TWI664981B - 用於多模式、非侵入性的腫瘤特定治療診斷前藥之鑭系元素工具箱 - Google Patents

用於多模式、非侵入性的腫瘤特定治療診斷前藥之鑭系元素工具箱 Download PDF

Info

Publication number
TWI664981B
TWI664981B TW106132706A TW106132706A TWI664981B TW I664981 B TWI664981 B TW I664981B TW 106132706 A TW106132706 A TW 106132706A TW 106132706 A TW106132706 A TW 106132706A TW I664981 B TWI664981 B TW I664981B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
compound
cancer
ptgdl
cisplatin
emission
Prior art date
Application number
TW106132706A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201818971A (zh
Inventor
黃嘉良
李紅光
Original Assignee
香港浸會大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 香港浸會大學 filed Critical 香港浸會大學
Publication of TW201818971A publication Critical patent/TW201818971A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI664981B publication Critical patent/TWI664981B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A61K47/557—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells the modifying agent being biotin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/003—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table without C-Metal linkages

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本發明係關於具有試管內或活體內反應信號之治療診斷前藥及其用途。本發明亦關於用於評估與整合素αvβ3之結合的合成銪錯合物。

Description

用於多模式、非侵入性的腫瘤特定治療診斷前藥之鑭系元素工具箱 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2016年9月21日申請之美國臨時專利申請案第62/397,360號及2017年9月20日申請之美國專利申請案第15/709,942號之優先權，其揭示內容在此以引用之方式併入。
本發明係關於具有試管內或活體內反應信號之治療診斷前藥。更特定言之，本發明係關於腫瘤靶向及非腫瘤靶向前藥鑭系元素(諸如銪/鐿/釓等)-d-過渡金屬(諸如釕/鉑等)錯合物，其係用於評估與用於特定癌症之腫瘤細胞膜結合受體(諸如用於膀胱癌之整合素αvβ3)的結合。
高細胞毒性鉑(II)/(IV)配位錯合物，如順鉑(cisplatin)及其衍生物(卡鉑(carboplatin)/奧沙利鉑(oxaliplatin))為熟知的有效抗癌劑。已經有基於此等化合物之藥理學非活性形式(或者稱為前藥)的研究以優化藥物的遞送過程(例如腫瘤選擇性、水溶性及細胞滲透性)，之後在標靶 部位進行後續活化。儘管若干前藥取得臨床成功，但獲得期望藥物動力學且具最小額不良副作用仍為前所未有的挑戰，因其不特定分佈於整個身體中。根據文獻，前藥之主要缺陷在於難以追蹤其試管內或活體內活性。令人感興趣的是，診療(治療診斷)奈米藥物(將診斷及治療實體組合為一體之新興範例)之最新出現創造了新的研究前景且為前藥難題提供有希望的解決方案。
治療診斷技術同時提供疾病之成像診斷及靶向療法。具有診斷能力及治療功效之治療診斷奈米藥劑可例如用於病理性機制研究且由於其反應傳信能力可引導治療前/治療後評估，例如試管內或活體內磁共振及螢光研究。可獲得生物分佈資訊以及可操控以光控制之藥物釋放/光動力療法。借用奈米對應物之概念，本發明之一目標為提供具有改良之治療及/或診斷特性之額外治療診斷分子前藥。
本文提供生物相容性鑭系元素錯合物或材料，其可選擇性區分癌細胞且其遞送可使用無毒激發波長來觀測，其中細胞毒性d-過渡金屬錯合物(諸如順鉑、釕聚吡啶錯合物等)之釋放在達到過度表達癌症特定膜受體時選擇性地觸發。
在某些具體實例中，本文提供一種包含式(I)之化學結構的化合物：
其中Ln為鑭系元素金屬；R1獨立地為氫、Pn、 R1a為氫或Pn；R2為氫或烷基；R3、R4及R5各獨立地為氫、OMe、NMe2或CF3；R6、R7及R8各獨立地為O-、Pn、或
Pn為由SEQ ID NO：1、2、3、4或5表示之多肽；M表示選自由以下組成之群的部分： 其中X為Cl或OH；且n+表示化合物之淨電荷且為+1、+2、+3或+4；其限制條件為若M為，則R2為烷基或R1、R1a、R6、R7及R8中之至少一者為Pn。
在某些具體實例中，本文提供一種包含式I之化學結構的化合物，其中R1為Pn且R6、R7及R8為O-；R1為H，R6及R7為O-，且R8為Pn；或R1為H，R6及R8為O-，且R7為Pn；或R1為H且R6、R7及R8為O-。
在某些具體實例中，本文提供一種包含式I之化學結構的化合物，其中R2為甲基或R1、R6、R7或R8中之至少一者為Pn。
在某些具體實例中，本文提供一種包含式I之化學結構的化合物，其中該鑭系元素金屬為Eu、Gd或Yb。
在某些具體實例中，本文提供一種包含式I之化學結構的化合物，其中R3、R4及R5為氫。
在某些具體實例中，本文提供一種包含式I之化學結構的化合物，其中化合物包含選自由以下組成之群的式： 其中Pn為由SEQ ID NO：1表示之多肽。
在某些具體實例中，本文提供一種包含式(II)之化學結構的化合物：
其中，Ln1為Eu或Yb；Ln2為Gd；R2之各實例獨立地為氫或烷基；R3、R4及R5之各實例獨立地為H、OMe、NMe2或CF3；R6、R7及R8之各實例獨立地為O-或Pn；Pn之各實例為獨立地由SEQ ID NO：1、2、3、4或5表示之多肽；且n+表示化合物之淨電荷且為+2、+3、+4或+5。
在某些具體實例中，本文提供一種包含式II之化學結構的化合物，其中R2為甲基，R3、R4及R5為氫；R6、R7及R8為O-；R2為甲基，R3、R4及R5為氫，R6及R7為O-，且R8為Pn；或R2為甲基，R3、R4及R5為氫，R6及R8為O-，且R7為Pn。
在某些具體實例中，本文提供一種醫藥組合物，其包含含化學式I之化合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
在某些具體實例中，醫藥組合物包含以下之混合物 其中Ln1為Eu或Yb；且Ln2為Gd。
在某些具體實例中，本文提供一種在有需要之患者中治療、成像或成像及治療癌症的方法，其包含向患者投予有效量之包含化學式I之化合物的步驟。
在某些具體實例中，癌症為膀胱癌、子宮頸癌、皮膚癌、口腔癌或前列腺癌。
在某些具體實例中，化合物係選自由以下組成之群： 其中Pn為由SEQ ID NO：1表示之多肽。
本文所揭示之化合物為與一或多種相對陰離子(counter-anion)一起存在之離子物種。本文所描述之化合物及相對陰離子的淨電荷為零。可使用任何相對陰離子。相對陰離子之適合實例包括(但不限於)鹵化物(諸如氯化物、溴化物及碘化物)、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、丁二酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、棕櫚酸鹽、膽酸鹽、麩胺酸鹽、戊二酸鹽、酒石酸鹽、硬脂酸鹽、柳酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、山梨酸鹽、苦味酸鹽、苯甲酸鹽、肉桂酸鹽及其類似物。在某些具體實例中，相對陰離子為氯化物、溴化物、磷酸鹽、乙酸鹽、硫酸鹽或其組合。
熟習此項技術者應瞭解，本文所述之本發明除特定描述之彼等內容外允許進行變化及修飾。
本發明包括全部此類變化及修飾。本發明亦包括本說明書中單獨或共同提及或指出的所有步驟及特徵，以及該等步驟或特徵中之任兩者或多於兩者的任何及所有組合。
在本說明書通篇中，除非本文另有需要，否則詞語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」的變化形式應理解為意指包括所述整體或整體的群組，但不排除任何其他整體或整體的群組。亦應注意，在本發明中且尤其在申請專利範圍及/或段落中，諸如「包含(comprises)」、「包含(comprised)」、「包含(comprising)」及其類似物之術語可具有美國專利法中賦予其之含義；例如其可意謂「包括(includes)」、「包括(included)」、「包括(including)」及其類似物；且諸如「基本上由……組成(consisting essentially of)」及「基本上由……組成(consists essentially of)」之術語具有美國專利法賦予其之含義，例如其使得無需對要素明確說明，即排除先前技術中所見或影響本發明之基礎或新穎特徵的要素。
此外，在本說明書及申請專利範圍通篇，除非本文另有需要，否則詞語「包括(include)」或諸如「包括(includes)」或「包括(including)」的變化形式應理解為意指包括所述整體或整體的群組，但不排除任何其他整體或整體的群組。
本文中所用之所選術語的其他定義可見於[實施方式]內且通篇應用。除非另外定義，否則本文中所用之全部其他技術術語具有與一 般熟習本發明所屬技術者通常理解相同的含義。
對於熟習此項技術者，本發明之其他態樣及優勢由隨後說明書的綜述而顯而易見。
當結合附圖時，本發明之以上及其他目標及特徵將由以下本發明之描述而變得顯而易見，其中：圖1展示用於膀胱癌之光學/MRI成像及抑制之多模式水溶性的基於鑭系元素(銪/鐿/釓)之前藥的研發。
圖2展示本文所述之錯合物的具體實例。
圖3展示前藥PtEuL、N 1 -Pt-Eu-L 1 -P 1 及N 7 -Pt-Eu-L 1 -P 1 之化學結構。
圖4展示N 1 -Pt-Eu-L 1 -P 1 (a及b)及N 7 -Pt-Eu-L 1 -P 1 (c及d)與αvβ3整合素蛋白分子對接之初始資料。
圖5A展示用於光學成像之雙重探針的研發及為特定抗癌功效而經由與已知官能基(用於光解離)及具有其他抗癌Pt部分之胜肽生物結合進行功能化。(Pn=P1：-Ahx-cGRLKEKKc-RrRk(SEQ ID NO：1)；P2：-Ahx-cQKGGRKHc-RrRk(SEQ ID NO：2)；P3：-Ahx-cMKKHGKRc-RrRk(SEQ ID NO：3)；P4：-Ahx-cFDDFGc-RrRk(SEQ ID NO：4)且P5：-Ahx-cQDGRMGFc-RrRk(SEQ ID NO：5))。
圖5B展示用於αvβ3同功型之胜肽結構。(P1：-Ahx-cGRLKEKKc-RrRk(SEQ ID NO：1)；P2：-Ahx-cQKGGRKHc-RrRk (SEQ ID NO：2)；P3：-Ahx-cMKKHGKRc-RrRk(SEQ ID NO：3)；P4：-Ahx-cFDDFGc-RrRk(SEQ ID NO：4)且P5：-Ahx-cQDGRMGFc-RrRk(SEQ ID NO：5))。
圖6A展示前藥之改良穩定性及降低其非活性形式之毒性的結構。
圖6B展示前藥之改良其兩光子引發之光釋放效率的結構。
圖7A展示多模式治療診斷前藥之結構。(計劃A：螢光成像)。
圖7B展示多模式治療診斷前藥之結構。(計劃B：經由混合型及二聚合Gd-Eu或Gd-Yb錯合物光學及MR成像的前藥)。
圖8展示MRI方案，7T，ENSCP。
圖9展示DOTAREM、GdL及PtGdL之化學結構。
圖10展示多模式持久MRI對比劑(PtGdL)之光引發裂解的示意性說明，該裂解產生同時展示高螢光關-開信號及細胞毒性效應的快速清除MRI探針(GdL)。
圖11A展示tris緩衝劑(pH=7.4)溶液中PtGdL之光活化。UV(365nm.5mW)輻射下PtGdL之發射光譜(λex=365nm)變化。
圖11B展示426nm下I/I0相對於時間的曲線。準一級速率常數k=0.051min-1。
圖11C展示試管內PtGdL之光活化。與不同劑量濃度(1、2、5、10μM)之PtGdL一起培育24小時之HeLa細胞之兩光子(λex=730nm)引發之影像及細胞死亡。在無輻射下，沒有發射。
圖11D展示試管內PtGdL之光活化。與不同劑量濃度(1、2、5、10μM)之PtGdL一起培育24小時之HeLa細胞之兩光子(λex=730nm)引發之影像及細胞死亡。激發30分鐘後，觀測到自釋放之GdL的明亮發射。
圖11E展示試管內PtGdL之光活化。與不同劑量濃度(1、2、5、10μM)之PtGdL一起培育24小時之HeLa細胞之兩光子(λex=730nm)引發之影像及細胞死亡。圖11D及圖11C之明亮區域之合併影像展示自用PtGdL及730nm雷射處理之細胞的顯著細胞死亡及明亮發射強度。
圖12展示在25℃及37℃下，不同磁場強度值下PtGdL、GdL及Gd-DOTA(1mM)的NMRD特徵譜(profile)。
圖13A展示在注射GdL後6分鐘與4小時之間所獲得之小鼠肝的活體內T 1 加權MR影像。
圖13B展示在注射PtGdL後6分鐘與24小時之間所獲得之小鼠肝的活體內T 1 加權MR影像。
圖13C展示信號衰減曲線(PtGdL、GdL及DOTAREM)。
圖14A展示GdL之6分鐘與4小時之間小鼠腎皮層的活體內T 1 加權MR影像。
圖14B展示PtGdL之6分鐘與24小時之間小鼠腎皮層的活體內T 1 加權MR影像。
圖14C展示信號衰減曲線(PtGdL、GdL及DOTAREM)。
圖15A展示PtGdL及GdL在水溶液(10μM)中之吸收(λex=365nm)光譜。
圖15B展示PtGdL及GdL在水溶液(10μM)中之發射(λex=365nm)光譜。
圖16A展示PtGdL、GdL及順鉑在HeLa細胞中的MTT暗細胞毒性。GdL及順鉑在此實驗中用作對照。(HeLa-5中順鉑之IC50=約3.6±0.2μM；HeLa中GdL之IC50>200μM；HeLa中PtGdL之IC50=約25.0±0.8μM)。
圖16B展示PtGdL、GdL及順鉑在WPMY-1細胞中的MTT暗細胞毒性。GdL及順鉑在此實驗中用作對照。(WPMY-1中順鉑之IC50=7.2±0.6μM；WPMY-1中GdL之IC50>200μM；WPMY-1中PtGdL之IC50=43.9±1.1μM)。
圖17展示R1與水溶液中PtGdL之濃度的曲線。數據之線性擬合得出PtGdL的鬆弛度=24.4mM-1s-1。
圖18展示PtGdL在水溶液(2.5μM)中之DLS光譜。PtGdL之DLS光譜證明了PtGdL可凝集於水溶液中。
圖19A展示吾等光反應性抗癌劑RuLnL(Ln=Eu、Gd、Yb或其他鑭系元素)之光引發裂解的示意性說明，該裂解產生高度發光關-開信號及細胞毒性效應。
圖19B展示經設計之癌症靶向特定釕鑭系元素前藥。
圖20A展示RuEuL及EuL在水溶液中之吸收光譜。
圖20B展示RuEuL及EuL在水溶液中之發射光譜(10μM λex=330nm)。
圖21展示在雷射(455nm，P=1W)輻射下5μM RuEuL 在水溶液中之發射光譜變化。插圖展示在455nm雷射輻射8分鐘下RuEuL之銪發射增強的照片影像。
圖22展示水溶液中之RuEuL及參考樣品的光解離的HPLC定性分析：EuL、[Ru(OH)(bpy)2(H2O)]+、RuEuL及488nm雷射輻射2分鐘及8分鐘之後的RuEuL(P=1W)。水溶液中各樣品之濃度為5μM。
圖23A展示ESI-MS反應相對於[Ru(OH)(bpy) 2 ] + 或EuL之濃度及發射強度相對於EuL之濃度的校正曲線。
圖23B展示在用450nm雷射光(P=1W)輻射RuEuL 5μM之後，光解離產物[Ru(OH)(bpy) 2 ] + 及EuL的定量分析。
圖24展示在無光輻射下或455nm，光量=1J之光輻射下，RuEuL及EuL的DNA結合特徵譜。
圖25A展示RuEuL對HeLa細胞的暗及光-(450nm輻射1J)細胞毒性。
圖25B展示EuL對HeLa細胞的暗及光(450nm輻射1J)細胞毒性。
圖26A展示水溶液中之RuEuL及PtEuL(λex.=700nm)之光引發解離的兩光子激發監測。
圖26B展示RuEuL及PtEuL(對照)之光引發藥物釋放的試管內成像。將HeLa細胞與50μM RuEuL或10μM PtEuL一起培育6小時，且隨後用488-nm雷射(P=7mW)輻射；影像在兩光子700-nm激發下獲取。
圖27展示吾人之光反應性抗癌生物探針PtEuL之光引發裂 解的示意性說明，該裂解產生高度發光銪關-開信號及細胞毒性效應。
圖28A展示水溶液中之PtEuL及EuL(3μM，λex=325nm)的吸收光譜。
圖28B展示水溶液中之PtEuL及EuL(3μM，λex=325nm)的發射光譜。
圖28C展示在UVA(365nm)輻射(光量=4J cm-2)90分鐘下PtEuL之發射光譜變化。(c插圖)在UVA輻射20分鐘下PtEuL之銪發射增強的照片影像。
圖28D展示615nm下I/I 0 相對於時間的曲線。PtEuL之準一級速率常數k=0.53min-1。
圖29A展示用或不用PtEuL(50μM)在暗處於37℃下處理12小時之質體DNA(Tris-HCl緩衝劑中之20nM，pH=7.4)的CD光譜。
圖29B展示質體DNA與如所示之測試化合物(20μM)一起培育，藉由UVA(光量50J m-2)輻射，且隨後經受瓊脂糖凝膠電泳。DNA凝膠影像使用GelRed Nucleic Acid Stain(BIOTIUM)獲得。
圖30A展示與不同劑量濃度(0、1、2、5、10μM)之PtEuL一起培育24小時之HeLa細胞的兩光子(λex=730nm)引發之影像。無輻射。
圖30B展示與不同劑量濃度(0、1、2、5、10μM)之PtEuL一起培育24小時之HeLa細胞的兩光子(λex=730nm)激發下之影像。光照射30分鐘後。
圖30C展示與不同劑量濃度(0、1、2、5、10μM)之PtEuL一起培育24小時之HeLa細胞的兩個光子(λex=730nm)激發下之影像。圖30A及30B之合併影像。
圖31展示EuL之敏化銪發射及PtEuL之光誘發解離的所提出的能量傳遞機制。
圖32展示經受0分鐘及90分鐘之UVA輻射的PtEuL之HPLC分析圖及EuL之HPLC分析圖。
圖33A展示在與EuL(10、20、50及100μM)一起培育24小時之後，在730nm雷射激發(能量=500mW)20分鐘之後HeLa細胞的試管內發光成像。
圖33B展示在與EuL(10、20、50及100μM)一起培育24小時之後，在730nm雷射激發(能量=500mW)20分鐘之後HeLa細胞的試管內亮視野成像。
本發明之範圍不受限於本文所述之特定具體實例中之任一者。呈現以下具體實例僅用於例示。
本發明部分係關於膀胱癌特定前藥藥劑及用於評估與整合素αvβ3之結合的合成銪錯合物。
發明人花費超過十年一直研究及探究為基於鑭系元素之配位錯合物/材料之生物醫學用途提供較高成像品質之不同方式。相關研究包括NIR(上轉換/多光子)激發及試管內或活體內結構定位關係。
近來，發明人報導使用鉑-銪錯合物(PtEuL)之『概念驗證(proof-of-concept)』研究，其作為順鉑之控制遞送媒劑具有極大前景。其展示即時、反應性光觸發關-開切換行為及一旦順鉑光解離則觸發之基於鑭系元素之長期指紋發射。發明人關於『概念驗證』研究的報導呈現於本發明中題為其他具體實例部分下且其全部內容併入本文中。
然而，發明人之先前工作仍具有改良空間。舉例而言，癌細胞中之PtEuL的暗細胞毒性仍相當高且無癌細胞選擇性；此外，UV激發可能不會充分穿透以用於所欲活體內研究。近紅外線(NIR)激發光(800至1000nm，亦即美國國家標準-980nm激發，具有<0.73W cm-1 cw雷射光束，具有30-50mm組織穿透)使其在抗癌藥物之生物成像及光解離應用中更有效。研發能夠進行同時NIR-光學成像，亦即具有協同敏感及高時間空間解析度之雙重成像帶順鉑分子貨物的確有助於科學家更綜合地且便利地原位研究即時生物分佈及藥物動力學，以及在無自發螢光干擾及額外對照實驗需求下輔助前藥效能之評估。
在本發明中，三種不同合成方法研發切實可行的多模式治療診斷前藥(圖1)。將可滲透細胞及水溶性基於1,4,7,10-四氮雜環十二烷(cyclen)之銪錯合物與光/酶促可解離部分及癌症特定載體(胜肽)生物結合；基於Pt(II)/Ru(II)之活性藥物將試管內及活體內合成且綜合評估。對於癌症選擇，光活化前藥之未來研究將集中於皮膚/口腔/前列腺/膀胱癌。發明人想要追蹤膀胱癌中之整合素αvβ3同功型，由此從長遠來看研發膀胱癌特定前藥藥劑。選擇膀胱癌係因其為一種擴散至泌尿道其他部分之高風險癌症，且因此其極可能成為早期治療的候選項。
本發明之第一態樣提供一種用於治療診斷前藥之化合物，其包含具有(I)之調配物的基於鑭系元素之錯合物(圖2)
其中Ln為Eu、Gd、Yb或其他鑭系元素；其中P n 為癌症靶向載體，諸如整合素αvβ3同功型特定胜肽，包含其中P n (其中n=1-6)=P 1 ：-Ahx-cGRLKEKKc-RrRk(SEQ ID NO：1)；P 2 ：-Ahx-cQKGGRKHc-RrRk(SEQ ID NO：1)；P 3 ：-Ahx-cMKKHGKRc-RrRk(SEQ ID NO：3)；P 4 ：-Ahx-cFDDFGc-RrRk(SEQ ID NO：4)；P 5 ：-Ahx-cQDGRMGFc-RrRk(SEQ ID NO：5)；P 6 ：生物素衍生物，諸如： 其中Rn(其中n=1至8)，且其中d過渡金屬錯合物M=
其中X=Cl或OH。
在本發明第一態樣之第一具體實例中，提供一種用於治療診斷前藥之化合物，其包含具有(I)之調配物的基於鑭系元素之錯合物，其中該等基於鑭系元素之錯合物進一步包含下式之調配物
其中L1係指錯合物在鑭系元素部分中具有類似配位體且鉑部分之配位體為NH3、NH3及Cl)；其中L2係指鉑部分之配位體含有乙二胺配位體及Cl配位體；其中L3係指鉑部分之配位體含有(1R,2R)-環己烷-1,2-二胺配位體及Cl配位體；其中L4為L3之變體，其類似pt部分但鑭系元素部分含有苯甲醯胺取代基。
其中Ln=Eu或Gd或Yb或其他鑭系元素；其中R1=H或P n ；其中R2=H或P n ；其中R3、R4、R5=H、NMe2或CF3；其中R6、R7、R8=O-或P n ；其中m+為錯合物之總電荷；其中Ln=Eu或Gd或Yb或其他鑭系元素且其中P n 為癌症靶向載體，諸如整合素αvβ3同功型特定胜肽，包含其中P n (其中n=1-6)，(P 1 ：-Ahx-cGRLKEKKc-RrRk；P 2 ：-Ahx-cQKGGRKHc-RrRk；P 3 ：-Ahx-cMKKHGKRc-RrRk；P 4 ：-Ahx-cFDDFGc-RrRk；P 5 ：-Ahx-cQDGRMGFc-RrRk；P 6 ：生物素衍生物，諸如：
在本發明第一態樣之第二具體實例中，提供一種用於治療診斷前藥之化合物，其包含具有(I)之調配物的基於鑭系元素之錯合物，其 中該等基於鑭系元素之錯合物包含下式之調配物
其中R1=H或P n ；其中R2=H或P n ；其中R3、R4、R5=H、NMe2或CF3；其中R6、R7、R8=O-或P n ；其中m+為錯合物之總電荷；其中Ln=Eu或Gd或Yb或其他鑭系元素且其中P n 為癌症靶向載體，諸如整合素αvβ3同功型特定胜肽，包含其中P n (其中n=1-6)，(P 1 ：-Ahx-cGRLKEKKc-RrRk(SEQ ID NO：1)；P 2 ：-Ahx-cQKGGRKHc-RrRk(SEQ ID NO：2)；P 3 ：-Ahx-cMKKHGKRc-RrRk(SEQ ID NO：3)；P 4 ：-Ahx-cFDDFGc-RrRk(SEQ ID NO：4)；P 5 ：-Ahx-cQDGRMGFc-RrRk(SEQ ID NO：5)；P 6 ：，諸如：
在本發明第一態樣之第三具體實例中，提供一種用於治療診斷前藥之化合物，其包含具有(I)之調配物的基於鑭系元素之錯合物，其中該等基於鑭系元素之錯合物包含下式之調配物
其中Ln為Eu Gd、Yb或其他鑭系元素。N1係指1,4,7,10-四氮雜環十二烷巨環配位體之N1側；且N7係指1,4,7,10-四氮雜環十二烷之N7側。
在本發明之第二態樣中，提供一種具有(I)之調配物的化合物，其中該化合物為螢光成像或MRI或光可解離治療診斷前藥。
在本發明之第三態樣中，提供一種具有(I)之調配物的化合物，其中該化合物為螢光成像及MRI及光可解離治療診斷前藥。
在本發明之第四態樣中，提供一種具有(I)之調配物的化合物，其中該化合物為用於治療膀胱癌或子宮頸癌之治療診斷前藥。
在本發明之第五態樣中，提供一種具有(I)之調配物之化合物的用途，其用於治療膀胱癌或子宮頸癌。
在本發明第五態樣之第一具體實例中，提供一種具有(I)之調配物的化合物的用途，其中該化合物經由靜脈內注射投予。
在本發明之第六態樣中，提供一種具有(I)之調配物之化合物的用途，其用於成像膀胱癌或子宮頸癌。
在本發明第六態樣之第一具體實例中，提供一種具有(I)之調配物的化合物的用途，其中該化合物經由靜脈內注射投予。
在本發明之第七態樣中，提供一種具有(I)之調配物之化 合物的用途，其用於治療包含皮膚癌、口腔癌及前列腺癌之表體惡性病(superficial malignancy)。
在本發明第七態樣之第一具體實例中，提供一種具有(I)之調配物之化合物的用途，其中該化合物經由靜脈內注射投予。
在本發明之第八態樣中，提供一種具有(I)之調配物之化合物的用途，其用於對包含皮膚癌、口腔癌及前列腺癌之表體惡性病進行成像。
在本發明第八態樣之第一具體實例中，提供一種具有(I)之調配物之化合物的用途，其中該化合物經由靜脈內注射投予。
在本發明之第九態樣中，提供一種包含式(I)之化學結構的化合物：
其中Ln為鑭系元素金屬；R1獨立地為氫、Pn、 R1a為氫或Pn；R2為氫或烷基；R3、R4及R5各獨立地為氫、OMe、NMe2或CF3；R6、R7及R8各獨立地為O-、Pn或
Pn為由SEQ ID NO：1、2、3、4或5表示之多肽；M表示選自由以下組成之群的部分： 其中X為Cl或OH；且n+表示化合物之淨電荷且為+1、+2、+3或+4；其限制條件為若M為，則R2為烷基或R1、R1a、R6、R7及R8中之至少一者為Pn。
在第九態樣之第一具體實例中，提供一種化合物，其中包含式(I)之化學結構的化合物不具有式Ia： 其中Ln為鑭系元素金屬。在某些具體實例中，Ln為Eu或Gd。
在第九態樣之第二具體實例中，提供一種化合物，其中R1為Pn且R6、R7及R8為O-；R1為H，R6及R7為O-，且R8為Pn；或R1為H，R6及R8為O-，且R7為Pn；或R1為H且R6、R7及R8為O-。
在第九態樣之第三具體實例中，提供一種化合物，其中R2為甲基或R1、R6、R7或R8中之至少一者為Pn。
在第九態樣之第四具體例實中，提供一種化合物，其中鑭系元素金屬為Eu、Gd或Yb。
在第九態樣之第五具體實例中，提供一種化合物，其中R3、R4為R5為氫。
在第九態樣之第六具體實例中，提供一種化合物，其中化合物包含選自由以下組成之群的式： 其中Pn為由SEQ ID NO：1表示之多肽。
在本發明之第十態樣中，提供一種包含式(II)之化學結構的化合物：
其中，Ln1為Eu或Yb；Ln2為Gd；R2之各實例獨立地為氫或烷基；R3、R4及R5之各實例獨立地為H、OMe、NMe2或CF3；R6、R7及R8之各實例獨立地為O-或Pn；Pn之各實例為獨立地由SEQ ID NO：1、2、3、4或5表示之多肽；且n+表示化合物之淨電荷且為+2、+3、+4或+5。
在第十態樣之第一具體實例中，提供一種化合物，其中R2為甲基，R3、R4及R5為氫；R6、R7及R8為O-；R2為甲基，R3、R4及R5為氫，R6及R7為O-，且R8為Pn；或R2為甲基，R3、R4及R5為氫，R6及R8為O-，且R7為Pn。
在本發明之第十一態樣中，提供一種醫藥組合物，其包含式(I)之化學結構的化合物及至少一種醫藥學上可接受賦形劑。
在第十一態樣之第一具體實例中，提供一種醫藥組合物，其包含以下之混合物 其中Ln1為Eu或Yb；且Ln2為Gd。
在本發明之第十二態樣中，提供一種治療、成像或成像及治療有需要之患者中的癌症的方法，其包含向患者投予有效量之式(I)之化學結構的化合物的步驟。
在第十二態樣之第一具體實例中，提供一種方法，其中癌症為膀胱癌、子宮頸癌皮膚癌、口腔癌或前列腺癌。
在第十二態樣之第二具體實例中，提供一種方法，其中化合物係選自由以下組成之群： 其中Pn為由SEQ ID NO：1表示之多肽。
本文所揭示之化合物為與一或多種相對陰離子一起存在之離子物種。本文所描述之化合物及相對陰離子的淨電荷為零。可使用任何相對陰離子。相對陰離子之適合實例包括(但不限於)鹵化物(諸如氯化物、溴化物及碘化物)、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、丁二酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、棕櫚鹽、膽酸鹽、麩胺酸鹽、戊二酸鹽、酒石酸鹽、硬脂酸鹽、柳酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、山梨酸鹽、苦味酸鹽、苯甲酸鹽、肉桂酸鹽及其類似物。在某些具體實例中，相對陰離子為氯化物、溴化物、磷酸鹽、乙酸鹽、硫酸鹽或其組合。
發明人進行了三個概念驗證實驗：(1)已合成用於評估與整 合素αvβ3同功型之結合的新銪錯合物(胜肽接合在1,4,7,10-四氮雜環十二烷之相反位置的兩種鉑(II)-銪(III)錯合物，N1-Pt-Eu-L1-P1及N7-Pt-Eu-L1-P1)。各錯合物之設計已根據分子對接實驗選定。(2)對膀胱癌之選擇性藉由MTT分析及初始試管內成像研究確認。(3)已進行光引發之定量遞送分析，將光量發射強度與順鉑含量進行比較，建立此關係之線性。
長期來看，發明人設想將此等能夠成像使用之光解離前藥與不同載體合併以有助於增強其標靶特定性。提出系統地研發若干種鑭系元素錯合物作為靶向及監測疾病且另外試管內原位及活體內遞送抗癌前藥的反應性生物醫學探針，此係藉由生物化學、分子及結構性化學方法之組合得到。多模式(磁性及光學)能力的進一步轉型可易於藉由引入呈混合型/二聚合錯合物形式之釓(例如用於MRI對比成像工作)來獲得。
已進行三個關鍵『概念驗證』研究來支持本發明：
˙1.概念驗證I：經由自Eu-Pt錯合物之抗腫瘤順鉑的光釋放的銪發射進行即時原位監測
˙2.概念驗證II：藉由MRI及螢光成像即時多模式監測藥物遞送
˙3.概念驗證III：膀胱癌靶向前藥。已合成用於評估與整合素αvβ3結合的兩種新的銪錯合物(N1-Pt-Eu-L1-P1及N7-Pt-Eu-L1-P1)(圖3)；各錯合物之設計已根據分子對接模擬達最佳(圖4)。
用於癌症之成像及抑制之具有胜肽化學反應的鑭系元素錯合物/材料
發現整個有絲分裂中多個關鍵步驟中涉及之週期素及Plk1在治療癌症上極其重要，因其活性似乎限於增殖性細胞中之有絲分裂。然 而，缺乏該激酶之選擇性小分子抑制劑仍為進一步闡明其精確作用的主要障礙。舉例而言，使用靶向微管之抗癌劑可產生各種不良效應，部分因微管於細胞中之不同功能。到目前為止，僅少數小分子對週期素A/D/Plk1之成像及抑制具有可展示良好特定性。發明人已研發了結合胜肽化學作用之多種鑭系元素錯合物/材料以達到目標，即成像及靶向抗腫瘤活性。
基於鑭系元素之光活化之癌症療法的研發
已合成若干細胞器特定的新穎標記物(用於溶酶體、粒線體、高基氏體(Golgi apparatus))。此等錯合物可同時觸發試管內單態氧產生且在藉由可見光/NIR激發輻射時得到細胞器之發光影像。此類行為提供極力尋找的目標，即使用雙重雷射激發以獲得空間控制從而損壞選定細胞區室/組份。
概念驗證-NIR敏感前藥：經由自Eu-Pt錯合物之抗腫瘤順鉑之光釋放之銪發射進行即時原位監測
發明人已研發用於例如NIR生物光學成像之多模式基於鑭系元素之前藥，其與標靶整合素αvβ3同功型強有力地結合；NIR激發觸發順鉑的定量解離。
i)膀胱癌特定前藥之合成
鉑錯合物可經設計以靶向在癌細胞上表達之受體。舉例而言，整合素αvβ3同功型可經靶向以用於治療癌症，例如膀胱癌細胞。使整合素αvβ3同功型特定胜肽(P1-Ahx-cQDGRMGFc-RrRk)與PtEuL(圖3)結合。進行兩種水溶性銪錯合物(N1-Pt-Eu-L1-P1及N7-Pt-Eu-L1-P1)與整合素αvβ3同功型之分子對接刺激研究且展示N1-Pt-Eu-L1-P1相較於 N7-Pt-Eu-L1-P1而言與整合素αvβ3同功型蛋白具有更佳結合可能性。(N1-Pt-Eu-L1-P1：△G=-11.2kcal/mol-1；N7-Pt-Eu-L1-P1：△G-8.0kcal/mol-1)(圖3)。
本文所揭示之化合物可用於癌症療法且其發射特徵譜可用於理解順鉑(或其他抗癌Pt部分)之藥物動力學，諸如其在癌細胞內的結果(諸如會觸發細胞凋亡或壞死的給藥之劑量)。此分成三個部分：a).研發雙重探針以用於光學成像且用金屬錯合物功能化，該等金屬錯合物具有特定抗癌功效及癌症靶向胜肽(圖5A至圖5B，圖6A至圖6B及圖7A至圖7B)且同時；b).評估經由光學成像及其他典型LC-MS及蛋白質組質譜方案得到之試管內抗癌功效。合成方案(諸如1,4,7,10-四氮雜環十二烷鑭系元素錯合物合成)、胜肽結合及成像在發明人之實驗室中為成熟的。使用十個癌症/正常細胞系評估化合物之藥理學特定。癌細胞系包括T24、5637、22RV1、HeLa、SK-N-SH、A549、A2780及C666-1且正常細胞系包括MRC-5及WRPY-1；c).錯合物之藥物動力學及生物分佈在活體內進行研究(具有抗癌功效)。
「智慧型」多模式治療診斷前藥之合成，其可選擇性區分腫瘤細胞以進行有效藥物釋放且可用於試管內或活體內成像及光解離。
市售抗癌藥/前藥存在三個主要問題：(i)非活性形式之毒性；(ii)癌細胞之識別；及(iii)其效果之監測。本文所述之鑭系元素錯合物能夠經由與特定胜肽結合鑑別癌細胞，該等胜肽與癌細胞表面上(有時過度表達)之蛋白質特定結合；光釋放藥物(例如順鉑)且展示兩光子引 發之NIR發光特性，其能夠進行即時藥物遞送監測及全身成像以檢測本文所描述之化合物的藥物動力學效果。
治療診斷化合物的通用合成途徑
化合物2之合成.
將異菸鹼酸(2.0g，16.2mmol)添加至DMAP(5.9g，48.6mmol)於無水DCM(200mL)中之溶液中，接著添加EDCI(4.6g，24.3mmol)，在攪拌約10分鐘之後，添加4-碘苯胺(3.9g，17.8mmol)。於室溫下在N2氣體保護下攪拌所得溶液12h。此後，溶劑濃縮至100ml，收集白色固體作為產物化合物3(1.2g，mmol 89%)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ 10.6(s,1H)、8.78(d,J=2Hz,2H)、7.84(d,J=2Hz,2H)、7.72(d,J=4Hz,2H)、7.62(d,J=4Hz,2H)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ 164.1、150.3、141.7、138.5、137.4、122.6、121.6、88.1。
化合物3之合成.
將乙炔基三甲基矽烷(2.7ml，20.74mmol)添加至(4-溴吡 啶-2-基)甲醇(3.0g，20.74mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(112mg，0.16mmol)、CuI(60mg，0.32mmol)及DIPEA(5mL)於新近蒸餾之THF(50mL)中之溶液中，在N2氣體保護下在45℃下攪拌所得混合物6小時。濃縮殘餘物矽膠急驟管柱層析(Silica gel flash column chromatography)(己烷/EA 2：1)得到淡黃色油狀物。將油狀化合物溶解於MeOH中，添加K2CO3，且於室溫下攪拌所得溶液1h。濾出固體，濃縮濾液。殘餘物矽膠急驟管柱層析(己烷/EA=1：1)得到白色固體(2.20g，16.56mmol，兩個步驟之80%)作為產物。熔點：69-70℃；1H NMR(CDCl3,400MHz)：δ 8.54(d,J=2Hz,1H)、7.37(s,1H)、7.28(d,J=2Hz,1H)、4.76(s,2H)、3.60(br,1H)、3.32(s,1H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)：δ 59.4、148.3、131.2、124.8、123.0、82.2、80.8、63.9。
化合物4之合成.
將化合物3(0.23g，1.72mmol)添加至化合物2(0.84g，2.58mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(36mg，0.052mmol)、CuI(20mg，0.104mmol及DIPEA(5mL)於新近蒸餾之THF(50mL)中之溶液中，在N2氣體保護下在45℃下攪拌所得混合物6小時。濃縮殘餘物矽膠急驟管柱層析(DCM/MeOH 30：1)得到淡黃色固體(0.54g，1.63mmol，95%)作為產物。熔點：202-203℃；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)：δ 10.73(s,1H)、8.80(dd,J=4Hz,8Hz,2H)、8.52(d,J=2Hz,1H)、7.89(d,J=4Hz,2H)、7.86(d,J=2Hz,2H)、7.64(d,J=6Hz,2H)、7.54(d,J=2Hz,1H)、7.37(dd,J=4Hz,8Hz 1H)、5.53(t,J=6Hz,1H)、4.58(d,J=4Hz,2H)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)：δ 164.4、162.6、150.3、149.0、141.7、139.8、132.5、130.7、123.2、 121.6、121.5、120.3、116.5、93.4、86.8、64.0。HRMS m/z C20H16N3O2之計算值[M+H]+ 330.1243，實驗值330.1239。
化合物1之合成。
向化合物4(300mg，0.91mmol)於無水DCM(150mL)中之攪拌溶液中添加DIPEA(1.59mL，9.11mmol)及甲磺醯氯(0.22mL，2.73mmol)。在室溫下攪拌所得混合物3小時。隨後用飽和NaHCO3溶液、飽和NH4Cl溶液及飽和NaCl溶液洗滌所得溶液。有機層用無水Na2SO4乾燥，濃縮以得到淡黃色固體，其不再純化即直接用於下一步驟中。將淡黃色固體溶解於無水MeCN(50mL)中。添加2,2',2"-(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三第三丁酯(tBuDO3A，0.50g，0.61mmol)及無水K2CO3(1.26g，9.1mmol)。在50℃下在N2氣體下攪拌所得混合物12小時。濾出固體且濃縮濾液。殘餘物矽膠急驟管柱層析(CH2Cl2：MeOH=20：1)得到淡黃色固體(378mg，0.46mmol，75%)作為產物。熔點：170-172℃；1H NMR(CDCl3,400MHz)：δ 10.64(s,1H)、8.75(d,J=4Hz,2H)、8.22(d,J=4Hz,4H)、8.17(d,J=4Hz,2H)、7.48(d,J=6Hz,2H)、7.31(s,1H)、7.24(d,J=4Hz,1H)、3.17-2.15(m,32H)、1.50(s,27H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)：δ 172.4、164.5、158.3、150.0、148.5、141.3、140.1、132.7、132.1、125.0、123.8、122.4、121.3、116.6、95.5、85.5、82.0、58.5、56.1、55.2、54.2、50.0、42.5、27.8、27.7；HRMS m/z C46H64N7O7之計算值[M+H]+ 826.4867，實驗值826.4860。
錯合物LnL之合成(Ln=Eu及Gd)。
向化合物1(100mg,0.12mmol)於DCM(2mL)中之溶 液中添加三氟乙酸(2mL)。在室溫下攪拌所得溶液24小時。在真空下移除溶劑，將殘餘物溶解於1mL甲醇中。將溶液添加至50mL冷乙醚中。收集黃色固體，且隨後溶解於MeOH/H2O(V：V=1：1)中，添加硝酸銪(III)五水合物(54mg，0.13mmol)。利用NaOH溶液(0.4M)使所得溶液保持在6.0至6.5pH範圍內且在室溫下攪拌24小時。在真空下移除溶劑，將殘餘物溶解於1mL甲醇中且滴入乙醚(50mL)中。過濾沈澱物且用乙醚洗滌，於室溫下真空乾燥。獲得呈白色固體狀之EuL(94mg，0.11mmol，產率=95%)。HRMS(+ESI)m/z C34H37EuN7O7之計算值[M+H]+ 808.1967，實驗值808.1941，C34H36EuN7NaO7之計算值[M+Na]+ 830.1786，實驗值830.1641。
dL可用以上所展示之類似程序獲得。GdL(95mg，0.11mmol，產率=95%)。HRMS(+ESI)m/z C34H37GdN7O7之計算值[M+H]+ 813.1995，實驗值813.2005，C34H36GdN7NaO7之計算值[M+Na]+ 835.1815，實驗值835.1915。
PtLnL之合成(Ln=Eu、Gd)
順-[Pt(NH3)2Cl(DMF)](NO3)如Peter J.Sadler等人先前所描述來製備[S2]。將於無水DMF(1mL)中之EuL或GdL添加至順-[Pt(NH3)2Cl(DMF)](NO3)溶液中且在暗處於65℃下攪拌16小時。在真空下移除溶劑。殘餘物溶解於3ml MeOH中，接著過濾。過濾出黃色未反應之順鉑。將濾液添加入50mL Et2O中，收集所形成之沈澱且再溶解於3mL MeOH中，將溶液添加至50mL Et2O中，收集沈澱，且於室溫下真空乾燥。得到淡黃色固體作為最終產物。
如本文所描述其他治療診斷化合物之製備在此項技術之領域內係已知的，且可藉由本文所述合成方案之合適的合成修飾來製備。
PtEuL之產率及觀測到之高解析度質譜
PtEuL 0.040g，產率=72%；HRMS(+ESI)m/z C34H42ClEuN9O7Pt之計算值[M-NO3]+ 1071.1756，實驗值1071.1743，C34H43ClEuN9O8Pt之計算值[M-NO3-Cl+OH]+ 1053.2095，實驗值1053.1546。
PtGdL之產率及觀測到之高解析度質譜
PtGdL 0.040g，產率=70%；HRMS(+ESI)m/z C34H42ClGdN9O7Pt之計算值[M-NO3]+ 1076.1784，實驗值1076.1821，C34H43ClGdN9O8Pt之計算值[M-NO3-Cl+OH]+ 1058.2123，實驗值1058.1654。
1.1 前藥的修飾，使其具有非活性形式時的高穩定性及低暗細胞毒性
前藥PtEuL仍具有很多改良空間，諸如其非活性形式之穩定性及暗細胞毒性。本文所揭示之化合物克服如下此等問題。
非活性前藥之暗細胞毒性-配位吡啶環之2位置處的烷基(例如甲基)可藉由解離之NH3鉑錯合物配位體保護對DNA之親核攻擊。同時，1、2二胺將以比兩個NH3配位體更強的親和力螯合至Pt(II)。此處關注點係遏制可產生毒性之結合之NH3配位體的直接解離(圖6A至圖6B)。
鉑(II)抗癌藥物在其非活性形式下之穩定性-已知基於鉑(II)之藥物會與內源性細胞硫醇反應。大體而言，蛋白硫醇能夠與順鉑(及其他基於Pt(II)之藥物)反應，其可觸發毒性。胞內麩胱甘肽(GSH)往往會與Pt錯合物反應且由於反位不穩定化效應而促進相反配位體離開。最新設 計之錯合物(圖6A至圖6B)能夠遏制Pt(II)中心處之硫醇攻擊，其導致本文所揭示化合物的毒性降低。空間要求更苛刻之1,2-二胺(例如(SS)-反環己基-1,2-二胺亦可緩和與含硫醇化合物之不需要的反應。
引入第三金屬-釓離子作為「智慧型」多模式治療診斷前藥-多模式能力在新一代成像劑及MR成像中變得更常見，其能夠提供所關注部位之增強的時空解析度。對於釓(Gd)併入，考慮兩個主要因子：併入性質及有效濃度。可引入釓離子作為同一螯合單元中之雙核銪-釓(Eu-Gd)錯合物，或僅作為具有與銪錯合物相同/類似之配位體的各別錯合物。在前一情況下，銪及釓離子處於相同局部環境中(經由點擊反應一起引入兩個1,4,7,10-四氮雜環十二烷錯合物)，以使得發光監測將與MR成像一致(圖6A至6B，圖7)。相較之下，後者可能在金屬含量方面提供彈性以使得銪與釓之間的比率不必一定為50/50，且視諸如天線(antenna)之量子效率及配位體螯合劑之鬆弛度之因子而定，可獲得最佳化金屬含量比率以使發光與磁共振成像監測之效能達最大(圖6A至6B，圖7A至7B)。
1.2 在強兩光子引發之發射及光解離下錯合物對於膀胱癌的選擇性
已設計對整合素αvβ3同功型具有特定性之若干胜肽(如膀胱癌載體)且利用「Gold」軟體藉由分子對接來評估。合成一系列新的兩光子可用的天線。兩光子吸收截面可藉由用於光解離之能量傳遞之具有類似三重態之供體-π-受體系統的變化來改良(圖3，圖6A至圖6B，圖7A至圖7B)且與使用於吾人之雙重作用探針之結構設計達最佳的相同/基元胜肽序列結合，其旨在達成更佳的活細胞成像、感測效應、選擇性及與整合素 αvβ3同功型之結合親和力(圖6A至6B，圖7A至7B)。
所有化合物在溶液與固態藉由一系列光譜技術(IR、MS、NMR及螢光)及X射線結晶充分表徵。
所提出的多模式治療診斷前藥之綜合研究
檢測通用光物理特性，諸如發射量子效率及發射壽命、穩定性常量(pM值)及活性癌症藥物(例如釕錯合物之鉑)之定量光釋放。亦量測此等釓錯合物之磁性。
2.1 新穎合成之前藥的光物理、磁性及穩定性
根據文獻方案量測線性多光子光物理特性(亦即發射光譜、發射壽命、量子產率及兩光子吸收截面)及鑭系元素(III)錯合物之光解離量子產率。
錯合物之暗穩定性：進行滴定實驗以研究對於若干常見生物陰離子及人類血清白蛋白之合成之錯合物的穩定性；亦測定pM及pKa。添加各種生物物種，亦即血清白蛋白，檸檬酸鹽之後，使用吸收及螢光以及NMR光譜分析監測水溶液中錯合物之穩定性。
光解離程度評估：關鍵問題中之一者為來自本文所描述化合物之Pt部分的光解離程度。量測藥物光釋放前後或在與αvβ3同功型結合時的發色團的三重態。基於本文所述之合成方案，亦可合成La(鑭)及Gd(釓)類似物以量測發色團之三重態。此等發色團磷光之三重態及其磷光壽命的量測在低溫(77K)下進行。PtEuL之光解離動力學藉由在UVA/NIR之不同輻射時間下(總光劑量=4J cm-2)監測發射光譜來研究。615nm(5D0→7F2)處反應性及初始發光強度相對於時間的曲線將擬合指數生長及衰減 等式以獲得準一級速率常數。
兩光子引發之解離及反應性發光：本文所描述化合物之兩光子吸收(TPA)截面藉由Z-掃描方法(在Pt部分釋放之前，化合物不具發射性)及兩光子激發波長方法來量測。將使用光學參數放大器之超速雷射系統用於量測。發射光使用後向散射配置收集至液氮冷卻之CCD偵測器中。為量測兩光子吸收截面，雷射光束藉由光束分光器分裂為二束且臂中之一者用作束強度的參考以校正量測過程期間脈衝間的強度波動。在Z掃描中，樣品細胞之位置z藉由計算機控制之可轉換台沿雷射束方向(z軸)移動，以使得在恆定入射強度雷射功率等級下樣品細胞內之局部功率密度可發生變化。
所提出的釓「Gd」錯合物之鬆弛特性：增強大體積水鬆弛率之釓「Gd」對比劑的效率被稱為其鬆弛度，即每單位濃度水質子鬆弛率的增量。其在既定防護罩及溫度下量測。錯合物之鬆弛度(mM-1s-1，在310K及3.0/7.0T下)由在D2O溶液中藉由Bruker DPX300 NMR光譜儀所獲得的弛緩時間來計算。使用反轉恢復脈衝序列且在連續脈衝之間保持十倍t1延遲。鬆弛度(r1)藉由軸向時間倒數(1/t1)相對於Gd濃度之曲線獲得。
2.2 經由發射滴定得到之結合親和力
因胜肽可結合整合素αvβ3，因此細胞膜上之αvβ3蛋白將使用裂解緩衝劑製得。使用10μM錯合物進行螢光定量。簡言之，10個200μL Eppendorf管填充有10μm錯合物(200μL)，且與100nM/L至1μM/L之一系列αvβ3蛋白(200μL)混合。所有樣品藉由ABI(7500)檢測以量測雷射激發時的螢光發射(約400nm)。計算螢光強度與αvβ3濃度之間的關 係。另外，亦獲得錯合物與蛋白之間的結合親和力。
2.3 經由等溫熱量測定評估結合親和力
錯合物與αvβ3同功型之結合親和力藉由等溫滴定熱量測定(ITC)研究，該等溫滴定熱量測定為一種測量分子(例如巨大蛋白質及配位體)間之相互作用的溶液態方法。相互作用之結合親和力(Ka)、結合化學計量(N)及焓變化(△H)藉由ITC實驗直接測定。自此等量測，可藉由已建立之等式來確定Gibbs能量及熵變化。ITC之優點包括最重要地以非破壞性方式即時觀測分子間相互作用，而對分子量沒有限制。
2.4 順鉑釋放之反應性銪發射/光量的定量分析
圖6A、圖6B、圖7A及圖7B中之非發射性鑭系元素鉑錯合物經歷光解離且因此可在光輻射時釋放諸如順鉑之抗腫瘤劑。非活性Pt-Eu前藥錯合物之非發射性銪中心同時將變得具有高發射性。因此，進行銪發射與順鉑釋放程度之間的時間解析相關研究，以監測且理解順鉑釋放過程之效率。Pt-Eu前藥之兩個濃度(1μM及10μM)在350/700nm下進行輻射，且在六個既定時間點(t=5、10、20、30、45及60分鐘)量測Eu發射。在使用HPLC-MS/MS注射一系列濃度之單水解順鉑(0.1μM至50μM)之後，藉由繪製相對於器具反應之單水解順鉑的濃度來構建外部校準曲線。構建光輻射時間(分鐘)相對於銪發射(5D0→7F2)強度(任意單位)/整合面積(5D0→7FJ)相對於順鉑之濃度(μM)的3D散佈圖。
結構及生物活性(試管內或活體內成像及特定抗癌功效)
進行即時研究(例如光學成像及/或MR成像)及代謝研究中本文所揭示化合物之綜合試管內及活體內評估。
3.1 試管內細胞毒性研究及細胞吸收速率
在各種正常及癌症(亦即在T24膀胱腫瘤)細胞系中進行IC50及MTT分析以檢測鑭系元素錯合物之細胞毒性。所有此等細胞毒性分析根據已建立之方案來進行。錯合物之細胞吸收速率可藉由流動式細胞測量術/螢光分析基於其特徵發射波長監測。
3.2 發光錯合物試管內之活體細胞成像及效用分析：光細胞毒性分析
將癌症/正常細胞(癌細胞：T24、5637、22RV1、HeLa、SK-N-SH、A549、A2780、C666-1及正常細胞：MRC-5、WRPY-1(2×104個/孔)在96孔盤中培育隔夜。為了試管內成像，細胞用各化合物(任務1)在暗處處理6小時。培養基隨後置換為新鮮培養基且使細胞曝露於自裝配有熱隔離濾波器及500nm長波通濾波器之400W鎢燈所產生的光(1-8J/cm2)。對於光細胞毒性，T24細胞用若干濃度之錯合物處理，培育12小時。藉由改變培養基若干次移除培養基之自由錯合物。細胞隨後藉由雷射輻射以引發Pt自錯合物釋放且將進行MTT分析以量測多個培育時間點之後的細胞生存力。鉑濃度藉由ICP-MS檢測。因此，可計算出所釋放Pt及螢光強度(或光源強度)之間的定量關係。
3.3 所提出的鑭系元素錯合物之活體內生物分佈評估
ICPMS-將所有化合物靜脈內注射至攜帶異種移植癌症腫瘤之BALB/c無胸腺小鼠。在培育24小時之後，將小鼠處死，且移出其主器官，包括切除的腫瘤且固定於10% PBS緩衝福馬林(formalin)中。對照模型使用僅注射緩衝福馬林之無胸腺小鼠。將組織樣品凍結且凍乾24小時， 之後在70℃下藉由HNO3消化4小時。鑭系元素含量(反映錯合物的量)可藉由ICP-MS測定。亦評估小鼠尿中之鑭系元素含量以確認各錯合物活體內的代謝。
兩光子光學及MR成像及療法效果-使用移植之人類膀胱腫瘤細胞(T24)研發異種移植小鼠，該等腫瘤細胞隨後允許生長至所需體積。對於對照實驗，將子宮頸癌HeLa細胞移植至小鼠之p位置處。隨著14天的腫瘤生長，T24與HeLa細胞異種移植腫瘤達到約100mm3之體積。錯合物隨後注射至尾部靜脈中，腹膜/頰內遞送且24至48小時之後，以手術方式萃取異種移植物以用於兩光子共焦顯微鏡及MRI實驗，其中周圍腫瘤細胞萃取物作為對照(不應獲得鑭系元素錯合物信號)。活體內光學成像在PI研究所中進行。動物成像箱配備有980nm及700nm雷射。於Bruker Biospec 4.7T/30cm掃描儀(Bruker公司，MA)上對異種移植腫瘤進行活體內MRI實驗。在腫瘤抑制實驗中，腫瘤尺寸每週量測3次且獲得生長曲線。隨後比較且評估來自光學及MR成像的數據。
釓及鉑串聯：藉由MRI及螢光成像之藥物遞送的即時多模式監測
此處報導能夠進行同時NIR-光學及MR成像之雙重成像帶順鉑分子貨物。此持久MRI對比劑(24.4mM-1s-1之r1鬆弛度)為光活化的順鉑前藥(PtGdL)，其能夠即時監測抗癌功效。PtGdL為藉由MRI監測藥物遞送及抗癌功效的模型，相較於GdDOTA及其基元對照GdL，其在諸如腎皮層及脾之若干器官中具有更長的剩磁時間(24小時)。在順鉑完全釋放之後，大體上所有PtGdL皆轉化成能夠在四小時之其合理短清除時間內 進行療法功效之後續MRI分析的GdL。亦存在藉由光子激發實現之用於監測之反應性螢光增強。
高細胞毒性鉑(II)/(IV)配位錯合物，諸如順鉑及其衍生物，亦即卡鉑/奧沙利鉑為熟知的有效抗癌劑。已研發其藥理學非活性形式(或者稱為前藥)以使藥物遞送過程達最佳，例如腫瘤選擇性、水溶性及細胞滲透性，後在標靶部位進行後續活化。儘管若干前藥取得臨床成功，因其非特定地分佈於全身中，達成具有最小不良副作用之最佳藥物動力學仍為前所未有的挑戰。前藥之主要缺陷在於難以追蹤其試管內/活體內活性。令人感興趣的是，治療診斷奈米藥物(將診斷及治療實體組合為一體之新興範例)創造了新的研究前景且為前藥難題提供有希望的解決方案。
治療診斷技術提供疾病之同時成像診斷及靶向療法。舉例而言，具有診斷能力及治療功效之治療診斷奈米藥劑可用於病理性機制研究且因其反應傳信(例如試管內或活體內磁共振(MR)及螢光)而用於導引的預處理/處理後評估。此類藥劑將允許發明人獲得生物分佈資訊，受控藥物釋放及藉由光之光動力療法。借用其奈米對應物之概念，發明人研發治療診斷分子前藥。
鉑-銪錯合物(PtEuL)有作為順鉑之受控遞送媒劑的極大前景。其在藥物遞送至試管內治療性過程期間一旦順鉑光解離即展示即時反應性光觸發之『關-開』型基於鑭系元素之長期指紋發射。然而，利用先前方法之深穿透活體內成像(諸如在內臟中)係不可能的。本發明提供一種能夠進行同時NIR-光學及MR成像，亦即具有協同靈敏度及高時間空間解析度之雙重成像帶順鉑分子貨物，幫助科學家更綜合地且便利地原位研 究即時生物分佈及藥物動力學。另外，此將在無自發螢光干擾下輔助前藥效能之評估，更不必提可避免繁瑣對照實驗的優點。
本文描述一種『一體式(all-in-one)』螢光成像、MRI及光可解離治療診斷試劑，例如相較於DOTAREM及GdL(對照)(圖9)具有更大r1鬆弛度(24.4mM-1s-1)及更長剩磁(24小時)MR成像的PtGdL(圖10)。腎皮層內的更長剩磁時間(亦即在4至18小時之間)為使順鉑自PtGdL釋放以實現抗癌療法(條件)提供足夠持續時間，其經由光子清除基元形式GdL實現，從而允許進一步療法分析且在短時段內清除。
水溶液中之PtGdL及GdL的線性吸收及發射光譜(10μM,λex=365nm)展示於圖15A至圖15B中。PtGdL係非發射性的但在光子引發之Pt裂解之後，可轉化成發射形式GdL。GdL之發射帶最大值位於426nm處且歸因於有機發色團L。(PtGdL在tris緩衝溶液中及試管內之光活化展示於圖11A至圖11C中。PtGdL中順鉑單元之解離的準一級速率常數k為0.051min-1，其類似於吾人所報導之基元錯合物PtEuL(k=0.053min-1，在與PtGdL相同之條件下)。然而，在自PtGdL之順鉑單元之光釋放之後，PtGdL之有機天線的發射強度增強了48倍。
PtGdL錯合物之暗毒性在癌細胞系(HeLa)及正常細胞系(WPMY-1)PtGdL中評估，經歷24小時PtGdL展示相較於純順鉑更低之暗毒性(HeLa中順鉑之IC50=約3.3±0.3μM且WPMY-1=4.2±0.6μM；HeLa中之PtGdL=約23.6±0.8μM且WPMY-1=43.9±1.1μM，列數據展示於圖16A至圖16B中)。PtGdLres 16A-16B))。PtGdL對於光細胞毒性，在配備有飛秒雷射之Leica SP8(立式組態)共焦顯微鏡上研究人類子宮頸 癌細胞(HeLa)中兩光子試管內成像及順鉑之光釋放。在具有顯著毒性之細胞質中在730nm雷射之激發30分鐘下(30分鐘內之420mW功率，5分鐘持續時間，穩定溫度=37℃±1.5℃)觀測到自用PtGdL處理之細胞的明亮發射。(圖11D及圖E)在PtGdL之情況下在小於5μM劑量濃度下可觀測到驚人的細胞死亡，然而，在相同實驗條件下PtGdL相對於HeLa細胞之暗IC50為約23.6μM(圖16A)。自未曝露於雷射輻射之用PtGdL處理之細胞未觀測到顯著發射及/或細胞死亡。(圖11C)亦在相同實驗條件下用GdL進行對照實驗且自GdL處理或雷射輻射未觀測到顯著細胞死亡。
此工作之關鍵突破包括PtGdL之磁性。已量測所揭示MR可用前藥PtGdL之r1鬆弛度，且出人意料地，鬆弛度是標準樣品Gd-DOTA之6倍(圖12)。此極有前景的值鼓勵進一步研究鬆弛度及額外MRI實驗。PtGdL作為潛在MRI對比劑之功效藉由質子核磁性鬆弛色散(NMRD)來評估。PtGdL、GdL及Gd-DOTA之鬆弛度之質子NMRD特徵譜(定義為藉由1mM Gd(III)錯合物得到之縱向鬆弛率的強化)展示於圖12中。該等特徵譜在25℃及37℃下運作，且藉由ICP-MS確認樣品濃度。此外，亦在3T下量測到24.4mM-1s-1之PtGdL的高初始r1鬆弛度，表明其可能用作T1加權MRI對比劑。為研發此物質，在3T Philips Achieva掃描儀中量測一組5個不同濃度之PtGdL溶液的T1鬆弛時間。溶液濃度藉由ICP-MS確認且鬆弛度藉由隨以mM計之Gd(III)濃度而變的鬆弛率(R1,s-1)的曲線來確定(圖17，表2)。所觀測到之PtGdL的鬆弛度出乎意料地高。不希望受理論所束縛，咸信此等增加的鬆弛度係歸因於溶液中化合物的凝集，其由異菸鹼醯胺基團產生，從而引起分子的堆疊效應。此效應在順鉑單元存在下變得甚至更顯 著，從而使得與GdL比較時PtGdL鬆弛度額外增加：29.4相對於23.1mM-1s-1，在10MHz及25℃下。(圖12)PtGdL溶液的DLS量測展示存在凝集物，例如672±24nm(單峰，PDI 0.156；圖18)，其表明增強效應來自因溶液中存在凝集物而產生的高旋轉相關時間。
文獻中報導之相關化合物Gd-DO3A-(4-(N-啉基)吡啶)(Gd-DO3A-(4-morpholinopyridine))及Gd-DTPA-(順鉑-吡啶-2-基甲胺)分別展示5.3mM-1s-1(20MHz及25℃)及6.5mM-1s-1(20MHz，37℃)的鬆弛度。本發明所揭示化合物及文獻類似物中之Gd(III)中心的配位層相同，亦即特色為一個水分子(表1)。直接與吡啶結合之順鉑單元的存在相較於Gd-DOTA時僅導致鬆弛度的少量增加。此等事實有助於支持發明人的結論：本發明化合物之鬆弛度的增加由額外異菸鹼醯胺基團引起。
a)H2O中之吸收係數，298K；b)水分子的配位數目，GdL之q值藉由比較於D2O及H2O中之GdL、EuL的銪(III)類似物的發射壽命來確定，其報導於吾人之先前工作中。(Chem.Commun.2015,51,14022-14025；J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1999,2,493-504.)c)對於PtGdL而言，q值無法藉由使用與GdL相同之方法來確定，因為PtEuL係非發射性的，然而，PtGdL與GdL由於結構類似而應具有相同之水合作用數目(q=1.0±0.2)。d)錯合物之配位體發射的螢光量子產率藉由積分球方法來確定。(Chem.Rev. 2010,110,2729-2755)e)10MHz、25℃下之Gd錯合物的T 1相關性。
[a]用ICP-MS校正Gd(III)之濃度。[b]量測各樣品之縱向鬆弛時間兩次且取平均值。[c]縱向鬆弛度，R1=1/T1。
在正常小鼠內進行所揭示化合物的活體內7T MRI量測。在注射市售GdDOTA錯合物(DOTAREM)、GdL及PtGdL溶液之後，在各個時間點處採集影像。在野生型小鼠尾部之尾側靜脈注射之後，在肝及腎皮層中觀測到即時信號強化，表示所關注組織內部存在對比劑。GdL立即由肝、脾及腎捕獲(圖13A及圖14A)。在所關注組織中未觀測到特定剩磁。在注射後約4小時之時間窗處觀測到全部清除(圖13C及圖14C)。相較於GdDOTA，GdL在腎中呈現類似的生物分佈模式，但在肝中呈現更慢的清除率(0.002相較於0.016enh/分鐘)。然而，相較於GdL，PtGdL呈現延遲的捕獲、更長的剩磁及清除。相較於PtGdL，GdL立即由肝、脾及腎捕獲，該PtGdL視所關注組織而定顯示6至9分鐘捕獲延遲(圖13B及14B)。
在所關注組織內未觀測到GdL之特定剩磁(長達4小時)(圖13A)，然而觀測到PtGdL之約24小時的肝及腎剩磁(圖13B)。此持久清除可歸因於PtGdL中之順鉑部分與所關注組織中某些蛋白質之相互作用。就MR試劑之清除而言，GdL之信號強化在注射之後4小時減少了 90%，表示全部清除(圖13C)。然而，PtGdL之強化在24小時之後無太大變化，表示全部清除係在約一日的範圍內(圖14C)。因此具有以上優於無順鉑GdL之優點的PtGdL有可能成為新一代MRI可用的前藥。
自PtGdL之順鉑之受控光觸發釋放充當抗癌藥物遞送媒劑，而可同時監測未轉化之PtGdL的抗癌作用之功效。在含鉑錯合物大體上完全裂解時，例如自PtGdL大體上完全產生GdL時，其餘GdL在隨後4小時內清除，順鉑的結果已在文獻中充分研究。
發明人藉由併入極好的MRI能力(r1=24.4mM-1s-1)推進光活化治療診斷抗癌前藥作為監測即時抗癌功效的工具。發明人能夠經由本發明的試劑PtGdL藉由操控觸發光之功率及曝露時間來控制試管內的藥物釋放，PtGdL在目標器官內亦展現比無順鉑GdL及GdDOTA對照更長的剩磁時間(24小時)，因此允許更寬的時間框以釋放順鉑來進行抗癌作用及監測。在順鉑大體上完全釋放時，所有PtGdL皆轉化成GdL以在4小時之合理短清除時間內用於療法功效及生物分佈的隨後及反應性MR及螢光成像分析。
材料及方法
光物理量測
200至1100nm光譜範圍內之UV可見光吸收光譜藉由HP Agilent UV-8453分光光度計來記錄。發射光譜藉由使用Horiba Fluorolog-3分光光度計來記錄。(可用於螢光壽命及穩態發射量測，配備有氮氣流冷卻殼體內之可見光至近紅外光敏感性光電倍增器)。針對偵測器回應及雜散背景光磷光校正光譜。金屬錯合物之絕對發射量子產率藉由積分球來量測。
tris緩衝劑中之PtGdL的線性之光引發解離(20mM Tris鹼，50mM NaCl，pH 7.4)藉由在具有不同光量之365nm UV光下測定在tris緩衝劑中之PtGdL溶液的發光強度來監測。大體而言，在攪拌下用365nm UV燈(5mW)來輻射於3.5mL石英透光管中之3mL PtGdL溶液(在tris緩衝劑中3μM)。在不同時間點(0、1、3、5、7、10、15、20、30、45、60、75及90分鐘)記錄溶液之發射光譜。
鬆弛度量測
GdDOTA、GdL及PtGdL(1mM)之1/T 1 核磁性鬆弛色散(NMRD)特徵譜經覆蓋2.35×10-4T至0.25T之磁場的Stelar SMARtracer FEC快速磁場循環鬆弛計記錄，該磁場範圍對應於0.01至10MHz之質子拉莫(Larmor)頻率範圍。溫度藉由VTC91溫度控制單元控制且藉由氣流保持。溫度根據先前校正用Pt耐受性溫度探針來確定。溶液之精確濃度藉由感應耦合電漿質譜儀(ICP-MS)來測定。
製備濃度為5.4μM至0.1mM的一組5個溶液且其Gd(III)濃度藉由ICP-MS確認，用PerkinElmer NexION 350D光譜儀來量測。此等溶液之T 1值使用MOLLY序列以3T Philips Achieva掃描儀來量測。
在Mavern Zetasizer Nano-S設備於25.0℃下進行動態光散射(DLS)來研究PtGdL溶液中凝集物之存在。
試管內實驗
細胞培養
人類子宮頸癌HeLa細胞生長於達爾伯克氏改良之伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)中。人類肺二倍體纖維 母細胞MRC-5及前列腺基質WPMY-1細胞獲自中科院上海生命科學研究所之細胞資源中心。MRC-5及WPMY-1在37℃及5% CO2下生長於MEM(GIBCO 41500034)中且補充有10%(v/v)胎牛血清、1%青黴素及鏈黴素。
MTT細胞細胞毒性分析
將MRC-5或WPMY-1細胞用6個濃度(0、1、5、10、20及40μM)之測試錯合物處理24小時。細胞單層用磷酸鹽緩衝劑生理食鹽水(PBS)沖洗一次且用0.5mg/mL MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2及5-二苯基溴化四唑鎓)溶液培育。錯合物之細胞抑制效能在添加MTT 3小時以使得在細胞代謝期間產生甲之後，藉由甲的形成來檢測。此後，甲經由振盪完全溶解於DMSO中。最後，用Biotek Power wave xsMicroplate讀取器在570nm及690nm之波長下量測溶液吸收。
兩光子引發之活化及螢光試管內成像
細胞用PtGdL(1、2、5、10μM)培育12小時。用PBS緩衝劑洗出錯合物(細胞不可滲透但溶於培養基中)。將具有錯合物之細胞置放於兩光子共焦顯微鏡內部之組織培養腔室中(5% CO2，37℃)。藉由使用配備有飛秒雷射(波長：700至1000nm)及40x/60x油浸物鏡之Leica SP8(立式組態)共焦顯微鏡捕獲試管內影像。在30分鐘雷射激發(λex=700nm，功率=420mW，各5分鐘具有1分鐘的雷射激發，穩定溫度=37℃±1.5℃)之後採集試管內影像。
T 1 加權活體內成像及生物分佈
生物分佈研究在配備有4cm內徑之1H射頻線性線圈鳥籠式 探針的7T微型MRI系統(Bruker,Wissembourg,France)上進行以分析來自腎、肌肉、脾、肝之MRI對比劑(CA)的吸收及清除。所有動物實驗皆根據位於巴黎笛卡爾大學(Paris Descartes University)之機構用動物方案指南進行(saisine CEEA34.JS.142.1)，且由研究所之動物研究委員會核准。
野生型雌性8週齡BALB/c小鼠(Elevage Janvier,Le Genest-St-Isle,France)用異氟醚(1.5%，在空氣/O2 0.5/0.25L min-1下)吸入來麻醉且置放於專用競爭托架中。300μL於0.9%生理血清中之釓錯合物經由尾部靜脈進行靜脈內注射，同時小鼠處於掃描儀中。為再現性研究，每組注射3個小鼠(n=3)。
掃描方案使用Bruker Paravision 5.1軟體研發。DCE動態對比強化序列使用用於運動校正造影(motion free artifact)T1加權序列(TR=100ms，TE=4ms，α=80°)之Intragate Flash多片段來記錄。最終影像在平面內具有236μm×236μm之空間解析度。總掃描時間為每影像約3分14秒之量級。在40分鐘之掃描時間期間量測動態跟蹤。
為研究各錯合物之生物分佈，監測若干關注區(ROI)：肝、肌肉、脾、腎及血管。將與Gd錯合物對比劑之量相關之對應MRI強度相對於時間繪圖，以觀察各錯合物至器官內的吸收及清除。與市售GdDOTA(DOTAREM，Guerbet，法國)之比較亦在Gd(10mM)之對應濃度下進行。
基於Gd之錯合物之生物分佈成像：GdL及PtGdL
圖8呈現自於3小時處預掃描至1-時間點的MRI方案過程。在以下表3中，呈現7T處之活體內MRI方案：
觀測到，在本發明之一個具體實例中，相較於GdL及GdDOTA，Pt-GdL呈現延遲捕獲的、更長的剩磁及清除。
延伸研究-基於釕(Ru)(II)之前藥
鉑錯合物之研究發現亦延伸至基於釕(II)之前藥。因為釕(II)錯合物相較於鉑(Pt)(II)錯合物具有類似的DNA結合能力。圖19A至圖19B展示作為毒性釕(II)化合物[Ru(bpy)2Cl]+之光控制遞送媒劑的釕-鑭系元素(銪/鐿/釓)前藥之通用設計。圖19A展示PtEuL之類似設計。圖19B為作為能夠進行毒性錯合物-[Ru(bpy)2Cl]+之光學或光學及MRI雙重模型監測遞送的光觸發之發光反應性或發光/MRI雙重模型前藥的膀胱癌特定釕銪/鐿/釓錯合物之設計。已完成五個概念驗證研究。
在室溫下在水溶液中記錄RuEuL及其解離產物EuL的吸收及發射光譜(圖20A及20B)；其兩者均具有位於約330nm處之一個類似 吸收帶，其由RuEuL之莫耳吸收係數為26,970M-1cm-1且EuL之莫耳吸收係數為18,860M-1cm-1的其基於吡啶之配位體的π→π*轉變產生(圖20A)。另外，RuEuL具有四個歸屬於釕部分的其他吸收帶，且位於243nm(bpy配位體之π→π*轉變，ε=28,340M-1cm-1)、290nm(bpy配位體之π→π*轉變，ε=67,380M-1cm-1)、400nm(肩峰，MLCT)及464nm(MLCT)，ε=11,200M-1cm-1。對於發射光譜而言，EuL展現強紅色發射(對應於Eu(III)之5D0→7F0-4轉變)，而RuEuL之特色僅為在相同實驗條件下Eu(III)發射極弱(圖20B)。EuL之強敏化Eu(III)發射由自天線發色團至金屬離子之激發態的高效能量傳遞引起。
RuEuL之光引發之解離在各個時間(1至8分鐘)期間用可見光(λirr.=488nm，1W)連續輻射之後，藉由發射(圖21)光譜法及藉由RuEuL溶液之HPLC(5μM在H2O中)(圖22)同時研究。在輻射之後，觀測到銪發射開啟。此觀測可藉由Ru(II)上存在解離態來解釋，其由Saddler等人提出。光解離產物EuL及[Ru(OH)(bpy) 2 (H 2 O)] + 已藉由HPLC進一步定性鑑別(圖22)。在光輻射之前，僅觀測到一個對應於RuEuL的HPLC峰(滯留時間R=11.3分鐘)。在輻射之後，此峰消失，且出現兩個解離之光產物的峰。將光產物之HPLC跡線與純錯合物EuL(R=12.1分鐘)及製備的[Ru(OH)(bpy) 2 (H 2 O)] + (R=4.3分鐘)之HPLC跡線比較，證明光產物與此等化合物類似。此等結果一致性地證實，RuEuL可用可見光來光活化以產生EuL及[Ru(OH)(bpy) 2 (H 2 O)] + 錯合物。
為獲得用於生物醫學目的之光釋放釕(II)部分的準確量且即時評估藥物釋放，需要定量分析。其可藉由LC/ESI-MS同時偵測光產物EuL 及[Ru(OH)(bpy) 2 (H 2 O)] + 達成。此外，可切換銪(III)發射可視為用於釋放抗癌Ru(II)錯合物之即時傳信技術且亦可定量採用。為證實光產物之定量分析的可行性，製備具有濃度0.1、0.2、0.5、1、2及5μM之[Ru(OH)(bpy) 2 (H 2 O)]NO 3 及EuL的標準溶液以用於建立校正曲線。
因而，在Eu(III)發光、MS回應及釕化合物釋放程度之間建立時間分辨的相關關係(圖23A及圖23B)。Eu(III)發射與解離產物量(圖23A)之間存在高度相關性，意謂所釋放藥物之濃度可僅僅自Eu(III)發射強度來計算。準一級速率常數k在與對於光物理研究相同之實驗條件下自此等數據確定為0.43min-1。(圖23B)在對照實驗中，RuEuL在37℃下在暗處穩定24小時且[Ru(OH)(bpy) 2 (OH) 2 ] + 在與對於RuEuL光釋放相同之實驗條件下耐光。
此外，光活化RuEuL與DNA之相互作用藉由瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖24)。質體DNA(於Tris/EDTA(TE)緩衝劑中22.5μg/mL)用化合物(20μM)培育，藉由488nm光(劑量50J m-2)輻射或無輻射(對照)，且隨後經受1%瓊脂糖凝膠電泳。分離之DNA用GelRed核酸染色劑(BIOTIUM)染色且使用Tanon 1600凝膠成像系統(Tanon Science & Technology有限公司)成像。在實驗泳道(有光激發)中，相較於EuL及TE緩衝劑，對於RuEuL之DNA的遷移延遲，然而在對照泳道(無輻射)中，RuEuL保持DNA完好且展示正常的遷移。EuL不與DNA相互作用且展示正常的遷移。延遲變化表明自RuEuL釋放的Ru部分併入DNA中且顯然影響凝膠電子遷移。
為確定RuEuL作為光控制前藥的可能性，對人類子宮頸癌 (HeLa)細胞進行細胞毒性研究，且以EuL作為對照(圖25A及圖25B)。在輻射(488nm，1J)之前在暗處培育細胞6小時；同時進行暗對照。如所預期，EuL幾乎不展現對HeLa細胞之毒性。對比而言，光解離RuEuL展示顯著的光引發之細胞毒性。在HeLa中輻射之後，相較於PtEuL(光，IC 50 22.9μM)RuEuL具有更大毒性(光，IC 50 32.5μM)，但在暗處無毒性，其中IC50值超過200μM。光與暗IC 50值之間大致10倍的差異十分適合用於光活化前藥。
RuEuL對HeLa細胞之光引發之細胞毒性亦藉由共焦顯微鏡(圖26B)來研究，並在相同條件下測試PtEuL錯合物用於對比。初始研究在純水中進行；488nm(7mW)之雷射輻射30分鐘，未觀測到明顯的銪發射，其表明極少解離出現在PtEuL中，同時自RuEuL溶液之強發射表示錯合物中的結構變化。在細胞培養研究中，在15分鐘輻射之後觀測到自RuEuL之紅色Eu(III)發射。(圖26A)在更長的輻射時間下發射強度增加，因為更多激發能量引發更多Ru(II)部分自親本分子解離，且所得EuL單元產生更強的發光。另外，釋放之Ru(II)部分引起嚴重細胞損壞，因為在15分鐘輻射之後偵測到細胞分解。對比而言，自用PtEuL(10μM)培育之HeLa細胞未注意到紅色發射或細胞死亡。此意謂沒有明顯的由光輻射引發之細胞損壞，因為488nm無法觸發順鉑自PtEuL釋放。PtEuL在紫外線A輻射(λ=365nm)時發生光活化。然而，UVA輻射可對人類細胞造成嚴重不良效應。
發明人已證實，具有低暗細胞毒性(IC50>200μM)之一種簡單的基於釕-銪之前藥(RuEuL)可達成兩個重要任務，經由兩種不同激 發波長實現光活化藥物遞送及定量監測(488nm用於藥物釋放且350nm/700nm用於成像)。細胞中之光細胞毒性及所釋放之藥物量可藉由NIR中兩光子激發下EuL之即時銪發射來監測。此成像能力可易於利用合適設備、飛秒雷射及動物成像箱延伸至活體內實驗。因此，本文所述之多功能性RuEuL前藥可視為抗癌療法中用於定量治療診斷之有前景的模型。
總而言之，本發明並非僅限於基於鉑之多模式前藥，而且涵蓋基於釕之前藥。
其他具體實例
經自Eu-Pt錯合物之抗腫瘤順鉑之光釋放之銪發射即時原位監測
已合成基於順鉑鍵聯之銪-1,4,7,10-四氮雜環十二烷錯合物的水溶性光反應性抗腫瘤劑PtEuL且針對受控順鉑釋放進行評估，其藉由試管內線性/兩光子激發同時伴隨開啟及長期銪發射作為反應性可追蹤信號來實現。
順鉑為抵抗各種實體腫瘤(諸如睪丸癌及非小細胞肺癌)之極有效的化學治療藥物。順鉑主要經由觸發凋亡性細胞死亡之大量DNA加合物形成來發揮其抗癌活性。然而，其易被血液中之各種蛋白質(尤其血清白蛋白及麩胱甘肽)攻擊會妨礙其遞送至疾病標靶，從而產生限制順鉑其他應用的多種嚴重副作用(例如白血球減少症、腎毒性)。為克服此問題，已研發減緩其與蛋白硫醇反應的多種順鉑類似物。亦研發了其他策略，諸如其經由囊封微胞、奈米材料以及光活化Pt(IV)前藥的受控釋放(亦即順鉑以相對非活性之形式系統性運輸，且隨後在標靶部位藉由光再活化)。在本 發明具體實例中，發明人提出研發含有可僅在光輻射時釋放之順鉑的水溶性鑭系元素-順鉑錯合物PtEuL(Pt：鉑(II)；Eu：銪(III)；L：2,2',2"-(10-((4-((4-(異菸鹼醯胺基)苯基)-乙炔基)吡啶-2-基)甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(圖27))。伴隨此光解離，Pt-Eu-L錯合物之最初非發射性Eu中心現變得具高度發射性，因此允許直接監測細胞毒性順鉑之光釋放。此類關-開反應性銪發射可確認試管內標靶遞送及順鉑釋放開啟。PtEuL錯合物之設計係基於鑭系元素離子之獨特的光物理特性。由於其禁用f-f輻射躍遷，需要合適的有機天線發色團以吸收且傳遞光激發能量至鑭系元素離子，因此擴增其本身微弱但超敏感的指紋發射。水溶性及可滲透細胞之PtEuL錯合物自含有硬質π共軛天線發色團的Eu(III)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷錯合物構建，該發色團具有配位至順鉑的異菸鹼醯胺配位體(圖27)。由於緊密接近Pt中心，由天線發色團吸收的激發能量大多經由系統間電荷傳遞引至Pt的解離態且未偵測到Eu發光。在順鉑自PtEuL光解離時，自天線之三重激發態至Eu(III)之第一激發態的能量傳遞發生，同時Eu發射以關-開方式顯著增強。此設計錯合物為順鉑達至其試管內標靶提供即時可追蹤遞送媒劑。已進行此錯合物之綜合光物理及試管內研究，諸如量測其量子產率、敏感效率、發光壽命、DNA結合及裂解特性、暗細胞毒性及光細胞毒性。所獲得之結果支持將PtEuL作為可追蹤且可光活化前藥用於順鉑之受控及靶向遞送的即時光學監測。
在本發明中，製備無順鉑之Eu錯合物EuL作為對照以用於對比。另外，合成兩種釓類似物GdL及PtGdL以用於探測基於1,4,7,10-四氮雜環十二烷之配位體L的三重態。使用合成流程1獲得所有錯合物 PtLnL及LnL(Ln=Eu及Gd)且藉由HRMS及HPLC表徵。
在298K下記錄所有錯合物及配位體之溶液態電子吸收及發射光譜(圖28A至圖28D)。EuL錯合物為PtEuL光解離後之產物且用於監測自PtEuL之[Pt-(NH3)2Cl]+的光解離。PtEuL及EuL之吸收帶類似且分別位於約327及324nm處，但PtEuL之吸收係數為22 600M-1 cm-1，比EuL之吸收係數高4000M-1 cm-1(圖28A)。然而，PtEuL及EuL之發射量子產率展示與其吸收係數相反的趨勢。EuL在水溶液中展現具有11%量子產率的強紅色發射，而PtEuL在相同實驗條件下僅給出極其微弱的Eu發射(圖28B)。在天線配位體之UV激發(λex=325nm)下所獲得之PtEuL及EuL的室溫發射光譜提供於圖28B中，其展示特徵5D0→7F J ，其中J=Eu3+之0-4轉變。自PtEuL及EuL之5D0→7F J 發射的比率表示兩種錯合物均具有類似的配位幾何形狀，其中J=0-4(圖28B)。水溶性錯合物EuL展示徹底敏化的Eu發射，因為天線發色團之T 1激發態的能量水平為約20 202cm-1，其在Eu(III) 之第一激發態的最佳能量傳遞間隙內，5D0(17 300cm-1)(6.17μs，)。但在77K下獲得之PtGdL的磷光波譜展示445nm下之天線配位體的磷光帶(22 222cm-1，6.51μs)。此觀測表示亦有可能傳遞能量至Eu(III)之5D1激發態，首先填充且隨後進行快速非輻射能量傳遞至隨後發射之5D0態。然而，在Pt-Eu錯合物PtEuL中，僅發生自天線配位體之三重激發態至Eu激發態之有限能量傳遞，從而導致不顯著的Eu發射。所提出之PtEuL之能量傳遞機制概述於圖31中。在PtEuL中，將由天線配位體吸收之能量傳遞至順-Pt(II)部分之解離態，且因此極有限的能量可傳遞至Eu(III)激發態以用於發射。此異常光物理特性在PtEuL錯合物UVA或兩光子激發時提供反應性信號變化，導致[Pt(NH3)2Cl]+自錯合物解離以用於在習知順鉑抗癌化學治療中共價攻擊DNA鹼基。敏化電荷轉移首先減弱Py-Pt鍵，其隨後導致順鉑部分解離。現可在水溶液中觀測到Eu發射(圖28C)以用於兩光子引發之試管內成像(圖30A至圖30C，UV激發為光毒性的)。PtEuL之光解離(於Tris緩衝劑中3μM，pH值=7.4，50mM NaCl)藉由Eu發射(λem=615nm，5D0→7F2)隨輻射時間的變化來監測。在用UVA(λ=365nm)連續激發PtEuL之後，Eu發射強度增強至超過35倍(發射量子產率增加至>100倍)(圖28C)。在此等實驗條件下，準一級速率常數k確定為0.53min-1(圖28D)。90分鐘之UVA輻射之後，PtEuL的光解離產物藉由HPLC分析鑑別，其中發現所分離光產物的滯留時間及光譜與所合成EuL之滯留時間及光譜非常一致(圖32)。當順鉑及其類似物的主要毒性作用經由其與存在於蛋白質上之自由硫醇的相互作用介導時，其自前藥的控制釋放可增強活性順鉑與遞送部位處之意欲標靶的相互作用。
PtEuL與DNA在暗處的直接結合藉由圓偏光二色性(CD)研究。存在(培育時間=12h)及在沒有PtEuL下DNA的CD光譜展示於圖29A中。存在PtEuL下DNA之正與負譜帶之橢圓率的顯著減小表示，PtEuL可直接結合至DNA且使其螺旋展開，導致失去螺旋形(圖29A)。光活化PtEuL與DNA之相互作用藉由瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖29B)。在對PtEuL UVA輻射之後，清楚地發現質體DNA之超旋扭構形異構物轉化為表示DNA切口(單股斷裂)之開環的構形異構物及表示雙股斷裂之線性構形異構物。有趣的是，強DNA光裂解活性僅見於PtEuL之情況下，而在順鉑下不太顯著且在EuL下根本未見，表明不同於順鉑之DNA損壞機制的DNA損壞機制在PtEuL中運作。在兩個癌細胞系(HeLa及A549)以及順鉑中評估PtEuL之暗細胞毒性(表4)。發現相較於順鉑，PtEuL展現對HeLa及A549細胞之較低暗細胞毒性，其對應IC50為22.5±0.5μM及49.5±0.1μM(表4)。然而，EuL展示在相同條件下對此等兩種癌細胞系無毒性。
近紅外線(NIR)激發日益用於活體細胞成像及光動力或光活化之化學療法，因為NIR光子(λ=650-900nm)可在高度精確性及極少附帶光損壞下更深地穿透至組織中。此前已研究鑭系元素錯合物之一些天線配位體的兩光子光物理特性。在以不同量濃度(PtEuL：0、1、2、5、10μM；EuL：0、10、20、50、100μM)培育24小時之後，兩光子引發之EuL及PtEuL錯合物對HeLa細胞之細胞毒性使用兩光子(λex=730nm)共焦顯微鏡進行研究(圖30A至圖30C及圖33A及圖33B)。在30分鐘之間歇性兩光子激發之後，在此細胞中在>2μM下觀測到自PtEuL之紅色發 射(每分鐘10s之雷射激發)。此隨PtEuL劑量增加之發射與作為順鉑之已知胞內目標的細胞核及核膜緊密相關，順鉑可能衍生自解離之PtEuL。對比而言，在相同條件下自用EuL處理之細胞未偵測到紅色發射。此很可能歸因於EuL之較低細胞吸收速率，因為甚至在其他條件不變下用100μM之EuL培育之後自HeLa細胞仍未觀測到Eu發射。無光活化下自PtEuL之明顯慢之順鉑解離速率在達到其意欲標靶之前保持前藥穩定性上十分關鍵。
保持作為細胞毒性鉑及錸錯合物之受控遞送媒劑之極大前景的一系列鉑-鑭系元素(例如鉑-銪錯合物(PtEuL))或錸-鑭系元素˙另外，在鉑或錸錯合物(例如順鉑)自錯合物(例如PtEuL)光解離時所產生的鑭系元素(例如Eu)發射允許即時監測例如試管內順鉑釋放，因此使其成為發光影像以及抗腫瘤化學治療劑。
a H2O中的吸收係數，298K。
b 由PtGdL錯合物之磷光獲得之發色團的三重態能量水平(在v：v=1：1之H2O/甘油中，77K)。
c eu發光衰減(λem=615nm，5D0->7F2，λex=325nm)。
d Eu(III)錯合物之水合數，q=1.2×[k(H2O)-k(D2O)-0.25]，k=t-1.8。
e 於H2O中之總Eu發射量子產率，藉由積分球測定。
f HeLa及A549細胞上之錯合物的暗細胞毒性。順鉑在此實驗中用作對照且其在HeLa及A549上之IC50分別為3.30±0.1μM及8.70±0.5μM。IC50>500μM來自經由樣品濃度得到之毒性曲線。IC50呈現為三個獨立實驗之平均值(μM)±標準差。
工業適用性
本發明揭示具有試管內/活體內反應信號之治療診斷前藥。其亦係關於用於評估與整合素αvβ3之結合的合成鑭系元素錯合物。
視需要，本文中論述之不同功能可以不同順序及/或彼此並行地進行。此外，視需要，上述功能中之一或多者可視情況存在或可組合。
雖然上述發明已對於各個具體實例及實施例加以描述，但應理解，其他具體實例如以下申請專利範圍及其等效物中所表述，屬於本發明之範圍內。此外，以上特定實施例僅解釋為說明性的，且不以任何方式限制本發明之其餘部分。無需進一步詳細描述，咸信熟習此項技術者可基於本文中之描述最大程度利用本發明。本文中所列舉之全部公開案以全文引用的方式併入本文中。
<110> 香港浸會大學
<120> 用於多模式、非侵入性的腫瘤特定治療診斷前藥之鑭系元素工具箱
<130> P9348US01
<160> 5
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 併入有合成於實驗室中之非天然產生胺基酸的胜肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置一處之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置二處之C為D-胺基酸
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(10)
<223> 位置二及十處之C側鏈經由二硫鍵共價結合
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置二處之C為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 位置一處之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置十二處之R為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> 位置十四處之R為D-胺基酸
<400> 1
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 併入有合成於實驗室中之非天然產生胺基酸的胜肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置一處之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(10)
<223> 位置二之C側鏈與位置十處之C側鏈一起形成二硫鍵
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置二處之C為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置十處之C為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 位置十一處之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置十一處之R為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> 位置十四處之R為D-胺基酸
<400> 2
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 併入有合成於實驗室中之非天然產生胺基酸的胜肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置一處之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置二處之C為D-胺基酸
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(9)
<223> 位置二之C側鏈與位置九處之C側鏈一起形成二硫鍵
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位置九處之C為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置十處之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 位置十一處之R為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 位置十三處之R為D-胺基酸
<400> 3
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 併入有合成於實驗室中之非天然產生胺基酸的胜肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置一處之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置二處之C為D-胺基酸
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(8)
<223> 位置二之C側鏈與位置八處之C側鏈一起形成二硫鍵
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> 位置八處之C為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 位置九處之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置十二處之R為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置十二處之R為D-胺基酸
<400> 4
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 併入有合成於實驗室中之非天然產生胺基酸的胜肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 位置一處之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 位置二處之C為D-胺基酸
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(10)
<223> 位置二之C側鏈與位置十處之C側鏈一起形成二硫鍵
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 位置十處之C為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 位置十一處之Xaa為6-胺基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> 位置十二處之R為D-胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> 位置十四處之R為D-胺基酸
<400> 5

Claims (9)

  1. 一種化合物，其包含式(I)之化學結構：
    Figure TWI664981B_C0001
    其中Ln為Eu；R1為氫；R2為氫或烷基；R3、R4及R5各獨立地為氫、OMe、NMe2或CF3；R6、R7及R8各獨立地為O-或Pn Pn為由SEQ ID NO：1、2、3、4或5表示之多肽；M係
    Figure TWI664981B_C0002
    其中X為Cl或OH；且n+表示化合物之淨電荷且為+1、+2、+3或+4。
  2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1為H，R6及R7為O-，且R8為Pn；或R1為H，R6及R8為O-，且R7為Pn；或R1為H且R6、R7及R8為O-。
  3. 如申請專利範圍第2項之化合物，其中R2為甲基或R6、R7或R8中之至少一者為Pn。
  4. 如申請專利範圍第2項之化合物，其中R3、R4及R5為氫。
  5. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物係
    Figure TWI664981B_C0003
    其中Ln為Eu。
  6. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項之化合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
  7. 一種如申請專利範圍第1項的化合物之用途，其係用於製造用於治療、成像、或成像及治療有需要患者之癌症的醫藥品。
  8. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該癌症為膀胱癌、子宮頸癌、皮膚癌、口腔癌或前列腺癌。
  9. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該化合物係
    Figure TWI664981B_C0004
    其中Ln為Eu。
TW106132706A 2016-09-21 2017-09-21 用於多模式、非侵入性的腫瘤特定治療診斷前藥之鑭系元素工具箱 TWI664981B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662397360P 2016-09-21 2016-09-21
US62/397,360 2016-09-21
US15/709,942 2017-09-20
US15/709,942 US10183027B2 (en) 2016-09-21 2017-09-20 Lanthanide toolbox for multi-modal, non-invasive tumor specific theranostic prodrugs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201818971A TW201818971A (zh) 2018-06-01
TWI664981B true TWI664981B (zh) 2019-07-11

Family

ID=61618233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106132706A TWI664981B (zh) 2016-09-21 2017-09-21 用於多模式、非侵入性的腫瘤特定治療診斷前藥之鑭系元素工具箱

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10183027B2 (zh)
TW (1) TWI664981B (zh)
WO (1) WO2018054340A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10183956B2 (en) * 2016-05-27 2019-01-22 New Life Medicine Technology Company Limited Lanthanide toolbox for organelle specific molecular imaging

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4599352A (en) * 1984-03-01 1986-07-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Antineoplastic platinum (IV) complexes and compositions
US4675336A (en) * 1985-06-26 1987-06-23 American Cyanamid Company Platinum complexes of amines with dibasic acids
WO2006120444A1 (en) 2005-05-11 2006-11-16 University Of Durham Responsive luminescent lanthanide complexes
GB0613823D0 (en) 2006-07-12 2006-08-23 Univ Durham Assay
GB2451106A (en) 2007-07-18 2009-01-21 Cis Bio Int Lanthanide (III) ion complexing pyrazoyl-aza(thio)xanthone comprising compounds, their complexes and their use as fluorescent labels
CN101125865B (zh) * 2007-09-29 2010-09-08 广东药学院 手性钌配合物及其作为抗肿瘤药物的应用
GB2467012A (en) 2009-01-20 2010-07-21 Cis Bio Int Lanthanide (III) ion complexing compounds, luminescent lanthanide (III) ion complexes and use thereof as fluorescent labels
US9744236B2 (en) * 2009-06-26 2017-08-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Photolabile compounds
US10183956B2 (en) * 2016-05-27 2019-01-22 New Life Medicine Technology Company Limited Lanthanide toolbox for organelle specific molecular imaging

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chem Commun (Camb). 2015 Sep 25;51(74):14022-5 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201818971A (zh) 2018-06-01
US20180078564A1 (en) 2018-03-22
US10183027B2 (en) 2019-01-22
WO2018054340A1 (en) 2018-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ning et al. Near-infrared (NIR) lanthanide molecular probes for bioimaging and biosensing
Niu et al. Highly photostable two-photon NIR AIEgens with tunable organelle specificity and deep tissue penetration
AU2002323528C1 (en) Multi-use multimodal imaging chelates
AU2002323528A1 (en) Multi-use multimodal imaging chelates
Wu et al. A new near-infrared phosphorescent iridium (III) complex conjugated to a xanthene dye for mitochondria-targeted photodynamic therapy
Dasari et al. Near-infrared excited cooperative upconversion in luminescent Ytterbium (ΙΙΙ) bioprobes as light-responsive theranostic agents
Yang et al. A df heteronuclear complex for dual-mode phosphorescence and magnetic resonance imaging
US9522925B2 (en) Selective cancer tracking eradicator and the uses thereof
Yang et al. Diketopyrrolopyrrole-based multifunctional ratiometric fluorescent probe and γ-glutamyltranspeptidase-triggered activatable photosensitizer for tumor therapy
Fu et al. Creatine-based carbon dots with room-temperature phosphorescence employed for the dual-channel detection of warfarin
Dasari et al. Luminescent lanthanide (III) complexes of DTPA-bis (amido-phenyl-terpyridine) for bioimaging and phototherapeutic applications
Gkika et al. Metal peptide conjugates in cell and tissue imaging and biosensing
WO2018064961A1 (en) Multi-modal bioprobe for bladder cancer imaging and photodynamic therapy
Chen et al. A mitochondria-localized iridium (III)–chlorin E6 conjugate for synergistic sonodynamic and two-photon photodynamic therapy against melanoma
TWI664981B (zh) 用於多模式、非侵入性的腫瘤特定治療診斷前藥之鑭系元素工具箱
US9840522B2 (en) Multi-modal bioprobe for bladder cancer imaging and photodynamic therapy
RU2411243C1 (ru) Иттербиевый комплекс дикалиевой соли 2,4-диметоксигематопорфирина ix как флуоресцентная метка для ранней диагностики рака
Sathiyajith et al. Synthesis, photophysical characterization, relaxometric studies and molecular docking studies of gadolinium-free contrast agents for dual modal imaging
Licandro et al. Organometallic bioprobes for cellular imaging
KR100911250B1 (ko) 신규한 클로린 ｅ６-엽산 결합 화합물의 제조방법
Xie Luminescent bioprobes for imaging and inhibition of tumour cells
Yao Platinum-lanthanide metallodrugs for imaging and therapy
Tan et al. Cyclometalated iridium (III) tetrazine complexes for mitochondria-targeted two-photon photodynamic therapy
Li Responsive luminescence toolbox for biological applications
O'Neill et al. Luminescent Lanthanoid Probes