TWI687231B - 用於膀胱癌成像及光動力療法的多重模式生物探針 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於基於具有特異性官能基之卟啉-鑭系元素錯合物之新一代PDT藥劑，該等藥劑可特異性定位於特定腫瘤，且其PDT過程可經由鉺之NIR發射監測。特定言之，本發明提供多重模式鑭系元素-卟啉PDT藥劑(Er-R 3 )，其能夠經由來自卟啉部分之1O2選擇性殺死膀胱腫瘤細胞，且在Er-R 3 與膀胱癌細胞中之整合素α v β 3 同功型結合時同時提供螢光成像。
Description
本申請案主張2016年11月15日申請之美國專利申請案第15/352,561號及2016年10月5日申請之美國臨時申請案第62/404,222之權益，其兩者以全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於基於卟啉-鑭系元素錯合物之新一代光動力療法藥劑，且該光動力療法過程可經由鉺之NIR發射監測。特定言之，本發明提供能夠殺死膀胱腫瘤細胞之多重模式鑭系元素-卟啉光動力療法藥劑。
光動力療法(Photodynamic Therapy；PDT)新興作為幫助患者存活更長且改善其生活品質而不引起長期副作用的新穎癌症治療模式。歸因於現有技術限制及未有實際進展，PDT仍未能在社會中達到應得普及性，因為其僅在一些治療中心中提供且研究具有極少臨床試驗。最近，在美國食品與藥物管理局(Food and Drug Administration；FDA)已核准三種PDT光敏劑，例如胺基乙醯丙酸(Aminolevulinic acid；ALA)後，隨著PDT廣泛認可為局部癌症(亦即非轉移性癌症)以及皮膚及口中的前癌症 的有價值的治療選擇，PDT已開始復興。然而，習知PDT仍具有若干侷限性及缺陷：(i)其僅能夠治療光可到達的患病區域，亦即皮膚上或僅在皮膚下；(ii)當前所用PDT藥物可使人們對光極其敏感，且因此在已將藥物置於身體中或身體上之後必須採取特殊防護措施；(iii)歸因於生理條件之變化及細胞毒性單態氧之缺口分佈，發生不利的試管內/活體內反應；及(iv)非特異性治療性質可在PDT治療期間危及正常細胞。
就此而言，全世界科學家已深入探究另一種新穎類別的有前景的PDT藥劑，卟啉類部分，以開發光動力療法，其可用於且對其他類型的癌症及疾病有效，尤其在皮膚、膀胱、口及大腦中。就所關注之單態氧(1O2)生成之光穿透深度而言，數種卟啉部分已成功地展示達成近紅外(near-infrared；NIR)激發(經由多光子/二階諧波生成)之可能性。NIR光子可穿透深部且自組織迅速發射，不引起細胞損害，且其強的雙光子吸收特性處於約860nm。在文獻及參考之專利申請中，揭示一種卟啉合金屬錯合物，其可充當活體內抗癌魚雷(torpedo)，該抗癌魚雷具有用於成像之可見至NIR發射及用於腫瘤細胞選擇性之鑑別雷達，及1O2爆發性彈藥。然而，此等PDT藥劑之癌症選擇性仍尚未解決且存在提供具有較好癌症選擇性的PDT藥劑的需要。
本發明之目標為提供PDT探針，其可特異性定位於特定腫瘤上，且其PDT過程可經由NIR發射監測。
在本發明之第一態樣中提供用於光動力療法及癌細胞成像之組成物，其包含式(I)之釓卟啉錯合物(Gd-N)：
其中Ln=Gd，或其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明之第一態樣之第一具體實例中提供用於光動力療法及癌細胞成像之組成物，其中癌細胞具有陰離子細胞膜。
在本發明之第二態樣中提供光動力療法及癌細胞成像之方法，其包含向有需要之個體投予根據本發明之第一態樣之組成物且將輻射源輻射至有需要之個體體內的癌細胞。
在本發明之第二態樣之第一具體實例中，投予該組成物經靜脈內進行或藉由注射至該癌細胞之部位進行。
在本發明之第二態樣之第二具體實例中，提供光動力療法及癌細胞成像之方法，其包含向有需要之個體投予根據本發明之第一態樣之組成物且用輻射源輻射有需要之個體體內的癌細胞，其中該輻射源為波長約860nm之光源。
在本發明之第三態樣中提供合成式(I)化合物之方法，其包含根據流程1之步驟：
其中步驟a)：自Gd[N(SiMe3)2]3．[Li(THF)3Cl]x之溶液移除溶劑以形成LiCl沈澱；向LiCl沈澱添加二氯甲烷(CH2Cl2)以形成第一混合物，其中第一混合物經離心以自該第一混合物分離澄清層；將澄清層轉移至溶解於甲苯溶液中之卟啉自由鹼三氟丙基-三甲氧基矽烷(TFP-TMS)以形成第二混合物；使第二混合物回流直至卟啉自由鹼與金屬離子配位，以形成經回流第二混合物；將經回流第二混合物冷卻至室溫以形成冷卻之經回流第二混合物；向冷卻之經回流第二混合物添加無水Na{(η5-C5H5)Co[P(=O)(OMe)2]3}以形成第三混合物；攪拌第三混合物；自第三混合物移除溶劑以形成第一殘餘物；將第一殘餘物溶解於CH2Cl2中以形成第四混合物；過濾且使用 CH2Cl2/己烷作為溶析液管柱層析第四混合物以產生Gd-TMS；步驟b)：向溶解於CH2Cl2中之Gd-TMS溶液添加氟化四丁銨，且攪拌Gd-TMS溶液以產生化學反應；在完成化學反應後，使溶液通過管柱層析以形成第五混合物；自第五混合物移除溶劑以獲得中間體；將中間體及4-碘苯酚溶解於無水四氫呋喃及三乙胺中以形成第六混合物；使第六混合物與氮氣混合以形成氮化第六混合物；添加Pd(PPh3)4及CuI至該氮化第六混合物以形成第七混合物；在至少35℃下在氮氣氛圍下攪拌第七混合物至少10小時以產生經攪拌第七混合物；自經攪拌之第七混合物移除溶劑以產生第二殘餘物；用CH2Cl2/甲醇作為溶析液使用管柱層析法純化第二殘餘物以產生Gd-OH；步驟c)：向溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺之四乙二醇二碘化物及Gd-OH溶液中添加無水K2CO3以形成第八混合物；在氮氣氛圍下將該第八混合物加熱至至少80℃持續至少8小時以形成經加熱第八混合物；自經加熱第八混合物移除溶劑以形成第一粗產物；使用管柱層析法藉由CH2Cl2/CH3OH溶析來純化第一粗產物以產生Gd-I，且步驟d)：向溶解於無水DMF中之Gd-I溶液添加無水NEt3以形成第九混合物；在氮氣氛圍下將第九混合物加熱至至少85℃持續至少24小時以形成經加熱第九混合物；自經加熱第九混合物移除溶劑以獲得第二粗產物；使用管柱層析法用CH2Cl2/CH3OH作為溶析液純化第二粗產物以移除未反應之Gd-I及其他雜質，且用CH2Cl2/CH3OH作為溶析液進一步純化以獲得Gd-N。
在本發明之第四態樣中提供多重模式鑭系元素-卟啉PDT藥 劑(Er-R 3 )，其能夠經由來自卟啉部分之1O2殺死膀胱腫瘤細胞選擇性，且在Er-R 3 與膀胱癌細胞中之整合素α v β 3 同功型結合時同時提供螢光成像。
在本發明之第五態樣中提供用於光動力療法及癌細胞成像之組成物，其包含由以下分子式表示之鉺卟啉類錯合物或鐿卟啉類錯合物或釓卟啉類錯合物：
其中Ln為Er、Yb或Gd；且Rn為具有選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3組成之群的胺基酸序列的多肽；或由選自由Gd1、Gd2、Gd3、Gd4及Gd5組成之群的分子式表示的水溶性卟啉類釓錯合物：
其中Rn為
；或具有選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3組成之群的胺基酸序列的多肽或其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明之第五態樣之第一具體實例中提供組成物，在該組 成物中鉺卟啉類錯合物與整合素α v β 3 同功型特異性肽共軛。
在本發明之第五態樣之第二具體實例中提供組成物，在該組成物中鉺卟啉類錯合物與肽RrRk(SEQ ID NO：4)共軛。
在本發明之第五態樣之第三具體實例中提供組成物，在該組成物中鉺卟啉類錯合物與整合素α v β 3 同功型特異性肽序列(-cGRLKEKKc-)(SEQ ID NO：5)共軛。
在本發明之第五態樣之第四具體實例中提供組成物，在該組成物中鉺卟啉類錯合物與肽RrRk(SEQ ID NO：4)及整合素α v β 3 同功型特異性肽序列(-cGRLKEKKc-)(SEQ ID NO：5)共軛。
在本發明之第五態樣之第五具體實例中提供組成物，其包含由以下分子式表示之鉺卟啉類錯合物：
其中Ln為Er且Rn為具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列的多肽。
在本發明之第五態樣之第六具體實例中提供組成物，其中癌 細胞包含膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞及肺癌。
在本發明之第六態樣中提供光動力療法及癌細胞成像之方法，其包含向有需要之個體投予該組成物且用輻射源輻射有需要之個體體內的癌細胞。
在本發明之第六態樣之第一具體實例中提供方法，其中投予該組成物經靜脈內進行或藉由注射至該等癌細胞之部位進行。
在本發明之第六態樣之第二具體實例中提供方法，其中該輻射源為具有卟啉之Q波段中之波長的光源。
在本發明之第六態樣之第三具體實例中提供方法，其中該輻射源為波長超過550nm或為860nm之光源。
在本發明之第六態樣之第四具體實例中提供方法，其中該成像使用螢光成像、NIR成像或MRI成像進行
在本發明之第六態樣之第五具體實例中提供方法，其中當Ln為Gd，或Ln為Gd1、Gd2、Gd3、Gd4或Gd5時該成像使用MRI成像進行。
在本發明之第七態樣中提供合成如技術方案1之組成物之方法，其中Ln=Er或Ln=Yb，該方法包含根據以下流程之步驟：
其中該化合物Por(THP-TMS)經由包含以下之步驟合成：在氬氣氛圍下將吡咯、五氟苯甲醛及4-[2-(三甲基矽基)乙炔基]苯甲醛6溶解於CH2Cl2中以產生第一溶液；使該第一溶液靜置至少10分鐘；向該第一溶液添加BF3.O(Et)2；在室溫下攪拌第一溶液至少1小時；向該第一溶液添加DDQ(2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌)；在室溫下再攪拌該第一溶液至少1小時；在真空中自該第一溶液移除溶劑以產生第一混合物；使該第一混合物通過二氧化矽管柱(己烷-CH2Cl2)，在減壓下濃縮以產生5,10,15-參(五氟苯基)-20-[4-{2-(三甲基矽基)乙炔基}苯基卟啉]或Por(THP-TMS)；該化合物Ln-1經由包含以下之步驟合成： 在約攝氏0度下將Ln[N(SiMe3)2]3．x[LiCl(THF)3]：HN(SiMe3)2溶解於THF中以產生第二溶液；歷經至少30分鐘時間向該第二溶液緩慢添加n-BuLi；攪拌該第二溶液至少12小時；將該第二溶液轉移至具有懸浮於THF中之LnCl3的Schlenk燒瓶以產生第二混合物；攪拌該第二混合物至少24小時直至所有固體LnCl3消失，以產生Ln[N(SiMe3)2]3‧x[Li(THF)3Cl](x=3至5)，其中Ln=Er或Ln=Yb；該化合物Yb-1另外經由包含以下之步驟合成：將Yb[N(SiMe3)2]3‧x[Li(THF)3Cl](x=3至5)轉移至Schlenk燒瓶；在真空下自Yb[N(SiMe3)2]3‧x[Li(THF)3Cl](x=3至5)移除溶劑以產生第一殘餘物；向該第一殘餘物添加CH2Cl2以沈澱LiCl，以產生第三混合物；使該第三混合物離心直至產生澄清層；將該澄清層轉移至另一個具有溶解於甲苯中之無水Por(THP-TMS)自由鹼的Schlenk燒瓶，以產生第三溶液；使第三溶液回流直至大部分自由鹼與金屬離子配位；向該第三溶液添加無水NaLOMe[LOMe-((環戊二烯基)參(二甲基亞磷酸根)-鈷酸根或陰離子三腳架配位體(tripodalligand))以產生第四混合物；再攪拌該第四混合物至少12小時；將該第四混合物冷卻至室溫；在真空中自該第四混合物移除溶劑以產生第二殘餘物； 將該第二殘餘物溶解於CHCl3中；過濾且使用CHCl3/石油醚作為溶析液在矽膠上層析溶解之第二殘餘物；將來自層析之輸出物進一步溶解於CH2Cl2中；且過濾該溶液以產生化合物Yb-1；該化合物Er-1另外經由包含以下之步驟合成：如與Yb-1相同之步驟，用Er[N(SiMe3)2]3‧x[Li(THF)3Cl](x=3至5)替換Yb[N(SiMe3)2]3‧x[Li(THF)3Cl](x=3至5)；其中Ln=Yr之該化合物Ln-2經由包含以下之步驟合成：向溶解於CH2Cl2中之Yb-1溶液添加TBAF以產生第五溶液；攪拌第五溶液至少30分鐘；藉由TLC監測該第五溶液之反應進程；反應完成後，使該第五溶液通過短矽膠管柱；自該第五溶液移除溶劑以產生Yr-2；該化合物Er-2另外經由包含以下之步驟合成：如與Yb-2相同之步驟，用Er-1替換Yb-1；其中Ln=Yr之該化合物Ln-4經由包含以下之步驟合成：在氮氣下在乾燥燒瓶中混合Pd(PPh3)4、CuI、Yb-2及4-碘苯甲酸以產生第五混合物；向該第五混合物添加THF及NEt3且用氮氣使該第五混合物脫氣；在至少40℃下攪拌該第五混合物至少12小時；在減壓下自該第五混合物移除溶劑以產生第三殘餘物； 藉由層析純化該第三殘餘物；用CH2Cl2/甲醇溶析該經純化之第三殘餘物以產生經溶析化合物；在乾燥燒瓶中且在氮氣下混合該經溶析化合物、EDCI、NHS以產生第六混合物；向該第六混合物添加無水DMF；在室溫下攪拌第六混合物至少48小時；自經攪拌第六混合物移除溶劑以產生第四殘餘物；藉由二乙醚使該第四殘餘物再結晶且乾燥該等晶體以產生Yb-4；該化合物Er-4另外經由包含以下之步驟合成：如與Yb-4相同之步驟，用Er-2替換Yb-2；該化合物Yb-R1經由包含以下之步驟合成：將溶解於無水DMF之Yb-4之經攪拌溶液與N,N'-二異丙基乙胺(DIPEA)混合以產生第七混合物；向該第七混合物添加肽R1；使該第七混合物在室溫下反應至少24小時；在真空下自該第七混合物移除溶劑以產生無水第五殘餘物；藉由二乙醚使該無水第五殘餘物再結晶至少三次；乾燥該再結晶無水第五殘餘物以產生Yb-R1；該化合物Yb-R2另外經由包含以下之步驟合成：如與Yb-R1相同之步驟，用R2替換R1；該化合物Yb-R3另外經由包含以下之步驟合成：如與Yb-R1相同之步驟，用R3替換R1； 該化合物Er-R1另外經由包含以下之步驟合成：如與Yb-R1相同之步驟，用Er-4替換Yb-4；該化合物Er-R2另外經由包含以下之步驟合成：如與Yb-R2相同之步驟，用Er-4替換Yb-4；該化合物Er-R3另外經由包含以下之步驟合成：如與Yb-R3相同之步驟，用Er-4替換Yb-4。
在本發明之第八態樣中提供合成如技術方案1之組成物之方法，其包含根據以下流程之步驟：
其中該化合物Por-TMS經由包含以下之步驟合成：在丙酸中混合4-((三甲基矽基)乙炔基)苯甲醛與吡啶-4-甲醛以產生第八混合物；在至少130℃下攪拌該第八混合物至少半小時；向該第八混合物中逐滴添加吡咯，且溫度升高至至少140℃；在開放環境中攪拌該第八混合物至少30分鐘；將該第八混合物冷卻至室溫； 在減壓下自該第八混合物移除溶劑以產生粗產物；將該粗產物溶解於CH2Cl2中以產生第六溶液；藉由在矽膠管柱上CH2Cl2/甲醇管柱層析純化該第六溶液以產生Por-TMS；該化合物Gd[N(SiMe3)2]3．x[LiCl(THF)3]經由包含以下之步驟合成：在約攝氏0度下將HN(SiMe3)2溶解於THF中以產生第七溶液；歷經至少30分鐘時間向該第七溶液添加n-BuLi；攪拌該第七溶液至少12小時直至獲得澄清淡黃色溶液；將該第七溶液轉移至具有懸浮於THF中之GdCl3的Schlenk燒瓶以產生第九混合物；攪拌該第九混合物至少24小時直至所有固體GdCl3消失，以產生所得溶液Gd[N(SiMe3)2]3．x[LiCl(THF)3](x=3至5)；該化合物Gd-1-L1經由包含以下之步驟合成：將Gd[N(SiMe3)2]3．x[LiCl(THF)3](x=3至5)轉移至Schlenk燒瓶且在真空下移除其中的溶劑以產生第六殘餘物；向該第六殘餘物添加CH2Cl2以沈澱LiCl，以產生第十混合物；使該第十混合物離心直至產生澄清層；將該澄清層轉移至另一個具有溶解於甲苯中之無水Por-TMS自由鹼的Schlenk燒瓶，以產生第八溶液；使該第八溶液回流直至大部分的該自由鹼與金屬離子配位；向該第八溶液添加無水NaL1(0.1g，0.22mmol)[L1-((環戊二烯基)參(二甲基亞磷酸根)-鈷酸根，陰離子三腳架配位體)，以產生第十一混合物； 再攪拌該第十一混合物至少12小時；將該第十一混合物冷卻至室溫；在真空中自該第十一混合物移除溶劑以產生第七殘餘物；將該第七殘餘物溶解於CHCl3中；過濾且使用CHCl3/CH3OH醚作為溶析液在矽膠上層析該溶解的第二殘餘物；將來自層析之輸出物進一步溶解於CH2Cl2中；且過濾經溶解輸出物以產生化合物Gd-1-L1。
該化合物Gd-1-L2經由包含以下之步驟合成：如與Gd-1-L1相同之步驟，用KL2(參(1-吡唑基)硼氫化鉀)替換NaL1；該化合物Gd-3經由包含以下之步驟合成：向溶解於DCM中之Gd-1-L1溶液添加TBAF以產生第九溶液；攪拌該第九溶液至少30分鐘；藉由TLC監測該第九溶液之反應；使第九溶液通過使用DCM之短矽膠管柱以移除其中的溶劑，以產生純產物；將該純產物及Pd(PPh3)4、CuI、4-碘苯甲酸置放於乾燥燒瓶中及氮氣下，以產生第十二混合物；向該第十二混合物添加THF及NEt3；用氮氣使該第十二混合物脫氣；在至少40℃之溫度下攪拌該第十二混合物至少12小時；在減壓下自該第十二混合物移除溶劑以產生第八殘餘物； 藉由層析純化該第八殘餘物；用CH2Cl2/甲醇溶析該經純化之第八殘餘物；將該溶析之經純化第八殘餘物、EDCI、NHS置放於乾燥燒瓶中及氮氣下以產生第十三混合物；向第十三混合物添加無水DMF；在室溫下攪拌第十三混合物至少48小時；自該第十三混合物移除溶劑以產生第九殘餘物；藉由二乙醚使該第九殘餘物再結晶且乾燥該等晶體以產生Gd-3；將Gd-3溶解於DMF中；向該溶解之Gd-3添加CH3I；攪拌該溶解之Gd-3至少5小時；自該經攪拌溶解之Gd-3移除溶劑以產生第十殘餘物；用醚.DCM洗滌該第十殘餘物以產生純Gd-3；該化合物Gd-4經由包含以下之步驟合成：如與Gd-3相同之步驟，用Gd-1-L2替換Gd-1-L1；該化合物Gd-3-Rn經由包含以下之步驟合成：將溶解於無水DMF中經攪拌之Gd-3溶液與N,N'-二異丙基乙胺(DIPEA)混合以產生第十四混合物；向該第十四混合物添加肽Rn；在室溫下使該第十四混合物反應至少24小時；在真空下自該第十四混合物移除溶劑以產生無水第十一殘餘物；藉由二乙醚使該無水第十一殘餘物再結晶至少三次且進一步乾燥該產 物以產生Gd-3-Rn；該化合物Gd-4-Rn經由包含以下之步驟合成：如與Gd-3-Rn相同之步驟，用Gd-4替換Gd-3。
結合本發明之特定態樣、具體實例或實施例描述之特徵、整體、特性、化合物、化學部分或基團應理解為適用於本文所描述之任何其他態樣、具體實例或實施例，除非與其不相容。
熟習此項技術者應瞭解，本文所述之本發明除特定描述之彼等內容外允許進行變化及修改。
本發明包括全部此類變化及修改。本發明亦包括本說明書中單獨或共同提及或指示的所有步驟及特徵，以及該等步驟或特徵中之任兩者或多於兩者的任何及所有組合。
在此說明書中，除非本文另有規定，否則詞語「包含(comprise)」或變化形式，諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」，應理解為暗示包括所陳述之整體或整體的群組，但不排除任何其他整體或整體的群組。在本發明中且尤其在申請專利範圍及/或段落中亦應注意，諸如「包含(comprises)」、「包含(comprised)」、「包含(comprising)」及其類似物之術語可具有其歸於美國專利法中之含義；例如其可意謂「包括(includes)」、「包括(included)」、「包括(including)」及其類似物；且諸如「基本上由……組成(consisting essentially of)」及「基本上由……組成(consists essentially of)」之術語具有其歸於美國專利法中之含義，例如其使得要素無需明確列舉，但排除先前技術中所發現或影響本發明之基礎或新穎特徵的要素。
此外，在本說明書及申請專利範圍通篇，除非本文另有規定，否則詞語「包括(include)」或諸如「包括(includes)」或「包括(including)」的變化形式應理解為暗示包括所陳述整體或整體的群組，但不排除任何其他整體或整體的群組。
本文中所用之所選術語的其他定義可見於本發明之實施方式內且通篇應用。除非另外定義，否則本文所用之所有其他技術術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常理解的相同意義。
藉由閱讀隨後描述，熟習此項技術者將清楚本發明之其他態樣及優勢。
當結合附圖時，本發明的以上及其他目標及特徵將由本發明的以下描述變得顯而易見，其中：
圖1A展示癌細胞特異性光動力療法藥劑(Gd-N)及其對照類似物Yb-N、Gd-RhB及Yb-RhB之分子結構。
圖1B為在HeLa細胞中培育15小時後Gd-N之3D試管內成像。
圖1C及圖1D分別展示Gd-N在癌細胞(HeLa)及正常細胞(WPMY-1)中之次細胞定位(subcellular localization)的差異。
圖2展示Gd-N之發射光譜(HEPES緩衝溶液，10μM，λex=430nm，pH=7.4)及1O2量子產率量測值(1O2 CHCl3之近紅外磷光光譜，10μM，λex=430nm，abs(λex)=0.03)。Yb-N及H2TPP以類似方式量測作為對照。
圖3展示在培育2小時後Gd-N及Gd-RhB在腫瘤細胞-HeLa及正常細胞-MRC5(作為對照)中之試管內成像。PDT效果在860nm激發時觸發。A)Gd-RhB在HeLa中；b)Gd-RhB在MRC-5中；c)Gd-N在HeLa中；d)Gd-N在MRC-5中(1μM)。
圖4展示Gd-N、Gd-RhB(對照)及Yb-N(對照)對(A)癌細胞(HeLa)及(B)正常細胞(QSG 7701)之光細胞毒性。Gd-N(1O2可用，腫瘤特異性，在癌細胞中強的光細胞毒性，但在正常細胞中無光細胞毒性)，Gd-RhB(對照-1O2可用，非腫瘤特異性，強的癌症及正常細胞光細胞毒性)及Yb-N(對照，1O2不可用，在癌症及正常細胞中無光細胞毒性)。使用1μM之共軛物及0至1J/cm2之各種光劑量獲得光細胞毒性曲線；在培育24小時後進行MTT分析。(37℃，5% CO2)。
圖5展示腫瘤特異性Gd-N在四個腫瘤細胞株(HeLa，SK-N-SH，HK-1及A549)及三個正常細胞株(QSG 7701，MRC-5，WPMY-1)中之試管內光細胞毒性(λex=430nm)，以及兩個對照-Yb-N及Gd-RhB。
圖6展示Gd-N作為癌細胞特異性PDT藥劑之活體內研究。A)在使用860nm雷射激發之PDT後腫瘤之代表性光澤影像，且候選物分成四組(第1組：Yb-N；第2組：Gd-N；第3組：Yb-RhB；第4組：Gd-RhB)；b)a)中之腫瘤體積之量測值；c)經由ICP-MS研究之Gd-N之活體內生物分佈；d)c)中之腫瘤樣品之雙光子顯微鏡影像；e)Gd-N之活體內腫瘤抑制分析；f)藉由尾側靜脈注射經由Gd-N誘導之1O2之活體內腫瘤抑制。
圖7展示Gd-N及Gd-RhB誘導之1O2活化細胞凋亡蛋白質 家族之抑制劑及mTOR路徑。(A)用1μM Gd-N或Gd-RhB給藥且經0.5J/cm2輻射之HeLa細胞之西方墨點。未處理或無化學品樣品充當對照。(B)(A)中西方墨點色帶之細胞蛋白質變化使用Gel-Pro Analyzer軟體來半定量量測，且展示為與β-肌動蛋白(總蛋白質之內參考物)之比率。P值在未處理與Gd-N或Gd-RhB之間加上雷射組藉由單因子變異數分析計算。
圖8展示A)Gd-N之高解析度MALDI-TOF質譜；B)分子態離子Gd-N之同位素圖型；C)分子態離子Gd-N之經計算MS圖型(使用軟體：IsoPro 3.0)。
圖9展示Gd-N及Gd-RhB之吸收光譜。
圖10展示(A)釓卟啉錯合物(Gd-N)及(B)鐿卟啉錯合物(Yb-N)中能量吸收、遷移及發射(由
指示)過程之示意性圖示。
圖11展示DMSO(5μM)中在800nm處激發之Gd-N(351GM)及Gd-RhB(418GM)之開孔Z掃描軌跡。雷射光束之平均功率為0.271mW。
圖12展示(a)Ln-R n 之分子結構，(b)水溶液中之Ln-R n 在430nm激發下之可見光譜(濃度=1M，Ln=Er或Yb，n=1、2及3)及(c)水溶液中之Ln-R n 在430nm激發下之近紅外發射光譜(濃度=1M，Ln=Er或Yb，n=1、2及3)。
圖13展示Er-R n 及Yb-R n 卟啉錯合物在人類膀胱癌(T24及5637)細胞、正常肺纖維母細胞(MRC-5)及人類子宮頸癌(HeLa)細胞中之次細胞定位。
圖14藉由流式細胞量測術展示Er-R n 及Yb-R n 卟啉錯合物在如箭頭所指示培育0、3、6及24小時之5637、T24、HeLa及MRC-5細胞中的細胞攝取分析。y軸及x軸對應於細胞計數及FL3通道(波長>650nm)中之螢光強度。
圖15展示Er-R n 及Yb-R n 卟啉錯合物與ALA在用550nm長波通濾光片以10J cm-2輻射之(A)T24、(B)HeLa及(C)MRC-5細胞中的試管內光細胞毒性的比較，D)Er-R n 及Yb-R n 卟啉錯合物及ALA在T24、HeLa及MRC-5細胞中在存在及不存在輻射的情況下IC50值的彙總。
圖16展示錯合物之HPLC層析圖。溶析條件：管柱，安捷倫(Agilent)ZORBAXSB-C18(4.6×150mm，粒徑5；流動速率，1.0mL/分鐘；梯度溶析；偵測波長，430nm。滯留時間：(A)Yb-4，7.24分鐘；(B)Er-4，7.23分鐘；(C)Yb-R 1 ，10.00分鐘；(D)Yb-R 2 ，10.21分鐘；(E)Yb-R 3 ，10.01分鐘；(F)Er-R 1 ，9.66分鐘；(G)Er-R 2 ，10.09分鐘；及(H)Er-R 3 ，9.80分鐘。
圖17展示Por(THP-TMS)之400MHz-1H-NMR(CDCl3)譜圖。
圖18展示Por(THP-TMS)之MALDI-TOF譜圖。
圖19展示Yb-1之400MHz-1H-NMR(CDCl3)譜圖。
圖20展示Yb-1之MALDI-TOF譜圖。
圖21展示Er-1之400MHz-1H-NMR(CDCl3)譜圖。
圖22展示Er-1之MALDI-TOF譜圖。
圖23展示Yb-2之400MHz-1H-NMR(CDCl3)譜圖。
圖24展示Yb-2之MALDI-TOF譜圖。
圖25展示Er-2之400MHz-1H-NMR(CDCl3)譜圖。
圖26展示Er-2之MALDI-TOF譜圖。
圖27展示Yb-4之400MHz-1H-NMR(CDCl3)譜圖。
圖28展示Yb-4之MALDI-TOF譜圖。
圖29展示Er-4之400MHz-1H-NMR(CDCl3)譜圖。
圖30展示Er-4之MALDI-TOF譜圖。
圖31展示Yb-R 1 之MALDI-TOF譜圖。
圖32展示Yb-R 2 之MALDI-TOF譜圖。
圖33展示Yb-R 3 之MALDI-TOF譜圖。
圖34展示Er-R 1 之MALDI-TOF譜圖。
圖35展示Er-R 2 之MALDI-TOF譜圖。
圖36展示Er-R 3 之MALDI-TOF譜圖。
圖37展示Er-R n 及Yb-R n 卟啉錯合物藉由用溶體追蹤劑綠色(Lyso Tracker green)染色在(A)5637細胞、(B)T24細胞、(C)HeLa細胞及(D)MRC-5細胞中之次細胞定位。
圖38A展示現有細胞器/DNA特異性鑭系元素錯合物之NIR發射。經內消旋吡啶鎓取代卟啉類鐿錯合物在添加DNA時展示反應性NIR發射；圖38B展示水溶性及粒線體特異性卟啉類Yb(III)錯合物(Yb-2)之NIR發射。
圖39A展示Yb-N對磷脂醯絲胺酸及癌細胞之親和力；與磷 脂醯絲胺酸之強結合及經由靶向陰離子磷脂膜而區分癌細胞之能力；圖39B展示有機金屬錯合物如在試管內及活體內腫瘤特異性PDT藥劑中作為PDT藥劑的發展。
圖40展示用作PDT、光學及MRI藥劑之多重模式卟啉類金屬錯合物A)Gd-1、B)Gd-2、C)Gd-3-R1及D)Gd-3-N的分子結構。
圖41展示Gd-3-R 1 之細胞攝取之流式細胞量測分析。Gd-3-R 1 在四種卟啉錯合物中在癌細胞中具有最快攝取速率，且亦對(B)膀胱癌T24細胞而非(A)正常MRC-5細胞具有較好選擇性。
圖42展示Gd-3-R1錯合物及H2TPP在430nm激發下輻射之發射強度；在Gd-3-R1錯合物質子化時與PNAS,2014,E5492-E5497中報導之H2TPP相比具有類似1O2及發射量子產率，其在430nm處激發時分別為約70% 1O2量子產率及46%發射量子產率。
圖43展示各種濃度之Gd-DOTA及Gd-3-R 1 之t1鬆弛性；Gd-3-R1之t1鬆弛性比Gd-DOTA大三倍。
圖44展示每公克不同組織中Gd-1、Gd-2、Gd-3-R1及Gd-3-N以ppm含量計之濃度。
圖45展示改變不同取代基(改良水溶性)及有機金屬/分子封端(為了穩定性/鬆弛性)的結構(A)Gd-3-Rn、(B)Gd-4-Rn及(C)Gd-5-Rn。
圖46展示圖40及圖45之錯合物Gd-3-R n 及Gd-4-R n 中間體之反應流程。
圖47展示達成較好MRI及PDT效果之(A)Gd-5-Rn、(B) Gd-3-Rn、(C)Gd-4-Rn、(D)Gd-6-Rn的結構。(具有較好細胞滲透性、t1鬆弛性及用於光學成像之NIR發射)。
圖48展示用於光學成像及抑制膀胱癌之多重模式水溶性鑭系元素類PDT藥劑的發展。
圖49A藉由比較Gd-DOTA及Gd-3-R1之活體內磁共振影像(圖49B)展示對(T24膀胱癌、異種移植腫瘤)之選擇性。
本發明不被本文所述之特定具體實例中之任一者限制於範圍內。呈現以下具體實例僅用於例示。
不希望受理論所束縛，本發明之發明人已研發PDT藥劑釓卟啉(Gd-N；圖1A)，其基於Yb-N合成且在卟啉之特徵性NIR發射之情況下在光激發時展示51%單態氧量子產率。(圖1B至圖D)全面研究已揭示Gd-N在投予之後最初六小時內可藉由腫瘤細胞之陰離子磷脂醯絲胺酸膜識別腫瘤細胞。在投予Gd-N時，在特定波長下雷射輻射，Gd-N進入腫瘤細胞且產生1O2以及呈現TP誘導之NIR發射。活體內小鼠模型及生物分佈分析之結果進一步說明發現在簡單注射Gd-N至血管中之後Gd-N定位於腫瘤中。在自卟啉釋放1O2後，發現實體腫瘤在24小時治療之後減小。就此項技術中當前所知，缺乏活體內鑭系元素類PDT藥劑。本發明提供新穎PDT藥劑Gd-N，及其用於實際癌症追蹤、成像及治療之用途。
結果及討論
本發明人之先前作品中報導之鐿錯合物(Yb-N)之基元結構Gd-N的詳細合成及定性展示於流程1及圖8中。Gd-N及Yb-N結構上 不同之處在於錯合物中存在之鑭系元素離子(接合至Gd-N之載體亦與Yb-N相同)。不證自明，卟啉與不同鑭系元素之協作關係不僅可導致NIR發射改變，而且可導致1O2生成改變。(圖2及圖9)此類現象原則上起因於以下事實：金屬中心與配位體之間的較好軌域重疊造成較好能量傳遞(亦即由比Gd更小之原子半徑構成之Yb的結合軌域因此與卟啉的軌域重疊更佳且更相容)。鑭系元素發揮之重原子效應亦可加強三重峰狀態衰減速率且導致卟啉系統之較高三重峰狀態量子產率。根據光譜研究，Yb-N之單態氧量子產率量測為0%且Gd-N測定為51%。計算分別基於(i)由兩種錯合物產生之1O2(在1270nm處)之NIR磷光強度及(ii)鐿2F5/2(約10200cm-1)及釓6P7/2(約32000cm-1)之最低激發態。應注意6P7/2之後一能量水平遠高於卟啉單元之單峰/三重峰水平(單重態=約23200及15300cm-1；三重態=12500cm-1)。卟啉與Gd之間的大能隙，不存在卟啉至Gd之能量傳遞；因此獲得的能量可純粹以光形式消耗或經採用以形成單態氧，使得直接測定1O2量子產率可行。(圖10(A))此為與Yb完全不同的情況。由於卟啉與Yb之間的能隙較小，由卟啉單元吸收之大部分能量將僅簡單地有效轉移至鐿(經由重原子效應)且排他性地提供特徵性f-f發射。(圖10(B))兩種百分比已明確顯示幾乎一半由Gd-N之卟啉吸收之能量將參與1O2生成，而其餘部分將通常用於卟啉之NIR發射；相反，對於Yb-N，鐿在1.08μm下處之f-f發光為在相同光激發下能量消耗之主要方法。(在430nm及860nm處分別為線性及雙光子激發；Gd-N及Yb-N之雙光子吸收橫截面類似地為約351GM(圖11)。
就腫瘤選擇性、細胞毒性及光細胞毒性、成像、PDT效率 以及生物分佈而言，已完成與Gd-N在試管內及尤其活體內之實際PDT應用相關之研究。Gd-N對腫瘤及正常細胞之選擇性截然不同。如圖1B至圖1D中所示，在HeLa癌細胞中，在2小時培育後可在周圍，亦即膜表面上觀測到來自Gd-N之卟啉的強紅色發射。在培育多於15小時後，若干紅色發射進入細胞質且分散於細胞質內部。然而，在正常細胞MRC-5中，即使在培育12小時之後也不可在細胞表面上或內部偵測到發射。為了有公平的比較，已合成Gd-RhB用於對照實驗。若丹明B(Rhodamine B；RhB)為通常用於共軛之熟知粒線體載體。在相同實驗條件(培育時間、濃度、細胞株及雷射功率)下，本發明人在正常及癌症細胞之粒線體中均發現Gd-RhB之發射，且此特有的觀測變成Gd-N的腫瘤特異性特性的清晰的、認知的及有說服力的證明。(圖3)藉由MTT分析，三種錯合物Gd-N、Yb-N及Gd-RhB在暗處之細胞毒性隨後可針對兩種類型的細胞株測定。其IC50值分別為在癌細胞(HeLa)中0.78、0.80及0.65mM，且在正常細胞(MRC-5)中0.70、0.70及0.45mM。與Gd-N及Yb-N相比，Gd-RhB在暗處對癌症/正常細胞之細胞毒性的巨大差異的根本原因可大部分歸因於Gd-RhB的非選擇性。本發明之Gd-N再次展現關鍵腫瘤選擇性。三種錯合物之試管內PDT效果使用試管內共焦顯微鏡及光細胞毒性分析來評估。Gd-N、Yb-N及Gd-RhB錯合物投配於HeLa細胞及MRC-5細胞中6小時，且隨後在860nm處進行激發以觸發任何PDT效果。(三種錯合物均可用於TP誘導之試管內成像，且TP橫截面約為351GM；考慮到共焦光學顯微鏡之侷限性，僅自僅600nm至750nm監測來自卟啉之發射)在圖3中，在粒線體中可注意到Gd-RhB之發射。在適合之雷射誘導時，僅生成少量1O2，但在若干 分鐘內殺死癌細胞；實際上，在相同條件下亦迅速殺死正常細胞。因此Gd-RhB之PDT效果足夠有效但顯然為非選擇性及非所需的；其積聚於癌症及正常細胞之粒線體內部，非選擇性地使其失效。儘管Yb-N為癌症特異性的，但其不能生成任何1O2，使任何PDT實踐受到限制。紅色發光Gd-N不僅識別且定位於腫瘤細胞之陰離子膜上，而且進入細胞質之某些部分且在每分鐘閃爍5秒之9分鐘光劑下經由1O2誘導癌症細胞凋亡。在明確雷射輻射後需要更多時間以使Gd-N觸發癌細胞死亡；然而，在正常細胞中不存在顯著細胞死亡，遠優於其緩慢反應缺點。
Gd-N、Yb-N及Gd-RhB在0.2至1μM劑量範圍內在癌細胞及正常細胞中之濃度依賴性光細胞毒性在0.25至1J/cm2之變化光劑量下量測。所獲得之光劑量反應曲線展示於圖4中。在HeLa癌細胞中，Gd-RhB及Gd-N展現強的光細胞毒性，而Yb-N(無單態氧)無光細胞毒性(圖4(A))。根據圖4(B)，在正常細胞QSG 7701中，由Gd-N未發現光細胞毒性，而Gd-RhB得到與其在癌細胞中表現之極類似結果。此類趨勢與癌症及正常細胞對Gd-N之選擇性細胞攝取相關。本發明人已藉由使用更多癌細胞及正常細胞株擴展研究，且結果展示於圖5中-Gd-N保持其對總共7個細胞株(四種癌細胞及三種正常細胞)之良好腫瘤選擇性，因此充當出色的及特異性的PDT藥劑。
為展現本發明之錯合物之活體內攝取，經由異種移植小鼠模型及ICP-MS在此等錯合物對特定器官之感染的特色上進行生物分佈研究。將四種錯合物分為四組。HeLa細胞分別用Gd-N、Yb-N、Gd-RhB及Yb-RhB預培育，且經皮下注入至BALB/c裸鼠中，且隨後用860nm雷射 輻射經注射部位。兩週後，對小鼠拍照且量測腫瘤體積(小鼠圖像及腫瘤體積量測值分別展示於圖6a)及圖6b)中)。在Gd-N及Gd-RhB組中，與其對應物Yb-N及Yb-RhB相比發現腫瘤之有效抑制；在四種錯合物中，Gd-N為最佳活體內PDT藥劑，其以100%效率破壞腫瘤。在生物分佈研究中，腫瘤異種移植達到近似0.1cm3尺寸之BALB/c裸鼠經尾側靜脈注入Gd-N(1.0mg/kg)。投予兩天後，使用ICP-MS檢測不同組織或循環血液中Gd-N及Gd-RhB之濃度。如圖6c)中所見，腫瘤具有最大Gd-N富集(4.84ppm/g)，表明Gd-N對腫瘤細胞之特異性識別。
此結果亦藉由自經Gd-N投予之BALB/c裸鼠萃取之腫瘤組織的雙光子顯微鏡成像確認。存在明顯的來自Gd-N的雙光子顯微鏡信號(Gd-N之影像，畫圓圈點)，而對照影像(展示為背景，由明亮領域成像，未展示特異性信號。合併影像為背景及Gd-N之重疊光子，其展示於圖6d)中。Gd-N及Gd-RhB對帶有腫瘤之小鼠中腫瘤生長之抑制效果的進一步校驗藉由以下進行：對具有近似0.3cm3 HeLa異種移植腫瘤之BALB/c裸鼠瘤內注射Gd-N(2.0mg/kg)、Gd-RhB(2.0mg/kg)及ALA(60mg/kg)(5-胺基乙醯丙酸，其可在活細胞中生成原卟啉且在此處充當對照PDT化學品)，且在注射後用860nm光輻射三小時。腫瘤之總光劑量為50J/cm2。隨後使腫瘤再生長7天且進行最終萃取及拍照。如圖6e)中所示，Gd-N能夠在短時間內極大地抑制且甚至將實體腫瘤尺寸自2cm至1cm減小一半。
替代地，具有異種移植腫瘤之小鼠經尾側靜脈注入Gd-N及Gd-RhB(2.0mg/kg體重)且允許完整循環6小時。隨後如上類似地用860nm光輻射腫瘤。未經光處理之腫瘤用作對照。在隨後數天中以每天單次方 式重複處理三次。一致地，發現Gd-N加光處理腫瘤與其腫瘤之相反側腹對照或Gd-RhB組相比得到抑制。藥物動力學分析亦展示Gd-N在動物中存留較長時間，具有較大MRT(平均滯留時間)值(12.50小時)，而Gd-RhB被快速清除(MRT為5.04小時)(結果說明於圖6f)及表1中)。
亦探究PDT之分子機制、細胞存活之蛋白質水平及經PDT處理HeLa細胞之蛋白質裂解液中細胞凋亡蛋白質家族(IAP)的抑制劑。存活素及IAP家族成員，c-IAP1、c-IAP2及XIAP均在Gd-N加雷射處理樣品中明顯表現。發現mTOR路徑參與對癌細胞之PDT處理之反應。兩個關鍵成員mTOR及GβL之水平在Gd-N或Gd-RhB誘導之1O2應激刺激時明顯升高。此等結果顯示Gd-N促進之光動力療法在分子層級之成功的細胞殺死效果，且亦在當前PDT藥劑之設計及改良上露出曙光(圖7)。
結論
本發明提供適用作抗癌劑之治療性釓錯合物Gd-N，其具有用於成像之可見至NIR發射、腫瘤細胞選擇性及1O2生成。藉由一連串試管內及活體內研究，展示本發明之Gd-N適用作智慧的雙功能PDT藥劑的 效果及優勢。本發明亦提供使用Gd-N以及選擇性光動力療法追蹤及成像長期存活癌細胞之方法。
實驗方法
線性誘導光物理特性
UV可見光吸收光譜(範圍200至1100nm)及單光子發光光譜用以下記錄：HP UV-8453分光光度計及愛丁堡儀器(Edinburgh Instrument)FLS920組合螢光壽命及穩定狀態(Fluorescence Lifetime and Steady state)分光光度計，其在經氮氣流冷卻外殼內部配備有UV至NIR(UV-to-NIR)敏感性光電倍增器。本發明人已自偵測器反應及雜散背景光磷光校正所有光譜，在愛丁堡儀器FLS920中藉由供應有兩個出入埠之可拆卸142mm(內)直徑經硫化鋇塗佈之累計球量測鑭系元素錯合物的量子產率。
單態氧量子產率
藉由1270nm處之磷光，在PTI QM4發光光譜儀上用InGaAs偵測器偵測單態氧，且藉由比較樣品溶液之1O2發射強度與參考材料[4](H2TPP，CHCl3中Φ △=0.55)之1O2發射強度確定CHCl3中所有化合物的量子產率(Φ △)，且如在以下等式中說明：
其中Φ △指示單態氧量子產率，G △指示積分發射強度，A表示操作激發波長處之吸光度，n反映溶劑之折射率，考慮到上標REF及S分別表示參考及樣品。在所有情況下，本發明人已在適當激發時量測1O2發射光譜。為 減小所發射光之再吸收之影響，所有吸光度亦設定為0.05。
細胞培養
人類HeLa(子宮頸癌)及WPMY-1(正常前列腺基質不朽化細胞)細胞在DMEM培養基中生長；A549(肺腺瘤)保持於哈姆氏(Ham's)F12K培養基及L-麩醯胺酸(N3520，Sigma，美國密蘇里州聖路易斯)之混合物中；QSG 7701(正常肝細胞)、HK-1、HONE1(鼻咽癌)在RMPI-1640培養基中生長；MRC-5(正常肺纖維母細胞)及SK-N-SH(神經母細胞瘤)細胞在MEM培養基中生長。在所有培養基中亦添加(i)10%(v/v)胎牛血清(FBS)、(ii)100μg/ml鏈黴素及(iii)100單位/毫升青黴素。
試管內成像
為測試本發明之水溶性錯合物作為生物探針之適用性，使用配備有Ti：藍寶石雷射(Libra II，Coherent,Inc.)以及980nm波長雷射用於激發之商業共焦雷射掃描顯微鏡Leica TCS SP5使與本發明的五種錯合物一起培育的HeLa/WPMY-1/MRC-5細胞試管內成像。
MTT細胞存活率分析
在24小時後，水溶性錯合物及經處理細胞進一步與溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT)(0.5mg/ml)一起培育4小時，使得隨細胞之代謝路徑形成甲
(formazan)。隨後，萃取甲
且藉由二甲亞碸(DMSO)溶解，且後續溶液之吸光度在Bio-Rad iMark微板讀取器中量測(490nm)。重複四次且數據使用GraphPad Prism 5軟體繪圖分析和解釋。
光動力治療(PDT)分析
癌細胞(2×104/孔)首先在96孔盤上培育隔夜，且隨後用本發明之錯合物及對照類似物在暗處處理6小時。在用新鮮培養基替換舊培養基之後，細胞因此在mW/cm2之流暢速率下暴露於由400W鎢燈產生之黃光(1至8J/cm2)，該鎢燈裝配有熱隔離濾光片及500nm長波通濾光片。24小時後，藉由MTT分析檢測PDT後細胞存活率。細胞單層用PBS沖洗，隨後37℃下與250μg/mL MTT溶液一起培育3小時。甲
晶體形成且溶解於DMSO中，隨後在540及690nm下藉由96孔盤讀取器(Elx800吸光度微板讀取器)進行吸光度量測。
動物 ：所有需要動物模型之實驗在無胸腺裸鼠(BALB/c-nu/nu)上進行，該等裸鼠均獲自廣東醫學實驗室動物中心(Guangdong Medical Lab Animal Center)(許可證編號：SCXK-2008-0002)。根據國家動物護理及使用程序標準(National Standard of Animal Care and Use Procedures)(20080820)之嚴格協定飼養及操作小鼠。
藥物動力學分析 ：Gd-N及Gd-RhB(各自1.0μmol/kg體重)經尾側靜脈注入至小鼠中。隨後在如所指示之0至20小時之不同時間點收集血清。Gd-N及Gd-RhB之濃度藉由PerkinElmer EnVision多標記讀取器2104在570nm下量測，且經由濃度曲線使用標準吸收計算。藥物動力學參數(t1/2、Vd、MRT、AUC)藉由用單隔室模型擬合來計算。
經由ICP-MS之活體內生物分佈
本發明之錯合物之活體內攝取的生物分佈研究，尤其器官/細菌感染，經由ICP-MS進行。當腫瘤異種移植達近似0.1cm3尺寸時以1.0μmol/kg體重劑量向小鼠投予Gd-N及Gd-PhB。2天後，在腫瘤、肝、肺、 腎臟、脾、大腦、前列腺、皮膚及血液(80至90μL)中收集約0.02至0.04公克樣品組織。所有樣品在37℃下與500μL硝酸一起培育用於釋放金屬離子以進行進一步ICP-MS檢查，以及溶解干擾有機分子。
活體內光動力療法研究
為建立小鼠腫瘤異種移植模型，使細胞經胰蛋白酶處理，收集且懸浮於培養基中。100μL體積中1×106個細胞皮下注入至雌性無胸腺裸鼠(5週齡)之側腹中且等待10至15天。當腫瘤體積達100至150mm3尺寸時，將動物隨機劃分成不同組用於進一步實驗。腫瘤體積藉由測徑規(精確度0.02mm)量測且隨後各自基於等式V=(L×W2)/2計算，其中L及W分別對應於較大及較小尺寸。組之間的統計顯著性的單因子變異數分析藉由GraphPad Prism 5.0軟體評估。
材料及方法
所有所用化學品為試劑級別且購自Sigma-Aldrich且不經進一步純化即使用。中間體Yb[N(SiMe3)2]3‧[LiCl(THF)3]1及起始卟啉自由鹼TFP-TMS2之製備根據文獻程序進行。對照化合物Gd-RhB、Yb-RhB 4及Yb-N 5之製備根據本發明人之先前程序完成。所有分析級別溶劑藉由標準程序乾燥，在使用之前蒸餾且脫氣。在Bruker Autoflex MALDI-TOF質譜儀上獲得高解析度質譜，以m/z報導。元素分析在中華人民共和國西北大學化工學院(School of Chemical Engineering,Northwest University,P.R.China)進行。中間體及Gd-N之合成途徑展示於流程1中：
流程1. Gd-NGd-TMS之合成途徑：將Gd[N(SiMe3)2]3．[Li(THF)3Cl]x之溶液(5.0ml，0.6mmol Gd)轉移至Schlenk燒瓶且在真空下移除溶劑。隨後添加10ml二氯甲烷(CH2Cl2)以沈澱LiCl。使混合物離心且將澄清層轉移至另一個具有溶解於20ml甲苯中之卟啉自由鹼TFP-TMS(196mg，0.2mmol)的Schlenk燒瓶。使所得溶液回流12小時直至大部分自由鹼與金屬離子配位。將反應溶液冷卻至室溫。隨後將無水Na{(η5-C5H5)Co[P(=O)(Ome)2]3}(104mg 0.22mmol)添加至混合物，該混合物經磁力攪拌另外1小時。反應完成後，在真空下移除溶劑且將殘餘物溶解於CH2Cl2中，過濾且使用CH2Cl2/己烷作為溶析液在矽膠上層析，得到呈紅色固體狀之純產物。產率：86%；MALDI-TOF MS：針對[M+]計算：M.p.>300℃；1587.1965，實驗值：1587.2154；針對[C60H44CoF15N4O9P3SiGd]計算之分析：C，45.40；H，2.79；N，3.53%，實驗值：C，45.46；H，2.83；N，3.51%；UV/Vis(DMSO，25℃)：λ 最大(log ε)=427(5.68)，558(4.34)，597(3.29dm3 mol-1cm-1)。
Gd-OH：將氟化四丁銨(TBAF，1.0M於THF中，200μL，0.2mmol)添加至溶解於10ml CH2Cl2中之Gd-TMS(182mg，0.1mmol)溶液，且攪拌溶液30分鐘。藉由TLC監測反應進程。反應完成後，使混合物通過短矽膠管柱。移除溶劑後，獲得中間體且不經進一步純化即用於下一步驟。隨後將獲得之中間體及4-碘苯酚(33mg，0.15mmol)溶解於無水四氫呋喃(THF，15ml)及三乙胺(NEt3，5mL)中，且混合物用氮氣鼓泡30分鐘。此後，將Pd(PPh3)4(12mg 0.01mmol)及CuI(3.8mg，0.02mmol)添加至以上溶液。在至少35℃下在氮氣氛圍下攪拌反應混合物至少 10小時。隨後在減壓下移除溶劑。在矽膠上使用CH2Cl2/甲醇(50：1)作為溶析液藉由管柱層析純化殘餘物，得到呈紅色固體狀之純產物。產率：73%(表2)；M.p.>300℃；MALDI-TOF MS：針對[M+]計算：1607.0291，實驗值：1608.0308；針對[C63H40CoF15N4O10P3Gd]計算之分析：C，47.08；H，2.51；N，3.49%，實驗值：C，47.10；H，2.49；N，3.51%；UV/Vis(DMSO，25℃)：λ 最大(log ε)=426(5.70)，555mm(4.48dm3 mol-1cm-1)。
Gd-I：向溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(DMF，10ml)中之四乙二醇二碘化物(207mg，0.5mmol)及Gd-OH(161mg，0.1mmol)溶液中添加無水K2CO3(69mg，0.5mmol)，且在氮氣氛圍下將混合物加熱至80℃持續8小時。隨後在減壓下移除溶劑。粗產物在矽膠上藉由CH2Cl2/CH3OH(v/v，100：1)溶析藉由管柱層析純化，得到呈紅色固體狀之純產物。產率：82%；M.p.>300℃；MALDI-TOF MS：針對[M+]計算：1893.2210，實驗值1893.1038；針對[C71H55CoF15IN4O13P3Gd]計算之分析：C，45.04；H，2.94；N，3.11%，實驗值：C，45.21；H，2.99；N，3.06%；UV/Vis(DMSO，25℃)：λ 最大(log ε)=425(5.71)，555nm(4.50dm3 mol-1cm-1)。
Gd-N：向溶解於無水(DMF，10ml)中之Gd-I(95mg， 0.05mmol)溶液添加無水NEt3(1ml，過量)，且混合物在氮氣氛圍下加熱至85℃持續24小時。隨後在減壓下移除溶劑。所獲得之粗產物使用CH2Cl2/CH3OH(v/v，80：1)作為溶析液藉由矽膠管柱層析純化，以移除未反應之Gd-I及其他雜質，隨後使用CH2Cl2/CH3OH(v/v，10：1)純化，以獲得呈紅色固體狀之純產物。產率：80%；M.p.>300℃；MALDI-TOF MS；針對[M+]計算：1867.5095，實驗值1867.2538；針對[C99H85CoF15N6O16P3Gd]計算之分析：C，46.37；H，3.54；N，3.51%，實驗值：C，46.40；H，3.59；N，3.48%；UV/Vis(DMSO，25℃)：λ 最大(log ε)=426(5.74)，555nm(4.53dm3 mol-1cm-1)。
雙光子吸收量測
雙光子吸收光譜(亦即Z掃描軌跡)在800nm處藉由開孔Z掃描方法使用峰值功率為276GWcm-2之100fs雷射脈衝量測，該等脈衝來自以1kHz重複率操作之光學參數放大器，由Ti：藍寶石再生放大器系統生成。雷射光束經由光束分光器分成兩部分。一部分藉由光電二極體(D1)監測作為入射強度參考I 0，且另一部分藉由另一光電二極體(D2)偵測作為透射強度。在穿過f=20cm之透鏡時，雷射光束聚焦且穿過石英單元。樣品單元z之位置藉由計算機控制可平移表沿雷射光束方向(z軸)移動，以使得樣品單元內之局部功率密度可在恆定入射強度雷射功率水平下變化。最終，來自樣品單元之透射強度藉由光電二極體D2偵測。光電二極體D2介接至計算機用於信號採集及平均化。各透射強度資料表示超過100個量測值之平均值。假定高斯光束特徵曲線，非線性吸收係數β可藉由用等式(1)6曲線擬合至所觀測之開孔軌跡T(z)獲得，其中a 0為線性吸收係數， l為樣品長度(1mm石英單元)且z 0為入射光束之繞射長度。在獲得非線性吸收係數β之後，樣品分子之2PA橫截面σ (2)(以單位1GM=10-50cm4 sphoton-1計)可藉由使用等式(2)確定，其中N A 為Avogadro常數，d為呈溶解狀態之樣品化合物之濃度，h為Planck常數且v為入射雷射光束頻率。
本發明之其他具體實例
在本發明之另一具體實例中，提供基於具有特異性官能基之卟啉-鑭系元素錯合物之新一代PDT藥劑，該等藥劑可特異性定位於特定腫瘤，且其PDT過程可經由鉺(Er)之NIR發射監測。新研發之鉺卟啉錯合物與整合素α v β 3 同功型特異性肽共軛。來自Er-R 3 之卟啉及鉺發射展示Er-R 3 能夠顯著中斷膀胱癌腫瘤生長，其特異性結合於「整合素α v β 3 同功型」，具有反應性發射用於成像。
Er卟啉錯合物之水溶性藉由與親水性肽RrRk(SEQ ID NO：4)共軛而與先前報導類似物相比得到改良。選擇整合素α v β 3 同功型特異性肽序列(-cGRLKEKKc-)(SEQ ID NO：5)以與RrRk(SEQ ID NO：4)在不同位置共軛，用於估計對膀胱癌細胞中之整合素α v β 3 同功型之結合選擇性(流程3)。肽之兩親性特徵藉由合併親水性RrRk(SEQ ID NO：4)及疏水性cGRLKEKKc(SEQ ID NO：5)合成，以改良細胞滲透性。Er-R 1 、Er-R 2 及Er-R 3 之吸收係數(卟啉：Soret波段處於430nm，199,526cm-1) 及發射量子產率(卟啉：Soret波段及Er：2F5/2→2F7/2)類似。Ln-R n 之光物理量測之細節展示於表3中。由於來自卟啉Yb用於f-f發射之能量傳遞比自卟啉至Er f-f發射之能量傳遞好得多，Er部分展現比Yb部分較強的單態氧量子效率。所有Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物藉由1H NMR及質譜(圖17至圖36)表徵。
[a]吸收及發射在室溫下在水(3% DMSO)中量測。[b]此研究中使用之發射量子產率標準物為溶解於無水DCM中之四苯基卟啉(H2TPP)(298K下Φem=0.120)。[c]壽命在室溫下在水(3% DMSO)中量測[d]此研究中使用之單態氧量子產率標準物為溶解於無水DCM中之四苯基卟啉(H2TPP)(298K下Φ△=0.62)。
在圖12中，Er或Yb卟啉類錯合物之光物理特性類似。然而，歸因於肽之共軛，試管內次細胞定位、攝取及毒性(光及暗)不同。首先，膀胱癌細胞-T24及5637、子宮頸癌細胞-HeLa及正常肺正常細胞-MRC5中之Er-Rn卟啉錯合物及Yb-Rn卟啉錯合物(Ln=Er或Yb；n=1、2及3；R1=cQDGRMGFc={Ahx}-(D-Cys)-Gln-Asp-Gly-Arg-Met-Gly-Phe-(D-Cys)(SEQ ID NO：1)；R2=cGRLKEKKc={Ahx}-(D-Cys)-Gly-Arg-Leu-Lys-Glu-Lys- Lys-(D-Cys)(SEQ ID NO：2)；R3=RrRkcGRLKEKKc={Ahx}-Arg-Arg-(D-Arg)-Lys-{Ahx}-(D-Cys)-Gly-Arg-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-(D-Cys)(SEQ ID NO：3)的次細胞定位不同(圖13，給藥濃度=5μM，培育時間=6小時)。歸因於自卟啉分子至Yb3+離子之有效能量傳遞及發射Yb近紅外螢光，三種鉺卟啉錯合物之試管內螢光強度高於其鐿基元類似物。在膀胱癌細胞T24及5637中，僅在細胞膜上發現來自Er-R1之紅色卟啉發射，然而，在細胞內部發現Er-R2及Er-R3之紅色發射。鐿類似物亦展示相同次細胞定位；在細胞膜中發現卟啉Yb-R1之發射。已藉由綠色溶體追蹤劑進行共定位實驗，在圖37中，紅色發射形式Er-R2、Er-R3、Yb-R2及Yb-R3在T24及5637細胞中與來自溶體追蹤劑之綠色螢光很好地重疊，但Er-R1及Yb-R1並不如此，表明Er-R2卟啉錯合物、Er-R3卟啉錯合物、Yb-R2卟啉錯合物及Yb-R3卟啉錯合物大部分定位於T24細胞及5637細胞之溶酶體中，且Er-R1及Yb-R1定位於T24及5637細胞膜中。為進一步確認，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3中之肽序列可識別α v β 3 整合素。已在相同實驗條件下在非膀胱癌細胞、HeLa及MRC-5中進行Er-Rn卟啉錯合物及Yb-Rn卟啉錯合物(n=1、2及3)之試管內成像。在HeLa細胞及MRC-5中均未偵測到紅色發射信號。HeLa及MRC-5細胞中缺乏α v β 3 整合素應限制Er-Rn及Yb-Rn之攝取。卟啉錯合物Er-Rn及Yb-Rn(n=1、2及3)將不結合於HeLa及MRC-5細胞，因此在螢光染色實驗中僅展示來自溶體追蹤劑之綠色發射信號(圖37)。
為進一步證明Er-Rn及Yb-Rn(n=1、2及3)卟啉錯合物在膀胱癌細胞中之選擇性攝取藉由經由經調適環肽R1、R2及R3識別T24 表面上之α v β 3 整合素誘導，在三個細胞株中進行鉺(Er)及鐿(Yb)錯合物之流式細胞量測分析，且結果展示於圖14中。
分子對接模擬本發明卟啉錯合物且提供對肽之極大位阻並有助於與α v β 3 整合素相互作用。Zhang等人(Urologic Oncol.2012,30,635-645)已在不同細胞株中測試本發明錯合物之肽R 1 及R 2 且藉由OBOC組合庫篩查，以證實對膀胱癌之結合特異性。兩親性肽R 3 為R 2 之修改，藉由添加RrRk(SEQ ID NO：4)以改良水溶性及細胞攝取。因此，如圖14中所示，在與Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物一起培育6小時內，T24細胞在FL3通道(發射濾光片：670長波通濾光片)中顯示明顯螢光，而與Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物一起培育之HeLa及MRC-5(細胞表面α v β 3 整合素受體-陰性)在類似實驗條件下展示極少螢光信號。另外，細胞攝取隨在T24細胞中之培育時間增加，其在24小時後定量為中值螢光強度(表4)。
在驗證Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物在T24細胞中之特異性攝取後，在各種細胞株中進行試管內PDT。低-暗及高-光細胞毒性為應用於PDT中之光敏劑的必需特性。Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物對T24、HeLa及MRC-5細胞之細胞毒性使用MTT分析在存在(550 nm長波通濾光片，6mW cm-2，28分鐘)及不存在輻射的情況下檢驗。Er-R n 及Yb-R n 在10Jcm-2輻射下展現高的光細胞毒性。此外，光細胞毒性隨Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物之濃度增加，且在培育24小時後在圖15中計算半致死劑量(IC50)。Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物對T24之IC50比HeLa及MRC-5低8至10倍，其表明Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物選擇性殺死膀胱癌。由於Er-R 3 卟啉錯合物及Yb-R 3 卟啉錯合物中之RrRK(SEQ ID NO：4)肽序列，該等錯合物之細胞攝取高於Er-R 1 卟啉錯合物、Er-R 2 卟啉錯合物、Yb-R 1 卟啉錯合物及Yb-R 2 卟啉錯合物，其導致較高的光細胞毒性。此外，激發波長550nm位於卟啉之Q波段中，其將實際上提供較好的組織穿透。然而，其無法觸發與經FDA批准之胺基乙醯丙酸(ALA)類似的有效PDT效果。ALA在400-450nm處激發。在本發明之一些具體實例中，當激發超過550nm時，Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物比ALA造成更強的光細胞毒性效果。在所有Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物中，歸因於最亮試管內螢光及最高細胞攝取，Er-R 3 卟啉錯合物最有效地殺死膀胱癌細胞(可達成低至31μM之IC50)。然而，在不存在光之情況下，所有Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物基本上無細胞毒性。(IC50超過1000μM)基於上文之結果，Er-R 3 卟啉錯合物為選擇性殺死膀胱癌之PDT藥劑的較佳具體實例。
總之，本發明提供多重模式鑭系元素-卟啉PDT藥劑，其能夠經由來自卟啉部分之1O2殺死腫瘤細胞且同時提供螢光成像。Er-R 3 卟啉錯合物經合成且展示為藉由特異性靶向膀胱癌細胞中之整合素α v β 3 同功型而對膀胱癌細胞具有高度選擇性，具有強的NIR及1O2發射。本發明之卟 啉錯合物之癌細胞選擇性攝取特性藉由流式細胞量測術及試管內成像確認，且能夠藉由特異性結合於膀胱癌細胞之「整合素α v β 3 同功型」而顯著中斷膀胱癌細胞生長。
關於化合物合成之整體資訊
所有所用化學品為試劑級別且購自Sigma-Aldrich且不經進一步純化即使用。所有分析級別溶劑藉由標準程序乾燥，在使用之前蒸餾且脫氣。在Bruker Ultra shield 400 Plus NMR譜儀上記錄NMR譜圖。1H NMR化學位移參考四甲基矽烷TMS(d=0.00)。在Bruker Autoflex MALDI-TOF質譜儀上獲得高解析度質譜，報導為m/z。中間體及Ln-Rn(Ln=Yb、Er，n=1、2、3)之合成途徑展示於流程2中。所有Ln-Rn(Ln=Yb或Er，n=1、2、3)錯合物藉由高效液相層析純化。溶劑系統展示於表5中。
合成中間體及Ln-R
n
(Ln=Yb或Er，n=1、2、3)
製備化合物Por(THP-TMS)
在氬氣氛圍下將吡咯(280uL，4.0mmol)、五氟苯甲醛(588mg，3.0mmol)及4-[2-(三甲基矽基)乙炔基]苯甲醛6(202mg，1.0mmol)溶解於410mL CH2Cl2中。10分鐘後在劇烈攪拌下經由注射器添加BF3O(Et)2(0.60mL之2.65M儲備溶液，1.32mmol)。完成添加後，使反應物在室溫下攪拌1小時。添加DDQ(2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌)(0.68g，3.0mmol)且在室溫下攪拌1小時後在真空中移除溶劑。使粗反應混合物通 過短二氧化矽管柱(己烷-CH2Cl2(9：1))，在減壓下濃縮，得到產物5,10,15-參(五氟苯基)-20-[4-{2-(三甲基矽基)乙炔基}苯基卟啉]，粉紅/紫色固體(238mg，22.8%)；1HNMR(CDCl3)：-2.87(2 H,s,NH),7.91(2 H,d,J 8.1Hz,Ar-H),8.17(2 H,d,J 8.1Hz,Ar-H),8.89(2 H,d,J4.7Hz,P-吡咯),8.932(4 H,s,P-吡咯),8.94(2 H,d,J 4.7Hz,P-吡咯)；0.387(9H,s)[M]+之MS(MALDI)，針對C49H23F15N4Si計算980.1513，實驗值981.1519。
製備化合物Ln-1
在冰水浴中將Ln[N(SiMe3)2]3．x[LiCl(THF)3]：HN(SiMe3)2(Ln=Yb或Er，10.8ml 0.050mol)溶解於20ml之THF中，隨後歷經30分鐘時間緩慢添加n-BuLi(1.6M於己烷中)。磁力攪拌所得溶液12小時直至獲得澄清淡黃色溶液。隨後將溶液緩慢轉移至具有懸浮於20ml THF中之LnCl3(Ln=Yb或Er，4.74g，0.017mol)的Schlenk燒瓶。磁力攪拌所得混合物24小時直至所有固體LnCl3(Ln=Yb或Er)消失。所得溶液Ln[N(SiMe3)2]3‧x[Li(THF)3Cl](Ln=Yb或Er，x=3至5)用於下一合成步驟中。
Yb-1：將如上文所製備之Yb[N(SiMe3)2]3‧x[Li(THF)3Cl](2.5ml，0.52mmol之Yb)轉移至Schlenk燒瓶且在真空下移除溶劑。隨後添加10ml CH2Cl2，以沈澱LiCl。使混合物離心且將澄清層轉移至另一個具有溶解於15ml甲苯中之無水Por(THP-TMS)(0.1g，0.16mmol)的Schlenk燒瓶。使所得溶液回流直至大部分自由鹼與金屬離子配位。隨後添加無水NaLOMe(0.1g，0.22mmol)[LOMe-((環戊二烯基)參(二甲基亞磷酸根)-鈷酸根，陰離子三腳架配位體)，且經磁力攪拌另外12小時，隨後將反應溶 液冷卻至室溫。反應完成時，在真空中移除溶劑且將殘餘物溶解於CHCl3中，過濾且使用CHCl3/石油醚(V/V 1：1)作為溶析液在矽膠上層析。將產物溶解於CH2Cl2(5ml)中且過濾溶液。
Yb-1：產率：81%；1HNMR(CDCl3)：δ -5.02(s,5H),0.93(s,9H),6.37(s,18H),8.70(s,1H),8.97(d,J=4.96Hz,1H),10.88(s,1H),14.65(s,2H),14.89(s,2H),15.18(s,2H),15.58(s,2H),17.40(s,1H)；MALDI-TOF MS；針對C60H44CoF15N4O9P3SiYb[M]+計算1603.0571，實驗值：1603.0556。
Er-1：與Yb-1相同之程序，用Er[N(SiMe3)2]3‧x[Li(THF)3Cl]替換Yb[N(SiMe3)2]3‧x[Li(THF)3Cl]；產率：80%。1HNMR(CDCl3)：δ -35.54(s,5H),3.48(s,9H),14.09(s,1H),13.50(s,1H),21.73(s,18H),21.16(s,1H),31.22(s,2H),32.93(s,2H),36.37(s,2H),37.76(s,2H),46.77(s,1H)；MALDI-TOF MS：針對C60H44CoErF15N4O9P3Si[M]+計算1597.1878，實驗值1597.2927。
製備Ln-2之一般程序
Yb-2：向溶解於10ml CH2Cl2中之Yb-1(0.05mmol 76.55mg)溶液添加TBAF(1.0M於THF中，0.2mL，0.2mmol)，且攪拌溶液30分鐘。藉由薄層層析(TLC)監測反應進程。反應完成後，使混合物通過短矽膠管柱。移除溶劑後，獲得純產物。
Yb-2：產率：92%；1HNMR(CDCl3)：δ -4.82(s,5H),4.13(s,1H),6.30(s,18H),8.63(s,1H),8.95(d,J=4.44Hz,1H),10.83(s,1H),14.51(s,2H),14.90(s,2H),15.08(s,2H),15.44(s,2H),17.21(s,1H)； MALDI-TOF MS：針對C57H36CoF15N4O9P3Yb[M+Na+Cl]+計算1587.0176，實驗值1587.0514。
Er-2：與Yb-2相同之程序，用Er-1替換Yb-1；產率：92%；1HNMR(CDCl3)：δ -35.05(s,5H),13.94(s,1H),13.19(s,1H),20.56(s,18H),21.02(s,1H),30.97(s,2H),32.77(s,2H),36.44(s,2H),37.36(s,2H),46.20(s,1H)；MALDI-TOF MS：針對C57H36CoErF15N4O9P3[M+H]+計算：1525.0067，實驗值：1525.0143。
製備Ln-4之一般程序
Yb-4：在氮氣下將Pd(PPh3)4(22.16mg 0.08mmol)、CuI(7.65mg，0.04mmol)、Yb-2(30.62mg，0.02mmol)及4-碘苯甲酸5.087mg置放於乾燥燒瓶中。添加THF(15mL)及NEt3(5mL)且用氮氣使反應混合物脫氣。在40℃下攪拌反應混合物12小時。此後，在減壓下移除溶劑。藉由層析純化殘餘物。用CH2Cl2/甲醇(12：1)溶析。將經溶析化合物(26mg，0.0157mmol)、EDCI(6.04mg，0.031mmol)、NHS(3.57mg，0.031mmol)置放於乾燥燒瓶及氮氣下，添加10mL無水DMF。在室溫下攪拌48小時，隨後移除溶劑。殘餘物藉由二乙醚再結晶且乾燥，得到Yb-4。
Yb-4：產率：72%；1HNMR(CDCl3)：δ -4.82(s,5H),4.16(s,1H),6.39(s,18H),8.68(s,1H),8.98(d,J=4.44Hz,1H),8.47(s,J=4.44Hz,2H),8.45(s,J=4.44Hz,2H)10.91(s,1H),14.63(s,2H),14.92(s,2H),15.24(s,2H),15.61(s,2H),17.39(s,1H)；MALDI-TOF MS：針對C68H43CoF15N5O13P3Yb[M]+計算1748.0176，實驗值1748.0460。HPLC表徵：滯留時間=7.24分鐘(圖16(A))。
Er-4：與Yb-4相同之程序，僅用Er-2替換Yb-2；產率：80%；1HNMR(CDCl3)：δ -35.94(s,5H),6.04(s,1H),8.64(d,J=7.96Hz,2H),10.80(d,J=5.12Hz,2H),13.12(s,1H),13.76(s,1H),20.67(s,18 H),20.90(s,1H),31.06(s,2H),32.94(s,2H),36.39(s,2H),37.62(s,2H),46.54(s,1H)；MALDI-TOF MS：針對C68H43CoErF15N5O13P3[M+Cl-]計算：1777.2035，實驗值：1777.4591。HPLC表徵：滯留時間=7.23分鐘(圖16(B))。
製備Ln-Rn之一般程序
Yb-R 1 ：使溶解於無水DMF中之Yb-4(16mg，1當量)之經攪拌溶液與N,N'-二異丙基乙胺(DIPEA)(1當量)混合。將混合物溶液添加至含有肽R1(1.3當量)之小瓶中。其隨後在室溫下反應隔夜，此後，在真空下移除溶劑，得到無水化合物。殘餘物藉由二乙醚再結晶三次且乾燥，得到Yb-R 1 。
Yb-R 1 ：產率：69%。MALDI-TOF MS：針對C109H109CoF15N19O23P3S3Yb[M+H]+計算：2760.4878實驗值：2760.6458。HPLC表徵：滯留時間=10.00分鐘(圖16(C))。
Yb-R 2 ：與Yb-R1相同之程序，使用肽R2；產率：69% MALDI-TOF MS：針對C113H129CoF15N21O22P3S2Yb[M+H]+計算2808.6835實驗值：2808.6715。HPLC表徵：滯留時間=10.21分鐘(圖16(D))。
Yb-R 3 ：與Yb-R1相同之程序，使用肽R3；產率：65% MALDI-TOF MS：針對C143H187CoF15N35O28P3S2Yb[M+H]+計算3520.2985實驗值：3520.2543。HPLC表徵：滯留時間=10.01分鐘(圖16(E))。
Er-R 1 ：與Yb-R1相同之程序，用Er-4替換Yb-4；產率：75% MALDI-TOF MS：針對C109H109CoErF15N19O23P3S3[M+K]+計算：2791.4826。實驗值：2791.3747。HPLC表徵：滯留時間=9.66分鐘(圖16(F))。
Er-R 2 ：與Yb-R2相同之程序，用Er-4替換Yb-4；產率：72% MALDI-TOF MS：針對C113H129CoErF15N21O22P3S2[M+K]+計算：2839.6015實驗值：2839.2967。HPLC表徵：滯留時間=10.09分鐘(圖16(G))。
Er-R 3 ：與Yb-R3相同之程序，用Er-4替換Yb-4；產率：70% MALDI-TOF MS：針對C143H187CoErF15N35O28P3S2[M]+計算：3511.4955實驗值：3511.5162。HPLC表徵：滯留時間=9.80分鐘(圖16(H))。
細胞培養
在補充有10%胎牛血清(FBS，Gibco)及抗生素(青黴素，50gmL-1；鏈黴素，50gmL-1)之RPMI 1640培養基(Gibco)中培養人類膀胱癌(T24)及(5637)細胞。在補充有10% FBS(Gibco)及抗生素(青黴素，50gmL-1；鏈黴素，50gmL-1)之DMEM(Gibco)中培養人類子宮頸癌(HeLa)細胞。人類正常肺纖維母細胞(MRC-5)保持在補充有10% FBS及1% 50gmL-1青黴素；50gmL-1鏈黴素之最低必需培養基(MEM)中。所有細胞在37℃下在5% CO2之潮濕環境中培育。
暗細胞毒性
T24、HeLa及MRC-5細胞(1×105)用Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物以六個濃度(1、5、10、50、100、500M)處理24小時。細胞單層用經磷酸鹽緩衝的生理鹽水(PBS)沖洗一次，且與500gmL-1 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2及溴化5-二苯基四唑鎓(MTT)溶液一起培育。錯合物之細胞抑制效能藉由用MTT處理細胞3小時以允許在細胞代謝期間 生成甲
來檢驗。此後，藉由振盪將甲
晶體充分溶解於DMSO中。最終，用Biotek PowerWave XS微板讀取器在570及690nm波長下量測溶液之吸光度。
光細胞毒性
T24、HeLa及MRC-5細胞(1×105)用Er-R n 卟啉錯合物及Yb-R n 卟啉錯合物以四個濃度(1、5、10、50M)處理24小時。隨後，細胞在6mWcm-2(配備有550nm長波通濾光片)下輻射約27分鐘，且進一步培育24小時。細胞隨後根據如與先前MTT分析相同之方案處理。
試管內共焦顯微鏡
為研究所獲得錯合物作為生物探針之適用性，對T24、5637、HeLa及MRC-5細胞(1×105)進行成像。在與5M之錯合物一起培育24小時後，在成像前用PBS洗滌細胞三次。使用溶體追蹤劑綠色DND-26作為輔染色染料。在Leica TCS SPE共焦雷射掃描顯微鏡上採集影像。樣品及溶體追蹤劑分別在波長561及488nm處激發。
細胞攝取之流式細胞量測術量測
將5637、T24、HeLa及MRC-5細胞(每一樣品1×105個)接種於35mm皮氏培養皿上且培育隔夜。隨後細胞與Er-R n 及Yb-R n 卟啉錯合物(5M)一起培育3、6及24小時。用胰蛋白酶收集細胞且用PBS洗滌兩次。5637、T24、HeLa及MRC-5細胞對錯合物之攝取藉由流式細胞量測術分析。用488nm氬氣雷射激發細胞且在FL-3通道(具有650nm長波通濾光片)中收集發射；分析10000個結果。
錯合物之HPLC表徵。
本發明之另一具體實例。
i.用於生物研究之各種有機金屬/鑭系元素錯合物之研發及全面研究
本發明中提供另一系列有機金屬錯合物，且研究其在多光子及非線性方法中之結構光物理特性關係。此等錯合物適用於生物成像。水溶性鑭系元素(III)卟啉錯合物及經內消旋吡啶鎓取代之卟啉藉由用碘代甲烷使相對應吡啶基錯合物甲基化獲得且明確地表徵。探究此等水溶性鑭系元素(III)卟啉錯合物對DNA之結合相互作用及光裂解活動(圖38A)。另外，本發明人報導一種以三腳架[(η5-C5H5)Co{(MeO)2P=O}3]-陰離子封端之新穎的水溶性、粒線體特異性卟啉合Yb(III)錯合物(圖38B)，其在水中展示卓越的NIR發射量子產率。
ii.研發有機金屬錯合物作為活體內腫瘤特異性PDT藥劑
本發明提供另一組新穎的細胞器特異性標記物(用於溶酶體、粒線體、高基氏體)。此等錯合物在試管內同時引起試管內1O2產生且在藉由可見光/NIR激發照射時得到細胞器之發光影像。此類行為能夠使用雙雷射激發提供空間控制以損害選定細胞隔室/組分。先前，本發明人報導卟啉合鐿錯合物，其展示與磷脂醯絲胺酸的強結合及經由靶向陰離子磷脂膜區分癌細胞的能力(圖39A)，且最近，其基元結構(Gd-N)已展現作為活體內腫瘤特異性PDT藥劑的可用性。(圖39B)。
在本發明中，提供另一組用於生物成像(NIR光學及t1磁共振成像)之多重模式卟啉合鑭系元素類錯合物，其強有力地結合於目標磷酸化(phospholysation)陰離子膜/整合素α v β 3 同功型，且生成1O2作為抗癌劑。本發明提供(1)適用作雙重探針之錯合物，其經由與已知官能基及肽生物共軛以及來自卟啉部分之1O2用於光學及MRI 成像 及 癌症特異性PDT效果 ；(2)經由光學成像及其他典型方案之試管內抗癌效果；(3)此等錯合物(具有抗癌效果)藉由MRI成像/ICPMS之活體內藥物動力學及生物分佈。
本文中，本發明人已設計及合成4種水溶性、細胞滲透性卟啉類釓錯合物Gd-1、Gd-2、Gd-3-R1、Gd-3-N(圖40)，其具有如與圖12a)相同之化學通式。檢驗適用作多重模式PDT藥劑之此等錯合物(1.生物穩定性-PM；2.PDT及原位成像-1O2及發射量子產率：3.MR成像-t1鬆弛性；及4.癌症或膀胱細胞特異性-活體外毒性)
(a)釓錯合物Gd-1、Gd-2、Gd-3-R
1
、Gd-3-N之穩定性、溶解性及攝取特徵
Gd-1、Gd-2、Gd-3-R1、Gd-3-N之卟啉上之取代基的質子化表明水溶性的改良。所有錯合物已藉由HPLC純化。有機金屬系統Gd-2、Gd-3-R 1 及Gd-3-N展示比Gd-1較好的穩定性，且Gd-2.Gd-3-R 1 及Gd-3-N之Pm值為約8.15。Pm值為給定螯合劑保留未經錯合之自由金屬離子之濃度的負對數，pM=-log[M]自由。根據流式細胞量測術之細胞攝取特徵亦展示在四種錯合物中，Gd-3-R 1 在癌細胞中具有最快攝取速率，且亦對膀胱癌T24細胞具有相對於正常MRC-5細胞較好選擇性(圖41)。
(b)
1
O
2
及NIR發射量子產率
在錯合物質子化時，展示類似1O2及發射量子產率且與現有錯合物H2TPP比較，其在430nm處激發時分別具有約70% 1O2量子產率(圖42)及46%發射量子產率。
(c)Gd-1、Gd-2、Gd-3-R
1
、Gd-3-N之t
1
鬆弛性及活體外毒性/分佈
在目標研發其作為MR造影劑之情況下，錯合物之水交換率為初步研究關鍵中之一者。評估Gd-1、Gd-2、Gd-3-R 1 、Gd-3-N之t1鬆弛性，且Gd-3-R 1 之t1鬆弛性比Gd-DOTA大三倍(圖43)。Gd-3-R 1 之活體外腫瘤毒性效果已與對照(Gd-2)比較(圖44)。
(d)活體內磁共振成像(MRI)
在向小鼠尾部靜脈注射Gd-3-R 1 及Gd-DOTA後，立即進行MRI實驗。如圖49A及圖49B中所示，Gd-3-R 1 在異種移植腫瘤(T24膀胱癌細胞)上之造影效果顯著且特異性地增強，而Gd-DOTA增強全身信號，對腫瘤不具有選擇性。
對整合素α v β 3 同功型特異性肽塗層之多重模式鑭系元素類生物探針作為同步成像(光學及MR)及試管內及活體內抗癌劑。
任務1-合成可選擇性區分腫瘤細胞用於有效PDT且可供用於MR及光學成像之「智慧型」有機金屬錯合物
在光動力治療中存在兩個與商業或文獻可獲得之光敏劑相關的主要問題：(i)癌細胞之識別及(ii)其效果監測。研究展示新研發之鑭系元素錯合物Gd-3-R 1 能夠藉由其陰離子PS膜鑑別癌細胞，在特定雷射 波長下生成1O2，且顯示雙光子誘導之NIR發射及MR可用性。本發明人擴展其先前發現且執行全面方案，獲得新穎的鑭系元素錯合物(最佳癌細胞選擇性及較好1O2產率)作為特定用於癌症疾病之新一代PDT藥劑，尤其用於膀胱癌。新研發藥劑能夠治療皮膚下較深或身體組織中之腫瘤，相較於正常細胞對癌細胞更具選擇性且更快自身體移除，減少人們需要關心感光性反應之時間。最佳光敏劑之選擇標準。對於選擇光敏劑存在多個標準。首先，其必須為水溶性的。光敏劑應能夠在近紅外區域激發，尤其800nm至900nm之間。另外，最佳光敏劑之1O2量子產率應>20%，且具有特異性粒線體次細胞定位。有效膀胱癌特異性光敏劑(亦即1J雷射施配中之LC50為1M)之光細胞毒性必須比暗細胞毒性低100倍(IC50必須>0.1mM)。
卟啉類化合物之吸收及螢光細節
卟啉為具有11個非定域雙鍵之高度共軛分子。發現金屬卟啉之電子吸光帶處於約410至430nm(Soret波段或B波段)及550至650nm(Q波段)，具有強的單光子吸收係數(>100K M-1cm-1)。卟啉之發射帶始終位於約650至700nm。因此，金屬卟啉之發射及激發帶始終位於生物窗內。另外，金屬卟啉之強的雙光子吸收橫截面經記錄>100GM，其指示卟啉可在860nm處激發且在650nm至700nm得到雙光子誘導之發射用於分子成像，以及用於產生1O2及PDT。
1.1 合成靶向陰離子磷脂膜之水溶性、高度發光、MR及
1
O
2
可用的卟啉類釓(III)錯合物
水溶性卟啉類釓錯合物(Gd-N)展現對癌細胞膜強的選擇 性，發射強的可見至NIR發射光，且經歷可自身體快速移除之高代謝。為改良作為多重模式藥劑之錯合物之鬆弛性及穩定性，本發明提供額外兩種類型有機金屬錯合物，其中Gd離子藉由其他有機金屬化合物(Gd-4-R n )或藉由羧酸側接臂(Gd-5-R n )穩定(圖45及圖46)。
1.2 合成靶向膀胱癌細胞/腫瘤之水溶性、高度發光、MR及
1
O
2
可用的卟啉類釓(III)錯合物
對於膀胱癌診斷，偵測膀胱癌之身體檢查具有損害膀胱功能的高風險。就特定治療而論，PDT為較新穎的治療方法，現對其進行研究，看其是否適用於治療尤其早期膀胱癌。使用傳統PDT之侷限性為光的弱穿透能力，且難以即時監測效能。本發明提供多重模式PDT藥劑用於全面診斷及治療膀胱癌-MR用於診斷，NIR誘導之1O2用於PDT且NIR誘導之NIR發射用於即時監測PDT效果。在本發明人之公開案(PNSA,2014,E5492-E5497)及上文之實施例中，展示本發明卟啉類錯合物在癌細胞中之穩定性、鬆弛性、NIR誘導之發射、1O2能力及選擇性。靶向膀胱癌之治療診斷錯合物之設計展示於圖45中(Gd-3-R 1 /Gd-4-R 1 /Gd-5-R 1 )，且圖47中作為載體之針對整合素蛋白質之α v β 3 同功型的若干膀胱癌特異性肽(Gd-3-R n /Gd-4-R n /Gd-5-R n /Gd-6-R n )將與第1.1節中的多重模式錯合物共軛。
製備化合物Por-TMS
4-((三甲基矽基)乙炔基)苯甲醛(2.02g，10mmol)在丙酸(700mL)中與吡啶-4-甲醛(3.21g，30mmol)混合，且在130℃下攪拌混合物半小時。隨後將吡咯(2.64g，40mmol)逐滴添加至反應混合物中，且溫度升 高至140℃。隨後在開放環境中繼續攪拌混合物30分鐘。在冷卻至室溫後，在減壓下移除溶劑以得到黑色固體。將粗產物溶解於最小量之CH2Cl2中且藉由管柱層析在矽膠管柱CH2Cl2/甲醇(12：1)上純化，得到紫色固體。產率8%。
Gd[N(SiMe 3 ) 2 ] 3 ．x[LiCl(THF) 3 ]：在冰水浴中將HN(SiMe3)2(10.8ml，0.050mol)溶解於20ml THF中，隨後歷經30分鐘時間緩慢添加n-BuLi(1.6M於己烷中)。磁力攪拌所得溶液12小時直至獲得澄清淡黃色溶液。隨後將溶液緩慢轉移至具有懸浮於20ml THF中之GdCl3(4.47g，0.017mol)的Schlenk燒瓶。磁力攪拌所得混合物24小時直至所有固體GdCl3消失。所得溶液Gd[N(SiMe3)2]3．x[LiCl(THF)3](x=3至5)稱為溶液C。
Gd-1-L1：將上文所製備之溶液C(2.5ml，0.52mmol之Gd)轉移至Schlenk燒瓶且在真空下移除溶劑。隨後添加10ml CH2Cl2以沈澱LiCl。使混合物離心且將澄清層轉移至另一個具有溶解於15ml甲苯中之無水Por-TMS(0.099g，0.14mmol)的Schlenk燒瓶。使所得溶液回流直至大部分自由鹼與金屬離子配位。隨後添加無水NaL1(0.1g，0.22mmol)[L1-((環戊二烯基)參(二甲基亞磷酸根)-鈷酸根，陰離子三腳架配位體)，且經磁力攪拌另外12小時，隨後將反應溶液冷卻至室溫。反應完成時，在真空中移除溶劑且將殘餘物溶解於CHCl3中，過濾且使用CHCl3/CH3OH醚(V/V 200：1)作為溶析液在矽膠上層析。將產物溶解於CH2Cl2(5ml)中且過濾溶液。產率：61%
Gd-1-L2：與Gd-1-L1類似之程序，用KL 2 (參(1-吡唑基)硼氫化鉀，0.055g，0.22mmol)替換NaL 1 。產率：50%。
Gd-3：向溶解於10ml DCM中之Gd-1-L1(0.133mg，0.1mmol)溶液添加TBAF(1.0M於THF中，0.2mL，0.2mmol)，且攪拌溶液30分鐘。藉由TLC監測反應進程。反應完成後，使混合物通過使用DCM之短矽膠管柱，移除溶劑後，獲得純產物，將純產物(33.2mg，0.02mmol)及Pd(PPh3)4(2.2mg 0.008mmol)、CuI(0.77mg，0.004mmol)、4-碘苯甲酸5.1mg置放於乾燥燒瓶中及氮氣下。添加THF(15mL)及NEt3(5mL)且用氮氣使反應混合物脫氣。在40℃下攪拌反應混合物12小時。此後，在減壓下移除溶劑。殘餘物藉由層析純化。用CH2Cl2/甲醇(10：1)溶析獲得純產物，將純產物(30mg，23.75mmol)、EDCI(9.02g，0.048mmol)、NHS(5.52mg，0.048mmol)置放於乾燥燒瓶中及氮氣下，添加10mL無水DMF。在室溫下攪拌48小時。隨後移除溶劑，藉由二乙醚使殘餘物再結晶且乾燥，得到標題產物，將產物(33.37mg，0.025mol)溶解於DMF(10ml)中，隨後添加CH3I(0.25mmol)且攪拌5小時，反應完成後，移除溶劑。殘餘物用醚.DCM洗滌，獲得純產物。產率52%。
Gd-4：與Gd-3類似之程序，用Gd-1-L2替換Gd-1-L1。產率50%。
Gd-3-Rn：使溶解於無水DMF中之Gd-3(20mg，1當量)之經攪拌溶液與N,N'-二異丙基乙胺(DIPEA)(1當量)混合。將混合物溶液添加至含有肽(1.3當量)(Rn)之小瓶中。其隨後在室溫下反應隔夜，此後，在真空下移除溶劑，得到無水化合物。藉由二乙醚使殘餘物再結晶三次且乾燥，得到標題產物。產率70%。
Gd-4-Rn：與Gd-3-Rn相同之程序，用Gd-4替換Gd-3。產 率68%。
任務2：檢驗Gd-3-R
1
對膀胱癌之選擇性及鬆弛性
檢驗一般光物理特性，諸如發射量子效率及發射壽命。量測此等釓卟啉錯合物之磁性。α v β 3 同功型與本發明卟啉錯合物Gd-3-R 1 之間的結合親和力為研發用於監測α v β 3 同功型膀胱癌之多重模式探針的主要因素。本發明錯合物對α v β 3 同功型膀胱癌之結合親和力藉由焓變化及靜電相互作用測定。細胞滲透性及水溶性卟啉類釓卟啉錯合物將與癌症特異性載體(肽)生物共軛。經調適肽可用以追蹤膀胱癌細胞膜中之整合素α v β 3 同功型。膀胱癌(T24)模型處於研究中，且其他癌細胞模型，諸如HeLa、SK-N-SH、A549、C666-1及正常細胞：MRC-5充當對照(圖48)。
2.1 新合成釓(III)錯合物Gd-3-R
1
之光物理特性及穩定性
遵循文獻方案量測Gd-3-R 1 之線性多光子光物理特性(亦即發射光譜、發射壽命、量子產率及雙光子吸收橫截面)及1O2產率以及光漂白量子產率(與標準品，諸如尿卟啉相比)。進行滴定實驗以研究合成之卟啉錯合物對若干常見生物陰離子及人類血清白蛋白(HSA)的穩定性；測定PM及PKa。將各陰離子之液體濃縮儲備溶液以及HSA分別逐漸添加至所關注錯合物的溶液中。吸收、螢光以及31P NMR波譜分析用以監測在添加各種生物小分子(諸如HSA、檸檬酸鹽等)時錯合物在水溶液中的穩定性。
2.2 經由電泳遷移率位移分析之結合親和力
電泳遷移率位移分析為用於測定對膀胱癌具有特異性之本發明人之釓卟啉錯合物對α v β 3 同功型癌細胞的結合親和力的有效方法。α v β 3 同功型細胞在大腸桿菌系統中表現且藉由麩胱甘肽親和性層析進一步純 化，隨後進行瓊脂糖凝膠電泳。實驗用於確認與鑭系元素生物探針結合不會改變α v β 3 同功型之物理結構。
2.3 經由發射及等溫滴定量熱評估結合親和力
藉由溶液態方法等溫滴定量熱法(ITC)研究錯合物與α v β 3 同功型之結合親和力，該溶液態方法量測分子間(例如大分子蛋白質與配位體之間)的相互作用。相互作用之焓變化(H)、結合化學計量(N)及結合親和力(Ka)均可藉由ITC實驗直接測定。根據焓變化，藉由建立等式確定吉布斯(Gibbs)能量及熵變化。ITC之優點包括以(最重要地)非破壞性方式即時觀測分子間相互作用且對分子量無限制。
2.4 釓卟啉錯合物Gd-3-R 1 之鬆弛性測定
本發明人之所合成錯合物之鬆弛性將自藉由Bruker DPX300 NMR譜儀在D2O溶液中獲得之弛緩時間來計算。使用反轉恢復脈衝序列且在連續脈衝之間保持十×T1延遲。鬆弛性(r1)藉由縱向時間之倒數(1/T1)對比Gd濃度的曲線獲得：
其中T1obs及T1b分別為樣品及溶劑背景之縱向鬆弛時間。
2.5 將使用之腫瘤模型或細胞株，及生物研究細節
膀胱癌(T24)模型處於研究中，且其他癌細胞模型，諸如HeLa、SK-N-SH、A549、C666-1及正常細胞：MRC-5充當對照。癌症/正常細胞(癌細胞：T24-膀胱癌、HeLa、SK-N-SH、A549、C666-1及正常細胞：MRC-5，(2×104個/孔)在96孔盤中培育隔夜。為選擇性結合之試管內成像-在暗處用Gd-3-R 1 (任務1)處理細胞6、12及24小時。藉由新鮮 培養基替換培養基，且細胞在多光子共焦顯微鏡中暴露於由雷射(線性及多光子飛秒Ti：藍寶石雷射)產生的光(1至8J/cm2)。在細胞中進行Gd-3-R 1 之時移共焦影像，且比較其試管內次細胞定位。Gd-3-R 1 在膀胱細胞T24及其他非膀胱癌細胞株(諸如HeLa、C666-1及SK-N-SH)中之次細胞定位不同。
試管內光細胞毒性-用若干濃度之錯合物處理膀胱癌T24細胞且培育12小時。培養基中之自由錯合物將藉由更換培養基若干次來移除。細胞將藉由雷射輻射引發1O2自錯合物釋放且進行MTT分析以量測多個培育時間點之後的細胞存活率。在相同實驗條件下進行對照實驗，實驗條件為諸如光施配量、培育時間及所提出的錯合物在非膀胱癌細胞株中之濃度。
測試本發明錯合物之試管內暗毒性。24小時後，使水溶性錯合物及目標細胞進一步與溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(0.5mg/ml)，或者稱為MTT，一起培育4小時，使得隨細胞之代謝路徑可一起形成甲
。隨後，萃取甲
且藉由二甲亞碸(DMSO)溶解，且在Bio-Rad iMark微板讀取器中量測後續溶液之吸光度(490nm)。重複四次且數據使用GraphPad Prism 5軟體分析和解釋。
有效膀胱癌特異性光敏劑(亦即1J雷射施配中之LC50為1M)之光細胞毒性必須比其暗細胞毒性低100倍。(IC50必須>0.1mM)。
任務3-結構及生物活性(試管內/活體內成像及特異性PDT效果)
在此節中，評估Gd-3-R 1 在活體內之效果。採用全面試管內 及活體內檢查，諸如多共焦活體內即時研究、MR成像及代謝研究(圖49B)。
3.1 測定鑭系元素錯合物對生物分析之穩定性
鑭系元素錯合物對細胞研究之協作關係穩定性存在極大挑戰。因此，必須進行水性/組織培養基穩定性。亦藉由簡單UV-vis吸收/螢光滴定經由前述程序檢測本發明錯合物在各種生物分子(包含檸檬酸鹽及人類血清白蛋白(HSA))存在下及在變化pH中的水性穩定性。將各陰離子之液體濃縮儲備溶液以及HSA單獨且逐漸添加至所關注錯合物的溶液中。在所添加陰離子之體積總計為錯合物溶液之5%時或對錯合物吸收/發光之影響飽和時停止添加。
3.2 試管內細胞毒性研究及細胞攝取速率
為建立小鼠腫瘤異種移植模型，使膀胱癌細胞(T24)或非膀胱癌細胞(HeLa)經胰蛋白酶處理，收集且懸浮於無血清培養基中。將100μL體積中之5×106個細胞皮下注射至雌性無胸腺裸鼠(5週齡)之側腹中。當腫瘤體積達約100mm3尺寸時，將動物隨機分成四個實驗組，且各組中七隻小鼠，如下：第1組，媒劑對照組；第2組，順鉑處理組；第3組，Gd-N低劑量處理組；第4組，Gd-N高劑量處理組。經由每5天一次瘤內注射投予處理物，持續21至28天。重複實驗三次。藉由電子測徑規(精確度0.02mm)每2天量測腫瘤體積，且隨後各自基於等式V=(L×W2)/2計算，其中L及W分別對應於較大及較小尺寸。所有動物實驗根據香港浸會大學(Hong Kong Baptist University)教學及研究用人類及動物個體使用委員會(Committee on Use of Human and Animal Subjects in Teaching and Research)之準則進行。組之間的統計顯著性的單因子變異數分析藉由 GraphPad Prism 5.0軟體評估。
3.3 α
v
β
3
同功型之即時分析及腫瘤抑制效果評估(致瘤分析)-經由多光子共焦及磁共振成像對異種移植小鼠之腫瘤發展的數天/數週追蹤，用於藥物動力學研究
異種移植小鼠之患病藉由移植人類膀胱腫瘤細胞(T24)至小鼠來達成，允許該等腫瘤細胞生長。錯合物在尾部靜脈注入，經腹膜或頰內遞送且在24至48小時之後，以手術方式萃取出異種移植物用於雙光子共焦顯微鏡及MRI實驗，且萃取腫瘤周邊細胞作為對照(不應獲得鑭系元素錯合物信號)。在Co-I研究所中用Bruker Biospec 4.7 T/30cm掃描儀(Bruker公司，馬薩諸塞州)對異種移植物進行活體內MRI實驗。此外，將每週量測腫瘤尺寸。
3.4 所提出的釓錯合物之活體內生物分佈評估
Gd-3-R 1 經靜脈內注入帶有異種移植癌症腫瘤之BALB/c無胸腺小鼠中。在培育24小時之後，殺死小鼠且移除其包含腫瘤之主器官並固定於經10% PBS緩衝的福馬林中。對照模型為僅注射經緩衝的福馬林之無胸腺小鼠。冷凍且凍乾組織樣品24小時，隨後在70℃下藉由濃HNO3分解4小時。藉由ICP-MS測定釓含量(反映錯合物量)。評估小鼠尿液中之釓含量以確認此等錯合物在活體內的代謝。3.3及3.4中之結果應相關(圖44)。
本發明係關於基於具有特異性官能基之卟啉-鑭系元素錯合物之新一代PDT藥劑，該等藥劑可特異性定位於特定腫瘤，且其PDT過程 可經由鉺之NIR發射監測。特定言之，本發明提供多重模式鑭系元素-卟啉PDT藥劑(Er-R 3 )，其能夠經由來自卟啉部分之1O2選擇性殺死膀胱腫瘤細胞，且在Er-R 3 與膀胱癌細胞中之整合素α v β 3 同功型結合時同時提供螢光成像。
視需要，本文中論述之不同功能可以不同順序及/或彼此並行地進行。此外，視需要，上述功能中之一或多者可視情況存在或可組合。
雖然上述發明已相對於各個具體實例及實施例加以描述，但應理解，其他具體實例，如以下申請專利範圍中所表述及其等效物，屬於本發明之範圍內。此外，以上特定實施例僅解釋為說明性的，且不以任何方式限制本發明之其餘部分。無需進一步詳細描述，咸信熟習此項技術者可基於本文中之描述最大程度利用本發明。本文中所列舉之所有公開案以全文引用的方式併入本文中。
<110> 香港浸會大學 黃嘉良
<120> 用於膀胱癌成像及光動力療法的多重模式生物探針
<130> P8084US03
<140> 15/352,561
<141> 2016-11-15
<160> 5
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 實驗室中合成之併入非天然存在之胺基酸的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位點一中之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(10)
<223> 位點二中之C之側鏈與位點十中之C之側鏈一起形成二硫鍵
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位點二中之C為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位點十中之C為D-胺基酸
<400> 1 
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 實驗室中合成之併入非天然存在之胺基酸的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位點一中之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位點二中之C為D-胺基酸
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(10)
<223> 位點二中之C之側鏈與位點十中之C之側鏈一起形成二硫鍵
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位點十中之C為D-胺基酸
<400> 2 
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 實驗室中合成之併入非天然存在之胺基酸的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位點一中之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 位點四中之R為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 位點六中之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 位點七中之C為D-胺基酸
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(15)
<223> 位點七中之C之側鏈與位點十五中之C之側鏈一起形成二硫鍵
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> 位點十五中之C為D-胺基酸
<400> 3 
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 實驗室中合成之併入非天然存在之胺基酸的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> R為第二位點為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 第二位點中之R為D-胺基酸
<400> 4 
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 實驗室中合成之併入非天然存在之胺基酸的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位點一中之C為D-胺基酸
<220>
<221> DISULFID
<222> (1)..(9)
<223> 位點一中之C之側鏈與位點九中之C之側鏈一起形成二硫鍵
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位點九中之C為D-胺基酸
<400> 5 
Claims (17)
- 一種用於光動力療法及癌細胞成像之組成物，其包含由以下分子式表示之鉺卟啉類錯合物、鐿卟啉類錯合物或釓卟啉類錯合物：
- 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該鉺卟啉類錯合物與整合素α v β 3 同功型特異性肽共軛。
- 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物包含該鉺卟啉類錯合物且Rn為SEQ ID NO：4。
- 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物包含該鉺卟啉類錯合物且Rn為SEQ ID NO：5。
- 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物包含該鉺卟啉類錯合物且Rn為SEQ ID NO：3。
- 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物包含由以下分子式表示之鉺卟啉類錯合物：
- 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該等癌細胞包含膀胱癌細胞、子宮頸癌細胞及肺癌。
- 一種如申請專利範圍第1項之組成物的用途，其係用於製造用於有需要之個體中之光動力療法及癌細胞成像之醫藥品，其中用輻射源輻射該個體體內的癌細胞。
- 如申請專利範圍第8項之用途，其中該醫藥品之投予是經靜脈內進行或藉由注射至該等癌細胞之部位進行。
- 如申請專利範圍第8項之用途，其中該輻射源為具有卟啉之Q波段中之波長的光源。
- 如申請專利範圍第8項之用途，其中該輻射源為波長超過550nm之光 源。
- 如申請專利範圍第8項之用途，其中該輻射源為波長為860nm之光源。
- 如申請專利範圍第8項之用途，其中該成像使用螢光成像進行。
- 如申請專利範圍第8項之用途，其中該成像使用NIR成像進行。
- 如申請專利範圍第8項之用途，其中該成像使用MRI成像進行。
- 如申請專利範圍第8項之用途，其中該組成物包含該釓卟啉類錯合物。
- 一種合成如申請專利範圍第1項之組成物之方法，其中Ln為Er或Yb，該方法包含根據以下流程之步驟：
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