [compuesto 6a] y [Zn]-BChl-13^{2}-OH [compuesto 6b] por metalación directa de BPhe [1a] y BPhe-13^{2}-OH [1b], respectivamente, mediante el procedimiento de acetato/ácido acético o acetato/dimetilformamida.

1a. Procedimiento de acetato/dimetilformamida (DMF)

Se prepararon [Zn]-BChl y [Zn]-BChl-13^{2}-OH [6a, 6b] calentando a reflujo BPhe y BPhe-13^{2}-OH [1a, 1b], respectivamente, (\sim70 \muM) en DMF con un exceso de 1000 veces de Zn(OAcOAc)_{2} anhidro durante 60 (75) minutos a 110ºC (el reflujo a 163ºC reduce el tiempo de reacción a 5 minutos). La reacción se siguió espectroscópicamente y se llevó hasta su conclusión. El aislamiento y la purificación de los productos se realizó como para los complejos de Cd 8a, 8b a continuación (rendimiento: \sim80%).

1b: Procedimiento de acetato/ácido acético

Se prepararon [Zn]-BChl y [Zn]-BChl-13^{2}-OH [6a, 6b] calentando a reflujo 1a, 1b o 7a, 7b, (\sim70 \muM) en ácido acético glacial, con un exceso de 250 veces de Zn(OAc)_{2} anhidro y ascorbato sódico 50 mM durante 120 (30) minutos a 100ºC. A continuación el ácido acético se evaporó en una corriente de N_{2}, el complejo de Zn se extrajo con dietiléter y se purificó sobre una columna preparativa de HPLC ModCol (250 x 25,4 mm) empaquetada con Bakerbond Silica NP (tamaño de partícula 10 \mum; diámetro de poro 150). El compuesto 6a se eluyó isocráticamente (10 ml/min) de 2-propanol (5%), metanol (5%) y n-hexano (90%, v/v) con un tiempo de retención de 17 minutos aproximadamente, con un rendimiento del \sim75% del compuesto purificado. El compuesto 6b se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice, usando la misma mezcla disolvente que para la HPLC, dando un rendimiento del 90-95%.

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Ejemplo 2 Preparación de [Zn]-BChl-3-vinilo y [Zn]-BChl-3-vinil-13^{2}-OH por metalación directa

La metalación mediante el procedimiento de acetato/DMF como en el Ejemplo 1a se puede extender a otros derivados de la BPhe, cuando se varían ligeramente las condiciones de reacción. Por ejemplo, la metalación de 3-vinil-BPhe o 3-vinil-13^{2}-hidroxi-BPhe con Zn(OAc)_{2} se lleva a cabo en condiciones idénticas en \sim40 minutos a 120ºC.

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Ejemplo 3 Preparación de [Zn]-BChl-13^{2}-descarbometoxi por metalación directa

Los complejos de Zn de 13^{2}-descarbometoxi-BPhe (o 13^{2}-descarbometoxi-BChl) se obtienen en las mismas condiciones descritas anteriormente en el Ejemplo 1b. El tiempo de reacción es de 30 minutos a 100ºC; el aislamiento y la purificación es idéntica a 6b.

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Ejemplo 4 Preparación de [Cu]-BChl, [Cu]-BChl-13^{2}-OH y [Cu]-BChl-13^{2}-descarbometoxi por metalación directa

La [Cu]-BChl (5a) se preparó calentando a reflujo 1a o 7a, (\sim70 \muM) en ácido acético glacial, con un exceso de 250 veces de Cu_{2}O anhidro y ascorbato sódico (50 mM) durante 15 minutos a 100ºC. La [Cu]-BChl-13^{2}-OH (5b) se formó a temperatura ambiente mezclando 1b o 7b, (\sim70 \muM) en ácido acético glacial, con un exceso de 250 veces de Cu_{2}O anhidro y ascorbato sódico 50 mM. Los derivados de Cu de 13^{2}-descarbometoxi-BPhe (o 13^{2}-descarbometoxi-BChl) se obtuvieron en condiciones idénticas a como se describe para 5b. A pesar del uso de Cu_{2}O, los complejos de Cu se formaron en todos los casos debido a la presencia de oxígeno residual o a la desproporción. El aislamiento y purificación se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1b anterior para los complejos de Zn preparados mediante el procedimiento del ácido acético glacial, dando el \sim75% (5a), \sim90% (5b) y \sim90% (derivado de Cu de 13^{2}-descarbometoxi-BChl), respectivamente.

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Ejemplo 5 Preparación de [Cd]-BChl por metalación directa de BPhe

Se preparó [Cd]-BChl calentando a reflujo BPhe 70 \muM aproximadamente en dimetilformamida con un exceso de 300 veces de Cd(OAc)_{2} anhidro durante 40 min a 130ºC. La reacción se siguió espectroscópicamente y se llevó hasta su conclusión. Los productos en bruto aislados por reparto entre dietiléter (DE) y agua saturada con NaHCO_{3} se pueden purificar en gel de sílice en condiciones reductoras (ascorbato sódico al 1,5% mezclado) con tolueno/acetona/trietilamina (88/10/2 v/v/v) como eluyente. La reacción y el tratamiento final se llevaron a cabo bajo la estricta protección con Ar. La banda azul de [Cd]-BChl pura (R_{f} 0,7) se separó mecánicamente y se extrajo con dietiléter/agua como se ha descrito anteriormente para el producto en bruto. El producto puro se usó en todos los procedimientos de transmetalación descritos a continuación. Sus propiedades espectrales (compuesto 8a) se presentan en la Tabla 1.

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Ejemplo 6 Preparación de complejos de [M]-BChl y [M]-BChl-13^{2}-OH de Pd, Co, Ni, Cu, Zn, Cd y Mn por transmetalación de [Cd]-BChl y [Cd]-BChl-13^{2}-OH

Para la preparación del derivado de [Pd]-BChl (2a), la [Cd]-BChl (8a) del Ejemplo 5 se disolvió en acetona seca (A770 = 5 cm^{-1}, \sim50 \muM) bajo la protección estricta con Ar para prevenir la oxidación incontrolada en las posiciones C-7 y C-8. Después de 15 min aproximadamente, se añadió PdCl_{2} (Merck, p.a.) (\sim30 mg/100 ml de disolución) y la mezcla de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante 40 min. La reacción se puede seguir espectroscópicamente (desplazamientos de la banda Qx desde 590 nm a 530 nm tras la formación del producto). El producto esencialmente puro se aisló por extracción con dietiléter/agua como se ha descrito en el Ejemplo 5 para [Cd]-BChl. Si fuera necesario, se lleva a cabo una purificación adicional sobre placas de gel de sílice como se ha descrito para [Cd]-BChl. Las propiedades espectrales de la [Pd]-BChl (2a) se caracterizan en la Tabla 1.

De una manera similar, se preparó [Pd]-BChl-13^{2}-OH (2b) por transmetalación de [Cd]-BChl-13^{2}-OH y los complejos metálicos de Co, Ni, Cu, Zn y Mn de BChl (compuestos 3a, 4a, 5a, 6a, 9a) y de BChl-13^{2}-OH (compuestos 3b, 4b, 5b, 6b, 9b) se prepararon por reacción de [Cd]-BChl y BChl-13^{2}-OH, respectivamente, con los cloruros metálicos correspondientes. Los cloruros metálicos anhidros se añadieron en un exceso molar de 10 veces (Cu: 5a, 5b; Zn: 6a, 6b) un exceso molar de 100 veces (Co: 3a,3b) o hasta saturación en forma de Pd (Ni: 3a, 3b; Mn: 9a, 9b). Las reacciones ocurrieron prácticamente de manera instantánea a 25ºC, excepto para el Pd y el Ni (30-40 minutos de reflujo aproximadamente), y se siguieron espectroscópicamente. Se formaron pequeñas cantidades de productos oxidados en C7-C8 (\lambda_{max} 680 nm) debido a la presencia de oxígeno residual y se pueden suprimir mediante la adición de ascorbato sódico (saturado). El aislamiento y la purificación de los productos se realizó como para la [Cd]-BChl en el Ejemplo 5 anterior. Los productos se caracterizan por absorción, fluorescencia, RMN ^{1}H y FAB-MS como se muestra en la Tabla 1. El espectro de absorción UV/VIS se registró en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lamda 2, la intensidad de las emisiones de fluorescencia en un Spex Fluorolog 221 equipado con una lámpara de xenón de 450 W y normalizada a la sensibilidad del tubo fotomultiplicador y la energía de excitación. Las densidades ópticas máximas para las medidas de fluorescencia fueron de < 0,1 cm^{-1} y la excitación fue en la banda de absorción Qx de 1a, 1b a 9a, 9b. Se registró el espectro de dicroismo circular (CD) en un Dichrograph CD6 (Jobin Yvon). El FAB-MS se registró en un espectrómetro de masas CH7a/SS (Varian MAT) o en un Figan MAT 9000 con una pistola de Cs donde la ionización superficial del líquido se realizó en una matriz de alcohol m-hidroxi-bencílico. El espectro de RMN ^{1}H se registró en un modelo AM360 a 360 MHz Bruker. El disolvente normal era piridina-d_{5}, los desplazamientos químicos están en ppm frente al tetrametilsilano como patrón interno. Los coeficientes de extinción se determinaron mediante el espectro de absorción atómico ICP/ICPMS (AAS) de los metales centrales; antes de la combustión, se evaporó primero el disolvente en las muestras de 1a, 1b a 9a, 9b con densidades ópticas cuantificadas, en tubos de cristal de cuarzo y a continuación las muestras se trataron con ácido nítrico concentrado para permitir la liberación completa del
metal.

TABLA 1 Propiedades espectrales de 1a, 1b-9a, 9b^{a}

7

8

\begin{minipage}[t]{150mm} ^{a} Los espectros de absorción y fluorescencia de los pigmentos 13^{2}\text{-}OH (1b-9b) eran superponibles a aquellos de los respectivos compuestos parentales 13^{2}\text{-}H, excepto por un desplazamiento sistemático al azul de la banda de absorción Qx (intervalo 530-600 nm) de \sim 5 nm. El espectro de masas siempre estaba desplazado por 16 unidades de masa a valores más altos. Todas las longitudes de onda están en [nm]. ^{b} Los coeficientes de absorción y extinción (por AAS) a 298 K en DE (línea superior) y piridina (línea inferior, cursiva). ^{c} Fluorescencia en DE/éter de petróleo/isopropanol (5:5:2; v/v/v) a 298 K (77 K). ^{d} Electronegatividad (\chi _{M}) y radios iónicos efectivos (r_{M} en 10^{-14} m) para un grado de coordinación de 6 (los datos entre corchetes usan radios para un grado de coordinación de 4) de Buchler, 1975. RMN ^{1}H en piridina-d_{5}; (+): señales nítidas, (-): línea extensa ensanchada debido al metal central paramagnético. ^{f} No fluorescente (Spex fluorolog 221). ^{h} Señales de RMN ^{1}H nítidas en C_{2}H_{3}CN.\end{minipage}

Ejemplo 7 Transesterificación de [Pd]-BChl y BChl preferentemente modificadas al éster etílico 17^{3}

Para la preparación de un éster etílico de bacteriofeoforbida de Pd se disolvió [Pd]-BChl en cloroformo (1 mg/ml) y se añadió un volumen idéntico de etanol que contiene H_{2}SO_{4} al 5% en v/v. La mezcla se calentó a temperatura de reflujo en atmósfera de Ar durante 90 min. A continuación la [Pd]-BPhe (100 mg) se transesterificó en 50 ml de ácido sulfúrico en etanol/cloroformo (1:1, v:v) calentando a temperatura de reflujo en Ar durante 2,5 horas. A continuación la mezcla de reacción se diluyó con éter, se lavó varias veces con una disolución acuosa de bicarbonato sódico al 10%. Posteriormente, la fase orgánica se secó y se evaporó. Mediante TLC preparativa en nitrógeno en gel de sílice, eluyendo con acetona en tolueno al 8%, la banda que se mueve más lenta de las dos bandas obtenidas es el compuesto del título (R_{f} = 0,75). VIS en cualquiera de: \lambda_{max} [nm] (intensidad relativa) 329 (0,45); 385 (0,39); 527 (0,13); 755 (0,1). RMN ^{1}H [ppm]: 9,25, 8,80, 8,70 (cada uno s, 1 H, 5-, 10-, 20-H); 4,55 (c, 1 H, 18-H); 4,45 (d, 1 H, 17-H); 4,10 (c, 2 H, 8-CH_{2}CH_{3}); 3,85 (s, 3 H, 13^{2}-CO_{2}CH_{3}); 3,7 (d, 1 H, 7-H); 3,6 (c, 3 H, 17^{3}-CH_{2}CH_{3}); 3,50, 3,32 (cada uno s, 3 H, 2-, 12-CH_{3}); 3,30 (m, 1 H, 8-H); 3,06 (s, 3 H, 3-COCH_{3}); 3,04 (d, 3 H, 7-CH_{3}); 2,65 (2 H, 17^{1}-H_{2}); 2,45 (2 H, 17^{2}-H_{2}); 1,75 (d, 3 H, 18-CH_{3}); 1,65 (t, 3 H, 8 CH_{2}CH_{3}); 1,38 (t, 3 H, 17^{3}-CH_{2}CH_{3}); 0,10 y -1,90 (s, 2 H, 2 NH). FAB-MS calculado para Pd-C_{37}H_{40}N_{4}O_{6}: 742,38 (M+1). Hallado 742,2 (M+1).

Se pueden preparar ésteres de etilo y otros ésteres de otros complejos metálicos estables en ácido, como Ni, Cu, Zn, de derivados de BChl de una manera similar.

Ejemplo 8 Preparación de [Pd]-BChl-17^{3}-éster metílico de serilo, [Pd]-BChl-17^{3}-L-Ser-OMe ([Pd]-BChl-Ser)

La transesterificación enzimática de [Pd]-BChl preparada en el Ejemplo 6 anterior con el clorhidrato del éster metílico de L-serina (Sigma) se llevó a cabo con polvo de acetona clorofilasa como se describe en el documento EP 0584552 produciendo el compuesto del título, designado en el presente documento [Pd]-BChl-Ser, un compuesto con la fórmula I' en el presente documento en la que R_{1}' es el residuo éster metílico de serilo unido al grupo COO- a través del grupo hidroxiserina.

Mediante el mismo procedimiento de transesterificación enzimática, se pueden preparar los ésteres metílicos de 17^{3}-serilo correspondientes de otros complejos metálicos [M]-BChl según la invención así como ésteres de [Pd]-BChl-17^{2} con otros derivados de serina, por ejemplo, éster metílico de N-tritilo-L-serina y el éster metílico de N-carbobenzoxiserilserina, o con derivados de tirosina, por ejemplo, éster metílico de N-terc-butoxicarboniltirosina como se describe en el documento EP 0584552.

Ejemplo 9 Fototoxicidad in vitro de [Pd]-BChl-Ser 9a. Bacterias y virus

El ensayo de fototoxicidad consta de tres etapas discretas: incubación de una disolución bacteriana con el sensibilizador, iluminación y valoración de la fototoxicidad.

Se incubaron suspensiones (\sim1 x 10^{7} bacterias/200 \mul) de S. aureus fresco en tampón fosfato salino (PBS) con las concentraciones dadas de los sensibilizadores [Pd]-BChl-Ser o BChl-Ser durante 1 hora en oscuridad y posteriormente se lavó para la eliminación del pigmento por centrifugación y resuspensión en PBS. Las suspensiones bacterianas lavadas se iluminaron durante 5 min usando como fuente de luz una lámpara de xenón de construcción propia con una emisión vertical de 1000 lux/cm^{2} a nivel del objetivo, usando un filtro líquido (DO de la clorofila a = 10,00 a 660 nm). El daño fotodinámico se valoró por determinación de la supervivencia bacteriana: se cultivaron muestras de la suspensión bacteriana irradiada (30 \mul) en 3 ml de medio de cultivo bacteriano líquido de infusión de cerebro y corazón (BHI) durante 2 h a 37ºC con agitación. La densidad bacteriana se midió por turbidez a \lambda = 660 nm.

Cada experimento consta de (a) un grupo experimental (bacterias sometidas al tratamiento completo) y 3 grupos control: (b) bacterias irradiadas sin el sensibilizador, (c) bacterias sin irradiar tratadas con el sensibilizador, y (d) bacterias sin tratar (100% de supervivencia).

Como se muestra en la Figura 1, los efectos fototóxicos de la [Pd]-BChl-Ser son dependientes de la dosis con respecto a las concentraciones de sensibilizador (DL_{50} \sim0,6 \muM) y no se confirió toxicidad en oscuridad. Se obtuvieron resultados similares con la BChl-Ser, probada como comparación en las mismas condiciones, con una DL_{50} ligera, pero insignificantemente inferior.

Los ensayos se repitieron con B. subtilis y Propionibacterium acnes y con herpesvirus simplex 1 (HSV-1) tanto en suspensión como en células infectadas, y se obtuvieron resultados de fototoxicidad similares (no mostrado).

9b. Células de melanoma

El ensayo se llevó a cabo como se describe en Materiales y procedimientos anteriormente, secciones (iv) a (viii). Se incubaron monocapas de células M2R con las concentraciones indicadas de [Pd]-BChl-Ser durante 1 h y se sometieron a tratamiento fotodinámico como se ha descrito anteriormente. La fototoxicidad se valoró por incorporación de [^{3}H]-timidina y en la figura 2 se describe el porcentaje de supervivencia de las células tratadas y los controles apropiados. La supervivencia de las células no tratadas se tomó como el 100%.

Se puede observar en la Figura 2 que el efecto fototóxico era dependiente de la dosis con respecto a la concentración de [Pd]-BChl-Ser con una DL_{50} aproximada de 0,05 \muM. No se observó el efecto fototóxico en los controles en oscuridad.

Bibliografía

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Claims

1. Un procedimiento para la preparación de un derivado de [M]-bacterioclorofila metalado sintético con la fórmula:

[M]-BChl

en la que el derivado [M]-BChl se selecciona de un compuesto con la fórmula I, II o III:

9

en la que

R_{1} es un residuo hidrocarbilo C_{1}-C_{25};

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M representa un metal con un radio iónico más pequeño al del Cd (r = 95 pm), siendo dicho metal M seleccionado del grupo constituido por un metal divalente seleccionado del grupo constituido por Pd, Co, Ni, y Mn, un metal trivalente seleccionado del grupo constituido por Fe, Mn y Cr, y un metal tetravalente seleccionado del grupo constituido por Sn y Pt;

cuyo procedimiento comprende:

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que dicho metal M es Pd, Ni, Co o Mn, y BChl es un residuo de un derivado de bacterioclorofila con la fórmula I en la que R_{1} es fitilo o geranilgeranilo, R_{2} es COOCH_{3}, R_{3} es H u OH, R_{4} en posición 3 es acetilo y en posición 8 es etilo.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que dicha sal de un metal M empleada en dicha etapa (ii) es un cloruro de metal.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que dichas etapas (i) y (ii) se combinan en una única etapa, y dicho derivado de bacteriofeofitina se hace reaccionar con un exceso de la sal de un metal M deshidratada apropiada en presencia de cantidades catalíticas del acetato de Cd deshidratado en dimetilformamida o acetona.

5. Un derivado de bacterioclorofila metalado con la fórmula I, II o III como se ha definido en la reivindicación 1, en el que R_{1} es un residuo hidrocarbilo C_{1}-C_{25}; R_{2} es H, OH o COOR_{5}, cuando el compuesto es con la fórmula I, o R_{2} es H o R_{5}, cuando el compuesto es con la fórmula II, en la que R_{5} es alquilo C_{1}-C_{12} o cicloalquilo C_{3}-C_{12}; R_{3} es H, OH o alquilo o alcoxi C_{1}-C_{12}, cuando el compuesto es con la fórmula I, o R_{3} es H o alquilo o alcoxi C_{1}-C_{12} cuando el compuesto es con la fórmula II; R_{4} se selecciona cada uno independientemente del grupo constituido por vinilo, etilo, acetilo, 1-hidroxietilo y éteres y ésteres de los mismos; y M representa un metal con un radio iónico más pequeño al del Cd (r = 95 pm), siendo dicho metal M seleccionado del grupo constituido por un metal divalente seleccionado del grupo constituido por Pd, Co, Ni, y Mn, un metal trivalente seleccionado del grupo constituido por Fe, Mn y Cr, y un metal tetravalente seleccionado del grupo constituido por Sn y Pt.